Name: Otrzymywanie wirusowego DNA z nukleokapsydów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Naucz się izolować wysokiej czystości DNA wirusowych nukleokapsydów z zakażonych komórek. Ta metoda wykorzystuje ultrawirówkę i ekstrakcję fenolowo-chloroformową do uzyskania DNA o niskim poziomie zanieczyszczeń.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni za wkład Grega Smitha, Lisy Pomeranz, Matta Lymana, Marlies Eldridge, Haliny Staniszewskiej Goraczniak oraz członków laboratorium Enquista w dopracowanie niniejszego protokołu.

1. Pierwszy dzień: Infekcja wirusowa i przygotowanie buforów
<ol>
	<li>Przygotować od 5 do 10 szalek (o średnicy 15 cm) z hodowlą komórkową do infekcji, np. komórki PK-15 dla wirusa pseudowścieklizny (PRV) lub komórki Vero dla wirusa opryszczki zwykłej (HSV).</li>
	<li>Gdy komórki osiągną 95–100% konfluencji, zainfekować je z wielokrotnością infekcji (MOI) wynoszącą 5–10. W tym celu zaszczepić każdą płytkę, używając zapasu wirusa w całkowitej objętości 4 ml na płytkę, a następnie inkubować płytki przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Delikatnie kołysać płytkami co 15 minut, aby zapewnić pełne pokrycie monowarstwy komórek inokulum wirusa. W międzyczasie podgrzać pożywkę do następnego etapu.</li>
	<li>Po jednej godzinie infekcji odessać inokulum wirusa z płytek, dodać 15 ml ciepłej pożywki i inkubować w temperaturze 37°C przez 12–20 godzin w inkubatorze z nawilżaniem.</li>
	<li>Przygotować bufory LCM (patrz Tabela 1) i kołysać przez noc w temperaturze 4°C w celu dokładnego wymieszania. Przygotować TNE do resuspensji wirusowego DNA (patrz Tabela 2).</li>
</ol>
2. Drugi dzień, faza 1: Lizy komórek i ultrawirowanie
<ol>
	<li>Wizualnie potwierdź, że infekcja komórek wywołała jednolity efekt cytopatyczny (CPE). Pozostaw infekcję do czasu, aż wszystkie komórki przybiorą okrągły kształt, ale nie oddzielą się jeszcze od płytki.</li>
	<li>Zeskrob zainfekowane komórki do medium, a następnie przelej komórki wraz z medium do probówek stożkowych o pojemności 50 ml. Liczba probótek stożkowych potrzebnych na tym etapie zależy od liczby naczyń użytych do infekcji w kroku 1.2 powyżej, np. jedna probówka stożkowa 50 ml może służyć do wirowania osadu z maksymalnie 3 naczyń zawierających po 15 ml medium. Opcjonalnie: Przepłucz płytki 10 ml PBS i połącz ten płyn z komórkami i medium.</li>
	<li>Wiruj komórki i medium przez 10 minut przy sile względnej 2000 rcf w temperaturze pokojowej, następnie odessaj nadsącz i resuspenduj każdy osad w 10 ml PBS. Jeśli osad z jednej infekcji wirusowej został rozdzielony do wielu probótek stożkowych w kroku 2.2, można je na tym etapie połączyć w jednej probówce. Powtórz wirowanie i odsysanie. Opcjonalnie: Osad ten można przechowywać w temperaturze -20°C i kontynuować protokół w późniejszym terminie.</li>
</ol>
3. Drugi dzień, faza 2: Ultracentryfugacja
Podczas następnych etapów należy w miarę możliwości przechowywać osad komórkowy oraz bufory LCM w lodzie.
<ol>
	<li>Dodać β-merkaptoetanol do buforu LCM z 0% glicerolu. Rozpocząć chłodzenie ultrawirówki (do kroku 3.9 poniżej), ustawiając temperaturę 4°C i włączając pompę próżniową.</li>
	<li>Resuspendować osad komórkowy w 5 ml buforu LCM z 0% glicerolu, aż przestanie być grudkowaty. W razie potrzeby wymieszać probówkę na wirówce vortex, aby rozbić nierozpuszczony osad komórkowy.</li>
	<li>Przeprowadzić ekstrakcję, dodając 1,5 ml Freonu (1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroetan) i intensywnie mieszając na vortexie. Natychmiast wirować przez 10 min przy 2000 rcf w temperaturze 4°C. Zebrać górną warstwę za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze (unikając warstwy granicznej) i przenieść do nowej probówki. Opcjonalnie: Jeśli osad ma postać żelowatej substancji stałej, można szybko przelać górną warstwę do nowej probówki.</li>
	<li>Powtórzyć ekstrakcję Freonem i ponownie wirować.</li>
	<li>Zebrać górną warstwę (~5 ml) i przenieść do nowej probówki do ultrawirówki wykonanej z polialomeru. Dodać β-merkaptoetanol do dwóch pozostałych buforów LCM z glicerolem.</li>
	<li>Przygotować gradient w polialomerowej probówce do wirowania, nakładając pod ekstrakt z Freonu (warstwa górna) 3 ml buforu LCM z 5% glicerolu (warstwa środkowa), a następnie pod nią 2,5 ml buforu LCM z 45% glicerolu (warstwa dolna). Użyć cienkiej pipety, aby uniknąć przelania zawartości probówki.</li>
	<li>W razie potrzeby przygotować równoważącą probówkę balansową, stosując te same proporcje buforów LCM.</li>
	<li>Przenieść probówki do koszyków ultrawirówki. Zrównoważyć masę koszyków z dokładnością do 0,1 g, delikatnie dodając dodatkowy bufor LCM z 0% glicerolu do warstwy górnej (~50-100 μl na raz).</li>
	<li>Używając schłodzonej ultrawirówki z rotorem z koszykami poziomymi lub wahadłowymi, wirować zrównoważone próbki przez 1 godzinę przy 77 000 rcf (np. 25 000 rpm dla rotora SW41Ti) w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Podczas ultrawirowania wykonać szklany haczyk do wyłapania pływającego DNA na etapie precypitacji etanolem (4.6 poniżej). Trzymając oba końce szklanej pipety Pasteura, zawiesić środkową sekcję nad płomieniem. Gdy fragment szkła będzie niemal stopiony, delikatnie pociągnąć, aby rozciągnąć szkło, ostrożnie wygiąć, tworząc ostry haczyk (&lt;90 stopni) i gwałtownie pociągnąć, aby odciąć koniec. Jeśli końcówka szklanego haczyka pozostanie otwarta, trzymać ją nad płomieniem, aż szkło stopi się na tyle, by ją zamknąć.</li>
	<li>Po ultrawirowaniu powinien być widoczny cienki, nieprzezroczysty osad z ciemną plamką w środku. Ostrożnie odessać ciecz z probówki, w tym krople spływające po ściankach, unikając naruszenia osadu na dnie probówki.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml TNE w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Pozostawić osad na co najmniej 10 minut, aby umożliwić jego hydratację. Opcjonalnie: Osad można również resuspendować w TNE przez noc, przechowując go w temperaturze 4°C.</li>
</ol>
4. Trzeci dzień: Wytrącanie „duchowego” DNA
<ol>
	<li>Rozbić osad poprzez pipetowanie za pomocą końcówki o małej średnicy (np. końcówki do pipety p200). Na tym etapie nie należy obawiać się ścinania, ponieważ DNA wirusowe jest wciąż zamknięte w kapsydach. W temperaturze pokojowej dodać do probówki z osadem wirusowym następujące odczynniki w celu zniszczenia kapsydów:
	<ul>
		<li>4,25 ml TNE</li>
		<li>0,25 ml 10% SDS</li>
		<li>2 mg Proteinazy K</li>
	</ul>
	Delikatnie kołysać probówką, aby wymieszać odczynniki. Powinien nastąpić niewielki wzrost lepkości.</li>
</ol>
Od tego momentu należy unikać sił ścinających, np. stosować pipety o dużej średnicy otworu i nie mieszać materiału wirusowego w wirówce typu vortex
<ol start="2">
	<li>Wyekstrahować białka wirusowe, dodając 5 ml fenolu i chloroformu, a następnie niezwłocznie rozpocząć odwracanie probówki lub mieszanie w wstrząsaczu vórteksowym w celu utrzymania emulsji. Mieszać przez 10 sekund, a następnie odwirować emulsję przez 5 minut przy 2000 rcf w temperaturze pokojowej. Zebrać górną warstwę za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze, unikając warstwy granicznej, i przenieść do nowej probówki. Opcjonalnie: na tym etapie można zastosować probówki z żelem fazowym (PLG), aby uniknąć zanieczyszczeń z warstwy granicznej.</li>
	<li>Powtórzyć ekstrakcję fenol-chloroformową i ponownie odwirować.</li>
	<li>Po drugiej ekstrakcji fenol-chloroformowej zebrać górną warstwę do szklanej probówki Corex o pojemności 30 ml i schłodzić probówkę w temperaturze -20°C przez 10-15 minut, dbając o to, aby próbka nie zamarzła.</li>
	<li>Dodać 10 ml lodowatego etanolu, zakryć probówkę (np. naciągając kawałek folii Parafilm M na wierzchu) i natychmiast odwrócić, aby wymieszać. Obserwować pojawienie się „ducha” DNA, który ma postać cienkiego, sznurowatego osadu. Delikatnie odwracać probówkę, aby dalej mieszać i doprowadzić do skupienia się lepkich osadów DNA.</li>
	<li>Użyć szklanego haczyka, aby uchwycić „ducha” (lub „duchy”) DNA. Ostrożnie osuszyć DNA, aby usunąć nadmiar cieczy, następnie umieścić haczyk (końcem w dół) w probówce 1,5 ml i pozostawić do wyschnięcia. Dodać 0,25 - 0,5 ml buforu TE, aby rozpuścić „ducha” DNA. Pozostawić DNA do resuspensji przez co najmniej jedną godzinę. Przechowywać DNA w temperaturze 4°C. Opcjonalnie: aby zmaksymalizować wydajność DNA, można odłamać szklany haczyk do probówki 1,5 ml, tak aby resuspensja z fragmentów szkła mogła trwać w czasie.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Przy wystarczająco wysokim MOI komórki powinny osiągnąć pełny efekt cytopatyczny (CPE) w ciągu około 18 godzin po infekcji (hpi) w przypadku szczepów PRV typu dzikiego oraz około 24 hpi dla szczepów HSV-1 typu dzikiego (Rycina 1). Po zebraniu osadu z zainfekowanych komórek pozostałe kroki protokołu można zrealizować w ciągu jednego długiego dnia lub rozłożyć na dwa dni (Rycina 2).
Podczas przygotowywania szklanych haczyków do wychwytywania „ducha DNA”, ważne jest, aby kąt haczyka był mniejszy niż 90 stopni, tak aby mógł on później zmieścić się w podstawie probówki 1.5 ml (Rycina 3). Uszczelnienie końcówki tego haczyka zapobiega utracie DNA wewnątrz pipety.
„Duchy” DNA powstają podczas etapu precypitacji i przybierają postać białych, sznurowatych nici (Rysunek 4). Agregują one i przylegają do siebie i/lub do szklanego haczyka używanego do wyłapywania DNA. Dzięki temu ten sam szklany haczyk może posłużyć do zebrania wielu nici DNA z roztworu precypitacyjnego.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wybierz kolumnę na podstawie pożądanej objętości:</td>
			<td>10 ml</td>
			<td>15 ml</td>
			<td>20 ml</td>
			<td>40 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M KCl</td>
			<td>1,3 ml</td>
			<td>1,9 ml</td>
			<td>2,5 ml</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris (pH 7,4)</td>
			<td>300 μl</td>
			<td>450 μl</td>
			<td>600 μl</td>
			<td>1,2 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl22</td>
			<td>50 μl</td>
			<td>75 μl</td>
			<td>100 μl</td>
			<td>200 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,5 EDTA</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>15 μl</td>
			<td>20 μl</td>
			<td>40 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40/IGEPAL</td>
			<td>50 μl</td>
			<td>75 μl</td>
			<td>100 μl</td>
			<td>200 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>β-merkaptoetanol (dodać bezpośrednio przed użyciem)</td>
			<td>4.3 μl</td>
			<td>6.5 μl</td>
			<td>8.6 μl</td>
			<td>17.2 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5"> </td>
</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">Zastosuj proporcje dla pożądanej zawartości glicerolu w procentach (0, 5 lub 45%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0% glicerolu</td>
			<td>Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.</td>
			<td>Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.</td>
			<td>Proszę dostarczyć tekst źródłowy do tłumaczenia.</td>
			<td>Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>woda</td>
			<td>8,3 ml</td>
			<td>12,5 ml</td>
			<td>16,7 ml</td>
			<td>33,4 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% glicerolu</td>
			<td>0,5 ml</td>
			<td>0,8 ml</td>
			<td>1,0 ml</td>
			<td>2,0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>woda</td>
			<td>7,8 ml</td>
			<td>11,7 ml</td>
			<td>15,7 ml</td>
			<td>31,4 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45% glicerolu</td>
			<td>4,5 ml</td>
			<td>6,8 ml</td>
			<td>9,0 ml</td>
			<td>18,0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>woda</td>
			<td>3,8 ml</td>
			<td>5,7 ml</td>
			<td>7,7 ml</td>
			<td>15,4 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Składy buforów do LCM
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dla objętości 50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 1M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5 ml 1M Tris, pH 7,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml 0,5 EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>41,5 ml H2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Przygotowanie TNE (0.1 M NaCl; 50 mM Tris, pH 7.5; 10 mM EDTA)
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dla objętości 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,2 g KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,2 g KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 g NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,15 g Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O to 1L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3. Przygotowanie PBS (2.7 mM KCl; 1.5 mM KH2PO4; 137 mM NaCl; 8.1 mM Na2HPO4; pH 7.0)
<img alt="Porównanie morfologii hodowli komórkowych, obrazy mikroskopowe A, B, C, pokazujące różnice w strukturze komórek." src="/files/ftp_upload/3151/3151fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Komórki PK15 (A) przed infekcją, (B) w połowie procesu infekcji oraz (C) w fazie efektu cytopatycznego (CPE), po zastosowaniu wysokiej wielokrotności infekcji.
<img alt="Schemat procesu izolacji wirusa: infekcja komórek, wirowanie, ekstrakcja, precypitacja DNA." src="/files/ftp_upload/3151/3151fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Przegląd protokołu.
<img alt="Narzędzia stomatologiczne, haczyki ze stali nierdzewnej, sprzęt precyzyjny, proces stomatologiczny, badanie stomatologiczne." src="/files/ftp_upload/3151/3151fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Trzy reprezentatywne przykłady szklanych haczyków używanych do zbierania pustych kapsydów viralnego DNA.
<img alt="Wytrącanie chemiczne w probówce, wskazujące na tworzenie się produktu reakcji." src="/files/ftp_upload/3151/3151fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Reprezentatywny przykład dobrze uformowanego i obfitego „ducha” DNA.

<ol><li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li>
<li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins%3A+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li>
<li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li>
<li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li>
<li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus%2C+an+alphaherpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+virology%22">Principles of virology</a>. , 3rd edn, ASM Press. (2008).</li>
<li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pseudorabies+virus%3A+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li>
<li>Roizman, B., Pellett, P. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , 2 ed, Lippincott Williams & Wilkins. 2381-2397 (2001).</li>
<li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li>
<li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li>
<li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Część tego protokołu została pierwotnie opracowana do izolacji wirusowego DNA w warunkach BSL4, jednak równie dobrze sprawdza się on w warunkach spoza BSL.4 Zazwyczaj stosujemy ten protokół do izolacji DNA z alfaherpeswirusów PRV i HSV-1, których genomy DNA są zamknięte w białkowej kapsydzie i otoczone lipidową otoczką.7,8 Jest on jednak prawdopodobnie bezpośrednio możliwy do zaadaptowania do innych dużych wirusów DNA, w tym beta- i gammaherpeswirusów oraz adenowirusów. Podobne ekstrakcje są powszec...

<table><tbody><tr><td>Freon (1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluor&amp;#8211;etan)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T178-4</td><td>Skontaktuj się ze swoją instytucją w celu uzyskania wytycznych dotyczących właściwej utylizacji odpadów zawierających Freon lub zapoznaj się z publikacją Mendez i in. w celu znalezienia potencjalnych alternatyw dla Freonu.&lt;sup&gt;9&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Probówki z żelem separującym (Phase lock), wzmocnione, pojemność 15ml</td><td>5 PRIME</td><td>2302850</td><td>Opcjonalnie</td></tr><tr><td>Probówki do ultrawirówki z poliallomeru</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>331372*</td><td>*Wybierz probówki odpowiednie dla Twojej ultrawirówki; te zostały podane wyłącznie jako przykład</td></tr><tr><td>NP-40 / IGEPAL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-3021</td><td></td></tr><tr><td>Komórki PK-15</td><td>ATCC</td><td>CCL-33</td><td></td></tr><tr><td>Komórki Vero</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.03</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie viralnego dna z nukleokapsydów

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Wirusy są bezwzględnymi pasożytami wewnątrzkomórkowymi, w związku z czym badanie ich DNA wymaga odizolowania materiału wirusowego od zanieczyszczeń i DNA komórki gospodarza. Wiele zastosowań analitycznych wymaga dużych ilości czystego wirusowego DNA, co zapewnia niniejszy protokół. Zastosowania te obejmują sekwencjonowanie genomu wirusowego, w którym usunięcie DNA gospodarza jest kluczowe dla optymalizacji uzysku danych dla sekwencji wirusowych, oraz tworzenie nowych rekombinowanych szczepów wirusowych, gdzie kotransfekcja oczyszczonego plazmidu i linearnego wirusowego DNA ułatwia rekombinację.1,2,3 
Niniejsza procedura wykorzystuje kombinację ekstrakcji i wirowania w gradientach gęstości w celu wyizolowania oczyszczonego liniowego DNA nukleokapsydu herpeswirusa z zainfekowanych komórek.4,5 Początkowe etapy oczyszczania mają na celu wyizolowanie oczyszczonych kapsydów wirusowych, które zawierają i chronią wirusowe DNA podczas etapów ekstrakcji i wirowania służących do usunięcia białek oraz DNA komórkowego. Następnie liza nukleokapsydów uwalnia wirusowe DNA, a dwa końcowe etapy ekstrakcji fenol-chloroformem usuwają pozostałe białka. Końcowe DNA odzyskano z roztworu jest wysoce skoncentrowane i czyste, ze średnim OD260/280 na poziomie 1,90. W zależności od ilości użytych zainfekowanych komórek, wydajność wirusowego DNA mieści się w zakresie 150-800 μg lub więcej. Czystość tego DNA sprawia, że jest ono stabilne podczas długotrwałego przechowywania w 4°C. Dzięki temu DNA to jest idealnie odpowiednie do sekwencjonowania wysokoprzepustowego, reakcji PCR o wysokiej wierności oraz transfekcji. 
Przed rozpoczęciem protokołu ważne jest określenie średniej liczby komórek na naczynie (np. średnio 8 x 106 komórek PK-15 w konfluentnej płytce 15 cm) oraz miana używanego zapasu wirusa (np. 1 x 108 jednostek tworzących plaki na ml). Dane te są niezbędne do obliczenia odpowiedniej wielokrotności infekcji (MOI) dla danego protokołu.6 Na przykład, aby zainfekować jedną płytkę 15 cm z komórkami PK-15 powyższym zapasem wirusa przy MOI wynoszącym 5, należy użyć 400 μl zapasu wirusa i rozcieńczyć go w 3,6 ml medium (całkowita objętość inokulum dla jednej płytki 15 cm wynosi 4 ml).
Jednocześnie można przygotować wiele preparatów wirusowego DNA. Liczba jednoczesnych preparacji jest ograniczona jedynie liczbą probówek mieszczących się w rotorze ultrawirówki (jedna na wirusa; patrz krok 3.9 poniżej). W niniejszej sekcji opisujemy procedurę w odniesieniu do jednego wirusa.

Opisujemy proces izolacji wysokiej czystości DNA nukleokapsydu herpeswirusa z zainfekowanych komórek. Końcowe DNA odzyskane z roztworu charakteryzuje się wysokim stężeniem i czystością, co czyni je idealnym do sekwencjonowania wysokoprzepustowego, reakcji PCR o wysokiej wierności oraz transfekcji w celu otrzymania nowych rekombinantów wirusowych.

Przygotowanie viralnego DNA z nukleokapsydów

Wirusy są obligatoryjnymi pasożytami wewnątrzkomórkowymi, w związku z czym badanie ich DNA wymaga wyizolowania materiału wirusowego z zanieczyszczeń oraz DNA komórki gospodarza. ...

W tym filmie zaprezentowano procedurę izolacji wysokiej czystości nukleokapsydów wirusowych i DNA z zainfekowanych komórek. W pierwszej kolejności membrany lipidowe są denaturowane przy użyciu ekstrakcji dwufazowej. Następnie próbka jest poddawana ultrawirowaniu w celu wytrącenia nukleokapsydów wirusowych i oddzielenia ich od lżejszych komponentów komórkowych i wirusowych.Detergenty oraz proteinaza K są dodawane w celu uwolnienia viralnego DNA z osadzonych nukleokapsydów. Następnie przeprowadzane są podwójne ekstrakcje chloroformem z fenolem w celu usunięcia wszystkich pozostałych białek. Na koniec viralne DNA jest wytrącane z roztworu.Ostatecznie wyniki pokazują, że z tych zainfekowanych komórek wyizolowano wysoce skoncentrowane i czyste DNA wirusowe. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, które nie obejmują ekstrakcji w wolnym przepływie lub ultrawirowania, jest fakt, że uzyskane tutaj DNA wirusowe charakteryzuje się bardzo niskim poziomem zanieczyszczenia DNA gospodarza, co czyni je idealnym do dalszych procedur, takich jak PCR i głębokie sekwencjonowanie genomów wirusowych. Metody tej użyliśmy po raz pierwszy w początkowej fazie prac nad rekombinowanym DNA, kiedy dodatkowe środki ostrożności miały kluczowe znaczenie.Opracowaliśmy tę procedurę w celu izolacji DNA wirusowego podczas pracy w komorze z rękawicami w warunkach BSL 4. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy tworzenia gradientu oraz powstawania tzw. „ducha” DNA (DNA ghosting) są trudne do opanowania. Wynika to z faktu, że warstwowanie gradientu wymaga niezwykle pewnej ręki, a wytrącający się w roztworze „duch” DNA może być trudny do zauważenia bez wcześniejszego doświadczenia w jego identyfikacji.Procedurę rozpoczyna się od przygotowania od pięciu do 10 szalek o średnicy 15 centymetrów z hodowlą komórek do zakażenia. W tym przypadku komórki PK 15 przygotowuje się do zakażenia wirusem pseudo rabies; gdy komórki osiągną 95 do 100% konfluencji, należy wymienić pożywkę na 4 ml pożywki zawierającej wirusa. Przy MOI wynoszącym od pięciu do 10, inkubuj płytki przez jedną godzinę w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2, potrząsając nimi co 15 minut.Delikatnie kołysz płytkami, aby upewnić się, że monowarstwa komórek pozostaje w pełni pokryta inokulum wirusowym. Podczas inkubacji ogrzej pożywkę potrzebną do następnego kroku. Po godzinie infekcji odessaj inokulum wirusowe z płytek.Następnie dodać 15 mililitrów ciepłej pożywki i inkubować w temperaturze 37°C przez 12 do 20 godzin w inkubatorze z nawilżaczem. Na koniec, w ramach przygotowań do eksperymentów w następnym dniu, przygotować świeże partie buforów LCM i TNE. Należy pamiętać, że dodanie NP 40 spowoduje powstanie smug w roztworze roboczym.Przygotowane roztwory pozostaw na kołysarce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia roztwory powinny być całkowicie wymieszane. Umieść szalkę na stoliku mikroskopu złożonego i potwierdź wizualnie, czy infekcja komórek wywołała jednolity efekt cytopatyczny.Wszystkie komórki powinny być zaokrąglone, ale nie powinny odkleić się od płytki. Jeśli komórki nie są jeszcze zaokrąglone, należy kontynuować inkubację do momentu zaobserwowania efektów cytopatycznych. Następnie zeskrobione zakażone komórki należy przenieść do medium, a następnie połączyć komórki w medium w probówkach stożkowych o pojemności 50 mililitrów, aby zwiększyć wydajność.Opłucz płytki 10 mililitrami PBS i połącz z komórkami w medium, następnie odwiruj komórki wraz z medium przez 10 minut przy 2000 RCF w temperaturze pokojowej, aby wypłukać pozostałości medium i surowicy; odessij supernatant i resuspenduj osad w 10 mililitrach PBS. Powtórz wirowanie i aspirację. Jeśli eksperyment nie zostanie kontynuowany tego samego dnia, przechowuj osad w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu wykonania etapów opisanych w tej sekcji.Ważne jest, aby w miarę możliwości przechowywać osad komórkowy i bufory LCM w lodzie. Przygotuj próbkę do ultrawirowania, dodając Beamer capto ethanol do buforu LCM z 0% glicerolu, tak aby końcowe stężenie Beamer capto ethanol wynosiło 0,043%. Przygotuj również ultrawirowarkę, ustawiając temperaturę na 4°C i włączając pompę próżniową podczas chłodzenia urządzenia. Dodaj 5 ml buforu LCM z 0% glicerolu i 0,043% Beamer capto ethanol do osadu komórkowego, a następnie pipetuj w górę i w dół, aby resuspenderować osad.W razie potrzeby należy dokładnie rozbić wszystkie grudki. Wymieszaj zawartość probówki na wortexie, aby rozbić nierozpuszczony osad komórkowy. Następnie, w celu ekstrakcji błon komórkowych i wirusowych, dodaj 1,5 mililitrów.Energicznie wymieszaj próbkę w vortexerze. Wiruj przez 10 minut przy 2000 RCF w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu powstaną dwie warstwy.Górna warstwa wodna zawiera wirusowe nukleoidy, kapsydy i białka, natomiast dolna warstwa freonu zawiera błony wirusowe i komórkowe. Za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze należy zebrać górną warstwę, unikając interfejsu, i przenieść ją do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów. Ważne jest, aby nie dotknąć warstwy freonu i nie przenieść tego rozpuszczalnika organicznego do warstwy wodnej w nowej probówce.Dodać freon i wymieszać w wstrząsarce vortex zgodnie z wcześniejszą procedurą, aby powtórzyć ekstrakcję freonem po wirowaniu. Zebrać górną warstwę o objętości około pięciu mililitrów i przenieść ją do nowej polimerowej probówki do ultrawirowania. Dodać etanol do stężenia 0,043% do dwóch pozostałych buforów LCM z glicerolem.Następnie, aby przygotować gradient w polimerowej probówce do wirowania, należy za pomocą cienkiej pipety podłożyć ekstrakt freonowy trzema mililitrami 5%glycerol LCM. Następnie pod tę warstwę należy dodać 2,5 mililitra 45%glycerol LCM. W razie potrzeby należy przygotować równoważącą probówkę kontrolną, używając tych samych proporcji buforów LCM.Umieść probówki w koszyczkach ultrawirówki i zrównoważ je z dokładnością do 0,1 g, delikatnie dodając dodatkowy bufor LCM z 0% glycerolu do górnej warstwy, po 50 do 100 µL na raz. Wiruj zrównoważone próbki przez jedną godzinę przy 77 000 RCF w temperaturze 4 °C podczas ultrawirowania. Użyj szklanej pipety pasterskiej, aby stworzyć haczyk do przechwycenia pływającego DNA na etapie wytrącania etanolem.Chwyć oba końce pipety i zawieś środkową część nad płomieniem. Gdy fragment szkła się rozgrzeje, delikatnie pociągnij, aby rozciągnąć szkło. Ostrożnie zegnij je, tworząc haczyk pod kątem mniejszym niż 90 stopni, a następnie gwałtownie pociągnij, aby zamknąć końcówkę.Jeśli końcówka szklanego haczyka jest otwarta, należy trzymać ją nad płomieniem, aż szkło stopi się w stopniu pozwalającym na jej zamknięcie. Po ultrawirówce powstanie cienki, nieprzezroczysty osad z ciemnym punktem w środku, który zawiera nukleokapsydy wirusowe. Należy ostrożnie odessać ciecz z probówki, wliczając w to krople po ściankach, unikając jednak naruszenia osadu na dnie probówki.Dodaj 0,5 ml TNE w temperaturze pokojowej. Pozostaw osad na co najmniej 10 minut, aby umożliwić jego hydratację. Jeśli procedura nie zostanie kontynuowana następnego dnia, przechowuj resuspenderowany osad w temperaturze 4 °C.Używając końcówki P 200, rozbijcie uwodniony osad poprzez pipetowanie w górę i w dół. Na tym etapie nie należy obawiać się fragmentacji, ponieważ DNA wirusowe wciąż znajduje się w kapsydach. Aby rozbić kapsydy, dodajcie do osadu wirusowego następujące składniki: 4,25 mililitrów TNE, 0,25 mililitrów 10% SDS oraz dwa miligramy białka EK w temperaturze pokojowej.Delikatnie wstrząśnij, aby wymieszać odczynniki. Po zniszczeniu kapsydów powinna nastąpić niewielka zmiana lepkości; należy zachować ostrożność, aby uniknąć ścinania DNA – należy używać pipet o szerokim otworze i nie poddawać materiału wirusowego wirowaniu w wortexie w celu ekstrakcji białek wirusowych.Przenieś próbkę do probówki z żelem do separacji faz i dodaj 5 ml fenolu z chloroformem. Natychmiast rozpocznij odwracanie probówki, aby utrzymać emulsję, wykonując ten ruch przez co najmniej 10 sekund. Następnie odwiruj emulsję przez 5 minut przy 2000 RCF w temperaturze pokojowej.Po wirowaniu pobierz górną warstwę i przenieś ją do nowej probówki z żelem do separacji faz. Powtórz ekstrakcję fenolowo-chloroformową, a następnie ponownie odwiruj próbkę po drugiej ekstrakcji. Zbierz górną warstwę do szklanej probówki coex o pojemności 30 ml i schłódź probówkę w temperaturze -20 °C przez 10 do 15 minut.Należy dopilnować, aby próbka nie zamarzła. Dodać 10 mililitrów zimnego etanolu. Zamknąć probówkę i odwrócić, aby wymieszać zawartość.Należy natychmiast obserwować pojawienie się „ducha DNA” (DNA ghost), który ma postać cienkiego, nitkowatego osadu. Delikatnie odwróć probówkę, aby dodatkowo wymieszać zawartość i doprowadzić do skupienia się lepkich osadów DNA. Na koniec, za pomocą szklanego haczyka, ostrożnie wyjmij „duchy DNA”, a następnie osusz je, przykładając chusteczkę Kimwipe, aby usunąć nadmiar cieczy.Następnie umieść końcówkę haczyka w probówce 1,5 ml. Aby zmaksymalizować uzysk DNA, odłam szklany haczyk do probówki 1,5 ml, tak aby resuspensja fragmentów szkła mogła postępować w czasie. Pozostaw do wyschnięcia, a następnie dodaj 0,25 do 0,5 ml buforu TE, aby rozpuścić „DNA ghost”.Należy pozwolić na resuspensję DNA przez co najmniej jedną godzinę, przechowując DNA w temperaturze czterech stopni Celsjusza. DNA wirusowe przygotowano z nukleokapsydów zgodnie z opisem w niniejszym artykule wideo; przedstawiony tutaj reprezentatywny przykład dobrze uformowanego i obfitego „ducha” DNA składa się z liniowego genomowego DNA wirusowego wytrąconego w roztworze. Nitki skupiają się i będą wymagały czasu na rehydratację po umieszczeniu w roztworze Acquia. Przygotowane DNA wirusowe z jednego szczepu PRV, Becker Bartha oraz czterech dodatkowych szczepów poddano elektroforezie przez jedną godzinę w 0,5% żelu agarozy i wybarwiono bromkiem etydyny.Każda próbka PRV zawiera 1 µL preparatu nukleokapsydu DNA wirusa, przy całkowitej objętości 250 µL po lewej stronie. Drabinka z faga bakteriofaga lambda DNA sty one po trawieniu wykazuje duży rozmiar nietrawionego DNA lambda (48,5 kb) oraz genomowego DNA PRV (około 140 kb).Następnie seria rozcieńczeń znanych ilości Lambda DNA wykazuje, że stężenie próbek PRV po prawej stronie waha się od 50 do 200 nanogramów na mikrolitr, przy całkowitym uzysku od 12 do 50 mikrogramów na preparat wirusowego DNA. Przygotowane próbki wirusowego DNA z czterech szczepów PRV trawiono przez noc za pomocą BamHI lub KpnI. Próbki DNA trawione enzymami restrykcyjnymi rozdzielono w drodze nocy elektroforezy na żelu agarozy 0,8% i barwiono bromkiem etydium.Ścieżki H1 zawierają 8 µg viralnego nukleokapsydu DNA, natomiast ścieżki KPN1 zawierają 4 µg viralnego DNA. Poszczególne szczepy PRV można rozróżnić na podstawie ich odpowiednich wzorów polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak głębokie sekwencjonowanie, w celu uzyskania danych o zawartości genomu wirusa. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie wirusologii do charakteryzacji viralnego DNA za pomocą polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLPs), southern blottingu, klonowania rekombinowanego DNA, konstrukcji wirusów oraz innych manipulacji wirusami herpes oraz innymi typami wirusów.Należy pamiętać, że praca z fon może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak praca w dygestorium. Po odwirowaniu warstwa fon może szybko przejść ze stanu żelowatego półciała w stan ciekły, dlatego każdą probówkę należy ocenić indywidualnie przed podjęciem decyzji, czy najlepszą metodą pobrania wodnej warstwy górnej jest zlanie, czy pipetowanie.

preparation-of-viral-dna-from-nucleocapsids

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przygotowanie wirusowego DNA z nukleokapsydów

Opisano prosty, wydajny i niezawodny sposób synchronizacji dostarczania wielu komponentów wirusowych do komórek roślinnych za pomocą przejściowej ekspresji pośredniczonej przez Agrobacterium. Podejście to umożliwia badanie replikacji i enkapsydacji, a następnie ponowne składanie komponentów niewirusowych in vitro w pozbawione genomu optyczne „duchy” wirusowe (viral ghosts), odpowiednie do zastosowań biomedycznych.

Prosta i niezawodna metoda in vivo oraz in vitro do badania składania wirusów

Genomika pojedynczych wirusów (SVG) to metoda izolacji i amplifikacji genomów pojedynczych wirionów. Zawiesiny wirusowe mieszaniny różnych szczepów są sortowane za pomocą cytometrii przepływowej na preparat mikroskopowy z osobnymi studzienkami zawierającymi agarozę, co pozwala na przechwycenie wirionu i ograniczenie fragmentacji genomu podczas dalszej obróbki. Amplifikacja całego genomu jest przeprowadzana za pomocą wielokrotnej amplifikacji z wypieraniem (MDA), w wyniku czego otrzymuje się...

Izolacja i analiza genomu pojedynczych wirionów z wykorzystaniem metody „Single Virus Genomics”

W tym filmie opisujemy procedurę polegającą na wykonaniu nano-iniekcji jednoniciowego wirusa RNA o pozytywnym sensie do dorosłego samca muszki Drosophila, a następnie badaniu odpowiedzi przeciwwirusowych zainicjowanych w wyniku infekcji. Analiza reakcji łańcuchowej polimerazy identyfikuje regulację w górę określonych genów u zakażonych muszek, które wskazują na aktywację szlaków odpowiedzi immunologicznej, w tym interferencji RNA i sygnalizacji JAK/STAT.

Nanoiniekcja wirusa do klatki piersiowej w celu zbadania interakcji gospodarz-wirus u dorosłych much

Tutaj przedstawiono protokół tworzenia zakaźnego bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego pełnowymiarowe cDNA pozytywnej nici genomowego RNA wirusa japońskiego zapalenia mózgu. Protokół ten może być wykorzystany do skonstruowania funkcjonalnego cDNA innych wirusów o dodatniej nici RNA, co czyni go potężnym narzędziem genomicznym do badania biologii wirusów.

Sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici RNA

Oferujemy nowatorską strategię izolowania przedziałów replikacyjnych wirusa (RC) od komórek ludzkich zakażonych adenowirusem (Ad). Podejście to reprezentuje system bezkomórkowy, który może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych regulujących replikację i ekspresję genomu wirusa, a także regulację interakcji wirus-gospodarz ustalonych w RC.

Izolacja frakcji subjądrowych wzbogaconych w przedziały replikacji wirusa z normalnych komórek ludzkich zakażonych adenowirusem

Demontaż rdzeni wirusa grypy A podczas wnikania wirusa do komórek gospodarza jest procesem wieloetapowym. Opisujemy metodę in vitro do analizy wczesnych etapów odsłaniania się wirusa. W tym podejściu wirowanie w gradionym tempie służy do biochemicznej analizy etapów, które inicjują odwarstwianie w określonych warunkach.

In vitro Demontaż kapsydów wirusa grypy A przez wirowanie gradientowe

Tutaj prezentujemy protokół syntezy cząsteczek wirusopodobnych za pomocą systemów ekspresji bakulowirusa lub ssaków oraz oczyszczania przez ultrawirowanie. To wysoce konfigurowalne podejście służy do identyfikacji antygenów wirusowych jako celów szczepionek w bezpieczny i elastyczny sposób.

Ekspresja i oczyszczanie cząstek wirusopodobnych do szczepienia

Ten protokół opisuje szybką i szeroko stosowaną metodę bezstronnego sekwencjonowania RNA próbek wirusa z ludzkich izolatów klinicznych.

Bezstronne, głębokie sekwencjonowanie wirusów RNA z próbek klinicznych

Celem tego protokołu jest specyficzne oznaczanie i selektywne izolowanie wirusowego DNA z zakażonych komórek w celu scharakteryzowania białek związanych z genomem wirusa.

Oczyszczanie DNA wirusa w celu identyfikacji powiązanych białek wirusowych i komórkowych

Tutaj prezentujemy nowe podejście do identyfikacji wirusów roślinnych za pomocą dwuniciowych genomów DNA. Stosujemy standardowe metody ekstrakcji DNA i RNA z zakażonych liści oraz przeprowadzamy sekwencjonowanie nowej generacji. Narzędzia bioinformatyczne łączą sekwencje w kontigi, identyfikują kontigi reprezentujące genomy wirusów i przypisują genomy do grup taksonomicznych.

Połączenie analizy DNA w surowej ekstrakcji wirionu z analizą RNA z zakażonych liści w celu odkrycia nowych genomów wirusów

Dla dogłębnej analizy mechanistycznej syntezy RNA syncytialnego wirusa oddechowego (RSV), przedstawiamy protokół wykorzystania fosfoproteiny opiekuńczej (P) do koekspresji nukleoproteiny wolnej od RNA (N0) do późniejszego składania in vitro specyficznych dla wirusa nukleokapsydów (NC).

Wytwarzanie i składanie specyficznych dla wirusa nukleokapsydów syncytialnego wirusa oddechowego

Naucz się izolować wysokiej czystości DNA wirusowych nukleokapsydów z zakażonych komórek. Ta metoda wykorzystuje ultrawirówkę i ekstrakcję fenolowo-chloroformową do uzyskania DNA o niskim poziomie zanieczyszczeń.

Przygotowanie viralnego DNA z nukleokapsydów

Przeglądaj więcej filmów