Ocena poziomu neuroprzekaźników pobudzających u szczurów z przewlekłą padaczką

Weźmy szczura kontrolnego i szczura z przewlekłą epilepsją, którym wszczepiono kaniulę prowadzącą i elektrodę elektroencefalogramową lub EEG w hipokampie.

Indukcja padaczki zwiększa uwalnianie neuroprzekaźników pobudzających, powodując napływ jonów do komórek postsynaptycznych, co generuje ciągłe potencjały pobudzające. Prowadzi to do zsynchronizowanych wybuchów aktywności elektrycznej, zwanych napadami, rejestrowanych za pomocą elektrody.

Włóż do kaniuli sondę do mikrodializy z półprzepuszczalną membraną.

Przywiąż szczura do klatki systemu rejestracji EEG.

Wprowadź fizjologiczny bufor do tkanki mózgowej przez wlot sondy.

Upewnij się, że nie ma napadów padaczkowych i zbierz płyn zewnątrzkomórkowy przez wylot sondy, aby ocenić poziom neuroprzekaźników.

Podwyższony poziom podstawowy u szczura z padaczką wskazuje na wzrost spowodowany padaczką.

Wprowadzić bufor o wysokiej zawartości potasu i zebrać próbki.

Zwiększony poziom potasu przedłuża pobudliwość neuronów, wywołując ciągłe uwalnianie neuroprzekaźników.

Tymczasowy wzrost poziomu neuroprzekaźników zarówno u szczurów z padaczką, jak i u szczurów kontrolnych wskazuje na wysoki wzrost wywołany przez potas

Zacznij od przygotowania sond do mikrodializy do pierwszego użycia zgodnie z instrukcją obsługi producenta i napełnij je roztworem Ringera. Następnie wytnij 10-centymetrowe kawałki rurki FEP i podłącz je do kaniul wlotowych i wylotowych sondy za pomocą adapterów rurek w różnych kolorach. Upewnij się, że rurka styka się z adapterami bez martwych przestrzeni we wszystkich połączeniach.

Wyjmij atrapę kaniuli z prowadnicy za pomocą pęsety, mocno trzymając głowę zwierzęcia. Włóż sondę do mikrodializy do kaniuli prowadzącej i użyj plasteliny, aby jeszcze bardziej ujędrnić kaniulę. Następnie podłącz zwierzę do systemu rejestracji EEG na uwięzi. Następnie włóż zwierzę do cylindra z pleksiglasu i pozwól mu eksplorować nowe środowisko. Śledź obudzone i swobodnie poruszające się ruchy szczurów.

Następnie podłącz wlot sondy do strzykawki o pojemności 2,5 mililitra za pomocą igły o rozmiarze 22 zawierającej roztwór Ringera za pomocą adapterów rurek. Wepchnij jeden mililitr roztworu Ringera do sondy w ciągu 10 sekund, naciskając w sposób ciągły tłok strzykawki o pojemności 2,5 mililitra. Sprawdź, czy na wylocie nie pojawiła się kropla płynu, aby oznaczyć, kiedy sonda jest gotowa do użycia. Na koniec napełnij strzykawki o pojemności 2,5 mililitra podłączone do rurki FEP za pomocą adapterów rurek roztworem Ringera i zamontuj je na pompie infuzyjnej. Uruchom pompę z prędkością dwóch mikrolitrów na minutę i pozwól jej pracować przez noc.

Po zweryfikowaniu za pomocą zapisów wideo EEG, braku napadów w ciągu trzech godzin poprzedzających pobranie próbki, należy zatrzymać pompę przenoszącą rurki FEP, kaniulowane strzykawki wypełnione roztworem Ringera. Zamontuj kolejny zestaw strzykawek o pojemności 2,5 mililitra połączonych z rurką FEP za pomocą adapterów rurek wypełnionych zmodyfikowanym roztworem Ringera zawierającym 100 milimolowy roztwór potasu. Uruchom pompę z prędkością 2 mikrolitrów na minutę i pozwól jej pracować. Sprawdź, czy w systemie nie ma pęcherzyków powietrza i upewnij się, że rurki stykają się z adapterami bez martwych przestrzeni we wszystkich połączeniach.

Następnie sprawdź, czy na wylocie nie pojawiła się kropla płynu, aby oznaczyć, kiedy sonda jest gotowa do użycia. Następnie podłącz rurkę FEP strzykawek wypełnionych roztworem Ringera do kaniuli wlotowej sondy u każdego zwierzęcia i poczekaj na pojawienie się kropli cieczy na końcówce wylotu. Podłącz wylot sondy do rurki FEP, co prowadzi do gromadzenia się w probówce.

Włóż rurkę FEP do zamkniętej probówki o pojemności 0,2 mililitra z perforowaną nakrętką. I upewnij się, że rurka pozostaje na swoim miejscu, mocując ją kawałkiem plasteliny. Po uruchomieniu pompy z prędkością 2 mikrolitrów na minutę przez 60 minut bez pobierania próbek w celu zrównoważenia, system pobiera pięć kolejnych 30-minutowych próbek dializatu w warunkach wyjściowych. I przechowuj próbki na lodzie.

Po 10 minutach przełączyć rurkę ze strzykawek zawierających 100-milimolowy roztwór potasu Ringera na normalny roztwór Ringera i pozwolić pompie pracować. Po zebraniu piątego dialiatu po równowadze, należy zbierać 20 mikrolitrowych frakcji dializatu co 10 minut przez jedną godzinę. Następnie należy pobrać trzy dodatkowe 30-minutowe próbki dializatu i zatrzymać pompę. Na koniec należy przechowywać próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza po doświadczeniu do czasu analizy HPLC.