Name: Izolacja i hodowla embrionalnych neuronów ruchowych myszy na podstawie lektyny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Poznaj metodę izolacji embrionalnych neuronów ruchowych myszy z rdzenia kręgowego przy użyciu lektynowej puryfikacji. Technika ta umożliwia uzyskanie wzbogaconych kultur komórkowych do badań neurodegeneracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Sandrze Bargen za doskonałe wsparcie techniczne. Praca ta była wspierana przez Wydział Badań nad Białkami (PRD, TP A1.2 (R.C. i T.S.)) oraz Fundusz Badawczy RUB, Rektoratsprogramme – wissenschaftlicher Nachwuchs (A.K.). Przeciwciała monoklonalne 39.4D5 i F55A10 zostały pozyskane z Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa city, IA).

W przypadku odczynników specjalistycznych: patrz Tab. 1. Wszystkie pozostałe wymienione odczynniki są jakości do hodowli komórkowych, zakupione w firmie Sigma Aldrich.
1. Powlekanie szalek/szkiełek podstawkowych PORN-H/lamininą
<ol>
 <li>Przygotować roztwór roboczy hydrobromku poli-DL-ornityny (PORN-H) o stężeniu 0.5 mg/ml w 150 mM buforze boranowym o pH 8.35.
 <ol>
 <li>Roztwór zapasowy o stężeniu 50 mg PORN/1 ml buforu boranowego można przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze -20°C.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Zesterylizować szklane laminki poprzez opalanie w 100% etanolu i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.</li>
 <li>Pokryć powierzchnię odpowiednią ilością roztworu PORN-H i inkubować przez noc w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Następnego dnia wypłukać laminki trzykrotnie sterylną wodą i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.</li>
 <li>Przygotować roztwór roboczy lamininy o stężeniu 2.5 μg/ml w HBSS.
 <ol>
 <li>Alikwoty można przechowywać w temperaturze -20°C. Odmrozić w temperaturze 4°C bezpośrednio przed użyciem.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Pokryć powierzchnię laminek powlekonych PORN-H roztworem lamininy i inkubować przez co najmniej 2 h w temperaturze pokojowej do momentu użycia.</li>
</ol>
2. Powlekanie płytki do oczyszczania lektynami
<ol>
 <li>Przygotować roztwór 10 mM Tris w wodzie sterylnej o pH 9,5.</li>
 <li>Dodać lektynę (rozpuścić proszek lektyny (Sigma L9640) w HBSS) do stężenia końcowego 10 μg/ml.</li>
 <li>Pokryć powierzchnię 10 cm szalki do hodowli komórek 8 ml roztworu lektyny i inkubować przez co najmniej 30 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przemyć szalkę trzykrotnie HBSS i przechowywać w HBSS do momentu użycia.</li>
 <li>Przygotować roztwór depolaryzujący zawierający 30 mM KCl i 0,8% (w/v) NaCl. Sterylizować metodą filtracji i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).</li>
</ol>
3. Pożywka do hodowli motoneuronów
<ol>
 <li>Rozmrozić surowicę konia przez noc w temperaturze 4°C, a następnie inaktywować w temperaturze 55°C przez 30 min. Rozdzielić na aliquoty po 5 ml i przechowywać w temperaturze -20°C. Alikwot rozmrażać w temperaturze pokojowej bezpośrednio przed użyciem.</li>
 <li>Suplement B27 przechowywać w alikwotach po 1 ml w temperaturze -20°C. Rozmrażać suplement B27 w temperaturze pokojowej bezpośrednio przed użyciem. Unikać cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
 <li>Rozdzielić glutamax na alikoty po 0,5 ml i przechowywać w temperaturze -20°C; stosować w rozcieńczeniu 1:100.</li>
 <li>Przygotować roztwór stokowy CNTF o stężeniu 10 μg/ml w wodzie sterylnej z dodatkiem 0,1% BSA. Przechowywać w temperaturze -20°C.</li>
 <li>Bezpośrednio przed użyciem wymieszać 46 ml medium neurobasal z 2,5 ml surowicy konia, 1 ml suplementu B27 oraz 0,5 ml glutamax.</li>
 <li>Dodać CNTF do stężenia końcowego 10 ng/ml w medium, a następnie podgrzać medium do temperatury 37°C.</li>
</ol>
4. Disekcja rdzenia kręgowego
<ol>
 <li>Uśmierć mysz w 12,5 dniu ciąży (E12.5) i ostrożnie wyjmij zarodki. Dodaj odpowiednią ilość RT HBSS, aby całkowicie przykryć zarodki.</li>
 <li>Usuń głowę i ogon, a następnie ułóż zarodek grzbietem do góry z rozstawionymi kończynami.</li>
 <li>Unieruchom zarodek jedną pęsetą i za pomocą drugiej pęsety usuń skórę zewnętrzną.</li>
 <li>Usuń rdzeń kręgowy, wsuwając pęsetę pod niego i unosząc go ruchami piłującymi po obu stronach rdzenia.</li>
 <li>Przenieś wyizolowany rdzeń kręgowy do nowej szalki z HBSS i otwórz kanał centralny rdzenia od strony grzbietowej.</li>
 <li>Usuń zwoje korzeni grzbietowych poprzez usunięcie otaczających rdzeń kręgowy opon mózgowo-rdzeniowych.</li>
 <li>Zbierz części lędźwiowe rdzeni kręgowych z maksymalnie 6 zarodków na jedną płytkę z lektyną do probówki typu Eppendorf wypełnionej 1 ml HBSS i przechowuj w lodzie do czasu zakończenia preparacji.</li>
</ol>
5. Wzbogacanie populacji motoneuronów poprzez oczyszczanie z wykorzystaniem lektyn
Uwaga: Przed rozpoczęciem kolejnych kroków należy przygotować i ogrzać pożywkę (patrz krok 3.).
<ol>
 <li>Przygotować roztwór trypsyny, rozpuszczając 1 g trypsyny w 100 ml HBSS; przechowywać w temperaturze -20°C i rozmrażać w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Zmieszać 1 g inhibitora trypsyny z 98 ml HBSS i 2 ml 1 M HEPES pH 7.4; alikwoty o objętości 1 ml należy przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Przenieść probówkę z rdzeniami kręgowymi do komory z laminarnym przepływem powietrza i ostrożnie usunąć 700 μl HBSS.</li>
 <li>Dodać 7,5 μl roztworu trypsyny i wymieszać poprzez ostrożne odwracanie probówki.</li>
 <li>Przeprowadzić trypsynizację przez 8 min w temperaturze 37°C.</li>
 <li>Zatrzymać reakcję, dodając 30 μl inhibitora trypsyny, a następnie ostrożnie pipetować roztwór w górę i w dół (tryturacja) 10-15 razy za pomocą końcówki do pipety 1000 μl, aż do całkowitego zniknięcia agregatów komórkowych. Powtórzyć tryturację za pomocą pipety 20-200 μl i odpowiadającej jej końcówki.</li>
 <li>Przenieść zawiesinę komórkową do płytki z lektyną wypełnionej HBSS i rozprzestrzenić komórki poprzez delikatne obracanie płytką.</li>
 <li>Pozostawić płytkę z lektyną na 60 min w RT na powierzchni wolnej od wibracji. Przykryć płytkę, aby uniknąć kontaminacji.</li>
 <li>Bardzo delikatnie usunąć HBSS i ostrożnie przemyć płytkę 4 razy podgrzanym HBSS, aby usunąć fragmenty komórek oraz komórki nieprzytwierdzone.</li>
 <li>Natychmiast po ostatnim etapie płukania dodać do płytki 500 μl roztworu do depolaryzacji i inkubować przez 1 min.</li>
 <li>Ułatwić odłączenie komórek związanych z lektyną poprzez wstrząsanie i opukiwanie płytki.</li>
 <li>Wypełnić płytkę 2 ml podgrzanego pożywki hodowlanej i przenieść zawartość do probówki typu Falcon 15 ml.</li>
 <li>Policzyć komórki za pomocą komory liczącej Neubauera.</li>
 <li>Wysiać komórki na pokrywka szkiełkach lub płytkach powlekanych lamininą w odpowiedniej liczbie, zależnie od zastosowania.</li>
 <li>Dokonać wymiany pożywki w 1. dniu, a następnie co drugi dzień, ostrożnie wymieniając 50% starej pożywki. Zawsze używać podgrzanej, świeżo przygotowanej nowej pożywki hodowlanej.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
Zarodkowe motoneurony można uzyskać z embrionów myszy w dniach E12 do E14. Motoneurony stanowią 2-3% całkowitej populacji komórek lędźwiowego odcinka rdzenia kręgowego, a ponieważ neurony zwojów korzeni grzbietowych są również p75NTR-dodatnie, ważne jest usunięcie tych komórek przed rozpoczęciem procedury wstępnego wysiewania opartej na lektynach (przegląd przedstawiono na Rysunku 1 i Rysunku 2). Po drugie, opony mózgowo-rdzeniowe zawierają intensywnie dzielące się komórki, które również należy wykluczyć, ponieważ nie mogą być one prawidłowo usunięte w procedurze wstępnego wysiewania opartej na lektynach (Rysunek 2 i Rysunek 3). W gorszych przypadkach komórki te mogą zdominować płytki hodowlane. Reprezentatywne obrazy na Rysunku 3B i 3D dają również wyobrażenie o niższej gęstości komórek po przeprowadzeniu procedur płukania (patrz krok 5.9 protokołu). Hodowle zarodkowych motoneuronów myszy są zazwyczaj utrzymywane do pięciu lub siedmiu dni. W tym okresie komórki rozwijają swoje neuryty do maksymalnej długości (Rysunek 4). Długość neurytów silnie zależy od podłoża na płytkach8. Typowym podłożem jest laminina, którą nanosi się na naczynia hodowlane pokryte PORN-H. Motoneurony mogą również rosnąć na innych lub mniej zdefiniowanych podłożach, takich jak macierze zewnątrzkomórkowe generowane przez lizę wodną8. W przypadku suboptimalnego pokrycia, długość neurytów i powierzchnia stożka wzrostu ulegają zmniejszeniu, a śmiertelność komórek zazwyczaj wzrasta. Wsparcie troficzne odgrywa kluczową rolę w przeżywalności zarodkowych motoneuronów myszy w hodowli. Przeżywalność początkowo wysianych komórek w siódmym dniu spada do 10% do 20% bez wsparcia troficznego6. Mózgowy czynnik neurotroficzny (BDNF) oraz ciliarny czynnik neurotroficzny (CNTF) są najczęściej stosowanymi czynnikami, lecz inne mogą również promować przeżywalność [czynnik hamujący białaczkę (LIF), kardiotrofina-1 (CT-1), podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), insulinopodobny czynnik wzrostu 1 (IGF-1)9].
<img alt="Schemat procesu selekcji komórek zarodka myszy w stadium E12.5, izolacja rdzenia kręgowego, metoda wzbogacania." src="/files/ftp_upload/3200/3200fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat blokowy przygotowania embrionalnych motoneuronów myszy. Rysunek schematyczny przedstawia poszczególne etapy izolacji i hodowli embrionalnych motoneuronów myszy. Skróty: SC: rdzeń kręgowy; HBSS: zrównoważony roztwór soli Hanksa; MN: motoneuron.
<img alt="Sekwencja sekcji zarodka; zwoje korzeni grzbietowych, kręgosłup; analiza histologiczna." src="/files/ftp_upload/3200/3200fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Izolacja części lędźwiowej rdzenia kręgowego myszy w stadium E12.5. A: Zarodek myszy E12.5. W kolejnym kroku odcina się głowę i ogon, a ciało układa się grzbietem do góry B: Zarodek w pozycji z grzbietem do góry. Pincety po lewej i prawej stronie rdzenia kręgowego unieruchamiają ciało zarodka w tej pozycji. Następnie jedną z pęset używa się do nacięcia skóry oraz przecięcia tkanek pod rdzeniem kręgowym, podczas gdy druga służy do stabilizacji zarodka. C: Izolowany rdzeń kręgowy z zarodka myszy E12.5. Wskazano poszczególne odcinki rdzenia kręgowego (szyjny, piersiowy, lędźwiowy). Rdzeń kręgowy jest otoczony oponami, do których wciąż przylegają części zwojów korzeni grzbietowych. D: Rdzeń kręgowy zostaje przecięty wzdłużnie od strony grzbietowej, aby otworzyć go w kierunku kanału centralnego. E: Opony od strony brzusznej zostają teraz usunięte z rozpłaszczonego rdzenia kręgowego. Uwaga: Podczas usuwania, część lędźwiowa zostaje zaznaczona niewielkim nacięciem. F: Do dalszych procedur pobiera się wyłącznie część lędźwiową rdzenia kręgowego.
<img alt="Analiza komórek nerwowych; ekspresja markerów Islet1/DRG w rdzeniu kręgowym E12.5; schemat immunofluorescencji." src="/files/ftp_upload/3200/3200fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Wyznaczanie i izolacja komórek Islet-dodatnich z odcinka lędźwiowego rdzenia kręgowego zarodków myszy E12.5. A: Przeciwciało Islet-1/2 znakuje kolumny motoneuronów w embrionalnym rdzeniu kręgowym odcinka lędźwiowego (czerwony, strzałka), a Hoechst znakuje wszystkie jądra w przekroju. Przekrój poprzeczny odcinka lędźwiowego rdzenia kręgowego E12.5. Zarodki myszy E12.5 utrwalono przez imersję w 4% paraformaldehydzie przez 6 h, przemyto 3 razy roztworem PBS i poddano działaniu sacharozy zgodnie ze standardowymi procedurami. Za pomocą kriotomu wykonano krioprzekroje o grubości 20 μm, a następnie przygotowano je do barwienia immunohistochemicznego zgodnie ze standardowymi procedurami11. Przekroje zostały następnie znakowane Hoechst w celu lokalizacji jąder komórkowych. Należy zauważyć, że neurony zwojów korzeni grzbietowych są również Islet-1/2-dodatnie, a procedura przygotowania wyklucza te części tkanki z procesu izolacji. B: Komórki zdysocjowane z odcinka lędźwiowego rdzenia kręgowego zarodków E12.5 znakowane Islet-1/2 (czerwony, strzałka), po lewej – przed i po prawej – po preplatingu opartym na lektynach. Komórki podbarwiono Hoechst w celu wizualizacji wszystkich jąder komórkowych. C: Ilościowe oznaczenie komórek Islet-1/2-dodatnich przed i po preplatingu opartym na lektynach. D: Motoneurony znakowane Nkx6.1 z zarodków E12.5 po jednym dniu hodowli. Komórki podbarwiono Hoechst w celu wizualizacji wszystkich jąder. Należy zauważyć, że 90% wszystkich komórek jest Nkx6.1-dodatnich. Skróty: SC: rdzeń kręgowy; MN: motoneuron; DRG: zwoj korzenia grzbietowego.
<img alt="Etapy rozwoju hodowli neuronów ruchowych; obrazy mikroskopowe; barwienie Hoechst/βIII-tubulina; wzrost komórek." src="/files/ftp_upload/3200/3200fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Charakterystyka neuronów ruchowych myszy E12.5. A i B: Wzbogacone izolowane neurony ruchowe lędźwiowego rdzenia kręgowego myszy E12.5 wykazują ekspresję p75NTR w 0 dniu in vitro (0div) oraz w 2 dniu in vitro (2div). Komórki utrwalono 4% paraformaldehydem, a następnie zabarwiono na p75NTR zgodnie ze standardowymi procedurami. Komórki poddano przeciwbarwieniu barwnikiem Hoechst w celu wizualizacji wszystkich jąder. C: Wzbogacone neurony ruchowe po 5 dniach in vitro (5div) na podłożach hodowlanych PORN-H i lamininie, w obecności CNTF, zabarwione na β-III-tubulinę. Należy zauważyć, że komórki wykształciły długie neuryty i wykazują typową morfologię neuronów ruchowych z jednym dłuższym (rozgałęzionym) wypustkiem i jednym lub więcej krótszych wypustków (aksonami i dendrytami). Skróty: MN: neuron ruchowy; div: dni in vitro.
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td rowspan="2"> </td>
 <td colspan="3">Po dysocjacji bez wstępnego wysiewu z wykorzystaniem lektyny</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Całkowita liczba komórek/SC</td>
 <td>Komórki dodatnie z błękitem trypanu [%]</td>
 <td>Komórki dodatnie z Islet-1/2 [%]</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>995.0</td>
 <td>13,1</td>
 <td>9,5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2</td>
 <td>889.4</td>
 <td>8,0</td>
 <td>10,0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3</td>
 <td>1.180.0</td>
 <td>11,0</td>
 <td>10,8</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Średnia ± SD</td>
 <td>1.021.0 ± 147.1</td>
 <td>10,7 ± 2,6</td>
 <td>10,1 ± 0,7</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="4"> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="2"> </td>
 <td>Z wstępnym wysiewem z wykorzystaniem lektyny</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liczba komórek po wstępnym wysiewie/SC</td>
 <td>Komórki dodatnie z błękitem trypanu [%]</td>
 <td>Komórki dodatnie z Islet-1/2 [%]</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>189.6</td>
 <td>9,9</td>
 <td>70,5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2</td>
 <td>168.8</td>
 <td>3,7</td>
 <td>76,1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3</td>
 <td>125.0</td>
 <td>0,0</td>
 <td>72,5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Średnia ± SD</td>
 <td>161.1 ± 33.0</td>
 <td>4,5 ± 5,0</td>
 <td>73,0 ± 2,8</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Podsumowanie reprezentatywnych procedur izolacji embrionalnych motoneuronów myszy z etapu E12.5. Wyniki z 3 różnych procedur izolacji opracowanych specjalnie w tym celu przedstawiono jako liczby całkowite lub wartości procentowe ± SD. Skróty: SC: rdzeń kręgowy; SD: odchylenie standardowe.
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Komórki Islet-1/2 dodatnie po selekcji p75 [%]</td>
 <td>Komórki Islet-1/2 dodatnie po selekcji z użyciem lektyny [%]</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>92,0 ± 3,5 1</td>
 <td>73,0 ± 2,8</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 2. Porównanie liczby neuronów ruchowych wyselekcjonowanych metodą panningu z użyciem lektyn oraz p751. Wyniki przedstawiono jako wartości procentowe ± SD.

<ol><li>Vallstedt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+levels+of+repressor+activity+assign+redundant+and+specific+roles+to+Nkx6+genes+in+motor+neuron+and+interneuron+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification.</a> Neuron. 31, 743-755 (2001).</li>
<li>Tsuchida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+organization+of+embryonic+motor+neurons+defined+by+expression+of+LIM+homeobox+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes.</a> Cell. 79, 957-970 (1994).</li>
<li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+related+motor+neuron+pool+and+muscle+sensory+afferent+subtypes+defined+by+coordinate+ETS+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression.</a> Cell. 95, 393-407 (1998).</li>
<li>Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+mechanisms+for+survival+of+lesioned+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochir%22%5BJournal%5D)">Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons.</a> Acta Neurochir. , 21-35 (2004).</li>
<li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research%3A+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li>
<li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li>
<li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entering+the+Portal%3A+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Imaging+Cellular+and+Molecular+Biological+Functions%22%5BJournal%5D)">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li>
<li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li>
<li>Cara, D. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+as+a+tool+for+studying+recruitment+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).</li>
<li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li>
<li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+accelerates%2C+but+is+not+required+for%2C+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Zaletą tej techniki wstępnego wysiewu opartego na lektynach jest to, że jest ona mniej kosztowna niż procedura panningu oparta na p75NTR, a lektyna jest bardziej stabilna niż przeciwciała. Wzbogacenie przedstawione na Rys. 2 i w Tab. 1 wykazuje, że procedura ta pozwala na puryfikację podobnej liczby komórek i że większość z nich wykazuje ekspresję markera motoneuronów Islet-1/2. Najbardziej krytycznym etapem jest procedura izolacji rdzenia kręgowego z odcinka lędźwiowego. Usunięcie opon mózgowo-rdzeniowych oraz zwojów korzeni grzbietowych (DRGs) (Rys. 2) jest niezbędne do przeprowadzenia kolejnej procedury puryfikacji poprzez wstępny wysiew oparty na lektynach. Jeśli etap ten zostanie wykonany prawidłowo, prawie wszystkie komórki wykazują ekspresję p75NTR (reprezentatywny obraz przedstawiono na Rys. 3a). Przyczyną różnicy między ekspresją Islet-1/2 a p75NTR jest najprawdopodobniej fakt, że motoneurony lędźwiowe wykazują zróżnicowany, wysoki lub niski poziom ekspresji Islet-1/210. W przypadku niskiego poziomu ekspresji Islet-1/2 mogło to umknąć naszej uwadze podczas barwienia immunocytochemicznego i późniejszego liczenia, ponieważ stosowaliśmy rygorystyczne kryteria rozróżniania komórek pozytywnych od negatywnych (Tab. 1). Dodatkowo Tablica 1 wyraźnie pokazuje, że izolowane komórki przeżywają procedurę w stanie zdrowym, gdyż występuje tylko kilka komórek pozytywnych z błękitem trypanu, co wskazywałoby na nieodwracalne uszkodzenie komórek. Ta alternatywna procedura pozwala również na izolację motoneuronów z pojedynczych embrionów, a tym samym z miotów myszy embrionalnych o mieszanym genotypie. Podsumowując, ta alternatywa dla procedury panningu z przeciwciałem p75NTR6 posiada podobne, jeśli nie identyczne możliwości w zakresie potencjalnych zastosowań i stanowi tanią oraz wydajną, alternatywną metodę puryfikacji embrionalnych motoneuronów myszy.

<table><tbody><tr><td>Hydrobromek poli-DL-ornityny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8638</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>Szklane szkiełka zakrywkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td> 10 lub 14 mm</td></tr><tr><td>Lektyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5142</td><td></td></tr><tr><td>Szalka do hodowli komórkowej</td><td>Nalge Nunc international</td><td>150350</td><td>powierzchnia Nunclon delta</td></tr><tr><td>Surowica konia</td><td>Linaris</td><td>SHD3250ZK</td><td>Każda partia musi zostać przetestowana pod kątem hodowli MN</td></tr><tr><td>Suplement B27</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0513</td><td></td></tr><tr><td>BSA </td><td>Applichem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal </td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21103-041</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta</td><td></td><td></td><td>Stal nierdzewna, rozmiar 4 lub 5</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS003707</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Anti-Islet-1</td><td>DSHB</td><td>39.4D5</td><td>Nadsącz z hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Przeciwciało Anti-Nkx6.1</td><td>DSHB</td><td>F55A10</td><td>Nadsącz z hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Przeciwciało Anti-p75&lt;sup&gt;NTR&lt;/sup&gt;</td><td>Abcam</td><td>Ab8874</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 3.&lt;/strong&gt; Tabela specyficznych odczynników i sprzętu.</td></tr></tbody></table>

izolacja i hodowla embrionalnych motoneuronów myszy z wykorzystaniem lektyn

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Rdzeniowe motoneurony rozwijają się do etapów postmitotycznych podczas wczesnego rozwoju embrionalnego układu nerwowego, a następnie wypuszczają dendryty i aksony. Komórki neuroepitelialne cewy nerwowej wykazujące ekspresję Nkx6.1 są jedynymi komórkami prekursorowymi rdzeniowych motoneuronów1. Postmitotyczne motoneurony przemieszczają się w stronę swojej docelowej pozycji i organizują się w kolumny wzdłuż szlaku rdzeniowego2,3. Ponad 90% wszystkich tych zróżnicowanych i odpowiednio usytuowanych motoneuronów wykazuje ekspresję czynników transkrypcyjnych Islet 1/2. Innervują one mięśnie kończyn, a także mięśnie ciała i narządów wewnętrznych. Motoneurony typowo wykazują między innymi ekspresję receptorów o wysokim powinowactwie do czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF) oraz neurotrofiny-3 (NT-3), czyli kinaz tropomiozynowych B i C (TrkB, TrkC). Nie wykazują one ekspresji kinazy tropomiozynowej A (TrkA)4. Oprócz dwóch receptorów o wysokim powinowactwie, motoneurony wykazują ekspresję receptora neurotrofin o niskim powinowactwie p75NTR. p75NTR może wiązać wszystkie neurotrofiny z podobnym, lecz niższym powinowactwem niż to, z jakim receptory o wysokim powinowactwie wiążą dojrzałe neurotrofiny. W embrionalnym rdzeniu kręgowym p75NTR jest ekskluzywnie wyrażany przez rdzeniowe motoneurony5. Wykorzystano to do opracowania technik izolacji motoneuronów w celu oczyszczenia tych komórek z ogromnej większości komórek otaczających6. Izolowanie motoneuronów za pomocą specyficznych przeciwciał (metodą panningu) przeciwko domenom zewnątrzkomórkowym p75NTR okazało się metodą kosztowną, ponieważ ilość przeciwciał zużywana w pojedynczym doświadczeniu jest wysoka ze względu na rozmiar płytki używanej do panningu. Znacznie bardziej ekonomiczną alternatywą jest zastosowanie lektyny. Wykazano, że lektyna również specyficznie wiąże się z p75NTR7. Poniższa metoda opisuje alternatywną technikę wykorzystującą aglutyninę z zarodków pszenicy w procedurze preplatingu zamiast przeciwciała p75NTR. Lektyna jest niezwykle tanią alternatywą dla przeciwciała p75NTR, a stopień oczyszczenia przy użyciu lektyny jest porównywalny do tego uzyskiwanego za pomocą przeciwciała p75NTR. Motoneurony z embrionalnego rdzenia kręgowego mogą być izolowane tą metodą, przeżywają i wypuszczają neuryty.

Opisano alternatywną metodę izolacji embrionalnych motoneuronów mysich z rdzenia kręgowego. Metoda ta wykorzystuje fakt, że lektyna może wiązać się z niskopodobnym receptorem czynnika wzrostu nerwów p75NTR. To oparte na lektynach wstępne wysiewanie (preplating) pozwala na puryfikację podobną do tej uzyskiwanej za pomocą specyficznego przeciwciała przeciwko p75NTR.

Izolacja i hodowla embrionalnych motoneuronów myszy z wykorzystaniem lektyn

Motoneurony rdzeniowe rozwijają się w kierunku etapów postmitotycznych w trakcie wczesnego rozwoju embrionalnego układu nerwowego, a następnie wypuszczają dendryty i aksony. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie wzbogaconej hodowli embrionalnych neuronów ruchowych myszy. Procedura rozpoczyna się od uśmiercenia ciężarnej myszy, wyjęcia embrionów i wypreparowania rdzenia kręgowego z odcinka lędźwiowego. Następnym krokiem jest dysocjacja rdzenia kręgowego do postaci zawiesiny pojedynczych komórek poprzez obróbkę enzymatyczną i odpowiedni czas inkubacji.Następnie przeprowadź puryfikację opartą na lektynach w celu oddzielenia neuronów ruchowych od pozostałych składników komórkowych. W kolejnym kroku, po oszacowaniu całkowitej liczby komórek, komórki wysieje się na wcześniej okodowane szalki lub szkiełka podstawowe. Ostatnim etapem jest dostosowanie gęstości hodowli w zależności od procedury eksperymentalnej.Ostatecznie, w miarę wzrostu hodowlanych komórek, można zaobserwować typową morfologię neuronów ruchowych, co świadczy o powodzeniu procesu. Przy przygotowywaniu hodowli neuronów ruchowych myszy niezbędne jest przetestowanie różnych materiałów, substancji i roztworów. Ponieważ komórki mogą reagować wrażliwie na wszelkie zmiany w tych elementach, neurony ruchowe można hodować w wysokiej gęstości w celu izolacji RNA lub białek.Istnieje jednak możliwość, że komórki wytworzą aktywne sieci neuronalne, co doprowadzi do ich przeżycia niezależnie od wsparcia troficznego. Dlatego w niektórych przypadkach do analizy RNA lub białek lepiej może być hodować komórki przy niskiej gęstości; procedurę tę zaprezentują Rebecca Conrad i Terza Japan. Obie są doktorantkami w naszym laboratorium.Procedurę należy rozpocząć od przygotowania roztworu roboczego hydrobromku poli-DL-ornityny o stężeniu 0,5 mg/mL w 150 mM buforze bide o pH 8,35, a następnie wysterylizować roztwór poprzez filtrację. Następnie należy wysterylizować szklane szkiełka zakrywkowe, opalając je w 100% etanolu. Po pozostawieniu ich do wyschnięcia, powierzchnię szkiełek należy pokryć odpowiednią ilością roztworu porn H i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.Przemyć je trzykrotnie wodą sterylną. Następnie pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Przygotować roztwór roboczy o stężeniu 2,5 µg/mL.Pokryj powierzchnię szkiełek podstawowych powlekanych poli-L-lizyną roztworem lamininy w buforze HBSS. Następnie inkubuj je przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej do momentu użycia. Kolejnym krokiem jest przygotowanie 10 mM roztworu TRIS w wodzie sterylnej o pH 9,5.Po przefiltrowaniu roztworu, dodać lektynę do mieszaniny do stężenia końcowego 10 µg/mL. Następnie pokryć powierzchnię 10 cm szalki do hodowli komórek ośmioma mililitrami roztworu lektyny i inkubować przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć płytkę buforem HBSS 3 razy i przechowywać ją w HBSS do momentu użycia.Następnie przygotować roztwór depolaryzujący zawierający 30 mM chlorku potasu i 0,8% chlorku sodu. Po tym czasie wysterylizować mieszaninę poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze pokojowej. Aby rozpocząć tę procedurę, rozmrozić surowicę konia przez noc w temperaturze 4 °C.Następnie inaktywować w temperaturze 55 °C przez 30 minut, podzielić na porcje o objętości 5 ml i przechowywać te alikwoty w temperaturze -20 °C. Przed użyciem rozmrozić jedną alikwotę bezpośrednio w temperaturze pokojowej; następnie przechowywać suplement B 27 w alikwotach o objętości 1 ml w temperaturze -20 °C. rozmrozić w temperaturze pokojowej bezpośrednio przed użyciem. Aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania, należy rozdzielić glutaminian na aliquoty po 0,5 ml i przechowywać je w temperaturze -20 °C. Następnie należy przygotować roztwór stokowy CNTF o stężeniu 10 µg/ml w sterylnej wodzie z 0,1% BSA i przechowywać go w temperaturze -20 °C.Na koniec zmieszaj 46 ml pożywki Neurobasal z 2,5 ml surowicy konia, 1 ml suplementu B 27 oraz 0,5 ml glutaminianu. Bezpośrednio dodaj CNTF do stężenia końcowego w pożywce wynoszącego 10 ng/ml. Podgrzej roztwór do 37 °C.Na tym etapie należy uśmiercić ciężarną mysz w 12,5 dniu rozwoju embrionalnego i ostrożnie wyjąć zarodki. Dodać HBSS o temperaturze pokojowej, aby całkowicie przykryć zarodki, a następnie umieścić jeden z nich pod mikroskopem. Następnie należy odciąć głowę i ogon, a zarodek ułożyć grzbietem do góry z rozstawionymi kończynami.Następnie unieruchom zarodek jedną parą pęsety i usuń zewnętrzną skórę drugą parą pęsety. Po tym etapie usuń rdzeń kręgowy, wsuwając pęsetę pod niego i podnosząc go ruchami piłującymi po obu stronach rdzenia. Przenieś wyizolowany rdzeń kręgowy do nowej szalki z HBSS.Otwórz kanał centralny rdzenia kręgowego od strony grzbietowej. Następnie usuń zwoje korzeni grzbietowych, usuwając otaczające rdzeń kręgowy opony miękkie. Potem przenieś rdzenie kręgowe do probówki reakcyjnej EOR wypełnionej 1 mL HBSS.Przechowywać je w lodzie do czasu przygotowania procesu trawienia rdzenia kręgowego. Przenieść probówkę z rdzeniami kręgowymi do komory z laminarnym przepływem powietrza. Ostrożnie usunąć 700 µL HBSS, a następnie dodać 7,5 µL 1% rozmrożonego roztworu trypsyny, który został przygotowany wcześniej zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie.Następnie wymieszać zawartość, ostrożnie odwracając probówkę. Trypsynizację prowadzić przez osiem minut w temperaturze 37 °C. Następnie zatrzymać reakcję, dodając 30 µL inhibitora trypsyny i ostrożnie pipetować ciecz w górę i w dół, 10–15 razy, używając końcówki do pipety 1000 µL, aż do momentu, gdy nie będą już widoczne agregaty komórkowe.Następnie powtórz tę czynność, używając pipety 20–200 µl. Przenieś roztwór komórek do płytki z lektyną wypełnionej HBSS i rozmieść komórki, delikatnie obracając płytką. Przykryj płytkę z lektyną, aby uniknąć zanieczyszczeń, i pozostaw ją na powierzchni wolnej od wibracji w temperaturze pokojowej na 60 minut.Bardzo delikatnie usuń HBSS i opłucz płytkę czterokrotnie, uważnie używając podgrzanego HBSS, aby usunąć fragmenty komórek oraz komórki nieprzytwierdzone. Bezpośrednio po ostatnim etapie płukania dodaj do płytki 500 µL 30 mM roztworu depolaryzującego chlorku potasu i 0,8% chlorku sodu, a następnie inkubuj przez jedną minutę. Wstrząśnij i opukaj płytkę, aby ułatwić odczepienie komórek związanych z lektyną. Wypełnij płytkę dwoma ml podgrzanego medium hodowlanego. Następnie przenieś zawartość do probówki Falcon 15 ml.Policz liczbę komórek przy użyciu komory Neubauera. Następnie wysiej komórki na szkiełka podstawowe lub płytki pokryte lamininą. Wymień medium w pierwszym dniu, a następnie raz na dwa dni, ostrożnie zastępując 50% starego medium podgrzanym, świeżo przygotowanym pożywką.Przedstawiony tutaj przekrój poprzeczny embrionalnego rdzenia kręgowego w odcinku lędźwiowym (dzień 12,5) został znakowany barwnikiem herst w celu lokalizacji jąder komórkowych. Strzałka wskazuje kolumny neuronów ruchowych w embrionalnym rdzeniu kręgowym odcinka lędźwiowego, znakowane przeciwciałem eyelet one two. Przykład zdysocjowanych komórek znakowanych eyelet one two.Komórki lędźwiowego rdzenia kręgowego z embrionów w 12,5 dniu rozwoju przed i po wstępnym wysiewaniu z użyciem lektyny przedstawiono odpowiednio na panelu lewym i prawym. Przedstawiono tutaj wyniki ilościowe komórek wykazujących pozytywną reakcję na eyelet one two przed i po wstępnym wysiewaniu z użyciem lektyny. Poniżej znajduje się przykład obrazujący wzbogacenie populacji neuronów ruchowych w dniu zero oraz w dniu drugim; komórki utrwalono w 4%paraldehyde, a następnie barwiono przeciwciałem przeciwko P 75 NTR.Zgodnie ze standardowymi procedurami, następnie wykonano barwienie kontrastowe w celu wizualizacji wszystkich jąder komórkowych po pięciu dniach in vitro na podłożach hodowlanych z polionomeru H i lamininy; w obecności CNTF, w przypadku barwienia na beta-tubulinę III, komórki wykształciły długie neuryty i wykazywały typową morfologię neuronów ruchowych, z jednym dłuższym wypustkiem i jednym lub więcej krótszych wypustków. Neurony ruchowe odgrywają centralną rolę w organizmach wszystkich kręgowców i bezkręgowców.Ta izolacja jest niezwykle użyteczna w analizie mechanizmów przetrwania neuronów ruchowych. Wykorzystując wyizolowane komórki, można selektywnie analizować aktywność innych oddziałujących na nie komórek, białek oraz węglowodanów, a także badać wpływ substancji farmakologicznych na przeżywalność i wzrost neuronów tych komórek.

lectin-based-isolation-and-culture-of-mouse-embryonic-motoneurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Izolacja i hodowla mysich zarodkowych motoneuronów opartych na lektynach

Opracowaliśmy nowy protokół w celu zwiększenia wydajności różnicowania embrionalnych komórek macierzystych myszy w neurony ruchowe in vitro. Zróżnicowane komórki ES nabyły cechy neuronów ruchowych, co potwierdzono poprzez wykazanie ekspresji markerów neuronalnych i neuronów ruchowych z wykorzystaniem technik immunohistochemicznych.

Efektywna różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w neurony ruchowe

Opisujemy szybką metodologię izolacji i hodowli neuronów hipokampa i kory mózgowej z embrionów gryzoni. Protokół ten umożliwia przeprowadzanie eksperymentów wymagających niemal czystych kultur neuronalnych.

Izolacja i hodowla embrionalnych komórek neuronalnych szczura: szybki protokół

Izolacja embrionalnej grzebieni neuralnej z rurki neuralnej umożliwia zastosowanie metod in vitro do badania migracji, samoodnawiania oraz multipotencji grzebieni neuralnej.

Izolacja i hodowla komórek grzebienia neuronalnego z zarodkowej rurki nerwowej myszy

Film pokazuje izolację neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych od transgenicznego zarodka myszy. Zarodek wykazuje ekspresję neuronów ruchowych znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w celu łatwej wizualizacji i identyfikacji. Neurony ruchowe są chirurgicznie izolowane pod mikroskopem fluorescencyjnym i utrzymywane w pożywce hodowlanej.

Izolacja i hodowla neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych z zarodka myszy

Ten film demonstruje protokół izolacji i hodowli pierwotnych komórek kory mózgowej z grzbietowo-bocznego kresomózgowia embrionów myszy.

Izolacja i hodowla komórek z zarodka myszy Grzbietowo-boczne kresomózgowie

Wideo pokazuje proces izolacji i hodowli neuronów dopaminowych ze śródmózgowia embrionów myszy. Izolowane brzuszne dno śródmózgowia jest dysocjowane za pomocą enzymów. Powstałe neurony dopaminowe są zbierane i przenoszone do mikrowysp wewnątrz płytek wielodołkowych. Komórki są inkubowane z pożywką neuronów dopaminowych, aby utrzymać komórki w dużej gęstości wewnątrz mikrowysp.

Izolacja i hodowla pierwotnych embrionalnych neuronów dopaminowych śródmózgowia myszy

Prezentujemy protokół hodowli komórkowej do bezpośredniego badania neuronalnych i glejowych składników jelitowego układu nerwowego. Mieszana hodowla neuronów i glejów na szkiełkach nakrywkowych jest przygotowywana ze splotu mięśniowo-jelitowego dorosłej myszy, co daje możliwość zbadania funkcji poszczególnych neuronów i gleju za pomocą elektrofizjologii, immunohistochemii itp.

Preparat in vitro izolowanych neuronów jelitowych i gleju ze splotu mięśniowo-jelitowego dorosłej myszy

To badanie przedstawia technikę izolacji neuronów od noworodków myszy WT. Wymaga starannego wypreparowania rdzenia kręgowego od noworodka myszy, a następnie oddzielenia neuronów od tkanki rdzenia kręgowego poprzez mechaniczne i enzymatyczne rozszczepienie.

Izolacja i hodowla neuronów rdzenia kręgowego od nowonarodzonych myszy

Celem tej techniki jest przygotowanie wysoce wzbogaconej kultury pierwotnych neuronów ruchowych (MN) z mysiego rdzenia kręgowego. Aby ocenić konsekwencje mutacji powodujących choroby MN, opisujemy tutaj izolację tych izolowanych MN i ich transfekcję przez magnetofekcję.

Modelowanie choroby Charcota-Marie-Tootha in vitro poprzez transfekcję pierwotnych neuronów ruchowych myszy

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę mikrochirurgiczną do izolacji nerwowych komórek macierzystych z wyniosłości zwojowej zarodka myszy E13.

Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych

Ta praca przedstawia protokół do uzyskania jednorodnych kultur komórkowych pierwotnych neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych. Kultury te można wykorzystać do analiz porównawczych cech morfologicznych, komórkowych, molekularnych i elektrofizjologicznych neuronów ruchowych oka i rdzenia.

Izolacja i hodowla neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych myszy transgenicznych z grupy prenatalnej mn:GFP

Poznaj metodę izolacji embrionalnych neuronów ruchowych myszy z rdzenia kręgowego przy użyciu lektynowej puryfikacji. Technika ta umożliwia uzyskanie wzbogaconych kultur komórkowych do badań neurodegeneracyjnych.

Izolacja i hodowla embrionalnych motoneuronów myszy z wykorzystaniem lektyn

Przeglądaj więcej filmów