JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:25 min • August 7th, 2025
Weźmy mikrowstrzykiwacz z mikroigłą zawierającą wysoce wydajny transport wsteczny lub wektor wirusowy HiRet.
Glikoproteiny w otoczce wirusa HiRet ułatwiają jego wnikanie do neuronów za pośrednictwem synaps. Wirus jest również nosicielem genu kodującego białko fluorescencyjne.
Weź znieczulonego szczura z odsłoniętym lędźwiowym rdzeniem kręgowym od 1 do 4.
Używając linii środkowej rdzenia kręgowego jako punktu odniesienia, umieść igłę powyżej miejsca wstrzyknięcia.
Opuść igłę do rdzenia kręgowego.
Rozpocznij podawanie wirusa w kontrolowanym tempie.
Należy odczekać wystarczająco dużo czasu na dyfuzję wirusa przed wyjęciem igły.
Receptory neuronalne wiążą się z glikoproteinami wirusa, ułatwiając wnikanie wirusa przez synapsę i transport przez akson do somy, proces zwany transportem wstecznym.
Gen wirusa integruje się z genomem gospodarza, umożliwiając ekspresję białek fluorescencyjnych.
Wirusy te przemieszczają się również przez połączone neurony, umożliwiając śledzenie ścieżek neuronalnych.
Umieść igłę na linii środkowej rdzenia kręgowego i użyj skali noniusza na mikromanipulatorze, aby skierować igłę na boki o 0,8 milimetra. Następnie opuść igłę do rdzenia kręgowego, aż zacznie się wcinać, ale nie przebija opony twardej. I szybkim ruchem obrotowym nakłuj oponę twardą igłą, aż końcówka igły zanurzy się na głębokość 1,5 milimetra.
Po umieszczeniu igły na miejscu zaprogramuj wstrzykiwacz tak, aby dostarczał wirusa z szybkością 400 nanolitrów na minutę i potwierdź, że wirus dostaje się do rdzenia kręgowego, obserwując postęp frontu barwnika. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy pozostawić igłę w rdzeniu kręgowym na dwie do pięciu minut, aby ułatwić dyfuzję wirusa, a następnie powoli wycofać igłę w celu umieszczenia w następnym miejscu wstrzyknięcia.