Generowanie potworniaków w torebce jądra
7 listopada 2011
Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSCs) mają potencjał do leczenia wielu różnych chorób. Użyteczność tych komórek wynika z faktu, że mogą one różnicować się w każdy typ komórek w organizmie. W niniejszym materiale opisujemy test teratomiowy, który służy do wykazania pluripotencji hPSCs.
Ogólnym celem tej procedury jest ocena pluripotencji poprzez generowanie potworniaków w torebce jądra myszy z niedoborem odporności z wykorzystaniem ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (H PSCs). Należy rozpocząć od pobrania hodowli domniemanych H PSCs, których pluripotencja ma zostać zbadana. Następnie należy przeprowadzić zabieg chirurgiczny w celu odsłonięcia jąder myszy i wstrzyknąć komórki do torebki jądra.
Umieść jądra z powrotem w ich pierwotnym miejscu i chirurgicznie zamknij nacięcie u myszy. Po sześciu do 12 tygodniach zbadaj powstały guz metodą histologiczną w celu stwierdzenia obecności komórek z każdej z warstw zarodkowych. Ostatecznie wyniki mogą wykazać, że linia HPSC jest prawdziwie pluripotencjalna, poprzez wykazanie, że może ona różnicować się w komórki wszystkich trzech warstw zarodkowych u myszy z niedoborem odporności. Choć w ostatnim czasie opisano nowe metody demonstrowania pluripotencjalności ludzkich komórek macierzystych, test teratoma pozostaje złotym standardem w tej dziedzinie, a procedurę tę zaprezentuje tron, starszy technik w moim laboratorium Culture.
Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste należy poddać konfluencji, a następnie dysocjować hPSC za pomocą Accutase. Należy policzyć komórki, aby przygotować zawiesinę zawierającą 1 milion hPSC na jedną iniekcję. Najpierw należy zgolić brzuch znieczulonych, sześciotygodniowych samców myszy szczepu immunokompromitowanego za pomocą trymmera. Przednią ścianę brzucha myszy należy oczyścić roztworem jodyny, zaczynając od centrum brzucha i poruszając się zgodnie z ruchem wskazówek zegara na zewnątrz.
Następnie przemyj ogoloną okolicę 70% ethanol. Powtórz ten proces trzy razy, za każdym razem zmieniając gaziki. Aby przeprowadzić zabieg chirurgiczny, przenieś zwierzę na podkładkę grzewczą wewnątrz sterylnego dygestorium, używając sterylnych nożyczek chirurgicznych.
Wykonaj jednocentymetrowe cięcie podłużne przez skórę i otrzewną tuż poniżej poziomu stawu biodrowego, trzymając otrzewną pęsetą. Sięgnij w stronę prawego biodra drugą parą sterylnych pęset i wyciągnij białą tkankę tłuszczową wraz z przytwierdzonymi jądrami. Następnie napełnij strzykawkę tuberkulinową o pojemności 1 CC hpsc przeznaczonymi do wstrzyknięcia. Powoli wstrzyknij 20 do 30 µL H PSCs do centrum torebki jądra, z dala od głównych naczyń krwionośnych.
Powoli wyjmij igłę za pomocą pęsety, aby zapobiec cofaniu się komórek. Przenieś jądra i tkankę tłuszczową z powrotem na ich pierwotne miejsce w jamie brzusznej. Zamknij otrzewną za pomocą dwóch lub trzech szwów wchłanialnych, a skórę zamknij za pomocą automatycznych klipsów.
Po operacji podawać leki przeciwbólowe dwa razy dziennie w razie potrzeby. Monitorować zwierzę pod kątem wyczuwalnego wzrostu guza w okresie od sześciu do 12 tygodni. Gdy guz osiągnie rozmiar około pięciu milimetrów, usunąć go z uśpionej myszy w celu dokumentacji.
Wykonaj zdjęcie guza i zmierz jego rozmiar oraz wagę. Następnie przetnij guz na małe fragmenty i utrwal w 4% roztworze paraldehydu do badania histopatologicznego. Zazwyczaj teratoma jest obserwowana po sześciu do 12 tygodniach.
W niniejszym przykładzie 1 milion ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych WA 09 wstrzyknięto do torebki jądra myszy z niedoborem odporności. Szczegółowe badanie potworniaka ujawnia heterogeniczność oraz liczne przylegające torbiele. Jest to wynik zgodny z oczekiwaniami.
Analizy histopatologiczne wskazują na obecność komórek z każdej z trzech warstw zarodkowych. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby uwzględnić linię komórkową kontroli pozytywnej o znanej wysokiej potencji, co pozwoli upewnić się, że test został wykonany prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć jasne wyobrażenie o tym, jak określić, czy ludzka linia komórek macierzystych jest pluripotencjalna.
Przegląd
Niniejszy artykuł omawia test teratoma, metodę stosowaną do oceny pluripotencji ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSCs). Badanie polega na wstrzykiwaniu hPSCs do torebki jądra myszy z niedoborem odporności i analizie powstałych teratoma pod kątem różnicowania się w różne typy komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórek macierzystych
- Medycyna regeneracyjna
- Histopatologia
Wprowadzenie
- Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste mogą różnicować się w każdy typ komórek.
- Tworzenie potworniaków jest kluczowym wskaźnikiem pluripotencji.
- Analiza ta jest uważana za złoty standard wykazania pluripotencji.
- Istnieją nowe metody, jednak analiza tworzenia potworniaków pozostaje powszechnie stosowana.
Cel badania
- Wykazanie pluripotencji hPSC poprzez tworzenie potworniaków.
- Przedstawienie szczegółowej metodologii przeprowadzania testu na tworzenie potworniaków.
- Podkreślenie znaczenia zastosowania kontroli pozytywnej w teście.
Zastosowane metody
- Pozyskiwanie hPSC i przygotowanie do iniekcji.
- Chirurgiczne odsłonięcie jądra myszy i iniekcja hPSC.
- Monitorowanie wzrostu guza przez okres od sześciu do dwunastu tygodni.
- Analiza histologiczna potworniaka w celu oceny różnicowania warstw zarodkowych.
Główne wyniki
- Potworniaki powstały od sześciu do dwunastu tygodni po wstrzyknięciu.
- Analiza histopatologiczna potwierdziła obecność komórek z wszystkich trzech listków zarodkowych.
- Wykazano skuteczność testu potworniakowego w ocenie pluripotencji.
- Zastosowano kontrolę pozytywną w celu walidacji wyników testu.
Wnioski
- Test teratoma jest niezawodną metodą potwierdzania pluripotencji hPSC.
- Właściwe techniki chirurgiczne i monitorowanie są kluczowe dla uzyskania pomyślnych wyników.
- Przyszłe badania mogą eksplorować alternatywne metody obok tradycyjnych testów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Test teratoma dostarcza funkcjonalnej oceny pluripotencji, wykazując zdolność do różnicowania w obrębie wszystkich trzech listków zarodkowych in vivo. Badanie to wspiera walidację celu oraz minimalizację ryzyka mechanistycznego we wczesnych etapach opracowywania terapii opartych na komórkach macierzystych. Pozwala ono na uzyskanie wiarygodności prognostycznej w kwestii tożsamości komórkowej przed przejściem do modeli przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Potwierdza pluripotencję poprzez weryfikację różnicowania w kierunku linii ektodermy, mezodermy i endodermy.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje ustandaryzowany model in vivo w celu zredukowania fałszywie dodatnich wyników dotyczących pluripotencji.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podjęcie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) w zakresie przydatności linii komórek macierzystych do rozwoju terapeutycznego.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe wyniki histopatologiczne w zakresie reprezentacji warstw zarodkowych.
- Wartość operacyjna: Ustanawia powtarzalny protokół z wykorzystaniem wstrzykiwania do torebki jądra u myszy z niedoborem odporności.
- Wartość strategiczna: Wspiera standaryzację testów w różnych laboratoriach w celu zapewnienia spójnego badania pluripotencji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Potwierdza potencjał rozwojowy hPSC przed różnicowaniem w kierunku progenitorów specyficznych dla danej linii.
- Wartość operacyjna: Wymaga monitorowania pod kątem tworzenia się guzów oraz analizy histopatologicznej w okresie od 6 do 12 tygodni.
- Wartość strategiczna: Pozwala na dostosowanie ryzyka przy wprowadzaniu linii komórek macierzystych do przedklinicznych badań skuteczności.
Integracja potoku i przepływu pracy
Badanie teratoma pełni funkcję etapu weryfikacyjnego w procesie odkrywania komórek macierzystych, znajdując się pomiędzy utrzymaniem pluripotencji a ukierunkowaną różnicowaniem lub badaniami przedklinicznymi nad skutecznością.
- Biologia odkrywcza: Weryfikacja głównej hipotezy pluripotencji poprzez ocenę zdolności do różnicowania w trzy linie zarodkowe.
- Przesiewy: Wyznaczenie ustandaryzowanych wskaźników tworzenia potworniaków oraz ocena histologiczna w celu porównawczej ewaluacji linii komórkowych.
- Analityka: Uzyskanie wyników specyficznych dla poszczególnych warstw zarodkowych za pomocą histopatologii w celu ilościowego określenia potencjału różnicowania.
- Badania translacyjne: Powiązanie potwierdzenia pluripotencji z późniejszymi procesami różnicowania w celu produkcji komórek istotnych w badaniach nad chorobami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako powtarzalny punkt kontrolny pluripotencji dla wielu linii hPSC w procesie przesiewowym w ramach opracowywania terapii.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w identyfikacji komórek macierzystych poprzez potwierdzenie funkcjonalnej pluripotencji.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne wyniki dzięki zdefiniowanym procedurom chirurgicznym i histologicznym.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez wczesne eliminowanie linii niepluripotencjałych na etapie rozwoju.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację linii komórek macierzystych w oparciu o ryzyko w celu inwestowania w różnicowanie i modelowanie chorób.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w chirurgii gryzoni oraz w technikach sterylnych niezbędnych do wstrzykiwania w torebkę jądra.
- Zależne od dostępu do szczepów myszy z niedoborem odporności oraz zaplecza do monitorowania stanu zwierząt po operacji.
- Wymaga infrastruktury histopatologicznej w celu identyfikacji warstw zarodkowych w przekrojach teratoma.
- Wiąże się z nadzorem etycznym i koniecznością uzyskania zgody IACUC na wykorzystanie zwierząt w testach tumorigeniczności.
- Ograniczone przez ramy czasowe wynoszące 6–12 tygodni, co może spowolnić iteracyjne kampanie przesiewowe.
