Implantacja mankietu tętnicy szyjnej w celu wywołania miażdżycy indukowanej naprężeniem ścinającym u myszy
13 stycznia 2012
Opaska uciskowa przedstawiona w tym artykule została zaprojektowana w celu wywołania miażdżycy w tętnicy szyjnej wspólnej myszy. Dzięki stożkowatemu kształtowi wewnętrznego światła, wszczepiona opaska generuje wyraźnie określone obszary niskiego, wysokiego i oscylacyjnego naprężenia ścinającego, co wywołuje rozwój zmian miażdżycowych o różnych fenotypach zapalnych.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest implantacja modyfikatora naprężeń ścinających wokół jednej z dwóch tętnic szyjnych wspólnych w mysim modelu miażdżycy. Jest to realizowane poprzez wstępne wycięcie dwóch połowy wzdłużnych modyfikatora naprężeń ścinających z formowanego polieteroketonu. Następnie otwiera się szyję myszy doświadczalnej i odsłania jedną z dwóch tętnic szyjnych wspólnych.
Następnie dwie połówki mankietu zostają umieszczone wokół obu tętnic szyjnych wspólnych, a połówki są ze sobą połączone za pomocą nici chirurgicznej, aby utworzyć stożkowate wewnętrzne światło funkcjonalnego mankietu. Na koniec szyja zwierzęcia zostaje zamknięta. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące zmienione parametry przepływu oraz naprężenia ścinające, co w konsekwencji prowadzi do powstania blaszek miażdżycowych powyżej i poniżej mankietu.
Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat powstawania blaszek miażdżycowych, można ją również zastosować do innych zagadnień dotyczących dysfunkcji śródbłonka i zapalenia naczyń. Modyfikator naprężenia ścinającego składa się z dwóch podłużnych połówek cylindra z lumenem w kształcie stożka.
Połówki otoczek wykonane są z termoplastycznego polieteroketonu, a każdy odlew zawiera połówki otoczek o różnych rozmiarach, od 150 micrometers do 300 micrometers. Aby przygotować modyfikator naprężenia ścinającego, pracując pod mikroskopem chirurgicznym, należy chwycić połówkę otoczki pęsetą tępą i za pomocą ostrego skalpela delikatnie wyciąć ją z odlewu. Następnie należy umieścić prekursor połówki otoczki na płaskiej, antypoślizgowej płytce.
Utrwalić go za pomocą pęsety tępej i rozciąć dokładnie wzdłuż wcześniej wykonanego nacięcia. Aby usunąć zamknięty koniec, należy delikatnie wygładzić wszelkie pozostałe ostre krawędzie. Przechowywać połówki mankietów, pogrupowane według rozmiaru, w 70% etanolu.
W procedurze implantacji mankietu należy rozpocząć od wykorzystania 10-tygodniowych myszy z nokautem genu APOE o masie co najmniej 20 g. Należy założyć fartuch chirurgiczny, maseczkę, czepek oraz jałowe rękawiczki.
Sterylizuj narzędzia przez 30 s w sterylizatorze koralikowym, a następnie umieść je na sterylnej, nieprzezroczystej ściereczce. Znieczul mysz 3% isofluranem i sprawdź głębokość znieczulenia, wykonując ucisk palca u nogi. Usuń owłosienie między żuchwą a mostkiem, stosując środek depilacyjny lub korzystając z precyzyjnej golarki elektrycznej.
Umieść mysz na podgrzewanej płycie chirurgicznej w pozycji grzbietnej. Następnie zastosuj środek nawilżający, aby zapobiec wysychaniu oczu. W przypadku stosowania izofluranu, umieść gryzonia w masce i podaj 2% izofluranu.
Przymocuj taśmą podłoże oraz tylne łapy i ustal maskę twarzową. Przygotuj wcześniej przygotowaną mankietkę, półpowłoki o różnych rozmiarach oraz odcinek nici jedwabnej 6-0 o długości 2,5 centymetra do połączenia półpowłok w miejscu okluzji tętnicy szyjnej. Demonstracja wizualna tej metody jest kluczowa, ponieważ kroki przedstawiające preparację tętnicy szyjnej w określonej pozycji pomagają zminimalizować manipulację tkankami.
Ponadto chciałbym zaznaczyć, że prawidłowe umieszczenie i dopasowanie mankietu jest najważniejszym etapem w celu uzyskania powtarzalnych wyników. Aby to zapewnić, zdefiniowaliśmy precyzyjną pozycję anatomiczną jako miejsce implantacji. Dodatkowo, prawidłowe dopasowanie mankietu jest ułatwione dzięki rowkowi na powierzchni zewnętrznej mankietu, półmuszli, który służy jako prowadnica dla łączącego gwintu.
Zdezynfekuj skórę obfitą ilością Betadinu. Za pomocą małych, ostrych nożyczek wykonaj nacięcie skóry i leżącej pod nią powięzi szyi, wykonując cięcie przyśrodkowe o długości od czterech do pięciu milimetrów, zaczynając od górnej krawędzi mostka; rozszerz otwór, odsuń prawy gruczoł ślinowy przyuszny i wprowadź rozszerzacze, aby odsłonić pole operacyjne. Następnie wykonaj tępe rozcięcie w kierunku przyśrodkowym, tuż po lewej stronie tchawicy, w miejscu, gdzie prawy mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy krzyżuje się z prawym mięśniem łopatkowo-gnykowym, aby zlokalizować pulsującą prawą tętnicę szyjną wspólną.
Używając bardzo cienkich pęsety kątowej lub zakrzywionej, wypreparuj prawą tętnicę szyjną wspólną, delikatnie usuwając otaczającą ją tkankę łączną. Oddziel tętnicę szyjną od nerwu błędnego, który jest białą, nitkowatą strukturą biegnącą bezpośrednio wzdłuż tętnicy szyjnej.
Ponieważ ten krok jest niezbędny do całkowitego odsłonięcia naczynia, należy uważać, aby nie uszkodzić nerwu błędnego ani odgałęzienia prawej żyły szyjnej wewnętrznej, która również ściśle przylega do tętnicy szyjnej. Aby dobrać odpowiedni rozmiar mankietu, należy porównać średnicę odsłoniętej tętnicy szyjnej z wewnętrzną średnicą mankietu (połówek); największa szerokość światła mankietu powinna odpowiadać średnicy zewnętrznej tętnicy szyjnej. Następnie ostrożnie wprowadź końcówkę pęsety pod tętnicę szyjną.
Otwórz pęsetę. Przełóż fragment szwu jedwabnego 6-0 pod tętnicę i uformuj pętlę; umieść jedną mankietową półmuszlę pod tętnicą szyjną, tak aby strona o największym zwężeniu znajdowała się z prądem przepływu. Umieść drugą mankietową półmuszlę wewnątrz pętli na wierzchu tętnicy szyjnej.
Delikatnie zaciśnij pętlę szwu i zawiąż nić. W ten sposób powstaje działający modyfikator naprężenia ścinającego. Aby zapewnić precyzyjne dopasowanie mankietu, niezbędne jest, aby szew przebiegał dokładnie wewnątrz wstępnie uformowanego rowka na zewnętrznej powierzchni mankietu.
Stożkowate zwężenie tętnicy powinno być teraz wyraźnie widoczne. Mankiet należy zawsze umieścić wokół jednej z dwóch wspólnych tętnic szyjnych zwierzęcia, a strona przeciwległa służy jako kontrola. Tutaj widoczny jest stożkowaty kształt wewnętrznego światła.
Ten stożkowaty kształt jest niezbędny do utworzenia trzech obszarów o odmiennej dynamice przepływu. Przesuń prawy gruczoł ślinowy przyuszny z powrotem na pierwotne miejsce. Zbliż i zamknij skórę, używając niewielkiej ilości szwów z prolinu 6-0 lub klipsów chirurgicznych.
Podaj podskórnie pojedynczą dawkę karprofenu w ilości 5 mg/kg w celu profilaktycznego leczenia bólu, a następnie umieść mysz w komorze grzewczej do czasu wybudzenia. Jeśli następnego dnia zwierzę będzie wykazywać oznaki stresu, podaj drugą dawkę analgetyku. Typowe wzorce naprężeń ścinających indukowane przez odlew, obliczone na podstawie pomiarów dopplerowskich, oraz odpowiadające im prędkości przepływu oparte na prędkości kontrastu fazowego.
Przedstawiono tutaj obrazy MR po implantacji mankietu u myszy z knockoutem P OE, karmionych dietą typu zachodniego. Zmieniona dynamika przepływu wywołuje indukowane naprężeniem ścinającym odkładanie blaszek miażdżycowych powyżej zwężenia stożkowego. Niski laminarny naprężenie ścinające prowadzi do masywnego rozwoju blaszek miażdżycowych o fenotypie bardziej podatnym na pękanie, charakteryzującym się obecnością rdzeni lipidowych blisko centralnego światła naczynia, przykrytych jedynie cienką czapką włóknistą.
Stożkowaty wewnętrzny prześwit mankietu prowadzi do zwiększenia prędkości przepływu. W obszarze tym, bezpośrednio za miejscem zwężenia, niemal nie obserwuje się odkładania blaszki miażdżycowej. Nagłe poszerzenie tętnicy skutkuje powstaniem obszaru wirów i oscylacyjnych parametrów przepływu, co powoduje mniej rozległy rozwój blaszki o bardziej stabilnym fenotypie.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak prawidłowo umieścić modyfikator naprężenia ścinającego wokół wspólnej tętnicy szyjnej myszy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono metodę indukowania miażdżycy w tętnicach szyjnych wspólnych myszy z wykorzystaniem specjalnie zaprojektowanej opaski zwężającej. Stożkowaty kształt opaski tworzy wyraźne obszary naprężeń ścinających, co prowadzi do powstania zmian miażdżycowych o zróżnicowanej charakterystyce zapalnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania układu sercowo-naczyniowego
- Modelowanie miażdżycy
- Analiza naprężeń ścinających
Wstęp
- Miażdżyca jest główną chorobą układu sercowo-naczyniowego.
- Naprężenie ścinające wpływa na tworzenie się blaszek miażdżycowych w tętnicach.
- Modele mysie są powszechnie wykorzystywane do badania miażdżycy.
- Zrozumienie naprężenia ścinającego może pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych.
Cel badania
- Implantacja modyfikatora naprężeń ścinających wokół tętnicy szyjnej.
- Analiza wpływu różnych obszarów naprężeń ścinających na miażdżycę.
- Badanie fenotypów zapalnych zmian miażdżycowych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie modyfikatora naprężenia ścinającego z polieteroketonu.
- Chirurgiczne odsłonięcie tętnicy szyjnej wspólnej u myszy.
- Umieszczenie półmankietów wokół tętnicy.
- Zamknięcie miejsca operacyjnego po implantacji.
Główne wyniki
- Po implantacji zaobserwowano zmiany parametrów przepływu.
- Zidentyfikowano obszary niskiego, wysokiego oraz oscylacyjnego naprężenia ścinającego.
- Blaszki miażdżycowe utworzyły się powyżej i poniżej mankietu.
- Zdokumentowano różne fenotypy zapalne zmian.
Wnioski
- Mankiet skutecznie modyfikuje naprężenie ścinające w tętnicy szyjnej.
- Model ten może być wykorzystany do badania rozwoju miażdżycy.
- Zrozumienie wpływu naprężeń ścinających może prowadzić do opracowania lepszych metod leczenia.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Powtarzalne modelowanie miażdżycy indukowanej naprężeniem ścinającym u myszy umożliwia precyzyjną analizę stanu zapalnego naczyń i fenotypów blaszek miażdżycowych na wczesnych etapach odkrywania leków. Podejście to wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego oraz walidację punktów uchwytu w procesie poszukiwania leków sercowo-naczyniowych, zapewniając kontrolowany system do badania rozwoju zmian zależnych od przepływu. Zdolność tej metody do generowania różnych typów zmian zwiększa pewność prognostyczną w badaniach translacyjnych i selekcji projektów w portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia systematyczną ocenę wpływu naprężeń ścinających na dysfunkcję śródbłonka i ekspresję genów zapalnych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez korelację dynamiki przepływu z fenotypem zmiany chorobowej.
- Ułatwia mechanistyczną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów naczyniowych zaangażowanych w miażdżycę.
- Zapewnia platformę do weryfikacji hipotez dotyczących szlaków chorobowych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Ustanawia zwalidowany system in vivo do oceny wpływu potencjalnych interwencji na tworzenie się blaszek miażdżycowych.
- Zapewnia powtarzalne i mierzalne wyniki w zakresie zmian chorobowych na potrzeby badań porównawczych.
- Wspiera standaryzację analizy poprzez zdefiniowanie rozmieszczenia anatomicznego oraz parametrów przepływu.
- Umożliwia wiarygodną ocenę wpływu związków na odmienne fenotypy blaszek miażdżycowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia zestawienie fenotypów zmian z cechami istotnymi dla ludzkich schorzeń w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Stanowi pomost między biologią odkrywczą a przedkliniczną walidacją celów naczyniowych.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem oceny ryzyka, w oparciu o dane mechanistyczne i fenotypowe.
- Wspiera dopasowanie biomarkerów poprzez korelację dynamiki przepływu ze stabilnością zmian.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta znajduje zastosowanie na etapie od wczesnego odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając weryfikację hipotez, walidację celów terapeutycznych oraz badania translacyjne w modelach chorób układu sercowo-naczyniowego.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia kontrolowane testowanie hipotez dotyczących wpływu naprężeń ścinających na zapalenie naczyń i rozwój blaszki miażdżycowej.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, mierzalne wyniki w postaci zmian chorobowych do oceny potencjalnych kandydatów.
- Analityka: Umożliwia pomiar parametrów przepływu i fenotypów zmian w celu przeprowadzenia rzetelnego porównania statystycznego.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość badań poprzez modelowanie istotnych cech blaszki miażdżycowej obserwowanych u ludzi.
- Zastosowania instytucjonalne: Oferuje wielokrotnego użytku platformę in vivo dla różnorodnych zagadnień badawczych w dziedzinie naczyniowej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów naczyniowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowaną, powtarzalną i skalowalną indukcję zmian w celu zapewnienia porównywalności między badaniami.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez wczesne wyjaśnienie ryzyka biologicznego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację i rozwój programów kardio-naczyniowych z uwzględnieniem korekty ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach mikrochirurgicznych i znajomości anatomii naczyniowej.
- Wymagany jest dostęp do metod obrazowania w celu oceny przepływu i zmian (np. MRI, Doppler).
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja rozmieszczenia chirurgicznego i rozmiaru mankietu w obrębie całego zespołu.
- Można potrzebować adaptacji metody dla różnych szczepów myszy lub obszarów naczyniowych.
- Potencjalne ograniczenia obejmują zmienność techniczną oraz konieczność precyzyjnego celowania anatomicznego.
