Name: Ice-cap: metoda uprawy rzodkiewnika i pomidora na 96-dołkowych płytkach do wysokoprzepustowego genotypowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Poznaj metodę Ice-Cap do izolacji tkanek korzeniowych z siewek roślin w płytkach 96-dołkowych. Technika umożliwia ekstrakcję DNA i wysokoprzepustowe genotypowanie Arabidopsis thaliana, pomidora i ryżu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta została sfinansowana z grantu przyznanego przez National Science Foundation (numer grantu MCB-0447750).

<ol><li>Clark, K. A., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+An+improved+high-throughput+method+for+generating+tissue+samples+in+96-well+format+for+plant+genotyping+%28Ice-Cap+2.0%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0).</a> Plant Methods. 3, 8-8 (2007).</li>
<li>Krysan, P. I. ce-cap <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+capturing+plant+tissue+samples+for+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis.</a> Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).</li>
<li>Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+map-based+cloning+in+the+post-genome+era%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era.</a> Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).</li>
<li>Liljegren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHATTERPROOF+MADS-box+genes+control+seed+dispersal+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis.</a> Nature. 404, 766-770 (2000).</li>
<li>Buechel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+A-type+ARABIDOPSIS+RESPONSE+REGULATORS+in+meristem+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration.</a> Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).</li>
<li>Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+kinase+gene+family+encodes+essential+positive+regulators+of+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis.</a> Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).</li>
<li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iTILLING%3A+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).</li>
<li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILLING%3A+practical+single-nucleotide+mutation+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery.</a> Plant J. 45, 684-694 (2006).</li>
<li>Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILLING.+Traditional+mutagenesis+meets+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics.</a> Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).</li>
<li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+%28TILLING%29+for+plant+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj metoda Ice-Cap umożliwia jednemu naukowcowi pobranie próbek tkanek z setek, a nawet tysięcy poszczególnych roślin w ciągu jednego dnia oraz wydajną ekstrakcję genomicznego DNA z tych próbek do wykorzystania w reakcjach genotypowania. Dzięki zapewnieniu badaczowi możliwości genotypowania tysięcy siewek w krótkim czasie, metoda Ice-Cap ma potencjał do usprawnienia wielu eksperymentów genetycznych, których przeprowadzenie w inny sposób nie byłoby praktyczne. Poniżej przedstawiono kilka przykładów.
<ol>
	<li>Mapowanie genetyczne. Precyzyjne mapowanie genetyczne może zostać przyspieszone, jeśli badacz jest w stanie zidentyfikować zdarzenia rekombinacji w określonym przedziale wzdłuż chromosomu 3. Jeśli przedział ten obejmuje bardzo krótką odległość genetyczną, zdarzenia rekombinacji będą stosunkowo rzadkie w segregującej populacji mapowania. Z tego powodu konieczne może być przesiewanie tysięcy pojedynczych roślin w celu znalezienia pożądanych osobników rekombinantów. Proces ten mógłby zostać znacznie przyspieszony dzięki zastosowaniu Ice-Cap. Nawet w erze re-sekwencjonowania całego genomu wciąż niezbędne jest bezpośrednie wykazanie, że dana mutacja jest bezpośrednio odpowiedzialna za interesujący fenotyp. W takich przypadkach konieczne będzie odseparowanie interesującej mutacji od innych ściśle powiązanych mutacji, aby udowodnić, że mutacja kandydacka jest rzeczywiście przyczynowa. W takich sytuacjach Ice-Cap zapewniłby wydajną metodę rozbijania sprzężenia między parą ściśle powiązanych mutacji.</li>
	<li>Wielokrotne mutanty. Powszechną praktyką wśród badaczy studiujących Arabidopsis stało się łączenie alleli mutantów z kilku różnych loci w jednym osobniku w celu przezwyciężenia redundancji funkcjonalnej 4-6. Jako przykład rozważmy przypadek, w którym chcemy połączyć allele mutantów z czterech różnych loci w jednej roślinie poprzez krzyżowanie genetyczne. W ramach schematu krzyżowania konieczne będzie wygenerowanie osobnika heterozygotycznego w tych czterech loci. Gdy ten czterokrotny heterozygota zawiąże nasiona, oczekuje się, że czterokrotny homozygota pojawi się z częstotliwością jeden na 256 w powstałej populacji potomstwa. Przesiewanie w poszukiwaniu tego rzadkiego osobnika metodami tradycyjnymi byłoby bardzo pracochłonne. W porównaniu z tym, zastosowanie Ice-Cap w tym projekcie zapewniłoby naukowcowi wydajną strategię identyfikacji rzadkiego czterokrotnego homozygota w jednym pokoleniu.</li>
	<li>iTILLING. Nasze laboratorium opisało niedawno nowatorskie podejście do przesiewania obecności indukowanych mutacji w interesujących genach u Arabidopsis 7. Metoda ta jest wariantem uznanej techniki zwanej TILLING, która służy do wyszukiwania mutacji w uporządkowanych populacjach osobników poddanych działaniu mutagenu chemicznego 8-10. Nazwaliśmy naszą metodę iTILLING, ponieważ jest to zindywidualizowana wersja TILLING, która pozwala pojedynczemu naukowcowi osiągnąć cel, który tradycyjnie wymagał zaangażowania dużego zespołu badawczego. Ice-Cap stanowi integralną część metody iTILLING 7, zgodnie z poniższym opisem.</li>
</ol>
Idea iTILLING polega na wytworzeniu efemerycznej populacji mutantów, co stanowi przeciwieństwo trwałych populacji mutantów tworzonych w tradycyjnych projektach TILLING. W przypadku iTILLING nasiona z zbiorczej populacji M2 wysiewa się do 50–100 bloków Ice Cap, a DNA ekstrahuje metodą Ice-Cap. Siewki Arabidopsis umieszcza się następnie w temperaturze 4°C, podczas gdy przesiewanie mutacji przeprowadza się z wykorzystaniem preparatów DNA Ice-Cap. Siewki pomidora przechowuje się w temperaturze 12°C. Po zidentyfikowaniu siewek niosących pożądane mutacje, są one odzyskiwane z płytek Ice-Cap i przesadzane do gleby. iTILLING nie ma na celu dostarczenia długotrwałej populacji mutantów do przesiewania przez całą społeczność badawczą. Zamiast tego iTILLING oferuje strategię, dzięki której jeden naukowiec może szybko, wydajnie i przy stosunkowo niskim koszcie przesiewać spersonalizowaną populację mutantów pod kątem mutacji w kilku genach.
Stwierdziliśmy, że metoda Ice-Cap jest skutecznym sposobem hodowli i genotypowania Arabidopsis, pomidora oraz ryżu. Przewidujemy, że inne gatunki roślin również powinny być podatne na zastosowanie metody Ice-Cap. Jednym z ograniczeń w zakresie różnorodności gatunków, które można objąć metodą Ice-Cap, jest wielkość nasion. W obecnej konfiguracji Ice-Cap będzie kompatybilna jedynie z roślinami o nasionach na tyle małych, aby zmieściły się w dołkach płytki 96-dołkowej.

<table><tbody><tr><td>GenoGrinder</td><td>Spex/CertiPrep, Metuchen, NJ</td><td>2000 Geno/Grinder</td><td>Urządzenie do wstrząsania płytek z korzeniami w celu ekstrakcji DNA</td></tr><tr><td>Zgrzewarka ABgene Thermo-Sealer</td><td>ABgene Limited</td><td>AB-0384</td><td>Ręczna zgrzewarka termiczna stosowana do płytek z korzeniami przed rozbiciem tkanek</td></tr><tr><td>Wirówka wyposażona w mikroplatecie z koszykami z kątem nachylenia</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Allegra 25R</td><td>Odpowiednia będzie każda wirówka z mikroplatecetami z koszykami z kątem nachylenia</td></tr><tr><td>Dozownik do mikropłytek MicroFill</td><td>BioTek</td><td>AF1000A</td><td>Zautomatyzowany dozownik cieczy do napełniania mikropłytek</td></tr><tr><td>Komercyjna duża blacha do pieczenia marki Bialetti 17x11 cali</td><td>Dom Towarowy Target</td><td>www.bialetti.com</td><td>Ta konkretna blacha do pieczenia ma idealną głębokość dla układu Ice-Cap</td></tr><tr><td>Metalowy stelaż wykonany na zamówienie</td><td>Sklep sprzętowy</td><td></td><td>Pełny opis znajduje się w tekście</td></tr><tr><td>Plastikowy pojemnik do przechowywania o pojemności 33 litrów</td><td>Dom Towarowy Target</td><td>Marka Sterilite</td><td>Do fontanny Ice-Cap. &lt;br/&gt;Plastikowy pojemnik do przechowywania wystarczająco duży, aby pomieścić blachę do pieczenia 17x11 cali</td></tr><tr><td>Pompa fontannowa o wydajności 30 galonów na godzinę</td><td>Sunterra</td><td>104506</td><td>Mała zanurzalna pompa fontannowa dostępna w sklepach z artykułami ogrodniczymi</td></tr><tr><td>Wąż do pompy fontannowej</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td>Wąż kompatybilny z pompą fontannową</td></tr><tr><td>Zacisk plastikowy</td><td>Sklep sprzętowy</td><td></td><td>Zacisk do przymocowania węża do blachy do pieczenia</td></tr><tr><td>Przezroczyste plastikowe pokrywki z polistyrenowych płytek Falcon Microtest 96-dołkowych z płaskim dnem</td><td>BD Biosciences</td><td>351172</td><td>Przezroczyste plastikowe pokrywki do przykrywania płytek z siewkami Ice-Cap</td></tr><tr><td>Taśma chirurgiczna 3M Micropore</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027-761</td><td></td></tr><tr><td>Stalowe kulki o średnicy 3/32 cala</td><td>Hartford Technologies, Rocky Hill, CT</td><td>034-006-1K</td><td>Stosowane do rozbijania tkanki korzeniowej po zbiorze</td></tr><tr><td>Elastyczne gumki do włosów 3 cali</td><td>Lokalny sklep spożywczy</td><td></td><td>Stosowane do mocowania płytki z korzeniami do płytki z siewkami</td></tr><tr><td>Drewniane szpikulce o średnicy 4 mm</td><td>Lokalny sklep spożywczy</td><td></td><td>Szikulce te są zazwyczaj używane do przygotowywania szaszłyków</td></tr><tr><td>Płytki filtrujące 1-mL bez frity marki Nunc firmy Fisher Scientific</td><td>Fisher Scientific</td><td>278012</td><td>96-dołkowe płytki z siewkami z otworami w dnie</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka PCR z wysokimi ściankami Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-230-242</td><td>96-dołkowe płytki z korzeniami</td></tr><tr><td>Agar – testowany pod kątem hodowli komórkowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 4-morfolino&amp;#8211;taurosulfonowy (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>Podstawowa mieszanka soli Murashige i Skoog (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-5524</td><td></td></tr><tr><td>Folia do zgrzewania termicznego Easy Peel</td><td>ABgene Limited</td><td>AB-0745</td><td>Folia do zgrzewania termicznego stosowana do uszczelniania płytek z korzeniami przed rozbiciem tkanek</td></tr><tr><td>Szeroka taśma pakowa marki Duck Brand, 3.00&quot; x 54.6 yd</td><td>Office Max</td><td>Item no. 21242139</td><td>Taśma klejąca do uszczelniania mikropłytek zawierających ekstrakty DNA do przechowywania</td></tr><tr><td>Wałek do uszczelniania</td><td>Bio-Rad</td><td>MSR-0001</td><td>Ręczne narzędzie wałkowe do dociskania klejącej taśmy uszczelniającej do mikropłytek</td></tr><tr><td>96-dołkowy metalowy blok termiczny</td><td>Cole-Parmer</td><td>36400-66</td><td>Stosowany do zamrażania płytek z korzeniami w celu zbioru tkanek</td></tr><tr><td>Papier filtracyjny Whatman</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1002 090</td><td>Stosowany do sterylizacji powierzchniowej nasion</td></tr><tr><td>Jednorazowa pipeta Pasteura</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6A</td><td>Jednorazowa pipeta Pasteura 5 &amp;#190;&quot; stosowana do przenoszenia nasion do płytki z siewkami</td></tr><tr><td>Naczynie żaroodporne Pyrex (20 cm x 30 cm)</td><td>Dom Towarowy Target</td><td></td><td>Stosowane do przygotowania kąpieli z suchego lodu i etanolu</td></tr><tr><td colspan="4"> </td></tr></tbody></table>

ice-cap: metoda hodowli roślin arabidopsis oraz pomidora w płytkach 96-dołkowych do genotypowania wysokoprzepustowego

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Wśród naukowców zajmujących się roślinami coraz powszechniejsze staje się opracowywanie projektów wymagających genotypowania ogromnej liczby roślin. Pierwszym krokiem w każdym projekcie genotypowania jest pobranie próbki tkanki z każdej pojedynczej rośliny. Tradycyjne podejście do tego zadania polega na pobieraniu próbek z roślin jedna po drugiej. Jeśli jednak celem jest genotypowanie setek lub tysięcy osobników, zastosowanie tej strategii prowadzi do powstania znacznego wąskiego gardła w procesie genotypowania. Opisana tutaj metoda Ice-Cap stanowi rozwiązanie o wysokiej przepustowości dla tego problemu, umożliwiając jednemu naukowcowi pobranie tkanki z kilku tysięcy siewek w ciągu jednego dnia 1,2. Taki poziom przepustowości jest możliwy dzięki temu, że tkanka jest pobierana z 96 roślin jednocześnie, a nie pojedynczo.
Metoda Ice-Cap stanowi zintegrowaną platformę do prowadzenia hodowli siewek, poboru tkanek i ekstrakcji DNA. Podstawą metody Ice-Cap jest hodowla siewek w zestawieniu dwóch ułożonych jedna na drugiej płytek 96-dołkowych. Dołki górnej płytki zawierają wkładki z pożywki agarowej, na których kiełkują poszczególne siewki. Korzenie rosną w dół przez podłoże agarowe, opuszczają górną płytkę przez otwór i przechodzą do dolnej płytki zawierającej wodę. Aby pobrać tkankę do ekstrakcji DNA, wodę w dolnej płytce zawierającej tkankę korzeniową gwałtownie zamraża się, podczas gdy siewki w górnej płytce pozostają w temperaturze pokojowej. Następnie górna płytka jest oddzielana od dolnej, co pozwala uzyskać jedną płytkę z 96 zamrożonymi w lodzie próbkami tkanki korzeniowej oraz jedną płytkę z 96 żywymi siewkami. Technikę nazwano „Ice-Cap”, ponieważ wykorzystuje ona lód do przechwycenia tkanki korzeniowej. Płytka 96-dołkowa z siewkami może zostać następnie owinięta folią i przeniesiona do niskiej temperatury. Proces ten wstrzymuje dalszy wzrost siewek, ale nie wpływa na ich żywotność. Po zakończeniu analizy genotypu siewki o pożądanym genotypie mogą zostać przeniesione z płytki 96-dołkowej do gleby w celu dalszej propagacji. Wykazaliśmy użyteczność metody Ice-Cap na przykładzie siewek Arabidopsis thaliana, pomidora i ryżu. Przewidujemy, że metoda ta powinna być możliwa do zastosowania również u innych gatunków roślin o nasionach na tyle małych, aby zmieściły się w dołkach płytek 96-dołkowych.

Metoda Ice-Cap pozwala na hodowlę roślin w płytkach 96-dołkowych oraz niedestrukcyjne pobieranie tkanki korzenia z każdej siewki. DNA wyekstrahowane z tej tkanki korzenia może być wykorzystane w reakcjach genotypowania. Stwierdziliśmy, że metoda Ice-Cap sprawdza się w przypadku siewek Arabidopsis thaliana, pomidora oraz ryżu.

Ice-Cap: Metoda hodowli roślin Arabidopsis oraz pomidora w płytkach 96-dołkowych do genotypowania wysokoprzepustowego

Coraz powszechniejsze staje się opracowywanie przez naukowców zajmujących się roślinami projektów wymagających genotypowania ogromnej liczby roślin. Pierwszym krokiem w każdym procesie genotypowania...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest wyizolowanie próbek tkanek korzeniowych z siewek roślin hodowanych w płytkach 96-dołkowych w celu ekstrakcji DNA i genotypowania. Cel ten osiąga się poprzez najpierw wykiełkowanie siewek w specjalnych płytkach 96-dołkowych, które zawierają podłoże wzrostowe agar i posiadają otwory w dnie każdego dołka. Drugim krokiem jest ustawienie płytki z siewkami na standardowej płytce 96-dołkowej wypełnionej wodą.Gdy korzenie wyrosną w dół do dolnej płytki 96-dołkowej, ułożone jedna na drugiej płytki umieszcza się w bloku mrożącym w celu zamrożenia wody w dolnej płytce. Ostatnim krokiem jest oddzielenie górnej płytki od dolnej, co powoduje odłamanie korzeni, które pozostają zamrożone w dolnej płytce. W rezultacie otrzymane próbki tkanki korzenia mogą zostać wykorzystane do ekstrakcji DNA z każdej poszczególnej rośliny w celu analizy genotypu.Główną zaletą metody ice cap w porównaniu z alternatywnymi metodami jest możliwość izolacji DNA z tysięcy roślin w ciągu jednego dnia. Taki poziom wydajności jest możliwy dzięki temu, że w metodzie ice cap rośliny są przetwarzane w grupach po 96 sztuk, a nie pojedynczo, jak w tradycyjnym podejściu. Przykłady zastosowania metody ice cap obejmują przesiewanie dużych populacji roślin w celu zidentyfikowania rzadkich rekombinantów między ściśle sprzężonymi roślinami generującymi IDE, które niosą dużą liczbę różnych zmapowanych mutacji, a także przeprowadzanie selekcji wspomaganej markerami u gatunków uprawnych.W zasadzie w każdym eksperymencie wymagającym genotypowania dużej liczby poszczególnych roślin, zastosowanie naczynia icecap może przynieść korzyści. Pierwotnie opracowaliśmy icecap do użytku przy ropniach króliczych, ale z sukcesem wykorzystaliśmy go również do pobierania tkanek z siewek ryżu i pomidora. Przewidujemy, że icecap będzie skuteczny również w przypadku innych gatunków, pod warunkiem, że ich nasiona są wystarczająco małe, aby zmieścić się w płytce 96-dołkowej.Najpierw owinąć płytki z siewkami w folię i wysterylizować w autoklawie jednocześnie. Po zakończeniu cyklu autoklawowania namoczyć przezroczyste plastikowe pokrywki płytek w 95% etanolu, a następnie pozostawić płytki i pokrywki do całkowitego wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Po całkowitym wyschnięciu płytek nakleić taśmę pakową na dno każdej płytki i szczelnie docisnąć za pomocą wałka.Następnie za pomocą dozownika do mikropłytek microfill lub pipety wielokanałowej nalić 450 µL roztopionej pożywki wzrostowej do otworów każdej płytki z siewkami. Przykryć płytki plastikowymi pokrywkami i pozwolić pożywce wzrostowej stężeć w temperaturze pokojowej. Rozsypać suche nasiona na papierze filtracyjnym Watman i dokładnie pokryć każde nasiono 95% etanolem.Następnie należy pozostawić nasiona do całkowitego wyschnięcia na powietrzu. W kolejnym kroku przenieś nasiona na płytki do siewek, przykładając najpierw zaklejony ogniem koniec zmodyfikowanej pipety szklanej do powierzchni pożywki agarowej. Pozwala to na nawilżenie końcówki pipety, co ułatwia pobranie pojedynczego nasiona i przeniesienie go na powierzchnię agaru.Gdy w każdej studzience znajdzie się nasiono, należy przykryć każdą płytkę z siewkami przezroczystą plastikową pokrywką i uszczelnić taśmą chirurgiczną micropore. Stosy płytek należy owinąć folią aluminiową i przechowywać w temperaturze 4 °C przez cztery dni w celu stratyfikacji nasion i synchronizacji kiełkowania. Po czterech dniach płytki z siewkami należy umieścić pod światłem fluorescencyjnym w temperaturze od 18 do 20 °C na kolejne cztery dni.Aby zainicjować kiełkowanie, zmontuj fontannę z czapą lodową na półce w pomieszczeniu do uprawy roślin w taki sposób, aby powierzchnia fontanny z czapą lodową była bezpośrednio oświetlona światłem fluorescencyjnym. Aby zmontować urządzenie, najpierw umieść specjalną konstrukcję regału w plastikowym pojemniku do przechowywania, a następnie połóż na niej blachę do pieczenia.Użyj nakrętek poziomujących, aby wyregulować poziom blachy. Następnie umieść pompę zanurzeniową w pojemniku i przymocuj wąż wylotowy pompy do boku blachy za pomocą zacisku sprężynowego. Następnie napełnij fontannę czapy lodowej mieszaniną trzech części wody destylowanej i jednej części wody z kranu.Należy dolewać wodę, aż pompa zanurzeniowa znajdzie się kilka centymetrów poniżej poziomu wody. Końcowy poziom wody w plastikowym pojemniku należy zaznaczyć za pomocą taśmy laboratoryjnej i markera. Płytki do korzeni przygotowuje się poprzez dodanie jednej stalowej kulki do każdej studzienki płytki 96-dołkowej przeznaczonej do korzeni.Następnie do każdej studzienki płytki z korzeniami należy wlać 340 µL mieszaniny składającej się z trzech części wody destylowanej na jedną część wody z kranu. Należy odkleić folię zabezpieczającą z dna płytek z siewkami i zdjąć przezroczyste plastikowe pokrywy.Każdą płytkę z siewkami należy umieścić w płytce korzeniowej zawierającej metalową kulkę i wodę, a następnie zabezpieczyć sparowane płytki dwiema gumkami recepturkami. Następnie stos płytki należy umieścić w fontannie z czapką lodową. Sparowane płytki powinny pozostać w fontannie z czapką lodową od 10 do 14 dni.W tym czasie należy utrzymywać poziom wody w fontannie z czapką lodową, dopełniając ją wodą destylowaną. Gdy większość siewek wykształci tkankę korzenia, która przeniknęła przez płytki korzeniowe, należy wyjąć płytki z fontanny z czapką lodową w celu przygotowania do zbioru tkanki korzenia. Po wyjęciu płytek z fontanny z czapką lodową, należy wsunąć trzy drewniane wykałaczki pomiędzy studzienki ułożonych w stosie płytek z siewkami i płytkach korzeniowych.Szaszłyki uniosą wierzchołki płytek z siewkami ponad otwory w płytkach z korzeniami. Pozostaw ustawione w stosy płytki z „czapą lodową” i włożonymi drewnianymi szaszłykami na noc pod lampami. Inkubacja ta pozwala na niewielkie odparowanie cieczy z płytek z korzeniami, co ułatwia późniejsze procesy mrożenia i rozdzielania płytek.W dniu pobrania tkanek należy przygotować kąpiel mrożącą. Umieść metalowy blok termiczny na 96 studzienek w naczyniu Pyrex z mieszaniną suchego lodu i 95% etanolu. Pozostaw blok termiczny na około 20 minut, aby wyrównał temperaturę.Umieść ułożone w stosie płytki z lodowymi czapkami, zabezpieczone drewnianymi wykałaczkami, na schłodzonym bloku termicznym i inkubuj przez pięć minut. W tym czasie woda w płytce korzeniowej całkowicie zamarznie. Wyjmij stos płytek z kąpieli mrożącej i połóż go na stole laboratoryjnym w temperaturze pokojowej, a następnie usuń gumki recepturki oraz drewniane wykałaczki z ułożonych płytek.Mocno naciśnij górną część płytki z siewkami, aby rozdzielić płytki. Następnie ostrożnie oddziel płytkę z korzeniami od płytek z siewkami. Pozostaw wodę w płytkach z korzeniami do rozmrożenia w temperaturze pokojowej.W przeciwnym razie proces rozmrażania można przyspieszyć, inkubując płytki z korzeniami w bloku grzewczym. Ustaw temperaturę 25 °C na czas rozmrażania płytek z korzeniami. Płytki z siewkami mogą zostać przygotowane do przechowywania.Aby to zrobić, należy uszczelnić dolną część płytki z siewkami za pomocą taśmy klejącej. Następnie na wierzchu płytki z siewkami należy umieścić przezroczystą plastikową pokrywkę i zabezpieczyć ją taśmą micropore.Ułóż płytki z siewkami jedna na drugiej, owiń je folią aluminiową i umieść siewki arabidopsis w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza. Siewki mogą być przechowywane w tych temperaturach przez kilka tygodni bez utraty żywotności. Upewnij się, że woda w płytkach z korzeniami całkowicie rozmroziła się.Przed przystąpieniem do procedury ekstrakcji DNA należy sprawdzić płytki w celu ustalenia, czy którekolwiek z dołków nie zawiera znacznie mniejszej ilości wody niż pozostałe; do dołków wymagających uzupełnienia należy doprowadzić wodę destylowaną za pomocą pipety. Następnie do każdego dołka płytki z korzeniami należy nanieść 25 µL roztworu 500 mM TRISS 50 mM EDTA. Następnie dołki w płytkach z korzeniami należy zamknąć, używając folii do uszczelniania termicznego oraz zgrzewarki termicznej.Umieść uszczelnione płytki z korzeniami w urządzeniu geno grinder, tak aby uszczelniona strona płytek była skierowana w dół. Wstrząsaj płytkami w geno grinderze przez trzy i pół minuty przy prędkości 1 350 ruchów na minutę. Przenieś płytki do wirówki z adapterami do mikropłytek i wiruj je przez 10 minut przy 3 500 RPM w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać pellet z rozdrobnionej tkanki korzenia.Używając pipety wielokanałowej, przenieś 20 µL supernatantu z każdej studzienki płytki z korzeniami do nowej płytki 96-dołkowej, w której każdej studzience znajduje się 80 µL wody milli Q. Ten rozcieńczony ekstrakt zawiera genomowe DNA, które można bezpośrednio wykorzystać w reakcji PCR do genotypowania zgodnie ze standardowymi protokołami. Po zidentyfikowaniu genotypu każdej siewki, wyjmij płytki z siewkami z chłodni i przygotuj doniczki z nasyconą wodą mieszanką glebową; używając sprężonego powietrza i gumowego wężyka, przyłóż delikatne ciśnienie powietrza do małego otworu w studzience płytki z siewkami, aby wypchnąć korek agaru wraz z siewką z płytki na blat laboratoryjny.Wykonaj w glebie mały otwór o wielkości zbliżonej do średnicy krążka agaru. Następnie umieść krążek agaru w glebie i uciśnij wokół niego wilgotną ziemię, aby ustabilizować siewkę w podłożu. Przesadzone siewki umieść pod oświetleniem w temperaturze od 18 do 22 °C.Każdą doniczkę należy przykryć plastikową pokrywką przez pierwsze dwa dni po przesadzeniu. Następnie należy zdjąć pokrywkę i hodować rośliny w standardowych warunkach wzrostu. Zdjęcie przedstawia siewki Arabidopsis, które były hodowane w fontannie lodowej (ice cap fountain) przez dwa tygodnie i są gotowe do zbioru tkanek.Każda z dwóch studni zawiera siewkę Arabidopsis. Ten widok z boku tych samych dwóch studni płytki korzeniowej pokazuje korzenie owijające się wokół wewnętrznej powierzchni studni. Technika ta może być wykorzystana do przetworzenia do 40 płytek icecap w ciągu ośmiogodzinnego dnia pracy.Pozwala to jednemu naukowcowi na przygotowanie próbek DNA z ponad 3 800 pojedynczych siewek w ciągu jednego dnia. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o przeniesieniu płytek do fontanny z lodową osłoną natychmiast po wykiełkowaniu siewek. Sprawdzaj płytki codziennie, aby nie przegapić właściwego momentu przeniesienia danych. Powodzenia w eksperymentach.

ice-cap-method-for-growing-arabidopsis-tomato-plants-96-well-plates

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ice-Cap: Metoda uprawy Arabidopsis i roślin pomidorowych w płytkach 96-dołkowych do wysokowydajnego genotypowania

Ten artykuł opisuje metody badania przesiewowego genów kontrolujących przepuszczalność plazmodalną, a tym samym gradient auksyny podczas odpowiedzi tropikalnej. Obejmuje to pomiar stopnia odpowiedzi tropikalnej u hipokotylu Arabidopsis thaliana i sprawdzenie przepuszczalności plazmodalnej przez obciążenie kwasem 8-hydroksypireno-1,3,6-trisulfonowym (HPTS) i wreszcie ocenę poziomu kalozy.

Strategia walidacji roli bramkowania plazmodowego za pośrednictwem kalozy w odpowiedzi tropikalnej

Korzystając z montażu DNA, wiele wektorów CRISPR może być konstruowanych równolegle w jednej reakcji klonowania, co sprawia, że budowa dużej liczby wektorów CRISPR jest prostym zadaniem. Owłosione korzenie pomidora są doskonałym systemem modelowym do walidacji wektorów CRISPR i generowania zmutowanych materiałów.

Wysokoprzepustowa konstrukcja wektora CRISPR i charakterystyka modyfikacji DNA przez generowanie owłosionych korzeni pomidora

Celem tego badania było określenie wpływu sterylizacji wybielaczem i chlorem gazowym na kiełkowanie nasion szeregu genotypów Arabidopsis uprawianych na sterylnych podłożach. Opracowano zoptymalizowane protokoły sterylizacji, aby zapobiec rozwojowi zanieczyszczeń mikrobiologicznych, zapewniając jednocześnie zadowalającą przeżywalność nasion.

Standaryzowana metoda wysokoprzepustowej sterylizacji nasion rzodkiewnika

Przeprowadzono wysokoprzepustowe badanie przesiewowe syntetycznych małych cząsteczek na modelowym gatunku rośliny, Arabidopsis thaliana. Protokół ten, opracowany dla robota do obsługi cieczy, zwiększa szybkość badań przesiewowych genetyki chemicznej, przyspieszając odkrywanie nowych małych cząsteczek wpływających na fizjologię roślin.

Optymalizacja wykorzystania robota do obsługi cieczy w celu przeprowadzenia wysokoprzepustowego badania przesiewowego genetyki chemicznej Arabidopsis thaliana

Często konieczne jest oszacowanie potencjalnej cytotoksyczności zestawu związków na hodowanych komórkach. W tym miejscu opisujemy strategię niezawodnego badania przesiewowego pod kątem toksycznych związków w formacie 96-dołkowym.

Strategia identyfikacji związków, które wpływają na wzrost i przeżycie komórek w hodowanych komórkach ssaków przy niskiej lub umiarkowanej przepustowości

Delikatna maszyna do ładowania dotykiem zbudowana jest ze szczotek do włosów ludzkich, ramion robota i kontrolera. Szczotki do włosów są napędzane przez ramiona robotyczne zainstalowane na maszynie i poruszają się okresowo, aby wywierać siłę nacisku na rośliny. Siła dotyku włosów sterowanych maszynowo jest porównywalna z siłą dotyku nakładanego ręcznie.

Oszczędzający pracę i powtarzalny protokół ekranowy sygnalizacji siły dotyku do badania tigmomorfogenezy modelowej rośliny Arabidopsis thaliana

Ten artykuł opisuje dwie metody ilościowego określania reakcji obronnych u Arabidopsis thaliana po ekspozycji na elicytory immunologiczne: przejściowy wybuch oksydacyjny i zahamowanie wzrostu siewki.

Testy wybuchu oksydacyjnego wywołanego wzorcem i zahamowania wzrostu siewek u Arabidopsis thaliana

Test zalewania sadzonek ułatwia szybkie badanie odmian dzikich pomidorów pod kątem odporności na bakterię Pseudomonas syringae. Ten test, stosowany w połączeniu z testem wzrostu bakterii siewek, może pomóc w dalszym charakteryzowaniu podstawowej odporności na bakterię i może być wykorzystany do mapowania populacji w celu określenia genetycznych podstaw odporności.

Wysokoprzepustowa identyfikacja oporności na Pseudomonas syringae pv. Pomidor w pomidorze za pomocą testu powodziowego sadzonek

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) oferuje możliwość analizowania programów rozwojowych przy minimalnym przetwarzaniu narządów i tkanek. Protokół zapewnia wysokiej jakości RNA z komórek ukierunkowanych na podjednostkę rybosomalną znakowaną zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Narzędzia do dalszej analizy, takie jak qRT-PCR lub sekwencja RNA, ujawniają profile ekspresji specyficzne dla typu tkanki i komórki.

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) w celu zbadania rozwoju korzeni rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) w skali specyficznej dla typu komórki

Dostępny jest protokół o wysokiej przepustowości do powierzchniowej sterylizacji nasion Arabidopsisthaliana (Arabidopsis), optymalizujący etapy obsługi cieczy za pomocą prostego urządzenia ssącego zbudowanego z pompą próżniową. Setki próbek nasion można wysterylizować powierzchniowo w ciągu jednego dnia.

Wysokowydajna, wytrzymała i bardzo elastyczna w czasie metoda powierzchniowej sterylizacji nasion rzodkiewnika

Tutaj opisujemy zaawansowane narzędzie przeznaczone do monitorowania biosyntezy chlorofilu podczas wczesnych etapów deetiolacji siewek rzodkiewnika. Nowatorska metodologia umożliwia nieinwazyjne obrazowanie fluorescencji chlorofilu w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.

Nieinwazyjny test do oznaczania kinetyki biosyntezy chlorofilu we wczesnych stadiach deetiolacji rzodkiewnika

Poznaj metodę Ice-Cap do izolacji tkanek korzeniowych z siewek roślin w płytkach 96-dołkowych. Technika umożliwia ekstrakcję DNA i wysokoprzepustowe genotypowanie Arabidopsis thaliana, pomidora i ryżu.

Ice-Cap: Metoda hodowli roślin Arabidopsis oraz pomidora w płytkach 96-dołkowych do genotypowania wysokoprzepustowego

Przeglądaj więcej filmów