donosowe podawanie siRNA do mózgu myszy za pomocą urządzenia pozycjonującego

Zacznij od znieczulonych myszy umieszczonych na urządzeniu pozycjonującym plecami równolegle do oparcia krzesła i prostopadle do siedzenia.

Myszy są ustawione w pozycji z głową w dół i do przodu i zabezpieczone za pomocą pasów krzeseł.

Używając mikropipety wypełnionej ukierunkowanym na neurony kompleksem peptyd-siRNA, umieść kroplę w pobliżu jednego nozdrza, pozwalając myszy na naturalne wdychanie roztworu.

Podczas inhalacji delikatnie dociśnij głowę myszy w dół, aby zapobiec przedostawaniu się roztworu do płuc.

Zrób krótką przerwę, a następnie powtórz podanie do drugiego nozdrza.

Powtórz procedurę dla pozostałych myszy.

Kompleks przenika przez błonę śluzową nosa, skąd dostaje się do nerwu węchowego i trójdzielnego i przechodzi przez nie, aby dotrzeć do mózgu.

Wewnątrz mózgu kompleks wiąże się z receptorami neuronalnymi, ulega endocytozie i ułatwia wewnątrzkomórkowe dostarczanie siRNA.

SiRNA staje się częścią kompleksu RISC, który po związaniu się z docelowym mRNA indukuje wyciszanie genów.

Aby rozpocząć tę procedurę, oceń poziom znieczulenia odruchu dwunożnego myszy w celu utrzymania płaszczyzny operacyjnej. Następnie umieść urządzenie pozycjonujące w odpowiedniej odległości i na odpowiedniej wysokości, aby umożliwić wygodny dostęp do wszystkich wymaganych odczynników.

Następnie nałóż maść na oczy zwierzęcia. Przypnij jedną mysz pasami krzesła, upewniając się, że przednie kończyny myszy zapewniają naturalne wsparcie, gdy jest w zrelaksowanej pozycji bez żadnego dyskomfortu. Powtórz procedury dla pozostałych myszy. Delikatnie umieść każdą mysz na wyznaczonym krześle, kładąc jej plecy równolegle do podparcia oparcia krzesła i pod kątem 90 stopni do siedziska krzesła.

Pozwól zwierzęciu leżeć naturalnie w pozycji głowy w dół i do przodu, bez pchania ani naciskania. Gdy wszystkie myszy zostaną przypięte, natychmiast rozpocznij inokulację donosową. Aby wykonać podanie donosowe, należy załadować mikropipetę 2 mikrolitrami roztworu kompleksu RVG9R-siRNA. Trzymaj pipetę w ręce dominującej, a drugą ręką podpieraj ją, aby uniknąć niekontrolowanych ruchów podczas podawania siRNA.

Umieść około 2-mikrolitrową kroplę bardzo blisko jednego nozdrza, aby mysz mogła ją bezpośrednio wdychać. Jeśli niewielka kropla nie jest łatwa do uformowania, wymień końcówkę pipety na nową i powtórz operację. Delikatnie popchnij głowę myszy palcem wskazującym w dół przez 5 sekund podczas wdechu i utrzymaj pozycję.

Aby zapobiec wyciekowi leku do płuc, ważne jest, aby lekko popchnąć głowę myszy palcem wskazującym w dół przez 5 sekund podczas wdechu myszy.

Uruchom stoper, aby odmierzyć czas trzy do czterech minut po tym, aby wprowadzić czas inokulacji do drugiego węzła pierwszej myszy. Ten odstęp czasu jest niezbędny, aby mysz zakończyła inhalację pierwszej dawki i przywróciła normalne oddychanie. W trzy- lub czterominutowym odstępie czasu między inokulacją naprzemiennych nozdrzy u pierwszej myszy, należy wykonać całkowitą inokulację donosową jednego nozdrza każdej z pozostałych trzech myszy umieszczonych na urządzeniu.

Gdy zabrzmi stoper, zaszczepij drugie nozdrze u pierwszej myszy i powtórz procedurę dla pozostałych myszy, jak powyżej. Powtarzaj procedurę, aż 20 do 30 mikrolitrów zostanie dostarczonych dla wszystkich czterech myszy. Zakończenie całej procedury inokulacji zajmie około 30 do 45 minut. Zwróć zwierzęta z powrotem do wyznaczonych klatek. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności, aby utrzymać leżący mostek.