Transfekcja zwojów korzenia grzbietowego myszy za pośrednictwem elektroporacji w celu wspomagania regeneracji aksonów czuciowych

Weźmy znieczuloną mysz z odsłoniętymi zwojami korzenia grzbietowego L4 i L5 zawierającymi ciała komórek neuronów czuciowych.

Załaduj pipetę do mikroiniekcji znakowanymi fluoroforem konstruktami RNA, które regulują regenerację aksonów, oraz barwnikiem znacznikowym.

Wstrzyknąć mieszaninę do DRG.

Za pomocą elektrod elektroporacyjnych przyłóż impulsy elektryczne do DRG.

Powoduje to rozerwanie błon ciał komórkowych neuronów czuciowych, tworząc pory, które umożliwiają konstruktom wejście do cytoplazmy, ułatwiając transfekcję.

Zszyj nacięcie i pozwól myszy dojść do siebie.

Po kilku dniach ponownie znieczul i zabezpiecz mysz.

Wykonaj nacięcie boczne do linii środkowej po lewej stronie. Wypreparuj mięśnie, aby odsłonić nerw kulszowy.

Zmiażdż nerw, aby uszkodzić aksony neuronów czuciowych. Zaznacz miejsce węzłem szwowym.

Zszyj nacięcie i pozwól myszy dojść do siebie.

Transfekowane konstrukty docelowe mRNA w ciałach komórek neuronów czuciowych DRG, przejściowo modulując produkcję białek w celu poprawy regeneracji aksonów czuciowych po urazie.

W celu wstrzyknięcia DRG należy załadować plazmidy DNA lub oligonukleotydy RNA do szklanej pipety kapilarnej. Następnie ostrożnie włóż końcówkę szklanej pipety kapilarnej do DRG. I stopniowo wstrzykiwać 1 mikrolitr roztworu plazmidów DNA lub oligonukleotydów RNA za pomocą wewnątrzkomórkowego systemu dozowania mikroiniekcji.

W celu elektroporacji delikatnie ściśnij docelowy DRG elektrodami i zastosuj 5-kwadratowe impulsy elektryczne za pomocą systemu elektroporacji. Następnie zamknij mięsień, a następnie warstwy skóry za pomocą nylonowych szwów. Dwa lub trzy dni po elektroporacji DRG znieczulij mysz dootrzewnowo, przyklej jej kończyny do tablicy korkowej i wykonaj 1-centymetrowe nacięcie 0,5 centymetra po lewej stronie wzdłuż linii środkowej.

Następnie przetnij podłużnie mięśnie, takie jak mięsień pośladkowy wielki i mięsień gruszkowaty. Następnie odsłoń odcinek nerwu kulszowego między otworem kulszowym większym a wcięciem kulszowym. Zmiażdż nerw kleszczami mikrochirurgicznymi przez 12 sekund i zaznacz miejsce zmiażdżenia nylonowym szwem epinalnym. Następnie zamknij warstwy mięśni i skóry nylonowym szwem.