Name: Metody in vitro Usuwanie powłok z rdzeni HIV-1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Poznaj metody izolacji rdzeni HIV-1 i pomiaru ich odpowłoki in vitro. Techniki te pozwalają badać czynniki komórkowe wpływające na stabilność wirusa i mechanizmy infekcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania nad rozpakowywaniem HIV-1 w laboratorium Aikena były wspierane przez granty NIH AI40364, AI50423 oraz AI076121. Kilka kluczowych materiałów, w tym odczynniki użyte w teście p24 ELISA, zostało dostarczonych przez NIH AIDS Research and Reference Program, Division of AIDS, NIAID, NIH.

1. Produkcja cząsteczek HIV-1
Przed przystąpieniem do pracy należy uzyskać zgodę i przestrzegać wytycznych biura bezpieczeństwa biologicznego swojej instytucji w zakresie pracy w placówce bezpieczeństwa biologicznego zatwierdzonej do pracy z zakaźnym wirusem HIV. Należy upewnić się, że podczas pracy w laboratorium bezpieczeństwa biologicznego zachowana jest należyta staranność i przestrzegane są wszelkie środki ostrożności.
Produkcję cząsteczek HIV-1 zazwyczaj przeprowadza się poprzez przejściową transfekcję komórek 293T prowiralnym DNA HIV-1 z wykorzystaniem metody transfekcji fosforanem wapnia7, 8. Odpowiednie są również zapasy wirusa o wysokim mianie, uzyskane z hodowli zainfekowanych limfocytów T.
<ol>
	<li>Hodować komórki 293T w pożywce Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i uzupełnionej o antybiotyki [penicylinę (100 IU/ml) i streptomycynę (100 μg/ml)] w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
	<li>Odłączyć komórki z prawie w pełni zrosłych naczyń za pomocą 0,25% Trypsyny-EDTA i wysiać 2x106 komórek w 9 ml pożywki na naczynie hodowlane 100 mm dzień przed transfekcją. Wysiać sześć naczyń hodowlanych 100 mm do produkcji wirionów. W przypadku potrzeby uzyskania stężonego preparatu rdzeni można wysiać więcej naczyń do transfekcji.</li>
	<li>Następnego dnia monowarstwy komórkowe powinny osiągnąć około 25% konfluencji i być gotowe do transfekcji. Dla sześciu naczyń z komórkami do transfekcji, doprowadzić 120 μg prowiralnego DNA do objętości 2,7 ml za pomocą sterylnej wody. Do mieszaniny dodać 0,3 ml 2,5 M CaCl2 oraz 3 ml 2XBBS i wymieszać dokładnie, pipetując ciecz w górę i w dół kilka razy. Pozostawić mieszaninę w temperaturze pokojowej na 10-20 minut.</li>
	<li>Dodawać po 1 ml otrzymanej mieszaniny kroplowo do centrum każdego naczynia, delikatnie nim kołysząc w celu wymieszania. Umieścić naczynia na noc (~16 godzin) w inkubatorze ustawionym na 35°C i 3% CO2.</li>
	<li>Odssać pożywkę hodowlaną i delikatnie dodać 5 ml PBS.</li>
	<li>Odssać PBS i dodać 5 ml świeżej pożywki. Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez dodatkowe 24-48 godzin.</li>
	<li>Zebrać nadsącz z hodowli zawierający cząsteczki wirusa i przenieść go do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Połączyć nadsącze ze wszystkich naczyń i wirować przy 1 500 x g przez 5 min, aby osadzić komórki i zanieczyszczenia. Przefiltrować nadsącz za pomocą filtrów strzykawkowych o rozmiarze porów 0,45 μm. Należy zachować środki ostrożności, aby zminimalizować powstawanie aerozoli podczas pracy z żywym wirusem. Obejmuje to stosowanie probówek stożkowych z o-ringami lub osłon kubełków rotora podczas etapu wirowania. Jeśli nie jest to możliwe, zakrętki probówek należy owinąć parafilmem.</li>
</ol>
2. Koncentracja wirionów HIV-1 poprzez ultrawirowanie
<ol>
	<li>Przenieś supernatant hodowli (30 ml) do probówki wirówkowej z polialomeru o pojemności 38,5 ml (do rotora Beckman SW32Ti lub odpowiednika). Pod supernatant zawierający wirusy ostrożnie nanieś 5 ml 20% roztworu sacharozy w PBS, używając pipety 5 ml.</li>
	<li>Wiruj przez 3 godziny przy 32 000 rpm w temperaturze 4°C (175 000 x g przy rmax), aby wytrącić cząsteczki wirusa w formie osadu.</li>
	<li>Usuń supernatant poprzez aspirację, uważając, aby nie naruszyć osadu na dnie probówki. Do probówki dodaj 0,5 ml buforu 1XSTE (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) i pozostaw w temperaturze 4°C na 1 godzinę w celu rozluźnienia osadu. Używając końcówki do pipety 1 ml o szerokim otworze, ostrożnie pipetuj zawiesinę kilka razy, aby oddzielić osad od dna probówki. Następnie przenieś rozluźniony osad do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, uważając, aby nie doprowadzić do spienienia. Inkubuj w temperaturze 4°C przez kolejne 1–3 godziny, aby umożliwić rozproszenie małych skupisk wirusa. W tym czasie przygotuj gradient sacharozy zgodnie z opisem w kroku 3.1.</li>
	<li>Ostrożnie pipetuj zawiesinę wirusa kilkakrotnie w górę i w dół, a następnie wiruj przy 8 000 rpm (6 000 x g) w temperaturze 4°C w chłodzonej mikrowirówce przez 1 min, aby usunąć pozostałe skupki. Przez cały czas procesu utrzymuj próbkę w niskiej temperaturze.</li>
</ol>
3. Centryfugacja w gradiencie sacharozy w celu izolacji rdzeni
Rdzenie HIV-1 są izolowane przy użyciu metody „spin-thru”9, która stanowi modyfikację wcześniej opisanej metody oczyszczania rdzeni HIV-210.
<ol>
	<li>Przygotować 12 ml liniowego gradientu sacharozy od 30% do 70% w buforze 1XSTE w 14,5 ml polialomerowej probówce wirówkowej do rotora SW32.1Ti. Do przygotowania gradientu należy użyć 20 ml formera gradientu; nalać 6 ml 70% roztworu sacharozy po stronie bliskiej (przy porcie wylotowym) i 6 ml 30% roztworu sacharozy po stronie dalekiej. Należy upewnić się, że w kanale łączącym obie komory nie uwięzione są pęcherzyki powietrza. Użyć formera gradientu Auto Densi-Flow, aby przepompować gradient od dołu do góry probówki zawierającej na dnie 1 ml 85% roztworu sacharozy. Gradient delikatnie inkubować w temperaturze 4°C aż do schłodzenia (2-4 godziny).</li>
	<li>Za pomocą końcówki do pipety 1 ml o szerokim otworze delikatnie nałożyć na gradient 0,25 ml 15% roztworu sacharozy w STE zawierającego 1% Triton X-100.</li>
	<li>Za pomocą końcówki do pipety 1 ml o szerokim otworze delikatnie nałożyć na wierzch 0,25 ml 7,5% roztworu sacharozy w STE. Należy uważać, aby nie zmieszać warstw.</li>
	<li>Delikatnie nałożyć 0,5 ml zawiesiny wirusa z kroku 2.4. Ten etap należy przeprowadzić ostrożnie, aby uniknąć zaburzenia gradientu i zmieszania znajdujących się poniżej warstw sacharozy.</li>
	<li>Umieścić probówki w schłodzonym wiadrze SW32.1Ti i wirować przy 32 000 rpm (187 000 x g przy rmax) przez noc (16-20 godzin) w temperaturze 4°C. Aby uniknąć zatrzymania wirówki, nie rozpoczynać wirowania, dopóki próżnia w wirówce nie osiągnie 250 μm.</li>
	<li>Zebrać frakcje o objętości 1 ml od góry do dołu gradientu za pomocą frakcjonatora gradientu Auto-Densi-Flow. Probówki należy natychmiast po zebraniu umieścić na lodzie. Wymieszać zawartość probówek poprzez kilkukrotne odwrócenie i pobrać 50 μl każdej frakcji do oznaczania ilościowego metodą ELISA lub testem aktywności odwrotnej transkryptazy.</li>
</ol>
4. Lokalizacja rdzeni HIV-1 i przechowywanie rdzeni
<ol>
	<li>Przed przeprowadzeniem testów rozpakowywania (uncoating assays) ważne jest określenie, które frakcje zawierają nienaruszone rdzenie HIV-1. Można to ustalić za pomocą testu p24 ELISA lub testu aktywności odwrotnej transkryptazy, wykorzystując 50 μl alikwoty z kroku 3.6.</li>
	<li>Odzysk CA związanego z rdzeniami jest często powiązany ze stabilnością rdzeni. Należy zmierzyć ilość CA związanego z rdzeniem za pomocą testu p24 ELISA9, wykorzystując próbkę z każdej frakcji. Alternatywnie można zmierzyć aktywność odwrotnej transkryptazy każdej frakcji. Przy zastosowaniu obu metod szczyt powinien przypadać około frakcji 10.</li>
	<li>Należy połączyć frakcje zawierające rdzenie. Jeśli rdzenie nie będą natychmiast użyte do testu rozpakowywania, należy podzielić połączone rdzenie na alikwoty o objętości od 0,2 do 0,3 ml, zamrozić je gwałtownie w ciekłym N2 i przechowywać w temperaturze -80°C. Rdzenie zamrożone w ten sposób nadają się do testu rozpakowywania. Wydajność CA związanego z rdzeniem wynosi zazwyczaj 1-2 μg p24 na mililitr lub około 15% całkowitego p24 związanego z wirionem.</li>
</ol>
5. Analiza kinetyczna rozpakowywania HIV-1
<ol>
	<li>Ilość rdzeni HIV-1 wymagana na jedną reakcję rozpakowywania wynosi około 50 ng. Aby przeprowadzić test rozpakowywania in vitro, należy wstępnie rozcieńczyć alikwot rdzeni równą objętością zimnego buforu 1XSTE, aby zmniejszyć lepkość zawiesiny i zminimalizować błędy pipetowania.</li>
	<li>Następnie rozcieńczyć 100 μl rdzeni w 0,15 ml zimnego buforu 1XSTE zawierającego 10 μg/ml BSA w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Suplementujemy bufor STE białkiem BSA (10 μg/ml), aby zminimalizować adsorpcję CA do ścianek probówki. Wymieszać, odwracając probówkę kilka razy. Nie mieszać próbek w wirówce typu vortex. Inkubować probówki w łaźni wodnej w temperaturze 37°C w określonych odstępach czasu (15, 30, 60 i 120 min). Probówki powinny być zanurzone w łaźni wodnej co najmniej do poziomu próbki wewnątrz, aby zapewnić równomierne ogrzewanie.</li>
	<li>Podczas inkubacji należy okresowo (zazwyczaj co 5-10 min) delikatnie mieszać zawartość probówki, stukując w nią palcem. Dla kontroli zero-minutowej rozcieńczyć 100 μl rdzeni w 0,15 ml zimnego buforu 1XSTE i inkubować na lodzie przez cały czas trwania eksperymentu (120 min). Kontrola zero-minutowa wskazuje podstawową wartość rozpakowywania i służy do określenia wzrostu rozpakowywania rdzeni inkubowanych w 37°C w różnych odstępach czasu.</li>
	<li>Po zakończeniu okresu inkubacji zatrzymać proces rozpakowywania, umieszczając probówki na lodzie na 10 minut.</li>
	<li>Wirować probówki przy 45 000 rpm (rotor TLA-55; 125 000 x g przy rmax) przez 20 minut w temperaturze 4°C. Spowoduje to osadzenie nienaruszonych rdzeni, a wolne CA uwolnione w wyniku rozpakowywania rdzeni pozostanie w supernatancie. Rotor powinien zostać schłodzony do 4°C przed załadowaniem próbek.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowych schłodzonych probówek do mikrocentryfugi, najlepiej używając końcówek do nakładania żelu przechowywanych w temperaturze pokojowej. Należy pamiętać, że osad nie będzie widoczny gołym okiem, dlatego należy zachować szczególną ostrożność podczas pipetowania supernatantu. Resuspendować osady w 250 μl rozcieńczalnika do próbek ELISA (0,5% Triton X-100 i 5% surowicy cielęcej donora w PBS). Aby zapewnić efektywne rozpuszczenie osadu, zastosować vortex po dodaniu rozcieńczalnika do próbek ELISA. Ilość CA w osadzie i supernatancie określić za pomocą testu ELISA p24 zgodnie z opisem w następnej sekcji.</li>
	<li>Stopień rozpakowywania uzyskuje się obliczając frakcję CA obecną w supernatancie.</li>
</ol>
6. Analiza CA za pomocą testu ELISA dla p24
<ol>
	<li>Dostępnych jest wiele komercyjnych zestawów ELISA, które można wykorzystać do ilościowego oznaczenia CA. Należy użyć dowolnego komercyjnego lub opracowanego wewnętrznie ("in-house") testu ELISA i uwzględnić standardy p24 w celu wyznaczenia liniowości analizy. W celu zapewnienia dokładności należy przeprowadzić analizę rozcieńczeń próbek.</li>
	<li>Opracowaliśmy własny test ELISA, którego rutynowo używamy do oznaczania CA. Procedura została zaadaptowana z poprzedniego raportu11 i jest wykonywana przy użyciu przeciwciał wychwytujących i detekcyjnych dostępnych w ramach NIH AIDS Research and Reference Reagent Program.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki:
Przykład wyniku testu ELISA służącego do oznaczenia frakcji zawierających rdzenie przedstawiono na Rysunku 1. Po zebraniu frakcji (po 1 ml każda), 50 μl próbki z każdej frakcji wykorzystano do wykonania rozcieńczeń seryjnych i analizy metodą ELISA. Całkowita ilość p24 uzyskana poprzez zsumowanie wartości dla dwunastu frakcji wyniosła 14,5 μg. Jak pokazano na rysunku, frakcje od 8 do 10 zawierały rdzenie. Wartość p24 dla frakcji zawierających rdzenie wyniosła 2,17 μg. Procent p24 związanego z rdzeniami (14,97%) określono obliczając stosunek wartości p24 dla frakcji rdzeniowych (2,17 μg) do całkowitej wartości p24 (14,5 μg). Frakcja 1 lub 2 zawsze zawiera najwyższą ilość p24; reprezentuje ona wolne CA, które nie jest związane z rdzeniami. Następnie obserwuje się stopniowy spadek wartości p24 w każdej kolejnej frakcji, a potem gwałtowny wzrost i wreszcie gwałtowny spadek wartości p24. Przy zachowaniu należytej staranności podczas nakładania gradientu, szczyt CA związanego z rdzeniami przypada w okolicy frakcji 10.
Typowy wynik uzyskany podczas badania kinetyki odowładkowania rdzeni HIV-1 przedstawiono na Rysunku 2. Wykres pokazuje zależny od czasu wzrost odowładkowania rdzeni HIV-1 typu dzikiego. Wartość procentowa odowładkowania została uzyskana poprzez obliczenie frakcji CA obecnej w nadsączu. Przy odpowiedniej praktyce test ten jest wysoce powtarzalny i przydatny do określania stabilności rdzeni wirusowych in vitro. Należy pamiętać, że powtarzalność testu jest w dużym stopniu zależna od prawidłowego obchodzenia się z próbkami podczas procedury. Ponieważ rdzenie są termolabilne, próbki powinny być przechowywane w temperaturze 4°C przez cały czas trwania testu, z wyjątkiem okresu inkubacji.
<img alt="Wykres słupkowy analizy frakcji p24, przedstawiający stężenie w ng/ml w 12 frakcjach, wskazujący na obecność rdzeni." src="/files/ftp_upload/3384/3384fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1 Centryfugacja w gradiencie gęstości równowagowej rdzeni HIV-1. Stężoną zawiesinę wirusa naniesiono na górę liniowego gradientu sacharozy 30-70%, przykrytego 1% Triton-X-100. Po nocnej centryfugacji przy 187,000 x g i 4°C zebrano frakcje o objętości 1 ml od góry (Frakcja 1) do dołu (Frakcja 12), a następnie oznaczono ilość p24 metodą ELISA.
<img alt="Wykres procentowego rozpakowania wirusa w czasie, pokazujący szybki początkowy wzrost, a następnie plateau po 60 min." src="/files/ftp_upload/3384/3384fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
Rysunek 2 Kinetyka rozpakowania HIV-1 in vitro. Oczyszczone rdzenie HIV-1 rozcieńczono i inkubowano w 37°C przez wskazane odstępy czasu. Próbkę z czasu 0 min inkubowano na lodzie przez cały czas trwania eksperymentu. Po inkubacji próbki poddano ultrawirowaniu przy 125,000 x g przez 20 minut w 4°C. Nadfiltr i osad rozdzielono i przeanalizowano za pomocą testu ELISA p24. Stopień rozpakowania określono zgodnie z opisem w tekście protokołu. Każda reakcja rozpakowania była przeprowadzana w dublecie; słupki błędów obejmują zakres dwóch wartości.

<ol><li>Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+analysis+of+conical+models+for+the+HIV-1+core%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core.</a> Science. 283, 80-83 (1999).</li>
<li>Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+reconstructions+of+helical+assemblies+of+the+HIV-1+CA+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein.</a> Nature. 407, 409-413 (2000).</li>
<li>Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+and+cellular+factors+that+regulate+HIV-1+uncoating%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+HIV.+AIDS%22%5BJournal%5D)">Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating.</a> Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).</li>
<li>Forshey, B. M., Schwedler, U. von, Sundquist, W. I., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+human+immunodeficiency+virus+type+1+core+of+optimal+stability+is+crucial+for+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication.</a> J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).</li>
<li>Forshey, B. M., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disassembly+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores+in+vitro+reveals+association+of+Nef+with+the+subviral+ribonucleoprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex.</a> J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).</li>
<li>Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+capsid+mutations+on+HIV-1+uncoating%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating.</a> Virology. 358, 48-54 (2007).</li>
<li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).</li>
<li>Aiken, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAiken%2C+C+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Prasad, V. R., Ganjam, K. V. 485, 41-53 (2009).</li>
<li>Kotov, A., Zhou, J., Flicker, P., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Nef+with+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+core%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Association of Nef with the human immunodeficiency virus type 1 core.</a> J. Virol. 73, 8824-8830 (1999).</li>
<li>Kewalramani, V. N., Emerman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vpx+association+with+mature+core+structures+of+HIV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Vpx association with mature core structures of HIV-2.</a> Virology. 218, 159-168 (1996).</li>
<li>Wehrly, K., Chesebro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p24+antigen+capture+assay+for+quantification+of+human+immunodeficiency+virus+using+readily+available+inexpensive+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents.</a> Methods. 12, 288-293 (1997).</li>
<li>Welker, R., Hohenberg, H., Tessmer, U., Huckhagel, C., Kräusslich, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+structural+analysis+of+isolated+mature+cores+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and structural analysis of isolated mature cores of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 74, 1168-1177 (2000).</li>
<li>Briggs, J. A., Wilk, T., Welker, R., Kräusslich, H. G., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+organization+of+authentic%2C+mature+HIV-1+virions+and+cores%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores.</a> EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).</li>
<li>Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoating+of+HIV-1+requires+cellular+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Uncoating of HIV-1 requires cellular activation.</a> Virology. 337, 93-101 (2005).</li>
<li>Accola, M. A., Ohagen, A., Göttlinger, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores%3A+retention+of+Vpr+in+the+absence+of+p6%28gag%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag.</a> J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Opisana tutaj metoda oczyszczania rdzeni HIV-1 w celu badania procesu odopakowywania in vitro jest przydatna do analizy tej fazy cyklu życiowego HIV-1, zwłaszcza ze względu na brak zwalidowanej metody analizy odopakowywania HIV-1 w komórkach docelowych. Chociaż w tej metodzie do oczyszczania rdzeni zastosowano ultracentryfugację równowagową, inni autorzy wykorzystywali bezpośrednie wirowanie po krótkiej lizie w 1% Triton-X-10012, 13 lub wirowanie przez poduszkę sacharozową z nałożonym 0,1% Triton-X-10...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Acros Organics</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>0,25% trypsyna-EDTA</td><td>Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>2XBBS</td><td></td><td></td><td>Skład: 50 mM BES [p&lt;sup&gt;H&lt;/sup&gt; 6,95], 280 mM NaCl i 1,5 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Dostosować pH do wartości 6,95 w temperaturze pokojowej. Sterylizować przez filtrowanie. &amp;i przechowywać w alikwotach w temperaturze -20°C&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Przeciwciało powlekające: Przeciwciało monoklonalne przeciwko p24 (183-H12-5C)</td><td>Krajowe Instytuty Zdrowia</td><td>3537</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe: HIV-Ig (hiperimmunologiczna surowica pacjenta)</td><td>Krajowe Instytuty Zdrowia</td><td>3957</td><td></td></tr><tr><td>&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. Jako profesjonalny tłumacz treści naukowych i edukacyjnych JoVE jestem gotowy do przełożenia materiałów na język polski, z zachowaniem najwyższych standardów akademickich, precyzji terminologicznej oraz naturalnego stylu publikacji naukowych.&quot;&gt;Przeciwciało wtórne:&lt;/p&gt;Przeciwciało kozie przeciwko ludzkiemu IgG, koniugowane z peroksydazą</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>31130</td><td></td></tr><tr><td>podłoże HRP</td><td>KPL Inc</td><td>50-76-11</td><td></td></tr><tr><td>płytki 96-dołkowe Immulon 2HB</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>3455</td><td></td></tr><tr><td>Rotory SW32Ti i SW32.1 Ti oraz kompatybilna ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor TLA-55 i nakładkowa ultracentryfuga stołowa</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki do wirówek mikroszybkich</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>326823, 358123, 357448</td><td></td></tr><tr><td>Frakcjonator gradientowy gęstości Auto-Densi Flow</td><td>Labconco Corp.</td><td>4517000</td><td></td></tr><tr><td>Kształtowanie gradientu</td><td>CBS Scientific Co. Inc.</td><td>GM-20</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> </td></tr></tbody></table>

in vitro rozpakowywanie rdzeni hiv-1

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Genom retrowirusów jest zamknięty w kapsydzie otoczonym kopertą lipidową. W przypadku lentiwirusów, takich jak HIV-1, stożkowa otoczka kapsydu składa się z białka CA ułożonego w postaci sieci heksagonów. Kapsyd jest zamknięty przez 7 pentamerów na szerokim końcu i 5 na wąskim końcu stożka1, 2. Wewnątrz tej otoczki kapsydu znajduje się wirusowy kompleks rybonukleoproteinowy, które razem tworzą rdzeń.
Po fuzji błony wirusa z błoną komórki docelowej, HIV-1 zostaje uwolniony do cytoplazmy. Następnie kapsyd ulega rozpadowi, uwalniając wolne CA w formie rozpuszczalnej3 w procesie zwanym odkapsydowaniem. Wewnątrzkomórkowa lokalizacja i czas trwania odkapsydowania HIV-1 są słabo poznane. Pojedyncze substytucje aminokwasowe w CA, które zmieniają stabilność kapsydu, upośledzają również zdolność HIV-1 do infekowania komórek4. Wskazuje to, że stabilność kapsydu ma krytyczne znaczenie dla infekcji HIV-1.
Proces odkapsydowania HIV-1 był trudny do zbadania ze względu na brak dostępności czułych i wiarygodnych testów dla tego procesu. W niniejszej pracy opisujemy ilościową metodę badania odkapsydowania in vitro z wykorzystaniem rdzeni wyizolowanych z zakaźnych cząsteczek HIV-1. Podejście to obejmuje izolację rdzeni poprzez sedymentację skoncentrowanych wirionów przez warstwę detergentu do liniowego gradientu sacharozy, w niskiej temperaturze. Aby ilościowo określić stopień odkapsydowania, wyizolowane rdzenie inkubuje się w temperaturze 37°C przez różne odstępy czasu, a następnie poddaje wirowaniu w ultrawirówce w celu wytrącenia osadu. Stopień odkapsydowania analizuje się poprzez ilościowe oznaczenie frakcji białka CA w supernatancie. Podejście to zostało zastosowane do analizy wpływu mutacji wirusowych na stabilność kapsydu HIV-14, 5, 6. Powinno ono być również przydatne do badania roli czynników komórkowych w procesie odkapsydowania HIV-1.

Odsłonięcie (uncoating) jest kluczowym etapem wczesnej fazy cyklu życiowego HIV-1 i definiuje się je jako rozpad otoczki kapsydu oraz uwolnienie wirusowego kompleksu rybonukleoproteinowego (vRNP). W niniejszej pracy prezentujemy techniki izolacji nienaruszonych rdzeni z wirionów HIV-1 oraz metody ilościowego oznaczania ich odsłaniania in vitro.

In vitro rozpakowywanie rdzeni HIV-1

Genom retrowirusów jest zamknięty w kapsydzie otoczonej kopertą lipidową. W przypadku lentiwirusów, takich jak HIV-1, stożkowata powłoka kapsydu jest ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie powłoki ENC in vitro dla HIV-1. Jest to realizowane poprzez wstępne wytworzenie cząstek HIV-1. Następnie warianty są zagęszczane za pomocą ultrawirowania. Kolejnym krokiem jest izolacja za pomocą ultrawirowania w gradiencie sacharozy.Na koniec przeprowadzono analizę kinetyczną rozpakowywania HIV-1. Ostateczne wyniki wykazały zależny od czasu proces rozpakowywania HIV-1, co potwierdzono poprzez ilościowe oznaczenie zawartości kapsydu w osadzie i nadsączu za pomocą testu ELISA. Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące HIV-1, takie jak rola czynników komórkowych w rozpakowywaniu oraz wpływ mutacji na stabilność kapsydu wirusa przed wejściem do jądra.Przed rozpoczęciem pracy w laboratorium poziomu bezpieczeństwa biologicznego przeznaczonym dla zakaźnego wirusa HIV-1 należy uzyskać zezwolenie oraz zapoznać się z wytycznymi biura bezpieczeństwa biologicznego swojej instytucji. Podczas pracy w laboratorium bezpieczeństwa biologicznego należy zachować należytą ostrożność i stosować odpowiednie procedury postępowania. W niniejszej demonstracji cząsteczki HIV-1 są wytwarzane poprzez przejściową transfekcję komórek

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

In vitro Zdjęcie osłonek od rdzeni HIV-1

Niniejszy artykuł opisuje metodę wizualizacji tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1 na płaskich dwuwarstwach wspieranych szkłem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF). Metodę tę można również połączyć z barwieniem immunofluorescencyjnym w celu wykrycia aktywacji i redystrybucji cząsteczek sygnałowych, które zachodzą podczas tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1.

Obrazowanie synapsy wirologicznej i sygnalizacji indukowanej przez białko otoczki HIV-1 na syntetycznych dwuwarstwach lipidowych

Opracowano metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu wizualnej detekcji wirusowego RNA genomowego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Przygotowano sondę specyficzną dla wirusowego RNA, która może być następnie identyfikowana za pomocą kombinacji technik hybrydyzacji i immunofluorescencji. Technika ta daje możliwość określenia lokalizacji wirusowego RNA lub DNA w stanie stacjonarnym, dostarczając informacji o kontroli procesów wewnątrzkomórkowego transportu wirusa.

Wykrywanie wirusowego RNA za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH)

Opracowaliśmy model koinfekcji malarią i HIV-1 in vitro, aby zbadać wpływ Plasmodium falciparum na cykl replikacyjny HIV-1 w ludzkich pierwotnych makrofagach pochodzących z monocytów. Ten wszechstronny system można łatwo dostosować do innych typów komórek pierwotnych podatnych na zakażenie HIV-1.

Model koinfekcji In vitro do badania interakcji między Plasmodium falciparum a HIV-1 w ludzkich pierwotnych komórkach odpornościowych pochodzących z monocytów

Zrozumienie konformacji antygenów powierzchniowych wirusa jest niezbędne do oceny neutralizacji przeciwciał i kierowania projektem skutecznych immunogenów szczepionkowych. W tym miejscu opisujemy komórkowy test ELISA, który umożliwia badanie rozpoznawania trimerycznego HIV-1 Env ulegającego ekspresji na powierzchni transfekowanych komórek przez specyficzne przeciwciała anty-Env.

Ocena konformacyjna glikoprotein otoczki trymerowej HIV-1 przy użyciu komórkowego testu ELISA

Ten protokół opisuje NAZWĘ, test, który pozwala na szybką identyfikację cząsteczek zdolnych do hamowania in vitro aktywności opiekuńczej białka nukleokapsydu HIV-1.

Test elektroforezy za pośrednictwem wyżarzania nukleokapsydu (NAME) umożliwia szybką identyfikację inhibitorów nukleokapsydu HIV-1

Ilustrujemy tutaj test wiązania błon in vitro, w którym interakcje między HIV-1 Gag a błonami lipidowymi są wizualnie analizowane za pomocą znakowanego YFP Gag syntetyzowanego w systemie translacji in vitro opartym na kiełkach pszenicy i GUV przygotowanych techniką elektroformacji.

Wizualizacja wiązania knebla HIV-1 z błonami gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV)

Ten raport opisuje test in vitro do pomiaru aktywności integracyjnej ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) związanego z kompleksem preintegracji () w ekstraktach cytoplazmatycznych ostro zakażonych komórek. Integracja DNA HIV-1 związanego z z heterologicznym docelowym DNA jest określana ilościowo przy użyciu zagnieżdżonej strategii reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym.

Pomiar aktywności integracyjnej in vitro kompleksów przedintegracyjnych HIV-1

Opisujemy test oparty na komórkach, który informuje o fuzji HIV-1 poprzez ekspresję białka zielonej fluorescencji wykrywalnego za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii fluorescencyjnej. Może być stosowany do testowania inhibitorów wnikania wirusa (szczególnie na etapie fuzji) w systemach infekcji bezkomórkowych i międzykomórkowych.

Wysokoprzepustowy test fuzji błony wirusowej aktywowanej Cre-Lox w celu identyfikacji inhibitorów fuzji błony wirusowej HIV-1

Protokół o wysokiej przepustowości do oceny funkcjonalnej skutecznej reaktywacji i usuwania utajonych prowirusów HIV jest opisany i stosowany poprzez testowanie wpływu interwencji na transkrypcję i splicing HIV. Przedstawiono reprezentatywne wyniki wpływu czynników odwracających opóźnienia na transkrypcję i splicing sterowany przez LTR.

Wysokoprzepustowa ocena in vitro czynników odwracających opóźnienia w transkrypcji i splicingu HIV

Ta metoda zapewnia dostępny i elastyczny protokół do przygotowania siatek mikroskopii elektronowej (EM) do kriotomografii komórkowej in situ oraz korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM).

Przygotowanie próbki do kriotomografii in situ komórek ssaków

Tutaj opisujemy kilka sprawdzonych metod określania stresu retikulum endoplazmatycznego (ER) i aktywacji odpowiedzi na nieswojone białko (UPR), ze szczególnym naciskiem na zakażenie HIV-1. W artykule opisano również zestaw protokołów do badania wpływu stresu ER/UPR na replikację HIV-1 i zakaźność wirionu.

Pomiar stresu retikulum endoplazmatycznego i odpowiedzi na niesfałdowane białko w limfocytach T zakażonych HIV-1 i analiza jego roli w replikacji HIV-1

Poznaj metody izolacji rdzeni HIV-1 i pomiaru ich odpowłoki in vitro. Techniki te pozwalają badać czynniki komórkowe wpływające na stabilność wirusa i mechanizmy infekcji.

In vitro rozpakowywanie rdzeni HIV-1

Przeglądaj więcej filmów