Name: Obrazowanie odpowiedzi neuronalnych w preparatach warstwowych narządu lemieszowo-nosowego wyrażającego genetycznie kodowany czujnik wapnia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Poznaj metodę obrazowania odpowiedzi neuronów narządu lemieszowo-nosowego na bodźce feromonowe w preparatach warstwowych myszy transgenicznych z G-CaMP2. Technika zachowuje integralność tkanki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Andrei Moran oraz członkom Lab Animal Service Facility (LASF) w Stowers Institute za doskonałe wsparcie w zakresie hodowli zwierząt i usług technicznych. Praca ta jest finansowana przez Stowers Institute oraz NIH (NIDCD 008003) dla CRY. Treść opracowania jest wyłączną odpowiedzialnością autorów i nie musi reprezentować oficjalnych poglądów National Institute on Deafness and Other Communication Disorders ani National Institutes of Health. Wniosek o patent w USA dla myszy tetO-G-CaMP2 został złożony przez Stowers Institute, CRY i LM.

<ol><li>Birch, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBirch%2C+MC+%22Pheromones%22">Pheromones</a>. , North-Holland Pub. Co. & American Elsevier Pub. Co. (1974).</li>
<li>Wyatt, T. D. Pheromones and animal behaviour : communication by smell and taste. , Cambridge University Press. (2003).</li>
<li>Papes, F., Logan, D. W., Stowers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vomeronasal+organ+mediates+interspecies+defensive+behaviors+through+detection+of+protein+pheromone+homologs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The vomeronasal organ mediates interspecies defensive behaviors through detection of protein pheromone homologs.</a> Cell. 141, 692-703 (2010).</li>
<li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Nature. 405, 792-796 (2000).</li>
<li>Dulac, C., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+family+of+genes+encoding+putative+pheromone+receptors+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 83, 195-206 (1995).</li>
<li>Herrada, G., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+family+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals+with+a+topographically+organized+and+sexually+dimorphic+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographically organized and sexually dimorphic distribution.</a> Cell. 90, 763-773 (1997).</li>
<li>Matsunami, H., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigene+family+encoding+a+diverse+array+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 90, 775-784 (1997).</li>
<li>Ryba, N. J., Tirindelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+multigene+family+of+putative+pheromone+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A new multigene family of putative pheromone receptors.</a> Neuron. 19, 371-379 (1997).</li>
<li>Pantages, E., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+family+of+candidate+pheromone+receptors+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A novel family of candidate pheromone receptors in mammals.</a> Neuron. 28, 835-845 (2000).</li>
<li>Zhang, X., Rodriguez, I., Mombaerts, P., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+and+vomeronasal+receptor+genes+in+two+mouse+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Odorant and vomeronasal receptor genes in two mouse genome assemblies.</a> Genomics. 83, 802-811 (2004).</li>
<li>Liberles, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formyl+peptide+receptors+are+candidate+chemosensory+receptors+in+the+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).</li>
<li>Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formyl+peptide+receptor-like+proteins+are+a+novel+family+of+vomeronasal+chemosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors.</a> Nature. 459, 574-577 (2009).</li>
<li>Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+evolution+of+the+V2r+vomeronasal+receptor+gene+repertoire+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats.</a> Genomics. 86, 306-315 (2005).</li>
<li>Rodriguez, I., Punta, D. el, Rothman, K., Ishii, A., T,, Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+new+and+isolated+families+within+the+mouse+superfamily+of+V1r+vomeronasal+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multiple new and isolated families within the mouse superfamily of V1r vomeronasal receptors.</a> Nat. Neurosci. 5, 134-140 (2002).</li>
<li>He, J., Ma, L., Kim, S., Nakai, J., Yu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+gender+and+individual+information+in+the+mouse+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Encoding gender and individual information in the mouse vomeronasal organ.</a> Science. 320, 535-538 (2008).</li>
<li>Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+vomeronasal+neurons+to+natural+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli.</a> Science. 289, 1569-1572 (2000).</li>
<li>Chamero, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+pheromones+that+promote+aggressive+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour.</a> Nature. 450, 899-902 (2007).</li>
<li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li>
<li>Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-specific+peptides+from+exocrine+glands+stimulate+mouse+vomeronasal+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons.</a> Nature. 437, 898-901 (2005).</li>
<li>Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+three-dimensional+fluorescence+imaging+of+activity+in+neural+populations+by+objective-coupled+planar+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy.</a> Neuron. 57, 661-672 (2008).</li>
<li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+I+peptides+as+chemosensory+signals+in+the+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ.</a> Science. 306, 1033-1037 (2004).</li>
<li>He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+signals+conveyed+by+pheromone+concentrations+to+the+mouse+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct signals conveyed by pheromone concentrations to the mouse vomeronasal organ.</a> J. Neurosci. 30, 7473-7483 (2010).</li>
<li>Haga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+male+mouse+pheromone+ESP1+enhances+female+sexual+receptive+behaviour+through+a+specific+vomeronasal+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor.</a> Nature. 466, 118-122 (2010).</li>
<li>Boschat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromone+detection+mediated+by+a+V1r+vomeronasal+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor.</a> Nat. Neurosci. 5, 1261-1262 (2002).</li>
<li>Hendel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+changes+of+genetic+calcium+indicators+and+OGB-1+correlated+with+neural+activity+and+calcium+in+vivo+and+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in.</a> 28, 7399-7411 (2008).</li>
<li>Pologruto, T. A., Yasuda, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+neural+activity+and+%5BCa2%2B%5D+with+genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monitoring neural activity and [Ca2+] with genetically encoded Ca2+ indicators.</a> J. Neurosci. 24, 9572-9579 (2004).</li>
<li>Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+a+genetically+encoded+optical+sensor+of+neural+activity+using+electrophysiology+in+intact+adult+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies.</a> Front Neural Circuits. 1 (3), (2007).</li>
<li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Większość receptorów jamwońnych (VRs) pozostaje receptorami osieroconymi od czasu ich odkrycia przez Dulaca i Axela 5. Ligandy feromonowe dla tych receptorów chemosensorycznych oraz ich rola w pośredniczeniu w zachowaniach zwierząt nie są dobrze poznane. Do tej pory zidentyfikowano tylko jedną parę ligand/receptor – peptyd ESP1 i jego pokrewny receptor Vmn2r116 (V2Rp5) – i wykazano, że przekazują one konkretne informacje społeczne 19,23. Wykazano również, że inny receptor, V1rb2, reaguje na 2-heptan...

obrazowanie odpowiedzi neuronalnych w preparatach skrawków narządu jamistego wyrażających genetycznie kodowany czujnik wapnia

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

Organ vomeronasalny (VNO) wykrywa sygnały chemosensoryczne niosące informacje o statusie społecznym, seksualnym i rozrodczym osobników tego samego gatunku 1,2. Te sygnały wewnątrzgatunkowe, czyli feromony, a także sygnały pochodzące od niektórych drapieżników 3, aktywują neurony sensoryczne vomeronasalne (VSNs) z wysokim poziomem specyficzności i czułości 4. W neuronach VNO ekspresjonowane są co najmniej trzy odrębne rodziny receptorów sprzężonych z białkiem G: V1R, V2R i FPR 5-14, które pośredniczą w detekcji bodźców chemosensorycznych. Aby zrozumieć, w jaki sposób informacje o feromonach są kodowane przez VNO, kluczowe jest przeanalizowanie profili odpowiedzi poszczególnych VSNs na różne bodźce oraz zidentyfikowanie konkretnych receptorów pośredniczących w tych odpowiedziach.
Neuroepitelia VNO są zamknięte w parze kości lemieszka. Półślepa struktura rurkowa VNO posiada jeden otwarty koniec (przewód womeronasalny) łączący się z jamą nosową. VSN wysyłają swoje dendryty do światła VNO, gdzie sygnały feromonowe kontaktują się z receptorami ekspresjonowanymi w guzkach dendrytycznych. Ciała komórkowe VSN tworzą warstwy pseudowielorzędowe, w których V1R i V2R są ekspresjonowane odpowiednio w warstwach apikalnej i bazalnej 6-8. W celu monitorowania odpowiedzi VSN na bodźce sensoryczne wykorzystano kilka technik 4,12,15-19. Wśród tych technik przygotowanie ostrych skrawków oferuje szereg zalet. Po pierwsze, w porównaniu z dysocjowanymi VSN 3,17, preparaty skrawkowe utrzymują neurony w ich natywnej morfologii, a dendryty komórek pozostają stosunkowo nienaruszone. Po drugie, ciała komórkowe VSN są łatwo dostępne w skrawkach koronalnych VNO, co umożliwia badania elektrofizjologiczne i eksperymenty obrazowe w porównaniu z preparatami całego nabłonka i preparatami typu whole-mount 12,20. Po trzecie, metodę tę można połączyć z technikami klonowania molekularnego, co pozwala na identyfikację receptorów.
Stymulacja sensoryczna wywołuje silny napływ Ca2+ do VSN, co świadczy o aktywacji receptorów 4,21. W związku z tym opracowaliśmy myszy transgeniczne wykazujące ekspresję G-CaMP2 w węchowych neuronach sensorycznych, w tym w VSN 15,22. Czułość oraz genetyczna natura sondy znacznie ułatwiają eksperymenty z obrazowaniem Ca2+. Metoda ta wyeliminowała proces wprowadzania barwnika stosowany w poprzednich badaniach 4,21. Stosujemy również system dostarczania ligandów, który umożliwia aplikację różnych bodźców do skrawków VNO. Połączenie tych dwóch technik pozwala nam na jednoczesne monitorowanie wielu neuronów w odpowiedzi na dużą liczbę bodźców. Na koniec opracowaliśmy półautomatyczny potok analizy w celu wspomagania przetwarzania obrazów.

Narząd jamistnokaczkowy (VNO) wykrywa wewnątrzgatunkowe sygnały chemiczne, które przekazują informacje społeczne i rozrodcze. Przeprowadziliśmy eksperymenty obrazowania Ca2+ z wykorzystaniem myszy transgenicznych wykazujących ekspresję G-CaMP2 w tkance VNO. Podejście to pozwala nam analizować złożone wzorce odpowiedzi neuronów jamistnokaczkowych na liczne bodźce feromonowe.

Obrazowanie odpowiedzi neuronalnych w preparatach skrawków narządu jamistego wyrażających genetycznie kodowany czujnik wapnia

Narząd jamisty (VNO) wykrywa sygnały chemosensoryczne, które niosą informacje o statusie społecznym, seksualnym i rozrodczym osobników w obrębie ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie sposobu przygotowania żywych skrawków tkanki do obrazowania odpowiedzi na feromony w neuronach organu nosowego MRO. W tym celu najpierw przygotowuje się żywe skrawki tkanki organu nosowego MRO lub VNO z myszy wykazujących ekspresję genetycznego wskaźnika wapnia GCaMP two. Kolejnym krokiem jest konfiguracja systemu perfuzji na stole mikroskopu w celu utrzymania skrawka, aplikacji bodźca oraz obrazowania.Odpowiedź. Następnie przeprowadzany jest eksperyment obrazowania time-lapse z zastosowaniem różnych bodźców feromonowych, po którym następuje analiza danych z wyników obrazowania. W końcowym etapie uzyskiwane są wzorce odpowiedzi neuronów VNO na różne bodźce feromonowe.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ładowanie wapnia D lub obrazowanie w komórkach dysocjowanych, jest możliwość zachowania nienaruszonej morfologii komórek, lepszego utrzymania żywotności skrawków oraz uzyskania silniejszego sygnału. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na niektóre z kluczowych pytań w badaniach nad systemem nosowym nicieni, takich jak identyfikacja ligandów i ich receptorów oraz profilowanie odpowiedzi poszczególnych neuronów nosowych nicieni. Metodę tę można zastosować również w innych systemach, takich jak systemy węchowe, surowicze lub w badaniach nad łuszczycą mózgu.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności ze względu na problem z pozyskaniem odpowiednich preparatów do psoriazy oraz konfiguracją systemu perfuzji. Przed rozpoczęciem procedury należy przygotować wymagane roztwory, w tym mysz, sztuczny roztwór Ringera do płynu mózgowo-rdzeniowego, 4% agar o niskiej temperaturze topnienia oraz stymulanty feromonowe, zgodnie z towarzyszącym rękopisem. Następnie należy umieścić dwie probówki z agarem o niskiej temperaturze topnienia na bloku grzejnym.Ustaw temperaturę powyżej 60 °C, aby roztopić agarozę. Gdy żel się upłynni, przenieś probówki do bloku grzejnego o temperaturze 37 °C. Aby przygotować skrawki VNO.Po odcięciu głowy uśpionej myszy GCaMP two, należy przeciąć kości żuchwy nożyczkami, aby usunąć dolną szczękę. Następnie należy oddzielić tkankę podniebienia twardego, aby odsłonić jamę nosową. Potem należy rozdzielić kości szczęki, wsuwając skalpel między dwa przednie siekacze.Ostrożnie usuń kość żuchwy, aby odsłonić VNO. W tym momencie unieś cały VNO z jamy nosowej, trzymając za kość ogonową. Przenieś VNO do schłodzonego, natlenionego roztworu A CSF dla myszy.Bezpośrednio pod mikroskopem stereoskopowym rozdziel dwa organy vno, delikatnie przesuwając końcówki pęsety wzdłuż ściany kości przegrody. Usuń kość vomer, która otacza tkankę VNO. Następnie delikatnie wyjmij całą tkankę VI NO z jamy kostnej.Na tym etapie należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić neuroepitelium. Następnie całkowicie usuń małe fragmenty kości pozostałe na powierzchni tkanki. Przed zatopieniem fragmentów pozostałych na.Tkanka może zostać pochwycona przez ostrze tnące, co spowodowałoby jej wyciągnięcie z bloku Aros. Następnie należy użyć pęsety, aby przytrzymać tylny koniec tkanki VNO i delikatnie zanurzyć ją w roztopionym Aros. Probówkę należy szybko schłodzić w lodzie.Aby utwardzić aros, proces zatapiania i chłodzenia powinien trwać krócej niż dwie minuty. Następnie należy przyciąć blok aros zawierający VNO i przykleić go do uchwytu tkankowego. W dalszej kolejności uchwyt tkankowy należy włożyć do metalowego cylindra, a pozostałą przestrzeń wypełnić dodatkowym aros o niskiej temperaturze topnienia.Gdy niskotopliwy agar zastygnie na lodzie, należy niezwłocznie przystąpić do sekcjonowania; do komory sekcyjnej slicera do tkanek należy podać zimny, natleniony płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) myszy, a następnie wycinać plastry o grubości od 180 do 200 micron.W tej procedurze należy najpierw umieścić skrawek VNO na środku komory perfuzyjnej i przytrzymać go za pomocą kotwicy do skrawków. Nitki kotwicy powinny naciskać jedynie na część aros o niskiej temperaturze topnienia, a nie na tkankę VNO. Następnie należy podać natleniony płyn CSF myszy do komory perfuzyjnej poprzez port wlotowy z prędkością około 100 µL/s.ciecz jest odprowadzana przez igłę ssącą poprzez port wylotowy, aby zapewnić ciągły przepływ świeżego CSF myszy A. Następnie należy napełnić strzykawkę o pojemności 30 mililitrów roztworem Ringera i zamocować ją do pompy strzykawkowej. Prędkość pompy należy ustawić w zakresie od 300 do 600 microliters per minute.Aby zapewnić ciągły przepływ roztworu Ringera nad skrawkiem, należy połączyć wylot z układu z roztworem Ringera z pętlą wtryskową A-H-P-L-C. Sterowanie pętlą wtryskową posiada dwie drogi przepływu. W pozycji załadunku należy wprowadzić próbkę moczu mysiego do pętli próbkowej za pomocą precyzyjnej strzykawki Hamiltona.Nadmiar próbki wypływa z pętli próbnej przez wylot do odpadów. Roztwór Ringera wstrzykiwany przez pompę strzykawkową omija pętlę próbną i trafia bezpośrednio do wylotu, który jest połączony z końcówką perfuzyjną w pozycji wtrysku. Roztwór z pompy przepływa przez pętlę próbną i wypycha bodźce feromonowe do wylotu.Przed eksperymentem obrazowania należy usunąć pęcherzyki powietrza, aby zapewnić płynny przepływ płynu perfuzyjnego. Następnie należy ustawić końcówkę perfuzyjną pod obiektywem 5x lub 10x w taki sposób, aby końcówka znajdowała się około 1 mm od przekroju żyły.Aby zmierzyć czas opóźnienia próbki oraz czas trwania, należy wprowadzić barwnik fluorescencyjny 0,1%rho domine six G do pętli próbkowej. Następnie należy przełączyć zawór w pozycję wtrysku. Pięć sekund po rozpoczęciu akwizycji obrazu należy detekować sygnał fluorescencji w czasie od 10 do 30 sekund.Gładka krzywa sygnału fluorescencyjnego wskazuje również, że pod obiektywem zanurzeniowym powstaje niewielka turbulencja oraz że do skrawka dociera odpowiednia perfuzja utlenionego CSF myszy A w naszym laboratorium. Do obrazowania time-lapse w celu wykrywania sygnałów GAMP two wykorzystuje się mikroskop Zeiss Axio scope FS two z 10 x lub 20 x obiektywem zanurzeniowym w wodzie. Stosowany jest standardowy filtr pasmowo-przepustowy GFP od 450 do 490 nanometrów.Obrazy epi-fluorescencyjne są rejestrowane za pomocą kamery CCD z binningiem 1x1 lub 2x2, w zależności od poziomu ekspresji GCaMP two. Najpierw ustaw prędkość akwizycji na jedną klatkę na sekundę. Dostosuj natężenie światła tak, aby zminimalizować blaknięcie sygnałów GCaMP two oraz uszkodzenia fotochemiczne komórek.Następnie w określonym punkcie czasowym przełącz zawór do pozycji wtryskiwania, aby uzyskać spójne opóźnienia czasowe we wszystkich próbach w ramach danej serii eksperymentów. Teraz przeprowadź bieg testowy, używając roztworu Ringera jako bodźca; skoryguj ustawienia perfuzji, jeśli podczas wtryskiwania próbki pojawią się artefakty ruchowe. Następnie wykonaj bieg kontroli pozytywnej z użyciem moczu mysiego rozcieńczonego w roztworze w stosunku 1:100, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej pomiędzy różnymi próbkami.Przemyj strzykawkę Hamiltona roztworem ringera co najmniej trzy razy po pobraniu jednego bodźca. Podobnie, przed aplikacją, przemyj pętlę próbkowania roztworem ringera co najmniej trzy razy pomiędzy różnymi bodźcami. Przed podaniem kolejnego bodźca odczekaj od 4 do 10 minut, aby neurony sensoryczne nosa MRO mogły się zregenerować, w celu przeprowadzenia rejestracji wszystkich obrazów pozyskanych z jednego skrawka.Do zautomatyzowania tego procesu wykorzystano specjalnie napisany skrypt VBA w programie Avision. W tym przypadku wszystkie klatki obrazu z tego samego eksperymentu są rejestrowane względem wspólnej, wybranej klatki referencyjnej przy użyciu transformacji elastycznej w celu wykonania odejmowania obrazów i zidentyfikowania komórek reagujących. Do zautomatyzowania tego procesu wykorzystano specjalnie napisane makra w programie ImageJ w wersji 1.42.Dla każdego stosu obrazów generowany jest obraz projekcji minimalnej, a komórki reagujące wyłaniają się po odjęciu projekcji minimalnej od surowych stosów obrazów. Następnie należy zidentyfikować obszar zainteresowania w stosach po odjęciu i wyznaczyć współrzędne ROI za pomocą wtyczki multi mesure z programu Image J. Następnie należy przetworzyć wszystkie stosy dla jednego eksperymentu i zapisać wszystkie współrzędne ROI w głównej liście ROI. Po tym etapie, korzystając z głównej listy ROI, należy zmierzyć odpowiedzi komórek z surowych stosów obrazów za pomocą specjalnie napisanego makra oraz wtyczki multi mesure z programu Image J. Na koniec należy wykreślić krzywe odpowiedzi i mapę ciepła w programie matlab.Przedstawiono tutaj przykład eksperymentu obrazowania VNO z wykorzystaniem próbek moczu pobranych od czterech osobniczych myszy. Około 80 komórek wykazuje odpowiedź na co najmniej jeden z bodźców z moczu, a wartości ich odpowiedzi delta F podzielone przez F zostały naniesione na mapę ciepła. Poniżej znajdują się ślady odpowiedzi komórek pierwszej, drugiej i trzeciej, które pokazują przebieg czasowy aktywacji przez bodźce z moczu; komórka pierwsza wykazuje odpowiedź na obie próbki moczu od samic, ale nie na próbki od samców.Podczas gdy komórka druga wykazuje przeciwstawne wzorce aktywacji i reaguje na obie próbki męskie, tylko komórka trzecia jest aktywowana zarówno przez indywidualne próbki męskie, jak i żeńskie. Po przygotowaniu preparatu, plaster można opracować w 30 minut, a neurony można utrzymać przy życiu od sześciu do ośmiu godzin, jeśli procedura zostanie przeprowadzona prawidłowo.Podczas stosowania tej metody należy pamiętać o użyciu odczynników klasy do hodowli tkankowych oraz o unikaniu kontaktu odczynników do utrwalania tkanek z preparatami tkankowymi. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przygotowania żywej tkanki z łuszczycą do obrazowania odpowiedzi termicznych w neuronach w polu widzenia z wykorzystaniem myszy wykazujących ekspresję G Camp.

imaging-neuronal-responses-slice-preparations-vomeronasal-organ

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Obrazowanie reakcji neuronów w przygotowaniach przekrojowych narządu węchowego wyrażającego genetycznie zakodowany czujnik wapnia

Opisujemy uznaną technikę pomiaru i analizy odpowiedzi wapniowych wywołanych zapachami w płacie antennym żywych Drosophila melanogaster.

Obrazowanie wapniowe odpowiedzi wywołanych zapachami w płacie antennym Drosophila

U myszy zdolność wykrywania feromonów jest zapośredniczona głównie przez narząd vomeronasalny (VNO). W niniejszej pracy opisano przygotowanie ostrych skrawków tkanki VNO do obrazowania wapnia. To podejście fizjologiczne umożliwia obserwację subpopulacji i/lub pojedynczych neuronów w żywej tkance i jest wygodne w procesie identyfikacji receptorów i ligandów.

Obrazowanie detekcji feromonów w preparacie cienkich przekrojów tkanki organu vomeronasalnego myszy

W niniejszym protokole aktualizujemy opis ostatnich postępów w obrazowaniu sygnałów Ca2+ w neuronach znakowanych GFP w skrawkach tkanki mózgowej z wykorzystaniem czerwonego fluorescencyjnego wskaźnika Ca2+.

Obrazowanie odpowiedzi wapniowych w neuronach z etykietą GFP w skrawkach mózgu myszy z obszaru podwzgórza

Wideo z protokołem opisuje tworzenie klamry do rejestracji elektrofizjologicznej z całych komórek z neuronów czuciowych narządu lemieszowo-nosowego (VNO) u myszy. Koronalny wycinek VNO z fluorescencyjnie znakowanymi neuronami czuciowymi umieszcza się w konfiguracji rejestracyjnej. Znakowany neuron jest łatany pipetą rejestrującą w konfiguracji całej komórki w celu zapisu elektrofizjologicznego w odpowiedzi na bodźce chemiczne.

Ustanowienie klamry krosowej dla całej komórki do zapisu elektrofizjologicznego z neuronów czuciowych lemieszowo-nosowych

Tutaj opisujemy fizjologiczne podejście, które pozwala na identyfikację i dogłębną analizę zdefiniowanej populacji neuronów czuciowych w ostrych wycinkach tkanki koronalnej mysiego narządu lemieszowo-nosowego za pomocą nagrań z całych komórek.

Dogłębna analiza fizjologiczna zdefiniowanych populacji komórek w ostrych wycinkach tkanek mysiego narządu lemieszowo-nosowego

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów Ca2+ do rejestrowania zmian w aktywności neuronalnej u zachowujących się robaków Caenorhabditis elegans.

Ratiometryczne obrazowanie wapnia poszczególnych neuronów w zachowaniu Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół, za pomocą którego można wizualizować wapń pre- i/lub postsynaptyczny w kontekście uczenia się i zapamiętywania Drosophila. Obrazowanie wapnia in vivo przy użyciu synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia jest połączone z klasycznym paradygmatem warunkowania węchowego, dzięki czemu można określić plastyczność synaptyczną leżącą u podstaw tego typu uczenia się asocjacyjnego.

Optyczne obrazowanie wapnia in vivo plastyczności synaptycznej indukowanej uczeniem się u Drosophila melanogaster

Tutaj prezentujemy, jak odsłonić kolankowaty ganglion żywej, znieczulonej myszy laboratoryjnej i jak wykorzystać obrazowanie wapnia do pomiaru reakcji zespołów tych neuronów na bodźce smakowe, co pozwala na wielokrotne próby z różnymi stymulantami. Pozwala to na dogłębne porównania, które neurony reagują na które degustacje.

Obrazowanie wapnia in vivo reakcji neuronów zwojowych układu nerwowego myszy na bodźce smakowe

Przedstawiamy protokół odsłaniania pnia mózgu dorosłej myszy od strony brzusznej. Dzięki zastosowaniu soczewki o indeksie gradientowo-refrakcyjnym z miniaturowym mikroskopem, obrazowanie wapnia można wykorzystać do zbadania aktywności somatów nerwowych dolnych oliwek in vivo.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia u myszy z oliwek dolnych

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo GCaMP nienaruszonych neuronów zwoju trójdzielnego (TG). Opis ten obejmuje chirurgię ekspozycji na TG, obrazowanie neuronów TG za pomocą mikroskopii konfokalnej in vivo , zastosowanie bodźców somatycznych podczas obrazowania mikroskopowego neuronów TG oraz analizę danych obrazowania wapnia GCaMP in vivo .

In vivo (in vivo ) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach nerwu trójdzielnego

Poznaj metodę obrazowania odpowiedzi neuronów narządu lemieszowo-nosowego na bodźce feromonowe w preparatach warstwowych myszy transgenicznych z G-CaMP2. Technika zachowuje integralność tkanki.

Obrazowanie odpowiedzi neuronalnych w preparatach warstwowych narządu lemieszowo-nosowego wyrażającego genetycznie kodowany czujnik wapnia (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie odpowiedzi neuronalnych w preparatach skrawków narządu jamistego wyrażających genetycznie kodowany czujnik wapnia

Przeglądaj więcej filmów