Name: Odkrywanie topografii obwodów neuronowych w wielu kolorach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Poznaj metodę śledzenia obwodów neuronowych in vivo przy użyciu znaczników WGA-Alexa w myszach. Technika umożliwia wizualizację topograficznych projekcji w móżdżku, korze i rdzeniu kręgowym z wysoką rozdzielczością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca została sfinansowana ze środków na rozpoczęcie działalności badawczej dla nowych badaczy przyznanych RVS przez Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University.

<ol><li>Apps, R., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+cortical+organization%3A+a+one-map+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).</li>
<li>Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+spinocerebellar+projection+in+the+prenatal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse.</a> J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).</li>
<li>Mesulam, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMesulam%2C+M+%22Tracing+neural+connections+with+horseradish+peroxidase%22">Tracing neural connections with horseradish peroxidase</a>. , Wiley. New York. (1982).</li>
<li>Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+expression+of+a+cocaine-+and+amphetamine+regulated+transcript+%28CART%29+peptide+reveals+complex+circuit+topography+in+the+rodent+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Patterned expression of a cocaine- and amphetamine regulated transcript (CART) peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex.</a> Journal of Comparative Neurology. , (2011).</li>
<li>Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+mapping+of+afferent+topography+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Struct.+Funct%22%5BJournal%5D)">Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions.</a> Brain. Struct. Funct. , (2011).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Stephen, D., Lao, Z., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed+homeobox+genes+determine+the+organization+of+Purkinje+cell+sagittal+stripe+gene+expression+in+the+adult+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Engrailed homeobox genes determine the organization of Purkinje cell sagittal stripe gene expression in the adult cerebellum.</a> J. Neurosci. 28, 12150-12162 (2008).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Vogel, M. W., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed+homeobox+genes+regulate+establishment+of+the+cerebellar+afferent+circuit+map%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Engrailed homeobox genes regulate establishment of the cerebellar afferent circuit map.</a> J. Neurosci. 30, 10015-10024 (2010).</li>
<li>Vig, J., Goldowitz, D., Steindler, D. A., Eisenman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentation+of+the+reeler+cerebellum%3A+segregation+and+overlap+of+spinocerebellar+and+secondary+vestibulocerebellar+fibers+and+their+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compartmentation of the reeler cerebellum: segregation and overlap of spinocerebellar and secondary vestibulocerebellar fibers and their target cells.</a> Neuroscience. 130, 735-744 (2005).</li>
<li>Vogel, M. W., Prittie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+spinocerebellar+mossy+fiber+projections+are+maintained+in+the+lurcher+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Topographic spinocerebellar mossy fiber projections are maintained in the lurcher mutant.</a> J. Comp. Neurol. 343, 341-351 (1994).</li>
<li>Voogd, J., Broere, G., van Rossum, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+medio-lateral+distribution+of+the+spinocerebellar+projection+in+the+anterior+lobe+and+the+simple+lobule+in+the+cat+and+a+comparison+with+some+other+afferent+fibre+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Psychiatr.+Neurol.+Neurochir%22%5BJournal%5D)">The medio-lateral distribution of the spinocerebellar projection in the anterior lobe and the simple lobule in the cat and a comparison with some other afferent fibre systems.</a> Psychiatr. Neurol. Neurochir. 72, 137-151 (1969).</li>
<li>Wu, H. S., Sugihara, I., Shinoda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+patterns+of+single+mossy+fibers+originating+from+the+lateral+reticular+nucleus+in+the+rat+cerebellar+cortex+and+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Projection patterns of single mossy fibers originating from the lateral reticular nucleus in the rat cerebellar cortex and nuclei.</a> J. Comp. Neurol. 411, 97-118 (1999).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Opisaliśmy szczegóły chirurgiczne i techniczne niezbędne do skutecznego śledzenia aksonów i dendrytów z wykorzystaniem nowatorskiego podejścia opartego na fluorescencji do szybkiego znakowania projekcji neuronalnych u myszy w fazie rozwoju oraz u osobników dorosłych. Wykorzystując WGA-Alexa, pokazujemy, w jaki sposób znaczniki i markery mogą być używane do analizy topografii uformowanych obwodów z wysoką rozdzielczością i w trzech wymiarach.
Do śledzenia obwodów neuronalnych dostępnych jest w...

<table><tbody><tr><td>Sterylizator koralikowy</td><td>Fine Science Tools</td><td>Model Steri 250 Cat. # 18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Kauteryzator</td><td>Fine Science Tools</td><td>Cat. # 18000-00</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary z borokrzemianowego szkła</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Cat. # 300056</td><td></td></tr><tr><td>Dwustopniowy wyciągacz szklanych mikropipet</td><td>Narishige International</td><td>Model 001-PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka mikrometryczna</td><td>Gilmont Instruments</td><td>Cat. # GS-1100</td><td></td></tr><tr><td>Aparat stereotaktyczny dla małych zwierząt</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 940-A</td><td></td></tr><tr><td>Manipulator elektrod</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 960</td><td></td></tr><tr><td>Komora Vetcare</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Cat. # 340508</td><td></td></tr><tr><td>Mata grzewcza</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Cat. # 341241</td><td></td></tr><tr><td>Kamera Leica DFC360 FX</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC360 FX</td><td></td></tr><tr><td>Kamera Leica DFC490</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC490</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Leica DM5500</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM5500</td><td></td></tr><tr><td>Kamera Leica DFC3000 FX</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC3000 FX</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Leica MZ16 FA</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ16 FA</td><td></td></tr><tr><td>Filtr CY3</td><td>Leica Microsystems</td><td>Model # 11600231</td><td></td></tr><tr><td>Filtr FITC</td><td>Leica Microsystems</td><td>Model # 11513880</td><td></td></tr><tr><td>Filtr A4 DAPI/UV</td><td>Leica Microsystems</td><td>Model # 11504162</td><td></td></tr><tr><td>Aglutynina z zarodków pszenicy, koniugat Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>Cat. #W11261</td><td></td></tr><tr><td>Aglutynina z zarodków pszenicy, koniugat Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>Cat. #W32464</td><td></td></tr></tbody></table>

ujawnianie topografii obwodów neuronalnych w wielu kolorach

Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color

Obwody neuronalne są zorganizowane w funkcjonalne mapy topograficzne. Aby zwizualizować złożoną architekturę obwodów, opracowaliśmy metodę pozwalającą na wiarygodne znakowanie globalnego wzorca wielu projekcji topograficznych. Móżdżek stanowi idealny model do badania uporządkowanego układu obwodów neuronalnych. Na przykład przedziałowa organizacja rdzeniowo-móżdżkowych włókien mszystych okazała się niezbędnym systemem do badania wzorców włókien mszystych. Niedawno wykazaliśmy, że aglutynina z zarodków pszenicy (WGA) sprzężona z Alexa 555 i 488 może być wykorzystana do śledzenia projekcji rdzeniowo-móżdżkowych włókien mszystych u myszy w rozwoju i u osobników dorosłych (Reeber et al. 2011). Zidentyfikowaliśmy trzy główne właściwości, które czynią znaczniki WGA-Alexa pożądanymi narzędziami do znakowania projekcji neuronalnych. Po pierwsze, fluorofory Alexa są intensywne, a ich jasność umożliwia obrazowanie całych preparatów bezpośrednio po śledzeniu. Po drugie, znaczniki WGA-Alexa znakują całą trajektorię rozwijających się i dorosłych projekcji neuronalnych. Po trzecie, znaczniki WGA-Alexa są szybko transportowane zarówno w kierunku wstecznym, jak i w przód. W niniejszej pracy szczegółowo opisujemy sposób przygotowania znaczników i innych niezbędnych narzędzi, sposób przeprowadzenia zabiegu chirurgicznego w celu śledzenia dróg rdzeniowo-móżdżkowych oraz optymalne metody obrazowania śledzonych projekcji w trzech wymiarach. Podsumowując, przedstawiamy protokół śledzenia krok po kroku, który będzie przydatny w rozszyfrowywaniu organizacji i łączności map funkcjonalnych nie tylko w móżdżku, ale także w korze mózgowej, pniu mózgu i rdzeniu kręgowym.

Przedstawiamy praktyczny przewodnik po wprowadzaniu tracerów in vivo, wykorzystując drogę rdzeniowo-móżdżkową jako system modelowy do zaprezentowania kluczowych kroków niezbędnych do skutecznej analizy obwodów neuronalnych u myszy. Szczegółowo opisujemy nasz wszechstronny protokół śledzenia, który wykorzystuje aglutyninę z zarodków pszenicy (WGA) sprzężoną z fluoroforami Alexa.

Ujawnianie topografii obwodów neuronalnych w wielu kolorach

Obwody neuronalne są zorganizowane w funkcjonalne mapy topograficzne. W celu wizualizacji złożonej architektury obwodów opracowaliśmy metodę pozwalającą na niezawodne...

Niniejsza procedura opisuje wszechstronny protokół śledzenia in vivo, który wykorzystuje gluteninę z zarodków pszenicy sprzężoną z fluoroforami Alexa do śledzenia obwodów neuronalnych. W pierwszym kroku wykonuje się nacięcie w dolnym odcinku piersiowym oraz górnym odcinku lędźwiowym, a następnie przecina powięź i powierzchowne mięśnie grzbietu.Następnie przygotowuje się mikroelektrodę i mocuje ją do mikromanipulatora. Kolejnym krokiem jest wtryskiwanie pod ciśnieniem znaczników neuronalnych do rdzenia kręgowego. Ostatnim etapem tej procedury jest zapewnienie odpowiedniej opieki pooperacyjnej podczas rekonwalescencji oraz pozostawienie wystarczającej ilości czasu na transport znaczników przez docelowe szlaki.W rezultacie, dzięki mikroskopii immunofluorescencyjnej, można uzyskać wyniki obrazujące organizację i łączność map topograficznych w korze móżdżku, pniu mózgu i rdzeniu kręgowym. Główną zaletą tego znacznika w porównaniu z istniejącymi znacznikami, takimi jak BDA lub W-G-A-H-R-P, jest fakt, że znaczniki WGA Alexa są wystarczająco jasne, aby umożliwić obrazowanie wszystkich preparatów bezpośrednio po znakowaniu. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie

revealing-neural-circuit-topography-in-multi-color

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ujawnianie topografii obwodów nerwowych w wielokolorowym

Fundamentalnym problemem w naszym rozumieniu obwodów korowych jest sposób, w jaki sieci w różnych warstwach kory kodują informacje sensoryczne. W niniejszej pracy opisujemy techniki elektrofizjologiczne z wykorzystaniem wielokontaktowych elektrod laminarnych do rejestracji pojedynczych jednostek oraz potencjałów polowych (LFP) i przedstawiamy analizy służące do identyfikacji warstw kory.

Badanie przetwarzania w lokalnych sieciach za pomocą rejestracji z zastosowaniem wielokontaktowych elektrod laminarnych

Niniejszy artykuł przedstawia podejście łączące fotostymulację za pomocą skanowania laserowego z rejestracją z całej komórki u myszy transgenicznych wykazujących ekspresję GFP w ograniczonych populacjach neuronów hamujących. Technika ta umożliwia szerokie mapowanie i analizę ilościową lokalnych obwodów synaptycznych specyficznych hamujących neuronów kory mózgowej.

Mapowanie hamujących obwodów neuronalnych za pomocą fotostymulacji skanującej laserowo

Obwody neuronalne są zorganizowane topograficznie w przedziały funkcjonalne o specyficznych profilach molekularnych. W niniejszej pracy przedstawiamy praktyczne i techniczne kroki służące do ujawnienia globalnej topografii mózgu z wykorzystaniem wszechstronnego podejścia opartego na barwieniu immunohistochemicznym całych preparatów (wholemount). Demonstrujemy użyteczność tej metody, wykorzystując dobrze poznaną cytoarchitekturę i obwody móżdżku.

Immunohistochemia całego preparatu w celu ujawnienia złożonej topografii mózgu

Opisano metodę znakowania neuronów barwnikami fluorescencyjnymi w określonych funkcjonalnych mikrodomenach kory nowej. Po pierwsze, obrazowanie optyczne sygnału wewnętrznego służy do uzyskania mapy funkcjonalnej. Następnie mikroskopia dwufotonowa jest używana do oznaczania i obrazowania neuronów w mikrodomenie mapy.

Celowane znakowanie neuronów w specyficznej funkcjonalnej mikrodomenie kory nowej poprzez połączenie sygnału wewnętrznego i obrazowania dwufotonowego

Ten protokół opisuje zakrojone na szeroką skalę rekonstrukcje selektywnych populacji neuronów, oznaczonych po wstecznym zakażeniu zmodyfikowanym wirusem wścieklizny wyrażającym markery fluorescencyjne, oraz niezależne, bezstronne analizy klastrów, które umożliwiają kompleksową charakterystykę wskaźników morfologicznych wśród różnych podklas neuronów.

Rekonstrukcje na dużą skalę i niezależne, bezstronne grupowanie oparte na wskaźnikach morfologicznych w celu klasyfikacji neuronów w selektywnych populacjach

Tutaj prezentujemy procedurę wykonywania wielkoskalowego obrazowania Ca2+ z rozdzielczością komórkową w wielu warstwach kory mózgowej u swobodnie poruszających się myszy. Setki aktywnych komórek można obserwować jednocześnie za pomocą miniaturowego mikroskopu montowanego na głowie w połączeniu z wszczepioną sondą pryzmatyczną.

Wielowarstwowe obrazowanie kory Ca2+ u swobodnie poruszających się myszy z sondami pryzmatycznymi i zminiaturyzowaną mikroskopią fluorescencyjną

Po zintegrowaniu z płytą czołową i konstrukcją optyczną kompatybilną zarówno z mikroskopami jedno-, jak i dwufotonowymi, soczewka mikropryzmatyczna daje znaczącą przewagę w pomiarze odpowiedzi neuronalnych w pionowej kolumnie w różnych warunkach, w tym w dobrze kontrolowanych eksperymentach w stanach skupienia na głowie lub naturalnych zadaniach behawioralnych u swobodnie poruszających się zwierząt.

Długoterminowe obrazowanie zidentyfikowanych populacji neuronów za pomocą mikropryzmatów u zwierząt swobodnie poruszających się i z unieruchomioną głową

Podstawowe obszary czuciowe w korze nowej wykazują unikalne spontaniczne działania podczas rozwoju. W tym artykule opisano, jak wizualizować aktywność poszczególnych neuronów i podstawowych obszarów czuciowych w celu analizy synchronicznych działań specyficznych dla danego obszaru u noworodków myszy in vivo.

Wizualizacja in vivo spontanicznej aktywności w korze czuciowej noworodków myszy w rozdzielczości pojedynczego neuronu

Tutaj używamy HD-MEA, aby zagłębić się w dynamikę obliczeniową dużych zespołów neuronalnych, szczególnie w hipokampie, obwodach opuszki węchowej i ludzkich sieciach neuronowych. Uchwycenie aktywności czasoprzestrzennej w połączeniu z narzędziami obliczeniowymi zapewnia wgląd w złożoność zespołu neuronalnego. Metoda ta pomaga lepiej zrozumieć funkcje mózgu, potencjalnie identyfikując biomarkery i metody leczenia zaburzeń neurologicznych.

Rejestrowanie i analizowanie multimodalnej dynamiki zespołów neuronalnych na zintegrowanej z CMOS matrycy mikroelektrod o dużej gęstości

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do rejestracji mikro-elektrokortykografii o wysokiej gęstości (μEcoG) u szczurów i myszy, w tym metody chirurgiczne, implantacyjne i rejestracyjne. Zapisy μECoG są wykonywane w połączeniu z zapisem laminarnej politrody w korze słuchowej szczura lub z optogenetycznym manipulowaniem aktywnością neuronalną w korze somatosensorycznej myszy.

Wieloskalowe badania przetwarzania kory mózgowej poprzez integrację politrod laminarnych i optogenetyki z mikroelektrokortykografią u gryzoni

Poznaj metodę śledzenia obwodów neuronowych in vivo przy użyciu znaczników WGA-Alexa w myszach. Technika umożliwia wizualizację topograficznych projekcji w móżdżku, korze i rdzeniu kręgowym z wysoką rozdzielczością.

Ujawnianie topografii obwodów neuronalnych w wielu kolorach

Przeglądaj więcej filmów