Subpialne dostarczanie genów w rdzeniu kręgowym myszy w celu oceny ekspresji genów

Weź znieczuloną mysz, ogol jej grzbiet i zdezynfekuj skórę.

Naciąć skórę, odłączyć mięśnie od kręgów i wycofać je za pomocą zacisków.

Wwiercić się w blaszki kręgowe, aby utworzyć pęknięcia, a następnie usuń fragmenty kości, aby odsłonić oponę twardą, zewnętrzną błonę rdzenia kręgowego.

Za pomocą igły utwórz otwór opony twardej i nakłuj leżącą pod nim pia mater, aby wejść do przestrzeni podskórnej w celu bezpośredniego dostępu do tkanki rdzenia.

Pobrać igłę do podawania zawierającą zawiesinę rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem zawierającym gen wykazujący ekspresję białka fluorescencyjnego i wstrzyknąć zawiesinę.

Wyjmij igłę, zszyj mięśnie i skórę i pozwól myszy dojść do siebie.

Wirus wiąże się z receptorami na neuronach i komórkach glejowych i ulega endocytozy.

Po dostaniu się do jądra wirus wyzwala ekspresję genów w celu wytworzenia białek fluorescencyjnych.

Model dostarczania genów subpialnych jest teraz gotowy do oceny ekspresji genów docelowych w rdzeniu kręgowym.

Zacznij od odpowiedniego znieczulenia zwierzęcia do operacji. Stosuje się tutaj izofluran. Przed kontynuowaniem upewnij się, że nie ma reakcji na uszczypnięcie łapy. Następnie zakryj oczy maścią okulistyczną. Następnie ogol grzbiet zwierzęcia maszynką do strzyżenia i oczyść skórę 2% chlorheksydyną.

Jeśli mają być wykonane iniekcje podbrzuszne lędźwiowe, należy przeciąć skalpelem skórę pokrywającą kręgi od T8 do L1. A następnie użyj nożyczek, aby odłączyć mięsień przykręgosłupowy od kręgów kręgowych T10 do T12. Zamontuj zwierzę w standardowej ramie stereotaktycznej za pomocą zacisków kręgosłupa myszy. Następnie użyj wiertła dentystycznego, aby ogolić obie strony blaszki kręgów od T10 do T12, aż pojawią się pęknięcia.

Następnie za pomocą kleszczy usuń popękane fragmenty kości i odsłoń grzbietową powierzchnię lędźwiowego rdzenia kręgowego. Opona twarda jest teraz widoczna. Użyj igły ze stali nierdzewnej o rozmiarze 30, aby wykonać 1 do 2 milimetrowe nacięcie w oponie twardej.

Ważne jest, aby ostrożnie rozciąć oponę twardą, aby uniknąć uszkodzenia leżącej pod spodem błony pia.

Teraz chwyć krawędź przeciętej opony twardej kleszczami i wydłuż otwór opony twardej na maksymalnie 5 milimetrów. Zamontuj igłę penetrującą pia o rozmiarze 34 i igłę iniekcyjną o rozmiarze 36 na ramionach Z dwóch oddzielnych manipulatorów XYZ za pomocą szklanych uchwytów kapilarnych.

Następnie użyj mikrostrzykawki o pojemności 50 mikrolitrów połączonej z rurką PE-10 lub PE-20, aby załadować wirusa AAV9-UBI-GFP. Po załadowaniu wirusa podłączyć koniec rurki do igły do wstrzykiwań. Następnie, patrząc przez chirurgiczną lunetę sekcyjną ustawioną na powiększenie od 8 do 10x, użyj ramienia X, aby opuścić igłę penetrującą pia do pia na głębokość 1 milimetra. Utrzymuj kąt igły penetrującej na poziomie od 5 do 10 stopni w stosunku do powierzchni tkanki.

Po otwarciu pia użyj ramienia X, aby usunąć igłę penetrującą pia z przestrzeni podskórnej. Zwróć uwagę na miejsce, do którego doszło penetrację, za pomocą punktu orientacyjnego, takiego jak naczynie krwionośne. Przesuń ramiona X, Y i Z drugiego manipulatora, aby umieścić końcówkę igły iniekcyjnej załadowanej wirusem AAV9 w miejscu penetracji pia.

Następnie, po wprowadzeniu końcówki igły iniekcyjnej na około 0,5 milimetra w przestrzeń podskórną, użyj ramienia Z, aby podnieść igłę o około 0,3 milimetra, a następnie użyj ramienia X, aby kontynuować przesuwanie igły poziomo w przestrzeń podskórną. Przesuwaj igłę, aż wejdzie w przestrzeń podskórną na głębokości około 2 do 3 milimetrów.

Następnie użyj mikrostrzykawki o pojemności 50 mikrolitrów, aby wstrzyknąć wirusa AAV9-UBI-GFP do przestrzeni subpialnej. Wyjąć igłę do wstrzykiwań z przestrzeni podbrzusznej po zakończeniu wstrzykiwania AAV9-UBI-GFP. Zamknij mięśnie i skórę za pomocą nici fluorowej i klipsów chirurgicznych. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie na poduszce grzewczej przed umieszczeniem w czystej klatce.