Kwantyfikacja aktywności agonistycznej receptorów sprzężonych z białkiem G

Ogólnym celem niniejszej procedury jest oszacowanie względnej stałej powinowactwa KB agonisty do stanu aktywnego receptora poprzez analizę krzywej zależności odpowiedzi od stężenia. Jest to osiągane poprzez uprzedni pomiar krzywych zależności odpowiedzi od stężenia grupy agonistów wywołujących odpowiedź w receptorze sprzężonym z białkiem G. Kolejnym krokiem procedury jest oszacowanie wartości eemax oraz EC 50 agonistów przy użyciu nieliniowej analizy regresji.

Wartości te są następnie wykorzystywane do obliczenia wstępnych szacunków parametrów dla późniejszej nieliniowej analizy regresji z wykorzystaniem modelu operacyjnego. W ostatnim kroku, względne szacunki stałych powinowactwa agonistów do stanu aktywnego receptora są uzyskiwane za pomocą globalnej nieliniowej analizy regresji ich krzywych odpowiedź-stężenie. Ostatecznie, stosując zmodyfikowaną formę modelu operacyjnego, stałą powinowactwa agonisty do stanu aktywnego receptora, wyrażoną względem stałej innego agonisty, można oszacować poprzez globalną nieliniową analizę regresji ich krzywych odpowiedź-stężenie.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie odkrywania leków, takie jak: czy agonista wykazuje selektywność względem konkretnej ścieżki sygnalizacyjnej? Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności ze względu na szczegóły analizy matematycznej. Do szacowania względnych wartości KB agonisty wymagana jest seria co najmniej dwóch krzywych zależności odpowiedzi od stężenia agonisty.

Omówienie kwestii dotyczących takich eksperymentów znajduje się w protokole pisemnym. Po uzyskaniu krzywych odpowiedzi należy odjąć odpowiedź podstawową od odpowiedzi zmierzonej w obecności każdego stężenia agonisty, a następnie zacząć wprowadzać dane z eksperymentów zależności odpowiedzi od stężenia do tabeli danych. W oprogramowaniu Prism wszystkie logarytmiczne stężenia agonistów wprowadza się w kolumnie oznaczonej jako X. Pomiary odpowiedzi dla agonisty, który wykazuje największą odpowiedź maksymalną lub wartość eax, wprowadza się do kolumny A, natomiast dane dla pozostałych agonistów wprowadza się do sąsiednich kolumn oznaczonych literami.

Wprowadź powtórne pomiary krzywych odpowiedzi stężeniowej do podkolumn danej kolumny oznaczonej literą. Wybierz arkusz wykresu, na którym naniesiono dane, a następnie wybierz opcję analizy, aby przeanalizować dane za pomocą nieliniowej analizy regresji z wykorzystaniem równania o zmiennym nachyleniu, ograniczając parametr bottom do zera i przeprowadzając analizę regresji. Zapisz parametry top oraz log EC 50 do wykorzystania w obliczeniach wstępnych szacunków parametrów.

Aby obliczyć wstępne szacunki parametrów, przypisz wartość log tau K obserwowaną do ujemnej wartości log EC 50 standardowego agonisty. Następnie oblicz wartość log RAI dla każdego badanego agonisty jako logarytm wielkości stanowiącej iloczyn wartości eemax badanego agonisty i EC 50 standardowego agonisty, podzielony przez iloczyn wartości emax standardowego agonisty i EEC 50 badanego agonisty. W tym równaniu parametry standardowego agonisty oznaczone są apostrofem.

Następnie przypisz logarytm stałej powinowactwa testowanego agonisty do ujemnego logarytmu ich odpowiednich wartości EC. Po wprowadzeniu danych do programu Prism upewnij się, że dane dla agonisty o największej wartości EMAX zostały wprowadzone do kolumny A. Agonista ten zostaje teraz wyznaczony jako standard, natomiast pozostałe agoniści zostają określeni jako agoniści testowi. Następnie wprowadź do programu Prism zdefiniowane przez użytkownika równanie log, RAI w kilku liniach.

W tym przypadku równanie zdefiniowane przez użytkownika obejmuje łącznie pięciu agonistów. Wprowadź początkowe wartości parametrów dla receptora R oraz stałe powinowactwa badanych agonistów. M sis otrzymuje wartość EMAX standardowego agonisty, a M otrzymuje wartość jeden.

Następnie wprowadź wstępne szacunki parametrów dla wartości log RAI badanych agonistów. Zastosuj ograniczenia parametrów, przypisując wartość zero do log K1 oraz ustawiając wspólną wartość dla log GR, m, sis i M dla wszystkich zestawów danych. Następnie uruchom nieliniową analizę regresji.

Wyniki pozwalają na uzyskanie wartości log K obserwowanego oraz log RAI dla badanych agonistów w celu oszacowania wartości KB agonistów w bezwzględnych jednostkach odwrotności molowej; wykorzystuje się do tego testy vitro w układach komórkowych wykazujących konstytutywną aktywność receptora. Należy dobrać agonisty i zaprojektować eksperyment zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Oblicz aktywność konstytutywną receptora oraz odpowiedź na każdą koncentrację agonisty jako różnicę między odpowiedzią zmierzoną a odpowiedzią podstawową w komórkach nietransfekowanych receptorem; tutaj przedstawiono odpowiedzi na różne agonisty obliczone w ten sposób dla szlaku sygnalizacyjnego wykazującego bardzo niską aktywność konstytutywną w analizie wstępnej.

W pierwszej kolejności wprowadź dane do programu Prism zgodnie z opisem dla aktywności niekonstytutywnej. Zatwierdź. Wprowadź również odpowiedź wywołaną przez konstytutywną aktywność receptora w odpowiednich kolumnach literowych w wierszu odpowiadającym stężeniu agonisty log -20. W tym celu wprowadzono dużą wartość ujemnego logarytmu, aby przybliżyć stężenie agonisty do zera.

Przeanalizuj dane w ten sam sposób co wcześniej, z wyjątkiem tego, że dla aktywności konstytutywnej parametr bottom powinien zostać ograniczony tak, aby był wspólny dla wszystkich zestawów danych. Zapisz wspólny parametr oraz parametry top i log EC dla każdego agonisty. Po wyznaczeniu stałej powinowactwa log dla agonisty standardowego w oddzielnych eksperymentach, oblicz wstępną szacunkową wartość log K obserwowane dla każdego testowanego agonisty częściowego jako logarytm wyrażenia składającego się z różnicy między wartością emax agonisty standardowego a agonisty testowanego, podzielonej przez iloczyn EC 50 oraz różnicy między wartością eemax agonisty standardowego a odpowiedzią konstytutywną.

Oblicz wstępną wartość log KB dla każdego agonisty oraz wstępną wartość log T cis w celu oszacowania wartości KB agonistów. Wprowadź dane do programu Prism, a następnie wprowadź zdefiniowane przez użytkownika równanie. Wartości log KB wprowadź do programu Prism w kilku liniach, zgodnie z przykładem przedstawionym tutaj dla warunków z dwoma agonistami.

Następnie wprowadź wstępne szacunki parametrów, podając wartości powinowactwa każdego agonisty. Szacunkowa wartość log T sis, szacunkowa wartość M sis i wartość M; dla M sis przypisz wartość EMAX standardowego agonisty, a dla M przypisz wartość jeden. Na koniec wprowadź wstępne szacunki log kb.

Zastosuj ograniczenia parametrów, ograniczając log K1 do jego wcześniej wyznaczonej wartości oraz ustawiając log Tsis, msis i M na wspólną wartość dla wszystkich zestawów danych. Uruchom nieliniową analizę regresji. Wyniki pozwolą na uzyskanie wartości log KB standardowego agonisty, log K obserwowanego oraz wartości log KB agonistów częściowych.

Maksymalna odpowiedź układu, wartość log T cys dla wolnego kompleksu receptora oraz współczynnik nachylenia przetwornika w modelu operacyjnym przedstawionym tutaj to indukowana agonistami muskarynowymi hydroliza fosfoinozytydów w komórkach jajnika chomika syryjskiego, stabilnie wykazujących ekspresję receptora muskarynowego M3. W tym teście zmierzono krzywe zależność odpowiedzi od stężenia wybranych agonistów muskarynowych, a dane przeanalizowano zgodnie z opisem, aby oszacować wartość KB każdego agonisty wyrażoną w stosunku do wartości dla Oxo Tremaine M. Krzywe teoretyczne reprezentują dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów równania regresji do danych. Estymacje log RAI przedstawiono dla kabale, a recline, pilokarpyny i McNeil.

A 3, 4 3. Wyznaczono odpowiadające im szacunki maksymalnej odpowiedzi układu oraz współczynnika nachylenia przetwornika. Wyznaczono również wartości log K dla każdego z przedstawionych agonistów.

Poniżej przedstawiono wyniki eksperymentów dotyczących stymulowanej agonistą muskarynowym hydrolizy fosfoinozytydów w komórkach HC 2 93. U stabilnie wykazujących ekspresję G alpha 15, przejściowa ekspresja receptora muskarynowego M three spowodowała wzrost podstawowej hydrolizy fosfoinozytydów, co przypisano konstytutywnej aktywności receptora. Dane przeanalizowano w celu oszacowania wartości log KB dla Oxo Tremaine M oraz MacNeil, A 3 43.

Krzywe teoretyczne reprezentują dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów równania regresji do danych. Przedstawiono wartości szacunkowe log KB dla Oxo Tremoring M oraz McNeil, A 3 43. Wyznaczono również wartość szacunkową K observed dla McNeil A 3 43.

Po opanowaniu ta technika analizy danych może zostać wykonana w ciągu kilku minut, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak szacować zarówno względne, jak i rzeczywiste wartości KB na podstawie krzywych odpowiedzi stężeniowej agonistów wywołujących odpowiedź w dalszej części szlaku sygnałowego receptora sprzężonego z białkiem G.