Name: Kwantyfikacja aktywności agonistycznej w receptorach sprzężonych z białkiem G (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Poznaj metodę szacowania stałej powinowactwa Kb agonistów dla aktywnego stanu receptorów sprzężonych z białkiem G poprzez analizę krzywych odpowiedzi stężeniowej. Ta technika wspiera odkrywanie leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była finansowana z grantu National Institutes of Health nr GM 69829.

<ol><li>Stephenson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modification+of+receptor+theory%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A modification of receptor theory.</a> British Journal of Pharmacology. 11, 379-393 (1956).</li>
<li>Furchgott, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+b-haloalkylamines+in+the+differentiation+of+receptors+and+in+the+determination+of+dissociation+constants+of+receptor-agonist+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Drug+Research%22%5BJournal%5D)">The use of b-haloalkylamines in the differentiation of receptors and in the determination of dissociation constants of receptor-agonist complexes.</a> Advances in Drug Research. 3, 21-55 (1966).</li>
<li>Ehlert, F. J., Suga, H., Griffin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+agonism+and+inverse+agonism+in+functional+assays+with+constitutive+activity%3A+Estimation+of+orthosteric+ligand+affinity+constants+for+active+and+inactive+receptor+states%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Analysis of agonism and inverse agonism in functional assays with constitutive activity: Estimation of orthosteric ligand affinity constants for active and inactive receptor states.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 33, 671-686 (2011).</li>
<li>Griffin, M. T., Figueroa, K. W., Liller, S., Ehlert, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+Agonist+Activity+at+G+Protein-Coupled+Receptors%3A+Analysis+of+M2+Muscarinic+Receptor+Signaling+through+Gi%2Fo%2CGs%2C+and+G15%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Estimation of Agonist Activity at G Protein-Coupled Receptors: Analysis of M2 Muscarinic Receptor Signaling through Gi/o,Gs, and G15.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 321, 1193-1207 (2007).</li>
<li>Black, J. W., Leff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operational+models+of+pharmacological+agonism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+LondonSeries+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Operational models of pharmacological agonism.</a> Proceedings of the Royal Society of LondonSeries B: Biological Sciences. 220, 141-162 (1983).</li>
<li>Tran, J. A., Chang, A., Matsui, M., Ehlert, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+relative+microscopic+affinity+constants+of+agonists+for+the+active+state+of+the+receptor+in+functional+studies+on+M2+and+M3+muscarinic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Estimation of relative microscopic affinity constants of agonists for the active state of the receptor in functional studies on M2 and M3 muscarinic receptors.</a> Mol. Pharmacol. 75, 381-396 (2009).</li>
<li>Schultz, J., Hamprecht, B., Daly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+adenosine+3%27%3A5%27-cyclic+monophosphate+in+clonal+glial+cells%3A+labeling+of+intracellular+adenine+nucleotides+with+radioactive+adenine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Accumulation of adenosine 3':5'-cyclic monophosphate in clonal glial cells: labeling of intracellular adenine nucleotides with radioactive adenine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1266-1270 (1972).</li>
<li>Berridge, M. J., Downes, C. P., Hanley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium+amplifies+agonist-dependent+phosphatidylinositol+responses+in+brain+and+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Lithium amplifies agonist-dependent phosphatidylinositol responses in brain and salivary glands.</a> Biochemical Journal. 206, 587-595 (1982).</li>
<li>Kendall, D. A., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKendall%2C+DA+%22Methods+in+Neurotransmitter+Receptor+Analysis%22">Methods in Neurotransmitter Receptor Analysis</a>. , Raven Press. Yamamura, H.I. 68-87 (1990).</li>
<li>Pulido-Rios, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitro+Isolated+Tissue+Functional+Muscarinic+Receptor+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Vitro Isolated Tissue Functional Muscarinic Receptor Assays.</a> Current Protocols in Pharmacology. 48, 4-15 (2010).</li>
<li>Kenakin, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKenakin%2C+T+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22">Current Protocols in Pharmacology</a>. Enna, S. J. , John Wiley & Sons. (2001).</li>
<li>Ehlert, F. J., Griffin, M. T., Sawyer, G. W., Bailon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((simple+method+for+estimation+of+agonist+activity+at+receptor+subtypes%3A+comparison+of+native+and+cloned+M3+muscarinic+receptors+in+guinea+pig+ileum+and+transfected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">simple method for estimation of agonist activity at receptor subtypes: comparison of native and cloned M3 muscarinic receptors in guinea pig ileum and transfected cells.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 289, 981-992 (1999).</li>
<li>Burstein, E. S., Spalding, T. A., Brann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacology+of+muscarinic+receptor+subtypes+constitutively+activated+by+G+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pharmacology of muscarinic receptor subtypes constitutively activated by G proteins.</a> Mol. Pharmacol. 51, 312-319 (1997).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Ponieważ nasza metoda szacowania RAi (względna wartość Kb) wymaga jedynie pomiaru krzywych zależności odpowiedzi od stężenia agonisty, nasza analiza może zostać przeprowadzona w dowolnym momencie, gdy krzywe te są mierzone.
Jeśli dobowa zmienność odpowiedzi preparatu eksperymentalnego (np. komórek lub tkanki) jest duża, pomiary odpowiedzi każdej krzywej zależności dawka-odpowiedź można znormalizować względem szacunkowej wartości „Top” standardowego agoni...

kwantyfikacja aktywności agonistycznej receptorów sprzężonych z białkiem g

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

Gdy agonista aktywuje populację receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), wywołuje on ścieżkę sygnalizacyjną, która kończy się odpowiedzią komórki lub tkanki. Proces ten można analizować na poziomie pojedynczego receptora, populacji receptorów lub odpowiedzi efektorowej. W niniejszej pracy opisujemy, jak analizować odpowiedź efektorową w celu uzyskania szacunkowej wartości stałej powinowactwa agonisty do stanu aktywnego pojedynczych receptorów.
Receptory zachowują się jak przełączniki kwantowe, które zmieniają swój stan między aktywnym a nieaktywnym (Rycina 1). Stan aktywny wchodzi w interakcje ze specyficznymi białkami G lub innymi partnerami sygnalizacyjnymi. Wobec braku ligandów przeważa stan nieaktywny. Wiązanie agonisty zwiększa prawdopodobieństwo przejścia receptora w stan aktywny, ponieważ jego stała powinowactwa do stanu aktywnego (Kb) jest znacznie większa niż do stanu nieaktywnego (Ka). Sumowanie losowych sygnałów wyjściowych wszystkich receptorów w danej populacji daje stały poziom aktywacji receptorów w czasie. Odwrotność stężenia agonisty wywołującego połowową maksymalną aktywację receptorów jest równoważna obserwowanej stałej powinowactwa (Kobs), a frakcja kompleksów agonista-receptor w stanie aktywnym jest definiowana jako skuteczność (ε) (Rycina 2).
Opracowano metody analizy odpowiedzi efektorowych GPCR, które umożliwiają oszacowanie Kobs oraz względnej skuteczności agonisty 1,2. W niniejszym raporcie pokazujemy, jak zmodyfikować tę analizę w celu oszacowania wartości Kb agonisty względem innego agonisty. W przypadku testów wykazujących aktywność konstytutywną pokazujemy, jak oszacować Kb w bezwzględnych jednostkach M-1.
Nasza metoda analizy krzywych zależności odpowiedzi od stężenia agonisty 3,4 polega na globalnej regresji nieliniowej z wykorzystaniem modelu operacyjnego 5. Opisujemy procedurę z użyciem aplikacji oprogramowania Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Analiza pozwala na oszacowanie iloczynu Kobs oraz parametru proporcjonalnego do skuteczności (τ). Iloraz oszacowania τKobs jednego agonisty i drugiego stanowi wzglomną miarę Kb (RAi) 6. W przypadku każdego receptora wykazującego aktywność konstytutywną możliwe jest oszacowanie parametru proporcjonalnego do skuteczności wolnego kompleksu receptorowego (τsys). W takim przypadku wartość Kb agonisty jest równoważna τKobs/τsys 3.
Nasza metoda jest użyteczna do określania selektywności agonisty względem podtypów receptorów oraz do ilościowego pomiaru sygnalizacji agonista-receptor poprzez różne białka G.

Opisano metodę szacowania stałej powinowactwa agonisty do stanu aktywnego (Kb) receptora sprzężonego z białkiem G. Analiza dostarcza bezwzględnych lub względnych wartości Kb w zależności od tego, czy konstytutywna aktywacja receptora jest mierzalna. Nasza metoda ma zastosowanie do różnych odpowiedzi występujących w kaskadzie sygnałowej po aktywacji receptora.

Kwantyfikacja aktywności agonistycznej receptorów sprzężonych z białkiem G

Kiedy agonista aktywuje populację receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), wywołuje on ścieżkę sygnalizacyjną, która kończy się odpowiedzią komórki ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest oszacowanie względnej stałej powinowactwa KB agonisty do stanu aktywnego receptora poprzez analizę krzywej zależności odpowiedzi od stężenia. Jest to osiągane poprzez uprzedni pomiar krzywych zależności odpowiedzi od stężenia grupy agonistów wywołujących odpowiedź w receptorze sprzężonym z białkiem G. Kolejnym krokiem procedury jest oszacowanie wartości eemax oraz EC 50 agonistów przy użyciu nieliniowej analizy regresji.Wartości te są następnie wykorzystywane do obliczenia wstępnych szacunków parametrów dla późniejszej nieliniowej analizy regresji z wykorzystaniem modelu operacyjnego. W ostatnim kroku, względne szacunki stałych powinowactwa agonistów do stanu aktywnego receptora są uzyskiwane za pomocą globalnej nieliniowej analizy regresji ich krzywych odpowiedź-stężenie. Ostatecznie, stosując zmodyfikowaną formę modelu operacyjnego, stałą powinowactwa agonisty do stanu aktywnego receptora, wyrażoną względem stałej innego agonisty, można oszacować poprzez globalną nieliniową analizę regresji ich krzywych odpowiedź-stężenie.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie odkrywania leków, takie jak: czy agonista wykazuje selektywność względem konkretnej ścieżki sygnalizacyjnej? Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności ze względu na szczegóły analizy matematycznej. Do szacowania względnych wartości KB agonisty wymagana jest seria co najmniej dwóch krzywych zależności odpowiedzi od stężenia agonisty.Omówienie kwestii dotyczących takich eksperymentów znajduje się w protokole pisemnym. Po uzyskaniu krzywych odpowiedzi należy odjąć odpowiedź podstawową od odpowiedzi zmierzonej w obecności każdego stężenia agonisty, a następnie zacząć wprowadzać dane z eksperymentów zależności odpowiedzi od stężenia do tabeli danych. W oprogramowaniu Prism wszystkie logarytmiczne stężenia agonistów wprowadza się w kolumnie oznaczonej jako X. Pomiary odpowiedzi dla agonisty, który wykazuje największą odpowiedź maksymalną lub wartość eax, wprowadza się do kolumny A, natomiast dane dla pozostałych agonistów wprowadza się do sąsiednich kolumn oznaczonych literami.Wprowadź powtórne pomiary krzywych odpowiedzi stężeniowej do podkolumn danej kolumny oznaczonej literą. Wybierz arkusz wykresu, na którym naniesiono dane, a następnie wybierz opcję analizy, aby przeanalizować dane za pomocą nieliniowej analizy regresji z wykorzystaniem równania o zmiennym nachyleniu, ograniczając parametr bottom do zera i przeprowadzając analizę regresji. Zapisz parametry top oraz log EC 50 do wykorzystania w obliczeniach wstępnych szacunków parametrów.Aby obliczyć wstępne szacunki parametrów, przypisz wartość log tau K obserwowaną do ujemnej wartości log EC 50 standardowego agonisty. Następnie oblicz wartość log RAI dla każdego badanego agonisty jako logarytm wielkości stanowiącej iloczyn wartości eemax badanego agonisty i EC 50 standardowego agonisty, podzielony przez iloczyn wartości emax standardowego agonisty i EEC 50 badanego agonisty. W tym równaniu parametry standardowego agonisty oznaczone są apostrofem.Następnie przypisz logarytm stałej powinowactwa testowanego agonisty do ujemnego logarytmu ich odpowiednich wartości EC. Po wprowadzeniu danych do programu Prism upewnij się, że dane dla agonisty o największej wartości EMAX zostały wprowadzone do kolumny A. Agonista ten zostaje teraz wyznaczony jako standard, natomiast pozostałe agoniści zostają określeni jako agoniści testowi. Następnie wprowadź do programu Prism zdefiniowane przez użytkownika równanie log, RAI w kilku liniach.W tym przypadku równanie zdefiniowane przez użytkownika obejmuje łącznie pięciu agonistów. Wprowadź początkowe wartości parametrów dla receptora R oraz stałe powinowactwa badanych agonistów. M sis otrzymuje wartość EMAX standardowego agonisty, a M otrzymuje wartość jeden.Następnie wprowadź wstępne szacunki parametrów dla wartości log RAI badanych agonistów. Zastosuj ograniczenia parametrów, przypisując wartość zero do log K1 oraz ustawiając wspólną wartość dla log GR, m, sis i M dla wszystkich zestawów danych. Następnie uruchom nieliniową analizę regresji.Wyniki pozwalają na uzyskanie wartości log K obserwowanego oraz log RAI dla badanych agonistów w celu oszacowania wartości KB agonistów w bezwzględnych jednostkach odwrotności molowej; wykorzystuje się do tego testy vitro w układach komórkowych wykazujących konstytutywną aktywność receptora. Należy dobrać agonisty i zaprojektować eksperyment zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Oblicz aktywność konstytutywną receptora oraz odpowiedź na każdą koncentrację agonisty jako różnicę między odpowiedzią zmierzoną a odpowiedzią podstawową w komórkach nietransfekowanych receptorem; tutaj przedstawiono odpowiedzi na różne agonisty obliczone w ten sposób dla szlaku sygnalizacyjnego wykazującego bardzo niską aktywność konstytutywną w analizie wstępnej.W pierwszej kolejności wprowadź dane do programu Prism zgodnie z opisem dla aktywności niekonstytutywnej. Zatwierdź. Wprowadź również odpowiedź wywołaną przez konstytutywną aktywność receptora w odpowiednich kolumnach literowych w wierszu odpowiadającym stężeniu agonisty log -20. W tym celu wprowadzono dużą wartość ujemnego logarytmu, aby przybliżyć stężenie agonisty do zera.Przeanalizuj dane w ten sam sposób co wcześniej, z wyjątkiem tego, że dla aktywności konstytutywnej parametr bottom powinien zostać ograniczony tak, aby był wspólny dla wszystkich zestawów danych. Zapisz wspólny parametr oraz parametry top i log EC dla każdego agonisty. Po wyznaczeniu stałej powinowactwa log dla agonisty standardowego w oddzielnych eksperymentach, oblicz wstępną szacunkową wartość log K obserwowane dla każdego testowanego agonisty częściowego jako logarytm wyrażenia składającego się z różnicy między wartością emax agonisty standardowego a agonisty testowanego, podzielonej przez iloczyn EC 50 oraz różnicy między wartością eemax agonisty standardowego a odpowiedzią konstytutywną.Oblicz wstępną wartość log KB dla każdego agonisty oraz wstępną wartość log T cis w celu oszacowania wartości KB agonistów. Wprowadź dane do programu Prism, a następnie wprowadź zdefiniowane przez użytkownika równanie. Wartości log KB wprowadź do programu Prism w kilku liniach, zgodnie z przykładem przedstawionym tutaj dla warunków z dwoma agonistami.Następnie wprowadź wstępne szacunki parametrów, podając wartości powinowactwa każdego agonisty. Szacunkowa wartość log T sis, szacunkowa wartość M sis i wartość M; dla M sis przypisz wartość EMAX standardowego agonisty, a dla M przypisz wartość jeden. Na koniec wprowadź wstępne szacunki log kb.Zastosuj ograniczenia parametrów, ograniczając log K1 do jego wcześniej wyznaczonej wartości oraz ustawiając log Tsis, msis i M na wspólną wartość dla wszystkich zestawów danych. Uruchom nieliniową analizę regresji. Wyniki pozwolą na uzyskanie wartości log KB standardowego agonisty, log K obserwowanego oraz wartości log KB agonistów częściowych.Maksymalna odpowiedź układu, wartość log T cys dla wolnego kompleksu receptora oraz współczynnik nachylenia przetwornika w modelu operacyjnym przedstawionym tutaj to indukowana agonistami muskarynowymi hydroliza fosfoinozytydów w komórkach jajnika chomika syryjskiego, stabilnie wykazujących ekspresję receptora muskarynowego M3. W tym teście zmierzono krzywe zależność odpowiedzi od stężenia wybranych agonistów muskarynowych, a dane przeanalizowano zgodnie z opisem, aby oszacować wartość KB każdego agonisty wyrażoną w stosunku do wartości dla Oxo Tremaine M. Krzywe teoretyczne reprezentują dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów równania regresji do danych. Estymacje log RAI przedstawiono dla kabale, a recline, pilokarpyny i McNeil.A 3, 4 3. Wyznaczono odpowiadające im szacunki maksymalnej odpowiedzi układu oraz współczynnika nachylenia przetwornika. Wyznaczono również wartości log K dla każdego z przedstawionych agonistów.Poniżej przedstawiono wyniki eksperymentów dotyczących stymulowanej agonistą muskarynowym hydrolizy fosfoinozytydów w komórkach HC 2 93. U stabilnie wykazujących ekspresję G alpha 15, przejściowa ekspresja receptora muskarynowego M three spowodowała wzrost podstawowej hydrolizy fosfoinozytydów, co przypisano konstytutywnej aktywności receptora. Dane przeanalizowano w celu oszacowania wartości log KB dla Oxo Tremaine M oraz MacNeil, A 3 43.Krzywe teoretyczne reprezentują dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów równania regresji do danych. Przedstawiono wartości szacunkowe log KB dla Oxo Tremoring M oraz McNeil, A 3 43. Wyznaczono również wartość szacunkową K observed dla McNeil A 3 43.Po opanowaniu ta technika analizy danych może zostać wykonana w ciągu kilku minut, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak szacować zarówno względne, jak i rzeczywiste wartości KB na podstawie krzywych odpowiedzi stężeniowej agonistów wywołujących odpowiedź w dalszej części szlaku sygnałowego receptora sprzężonego z białkiem G.

quantifying-agonist-activity-at-g-protein-coupled-receptors

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Określenie aktywności agonistów w przypadku receptorów sprzężonych z białkiem G

Uporczywa aktywacja hamujących receptorów sprzężonych z białkiem G powoduje uwrażliwienie na sygnalizację cyklazy adenylowej. Aby zidentyfikować podstawowe szlaki molekularne, konieczne jest bezstronne podejście; jednak strategia ta wymaga opracowania skalowalnego testu uczulającego na cAMP opartego na komórkach. W niniejszym artykule opisujemy test uczulający do badań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA.

Uwrażliwienie cyklazy adenylowej na leki: usprawnienie i miniaturyzacja testów do zastosowań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA

Opisany tutaj test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji jest średnioprzepustowym systemem badań przesiewowych farmakologii odwrotnej do identyfikacji funkcjonalnie aktywujących ligandów sierocych receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR).

Charakterystyka receptorów sprzężonych z białkiem G za pomocą testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji

Wiązanie trifosforanu guanozyny (GTP) jest jednym z najwcześniejszych zdarzeń aktywacji receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR). Protokół ten opisuje, jak farmakologicznie scharakteryzować specyficzne interakcje GPCR-ligand poprzez monitorowanie wiązania znakowanego radioaktywnie analogu GTP, [35S]guanozyno-5'-O-(3-tio)trifosforanu ([35S]GTPγS), w odpowiedzi na interesujący ligand.

Pomiar sygnalizacji receptora sprzężonego z białkiem G poprzez znakowane radioaktywnie wiązanie GTP

Opisany test komórkowy jest przeznaczony do identyfikacji czynników oddziałujących z receptorem chemokiny 4 (CXCR4) CXC, które hamują lub stymulują, konkurencyjnie lub allosterycznie, wewnątrzkomórkowe uwalnianie Ca2+ zainicjowane przez aktywację CXCR4.

Test mobilizacji Ca2 + oparty na fluorescencji kinetycznej w celu identyfikacji agonistów, antagonistów i modulatorów allosterycznych sprzężonych z białkiem G

Tutaj prezentujemy protokoły odkrywania związków aktywnych w receptorach GABAA, od wiązania po fizjologię i farmakologię.

Metody odkrywania nowych związków modulujących neuroprzekaźnictwo receptora kwasu gamma-aminomasłowego typu A

Ten protokół demonstruje rejestrowanie w czasie rzeczywistym pełnych zależności dawka-odpowiedź dla indukowanej przez agonistę aktywacji GPCR z pojedynczej warstwy komórki hodowanej na pojedynczej mikroelektrodzie przy użyciu pomiarów impedancji bez znaczników. Nowy schemat dozowania znacznie zwiększa przepustowość bez utraty rozdzielczości czasowej.

Protokół stopniowego dozowania w celu zwiększenia przepustowości w bezznacznikowych testach GPCR opartych na impedancji

Biorąc pod uwagę, że GPCR są atrakcyjnymi celami dla leków, badania przesiewowe ligandów GPCR są niezbędne do identyfikacji związków ołowiowych i badań nad desierotyzacją. W ramach tych wysiłków opisujemy PRESTO-Tango, platformę zasobów typu open source wykorzystywaną do jednoczesnego profilowania przejściowej rekrutacji β-arrestin2 przy około 300 GPCR przy użyciu testu reporterowego opartego na TEV.

Równoległe przesłuchanie rekrutacji β-Arrestin2 do badań przesiewowych ligandów w skali GPCR przy użyciu testu PRESTO-Tango

W tej pracy opisano wysokoprzepustowy, wewnątrzkomórkowy test fluorescencji wapnia dla 384-dołkowych płytek do badania bibliotek małych cząsteczek na rekombinowanych receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR). Cel, receptor kininowy kleszcza pomoru bydła, Rhipicephalus microplus, ulega ekspresji w komórkach CHO-K1. Ten test identyfikuje agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek w jednym teście "podwójnej addycji".

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

Opracowano ulepszony protokół testu mobilizacji wapnia z komórkami śródbłonka, używanego do identyfikacji ligandów receptorów aktywowanych proteazą (PAR). Nowy protokół skraca całkowity czas oznaczania o 90-120 minut i pozwala uzyskać powtarzalne krzywe stężenie-odpowiedź.

Charakterystyka modulatorów receptorów aktywowanych proteazą za pomocą testu mobilizacji wapnia za pomocą czytnika płytek

Protokół ten opisuje wykorzystanie biosensorów opartych na BRET do pomiaru aktywacji białka G w czasie rzeczywistym w żywych komórkach HEK293 po stymulacji ligandów sprzężonych z białkiem G. Tutaj receptor β2-adrenergiczny oraz receptor kannabinoidowy typu 1 służą jako przykłady do wykazania efektywności czujników dla kilku podtypów białek G oraz w różnych GPCR.

Biosensory białka G oparte na BRET do pomiaru aktywności receptorów sprzężonych z białkiem G w komórkach żywych

Poznaj metodę szacowania stałej powinowactwa Kb agonistów dla aktywnego stanu receptorów sprzężonych z białkiem G poprzez analizę krzywych odpowiedzi stężeniowej. Ta technika wspiera odkrywanie leków.

Kwantyfikacja aktywności agonistycznej receptorów sprzężonych z białkiem G

Przeglądaj więcej filmów