Dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Weźmy znieczuloną transgeniczną mysz z głową zabezpieczoną pod kątem na uchwycie do obrazowania in vivo siatkówki myszy.

Siatkówka zawiera komórki zwojowe siatkówki lub RGC, wyrażające białko znakowane fluoroforem.

Nałóż smar do oczu i załóż szkiełko nakrywkowe na oko.

Pod mikroskopem równomiernie oświetlić siatkówkę, aby wzbudzić białka fluorescencyjne w RGC.

Korzystając z emitowanej fluorescencji, uzyskaj szeroki widok płaszczyzny ogniskowej RGC i nieostrych RGC.

Przełącz na tryb obrazowania dwufotonowego, skupiając niskoenergetyczne światło bliskiej podczerwieni w warstwie RGC.

W punkcie ogniskowym, połączona energia z dwóch fotonów wzbudza fluorofor, który następnie uwalnia energię w postaci fluorescencji.

Ponieważ wzbudzenie jest ograniczone do jednego punktu, fluorescencja z innych płaszczyzn ogniskowych jest zminimalizowana.

Przechwytuj obrazy w wielu płaszczyznach ogniskowych wzdłuż osi z, aby zobrazować całą warstwę RGC.

Nałóż nawilżające krople do oczu na oba oczy myszy. Obróć główne ramię uchwytu głowicy, aż źrenica jednego oka zorientuje się w linii ze ścieżką światła, a następnie umieść szkiełko nakrywkowe o numerze 1.5 w kompaktowym uchwycie filtra. Po przymocowaniu uchwytu do stolika mikroskopu, opuść szkiełko nakrywkowe, aż zetknie się z i-żelem smarnym, nie dotykając rogówki. I wyreguluj stolik w wymiarze xy i pozycji obiektywu z, aż światło wzbudzenia szerokokątnego całkowicie pokryje rogówkę.

Użyj okularu, aby kontynuować regulację pozycji z, aż fluorescencyjne komórki lub struktury w siatkówce staną się ostre, zwiększając iluminator epifluorescencji w razie potrzeby, aby rozdzielić poszczególne komórki lub struktury będące przedmiotem zainteresowania. Dostosuj wyrównanie siatkówki do ścieżki światła obrazowania. Dostosuj kąt nachylenia głowicy, aż podczas zmiany płaszczyzny ogniskowej nastąpi tylko rozszerzanie lub kurczenie się nieostrego światła, minimalizując zniekształcenia xy.

Następnie wyłącz oświetlacz epifluorescencyjny i zamknij migawkę iluminatora. W przypadku obrazowania dwufotonowego należy przestrzegać wszystkich instytucjonalnych protokołów bezpieczeństwa laserowego. Wyłącz i zakryj całe światło otoczenia i przełącz ścieżkę światła wzbudzenia na laser, a ścieżkę światła emisyjnego na PMT.

W oprogramowaniu do akwizycji obrazów ustaw rozmiar klatki na 512 na 512, a średnią klatkę na 3. Ustaw krok z tak, aby zaczynał się od góry stosu i postępował w dół, minimalizując dwufotonową aktywację laserową fotoreceptorów. Włącz i włącz PMT i dostosuj napięcie do 680 woltów.

Włącz migawki obrazowania i emisji. Rozpocznij podgląd obrazu na żywo tkanki docelowej, zaczynając od 1% mocy lasera i automatycznie dostosuj jasność wyświetlacza, aby wyświetlić interesujące komórki lub struktury. Jeśli tkanka docelowa jest przyciemniona lub niewyraźna, zwiększaj procentową moc lasera, aż struktury staną się widoczne bez przekraczania 45 miliwatów.

Manewruj stolikiem mikroskopu w kierunku xy, aby wyśrodkować żądany obszar obrazowania i przejdź do płaszczyzny z, w której ustawiono ostrość na interesujących Cię strukturach. W przypadku przewlekłego eksperymentu poklatkowego otwórz wcześniej uzyskany obraz, aby użyć go jako odniesienia dla komórek będących przedmiotem zainteresowania, zwracając uwagę, aby kąt obrazowania na bieżącym obrazie był podobny do kąta poprzednich obrazów. Następnie przejdź do górnej i najniższej płaszczyzny z, aby ustawić limity z stosu obrazowania i uzyskać obraz.