Name: Wydajna produkcja rekombinowanego parwowirusa za pomocą systemów pochodnych adenowirusa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Poznaj wydajną metodę produkcji rekombinowanych parwowirusów z wykorzystaniem wektora pomocniczego adenowirusa typu 5. Protokół zwiększa wydajność ponaddziesięciokrotnie, zachowując jakość wirusa i redukując koszty.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy zespołowi jednostki produkcji i rozwoju wirusów DKFZ, w szczególności Marcusowi Müllerowi, Silvii Münstermann, Barbarze Liebetrau i Mandy Roscher. Badanie to zostało częściowo wsparte grantami z Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań (BMBF) oraz Stowarzyszenia Helmholtza w ramach wspólnego programu Deutsches Krebsforschungszentrum / Cancéropôle du Grand-Est w zakresie stosowanej wirusologii nowotworów.

Należy pamiętać, że do produkcji rekombinowanych parwowirusów (recPV) wymagane jest laboratorium o 2. poziomie bezpieczeństwa biologicznego.
Protokół jest podzielony na dwie główne części. Pierwsza część (produkcja recPV poprzez transfekcję) jest niezbędna do wytworzenia minimalnej ilości recPV, która służy jako inokulum w drugiej części protokołu (produkcja recPV poprzez infekcję). Po uzyskaniu niewielkiej ilości recPV pierwszą część protokołu można pominąć, a rekombinowany parwowirus może być amplifikowany wyłącznie poprzez infekcję, zapewniając gen kodujący białka kapsydu parwowirusa za pomocą pomocniczego adenowirusa (patrz poniżej).
1. Produkcja recPV za pomocą transfekcji
1.1 Transfekcja viralnego DNA
W tej sekcji protokołu można zastosować dowolną uznaną metodę transfekcji DNA, opartą na lipidach kationowych lub fosforanie wapnia. My zazwyczaj stosujemy odczynnik do transfekcji Fugene HD. Aby kontrolować wydajność transfekcji, zalecamy transfekcję dodatkowej płytki plazmidem wykazującym ekspresję ulepszonego zielonego białka fluorescencyjnego (np. pEGFP-N1, Clontech). Transfekcję uznaje się za wydajną i optymalną dla produkcji wirusa, gdy co najmniej 50% populacji komórek wykazuje pozytywny wynik dla EGFP 24 godziny po transfekcji.
<ol>
	<li>Na 1 dzień przed transfekcją wysiać 2 miliony komórek HEK293T na płytkę 10 cm, aby uzyskać 50% konfluencji komórek w dniu transfekcji. Hodować komórki w 10 ml pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę do produkcji wirusów (stosunek molowy 1:2:1) w probówce 1,5 ml:
	<ol class="lalpha">
		<li>3 μg wektora recPV zawierającego interesujący transgen (np. phH-1-GFP6).</li>
		<li>6 μg wektora pCMV/VP5 zawierającego jednostkę genu kapsydu parwowirusa</li>
		<li>8 μg pomocniczego plazmidu pXX67 pochodzenia adenowirusowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć mieszaninę plazmidów w pożywce bezsurowiczej do objętości 850 μl (końcowe stężenie 20 ng/μl).</li>
	<li>Dodać 42,5 μl Fugene HD (stosunek 2,5:1 μl Fugene: μg DNA). Podczas dodawania Fugene do pożywki nie dotykać ścianek probówki.</li>
	<li>Delikatnie wymieszać w wstrząsarku Vortex przez 5-10 sekund.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Dodawać mieszaninę do transfekcji kroplami do komórek. Delikatnie potrząsnąć płytką, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę.</li>
</ol>
1.2 Produkcja wirusa
<ol>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przy 92% wilgotności i 5% CO2 przez 72 godziny przed zbiorem. W tym okresie z plazmidów parwowirusowych tworzą się cząstki potomne parwowirusa.</li>
</ol>
1.3 Zbiór wirusa
<ol>
	<li>W komorze do hodowli tkankowej zeskrobać komórki wraz z medium, odessać i przenieść zawiesinę z płytki do plastikowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wirować probówkę z prędkością 250 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć 95% supernatantu.</li>
	<li>Delikatnie wymieszać zawartość probówki na wortexie, aby resuspendować osad w pozostałym supernatancie (około 0,5 ml).</li>
	<li>Zamrozić probówkę w temperaturze -80 °C. Na tym etapie można przerwać proces produkcji lub kontynuować protokół.</li>
	<li> rozmrozić zawiesinę i doprowadzić ją do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Zamrozić zawiesinę w kąpieli z ciekłego azotu, a następnie rozmrozić w ciepłej wodzie w temperaturze 37 °C. Intensywnie mieszać probówki na wortexie przez 15 s i powtórzyć cykl zamrażania i rozmrażania jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Wirować probówki z prędkością 16 000x g przez 15 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki. Na tym etapie probówka zawiera surowy ekstrakt wirusowy.</li>
	<li>Przystąpić do miareczkowania wirusa (patrz poniżej). W przypadku recPV niosącego gen GFP, typowa produkcja powinna dać 1-3 x 107 infekcyjnych jednostek wirusowych, co odpowiada około 1-3 x 1010 cząstek zawierających genom wirusa.</li>
</ol>
1.4 Przechowywanie wirusa
<ol>
	<li>W celu długotrwałego przechowywania zamrozić probówkę zawierającą surowy ekstrakt wirusowy w temperaturze -80 °C. Surowe ekstrakty wirusowe można wykorzystać jako inokulum w drugiej części protokołu.</li>
</ol>
2. Produkcja recPV poprzez infekcję
Przed rozpoczęciem produkcji recPV poprzez infekcję, należy wyprodukować i oczyścić adenowirus 5 niosący gen VP parwowirusa (pomocniczy Ad-VP, opisany w5) zgodnie ze standardowym protokołem8. Niezbędna jest również minimalna ilość recPV niosących interesujący transgen (np. otrzymanych poprzez transfekcję, jak opisano powyżej).
Poniżej opisujemy produkcję recPV w kolbach o powierzchni 175 cm2 (T175). Dalsza amplifikacja zapasu wirusa otrzymanego w ten sposób może być przeprowadzona w 10 wielowarstwowych komorach hodowlanych CellSTACK (Corning) przy niewielkich modyfikacjach proponowanego protokołu.
2.1 Infekcja
<ol>
	<li>Na 1 dzień przed infekcją wysiać 10 milionów komórek NB324K do kolby T175, aby w dniu infekcji uzyskać 60-80% konfluencji komórek. Przygotować drugą kolbę zawierającą taką samą liczbę komórek jako kontrolę (komórki nieinfekowane). Każda kolba T175 powinna zawierać 20 ml podłoża Minimum Essential Medium (MEM) jako objętość końcową, uzupełnionego o 5% płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM L-glutaminy, 100U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.</li>
	<li>Następnego ranka przygotować w plastikowej probówce o pojemności 2 ml mieszaninę wirusową składającą się z:
	<ol class="lalpha">
		<li>Ad-VP-helper5 przy wielokrotności infekcji (MOI, jednostki infekcyjne/komórka) = 10 (co odpowiada 1 x 108 jednostek infekcyjnych);</li>
		<li>recPVs przy MOI = 0,5 (co odpowiada 5 x 106 jednostek infekcyjnych). Uzupełnić do objętości 1,5 ml za pomocą MEM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nanieść całą mieszaninę wirusową do jednej z kolb T175.</li>
	<li>Inkubować kolbę przez 2 hr w temperaturze 37 °C, przy 92% wilgotności i 5% CO2, delikatnie wstrząsając co 15 min.</li>
	<li>Inkubować przez kolejne 20-24 hr w temperaturze 37 °C, przy 92% wilgotności i 5% CO2.</li>
	<li>Wymienić podłoże hodowlane na świeże podłoże.</li>
</ol>
2.2 Produkcja wirusa
Inkubować kolby w temperaturze 37 °C przy 92% wilgotności i 5% CO2 przez 48 godzin. Jako wskaźnik wydajnej produkcji wirusa, w kolbie zawierającej zainfekowane komórki powinny pojawić się wyraźne oznaki cytotoksyczności, począwszy od 36–48 godzin po infekcji.
2.3 Pozyskiwanie wirusa
<ol>
	<li>W komorze do hodowli tkankowej odessać i przenieść nadsącz z pożywki z kolby do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie 1,5 ml PBS.</li>
	<li>Poddać komórki trypsynizacji, używając 1,5 ml 0,25 % Trypsyny-EDTA. Dodać zawiesinę komórkową do wcześniej usuniętej pożywki.</li>
	<li>Wirować komórki wraz z nadsączem przy 5,000 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odlać nadsącz.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu TE (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,7) do osadu komórkowego i delikatnie wymieszać na wortexie, aby resuspendować komórki.</li>
	<li>Zamrozić zawiesinę komórkową w kąpieli z ciekłego azotu, a następnie rozmrozić w ciepłej wodzie w temperaturze 37 °C. Intensywnie mieszać probówkę na wortexie przez 15 s i powtórzyć cykl zamrażania i rozmrażania trzy razy.</li>
	<li>Potraktować zawiesinę komórkową nukleazą Benzonase w stężeniu 50 U/ml przez 30 min w 37 °C w celu strawienia genomowego DNA komórkowego oraz nieopakowanego DNA wirusowego.</li>
	<li>Wirować probówkę przy 5,000 x g przez 20 min w 4 °C.</li>
	<li>Zebrać nadsącz do nowej probówki. Nadsącz na tym etapie stanowi surowy preparat ekstraktu wirusowego. Typowe wydajności recPV-GFP otrzymywane zgodnie z tym protokołem powinny mieścić się w zakresie 1-10 x 108 jednostek infekcyjnych wirusa.</li>
</ol>
2.4 Przechowywanie wirusa
<ol>
	<li>W przypadku przechowywania krótkoterminowego (maksymalnie 2 miesiące), przechowywać wirusa w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>W przypadku przechowywania długoterminowego (powyżej 2 miesięcy), przechowywać wirusa w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie RecPV
<ol>
	<li>W celu oczyszczania recPV z surowych lizatów zalecamy przeprowadzenie nieciągłego gradientu jodiksanolowego zgodnie z metodą Zolotukhin et al. 9. Dla efektywnego oczyszczania wirusa zalecamy użycie co najmniej 5 ml surowego ekstraktu wirusowego (uzyskanego z produkcji w pięciu kolbach T175).</li>
</ol>
4. Miareczkowanie rekombinowanego parwowirusa
<ol>
	<li>Przeprowadź miareczkowanie recPV zgodnie z opisem w pracy El-Andaloussi et al.5</li>
</ol>
5. Kontrole jakości
<ol>
	<li>Należy zastosować protokół opisany przez El-Andaloussi et al.5, aby sprawdzić obecność niepożądanych wirusów zdolnych do replikacji (RCV), przeprowadzając test plackowy parwowirusa na komórkach wskaźnikowych NB324K.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Przykład produkcji recPV poprzez transfekcję w obecności lub braku genomowych elementów adenowirusa przedstawiono na Rysunku 3. Komórki poddano transfekcji pCMV/VP (plazmidem zawierającym gen kodujący białka kapsydu parwowirusa VP) wraz z phH-1-GFP (recPV zawierającym gen GFP) lub phH-1-luciferase (recPV zawierającym gen lucyferazy świetlika), w obecności (+ pXX6) lub bez (-pXX6) plazmidu pXX6 (zawierającego geny adenowirusa E2A, E4(orf6) i VA RNA). Równe objętości surowych ekstraktów komórkowych naniesiono na komórki NB324K, a następnie przeprowadzono analizę transdukcji GFP lub testy lucyferazy zgodnie z metodą opisaną przez El-Andaloussi et al.5. W obecności pXX6 uzyskano wyraźny wzrost produkcji recPV, przy czym produkcja wzrosła z 0,3 jednostek transdukcyjnych (TU) GFP/komórkę uzyskiwanych zgodnie z konwencjonalnymi protokołami do około 5 TU/komórkę uzyskanych zgodnie z naszą metodą (Rys. 3A, B). Znaczący wzrost (około 24-krotny) produkcji recPV zaobserwowano również w przypadku phH-1-luciferase (Rys. 3C). Wyniki te wskazują, że materiał genetyczny zawarty w pXX6 jest w stanie zwiększyć produkcję parwowirusów.
Reprezentatywny przykład produkcji recPV poprzez infekcję przedstawiono na Rysunku 4. Komórki NB324K poddano koinfekcji różnymi recPV (zgodnie z oznaczeniem na rysunku) oraz Ad-VP-helper (zawierającym gen kodujący białka kapsydu PV VP). Pomocniczy wektor Ad-VP dodatkowo zwiększył produkcję recPV do poziomu &gt;70 TU na wysianą komórkę (Rys. 4A) bez zwiększenia występowania niepożądanych cząsteczek wirusowych zdolnych do replikacji (Rys. 4B).
<img alt="Edycja genów; schemat plazmidu wektora; transfekcja wirusowego DNA; proces produkcji wirusów w komórkach HEK293T." src="/files/ftp_upload/3518/3518fig1.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Wektory oparte na autonomicznych parwowirusach. (A) Góra: Transgen zastępuje część genów kodujących VP i znajduje się pod kontrolą wirusowego promotora P38. Geny NS1/2 zostają zachowane, a ich ekspresja jest kontrolowana przez wirusowy promotor P4. Genom wektora jest flankowany przez parwowirusowe ITR, które zawierają elementy działające w cis, niezbędne do replikacji i pakowania rekombinowanego genomu. Dół: Plazmid niosący gen VP pod promotorem heterologicznym (np. CMV) lub autologicznym (np. P38) (Px) jest dostarczany in trans podczas produkcji rekombinowanego parwowirusa w celu zrekompensowania przerwania genów strukturalnych w rekombinowanym genomie. ITR, odwrócone powtórzenia końcowe. Rycina zaadaptowana z 4. (B) Schematyczna prezentacja klasycznego protokołu stosowanego do produkcji recPV. Komórki HEK293T są przejściowo transfekowane wirusowym DNA (plazmidami wektorowymi i pomocniczymi), a po trzech dniach komórki są zbierane, a wirusy izolowane.
<img alt="Schemat projektu rekombinowanego wektora wirusowego i procesu produkcji; konstrukty genowe; konfiguracja infekcji." src="/files/ftp_upload/3518/3518fig2.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Produkcja recPV przy użyciu Ad-VP. (A) Schematy map genomów recPV i Ad-VP. recPV zawiera heterologiczny transgen, który zastępuje część regionu VP. Ad-VP niesie gen VP parwowirusa. (B) Schematyczny widok protokołu opisanego w niniejszym opracowaniu. Komórki NB324K są koinfekowane wirusami recPV i Ad-VP. Po trzech dniach komórki są zbierane, a cząsteczki recPV odzyskiwane z lizatu komórkowego.
<img alt="Analiza ekspresji genów; fluorescencja (hH-1-GFP), wykres słupkowy; produkcja wirusowa w komórkach (wpływ pXX6)." src="/files/ftp_upload/3518/3518fig3.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Stymulacja produkcji recPV przez plazmidy pXX6 oparte na adenowirusie . Komórki HEK293T, wysiane w szalkach 10 cm, przetransfekowano pCMV/VP w połączeniu z phH-1-GFP (A i B) lub phH-luciferase (C) w celu produkcji recPVs. Jednocześnie komórki ko-transfekowano plazmidami pomocniczymi pXX6 pochodzącymi z adenowirusa lub nie, zgodnie z oznaczeniem. Trzy dni po transfekcji komórki zebrano i lizowano poprzez trzy cykle zamrażania i rozmrażania. Równe objętości surowych ekstraktów wirusowych naniesiono na komórki wskaźnikowe NBK i przeprowadzono testy transdukcji. (A) Reprezentatywne mikrografie pokazujące komórki GFP-dodatnie w konfluentnych monowarstwach NB324K. (B) Ilościowe oznaczenie testów transdukcji GFP wyrażone w jednostkach transdukcji (TU) na wysianą komórkę. (C) Ilościowe oznaczenie aktywności lucyferazy wyrażone w względnych jednostkach lucyferazy (RLU). Test lucyferazy przeprowadzono zgodnie z opisem w pracy El-Andaloussi et al.5. Słupki reprezentują wartości średnie z trzech powtórzeń z paskami odchylenia standardowego. Liczba nad słupkiem + pXX6 w (B i C) wskazuje krotność wzrostu mian wirusa recPV uzyskanego w obecności pXX6 w porównaniu do jego braku.
<img alt="Wykresy słupkowe porównujące produkcję RCV dla H-1-EGFP i Chi-hH-1-EGFP, przedstawione w komórkach z pomocniczym wirusem Ad-VP i bez niego." src="/files/ftp_upload/3518/3518fig4.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Stymulacja produkcji recPV za pomocą rekombinowanego pomocniczego wirusa Ad-VP. (A) Komórki NB324K zainfekowano oczyszczonym pomocniczym wirusem Ad-VP przy MOI wynoszącym 10 (jednostek Ad-X/komórkę, miareczkowanych przy użyciu Adeno-X Rapid Titer Kit), a następnie superinfekowano jednym z następujących rekombinowanych parwowirusów: Chi-hH-1-EGFP11 (0,1 TU/komórkę) lub H-1-GFP (0,5 TU/komórkę)5. Jeden dzień po infekcji zmieniono pożywkę, a dwa dni później komórki zebrano i poddano lizie poprzez trzy cykle zamrażania i rozmrażania. Surowe ekstrakty komórkowe wykorzystano do oznaczenia mian wirusa za pomocą testu transdukcji zgodnie z metodą El-Andaloussi et al.5. TU, jednostka transdukcyjna. (B) Partie wirusów otrzymane w obecności lub przy braku Ad-VP przeanalizowano pod kątem zawartości replikacyjnie kompetentnych cząstek wirusowych (RCV) za pomocą testu plackowego na komórkach wskaźnikowych NB324K.

<ol><li>Cotmore, S. F., Tattersall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvoviral+host+range+and+cell+entry+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Virus.+Res%22%5BJournal%5D)">Parvoviral host range and cell entry mechanisms.</a> Adv. Virus. Res. 70, 183(2007).</li>
<li>Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+parvoviruses+as+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185(2010).</li>
<li>Hristov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Through+Its+Nonstructural+Protein+NS1%2C+Parvovirus+H-1+Induces+Apoptosis+via+Accumulation+of+Reactive+Oxygen+Species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Through Its Nonstructural Protein NS1, Parvovirus H-1 Induces Apoptosis via Accumulation of Reactive Oxygen Species.</a> J. Virol. 84, 5909-5909 (2010).</li>
<li>Cornelis, J. J., Salome, N., Dinsart, C., Rommelaere, J. Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCornelis%2C+JJ+%22J.+Virol%22">J. Virol</a>. 6, 193-193 (2004).</li>
<li>El-Andaloussi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+adenovirus-based+helper+system+to+support+production+of+recombinant+parvovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel adenovirus-based helper system to support production of recombinant parvovirus.</a> Cancer Gene Ther. 18, (2011).</li>
<li>Kestler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cis+requirements+for+the+efficient+production+of+recombinant+DNA+vectors+based+on+autonomous+parvoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">cis requirements for the efficient production of recombinant DNA vectors based on autonomous parvoviruses.</a> Hum. Gene. Ther. 10, 1619-1619 (1999).</li>
<li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> J. Virol. 72, 2224(1998).</li>
<li>He, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2509(1998).</li>
<li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene. Ther. 6, 973(1999).</li>
<li>Maxwell, F., Harrison, G. S., Maxwell, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+production+of+recombinant+AAV+by+transient+transfection+of+NB324K+cells+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved production of recombinant AAV by transient transfection of NB324K cells using electroporation.</a> J. Virol. Methods. 63, 129(1997).</li>
<li>Wrzesinski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+and+pseudotyped+parvoviruses+minimize+the+contamination+of+recombinant+stocks+with+replication-competent+viruses+and+identify+a+DNA+sequence+that+restricts+parvovirus+H-1+in+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells.</a> J. Virol. 77, 3851(2003).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Wykazaliśmy, że produkcja recPV może zostać zwiększona dzięki obecności elementów genomowych adenowirusa. Zwiększyliśmy wydajność recPV ponad 10-krotnie (z 0,3 do 5 TU/komórkę) poprzez dostarczenie elementu genomowego adenowirusa za pomocą transfekcji, a ponad 100-krotnie poprzez koinfekcję komórek Ad-VP-helper w połączeniu z recPV w porównaniu do konwencjonalnych protokołów. Opisany tutaj protokół można dalej zoptymalizować, określając najbardziej odpowiedni czas dostarczenia elementów genomowych adenowirusa oraz optyma...

<table><tbody><tr><td>DMEM </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4655</td><td></td></tr><tr><td>Płodowe surowica bydlęca (F&amp;#8211;tal Bovine Serum)</td><td>PAA Laboratories</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Fugene</td><td>Roche Group</td><td>047097050001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Nukleaza Benzonase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8263</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do szybkiego oznaczania miana Adeno-X Rapid Titer Kit </td><td>Clontech Laboratories</td><td>632250</td><td></td></tr></tbody></table>

wydajna produkcja rekombinowanego parwowirusa z wykorzystaniem systemów pochodnych adenowirusa

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Parwowirusy gryzoni (PV), takie jak szczurzy H-1PV i MVM, to małe, ikosaedryczne wirusy z jednoniciowym DNA. Ich genom zawiera dwa promotory, P4 i P38, które regulują odpowiednio ekspresję białek niestrukturalnych (NS1 i NS2) oraz białek kapsydu (VP1 i VP2)1. Budzą one duże zainteresowanie jako środki przeciwnowotworowe ze względu na swoje właściwości onkolityczne i onkosupresyjne, przy jednoczesnym braku patogenności dla ludzi2. NS1 jest głównym efektorem wirusowej cytotoksyczności3. W celu dalszego wzmocnienia ich naturalnej aktywności przeciwnowotworowej, opracowano pochodne tych wektorów poprzez zastąpienie genu kodującego białka kapsydu transgenem terapeutycznym (np. cytotoksycznym polipeptydem, cytokiną, chemokiną, genem supresora nowotworów itp.)4. Wektor rekombinowanych parwowirusów (recPV) zachowuje sekwencje kodujące NS1/2 oraz telomery genomu PV, które są niezbędne do amplifikacji i pakowania wirusowego DNA. Produkcja recPV zachodzi wyłącznie w komórkach producentach (zazwyczaj HEK293T), poprzez kotransfekcję komórek drugim wektorem (pCMV-VP) wykazującym ekspresję genu kodującego białka VP (Rys. 1)4. Wektory recPV generowane w ten sposób są defektywne w replikacji. Chociaż wykazano, że recPV posiadają zwiększoną aktywność onkotoksyczną w porównaniu z wirusami rodzicielskimi, z których zostały wytworzone, ich produkcja pozostaje głównym wyzwaniem i w znacznym stopniu utrudnia zastosowanie tych środków w klinicznych aplikacjach przeciwnowotworowych.
Odkryliśmy, że wprowadzenie do komórek HEK293T wektora pochodnego od Ad-5 zawierającego geny E2a, E4(orf6) oraz VA RNA (np. plazmid pXX6) zwiększyło produkcję recPV ponad 10-krotnie w porównaniu z innymi stosowanymi protokołami. W oparciu o to odkrycie skonstruowaliśmy nowy pomocniczy wektor Ad-VP-helper, który zawiera genomiczne elementy adenowirusowe niezbędne do zwiększenia produkcji recPV, a także jednostkę genu VP parwowirusa5. Zastosowanie Ad-VP-helper pozwala na produkcję rec-PV zgodnie z protokołem opierającym się wyłącznie na etapach infekcji wirusowej (w przeciwieństwie do transfekcji plazmidowej), co umożliwia wykorzystanie linii komórkowych trudnych do transfekcji (np. NB324K) (Rys. 2). Przedstawiamy metodę, która znacznie zwiększa ilość produkowanego wirusa rekombinowanego, skracając czas produkcji i redukując koszty, bez wpływu na jakość produktu końcowego5. Ponadto możliwe jest teraz prowadzenie produkcji recPV na dużą skalę (w komórkach w zawiesinie i bioreaktorach).

W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół oparty wyłącznie na infekcji komórek, który zwiększa wydajność produkcji rekombinowanego parwowirusa ponad 100-krotnie w porównaniu z innymi stosowanymi protokołami. Protokół ten opiera się na wykorzystaniu nowego pomocniczego adenowirusa typu 5 zawierającego jednostkę transkrypcyjną VP parwowirusa (Ad-VP).

Wydajna produkcja rekombinowanego parwowirusa z wykorzystaniem systemów pochodnych adenowirusa

Parwowirusy gryzoni (PV), takie jak szczurzy H-1PV i MVM, to małe wirusy DNA o symetrii ikosaedrycznej z jednoniciowym genomem. Ich genom zawiera dwa promotory, P4 i P38...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie rekombinowanych wirusów parwowirusowych (rec PV) o wysokich mianach, przy jednoczesnym zachowaniu ich jakości oraz skróceniu czasu i obniżeniu kosztów produkcji. Osiąga się to poprzez wstępne wytworzenie wyjściowego zapasu wirusowego rec PV za pomocą transfekcji komórek HEC 2 9 3 T plazmidami rec PV wraz z wektorem pochodzącym z adenowirusa typu 5. Wprowadzenie elementów genomowych ad do komórek HEC 2 9 3 T zwiększa bowiem produkcję rec PV ponad dziesięciokrotnie.W porównaniu do istniejących protokołów opracowano nowy pomocniczy wektor AD VP, który zawiera genomiczne elementy adenowirusowe niezbędne do zwiększenia produkcji rekombinowanego parwowirusa, a także jednostkę genu VP parwowirusa. Kolejnym krokiem jest wytworzenie i oczyszczenie tego nowego pomocniczego wektora ADD VP zgodnie ze standardowymi protokołami.Ostatnim krokiem w tej procedurze jest amplifikacja rec PVS poprzez koinfekcję komórek NB three 20 4K wirusami rec PV i AD ADP. Dzięki tej strategii wydajność produkcji rec PV wzrasta ponad 100-krotnie; może ona być stosowana wyłącznie po uzyskaniu niewielkiej ilości rec PVS w drodze transfekcji. W końcowym etapie do mia

efficient-recombinant-parvovirus-production-with-help-adenovirus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Skuteczna produkcja rekombinowanego parwowirusa za pomocą systemów pochodzących od adenowirusów

Ratowanie rekombinowanych arenawirusów ze sklonowanych cDNA, podejście określane jako genetyka odwrotna, pozwala badaczom badać rolę określonych produktów genowych wirusa, a także wkład ich różnych specyficznych domen i reszt, w wielu różnych aspektach biologii arenawirusa. Podobnie, techniki genetyki odwrotnej w zatwierdzonych przez FDA liniach komórkowych (Vero) do opracowywania szczepionek zapewniają nowe możliwości generowania skutecznych i bezpiecznych szczepionek do zwalczania ludzkich...

Generowanie rekombinowanego arenawirusa do opracowania szczepionki w komórkach Vero zatwierdzonych przez FDA

Wirus rzekomego pomoru drobiu (NDV) był intensywnie badany w ciągu ostatnich kilku lat w celu opracowania nowych wektorów do szczepień i terapii, między innymi. Badania te były możliwe dzięki technikom ratowania rekombinowanego wirusa z cDNA, takim jak te, które tutaj opisujemy.

Ratowanie rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu z cDNA

W ciągu ostatnich 15 lat, wektory pochodzące od psiego adenowirusa typu 2 (CAV2) udowodniły swoją skuteczność w transdukcji komórek in vitro i in vivo i są szeroko stosowane w szczepieniach i terapii genowej. W tym miejscu opisujemy procedurę konstruowania, wytwarzania i oczyszczania wektorów CAV2, w wyniku której powstają zawiesiny wirusa o wysokim mianie.

Produkcja i oczyszczanie niereplikacyjnych wektorów pochodnych adenowirusa psów typu 2

Tutaj prezentujemy protokół do generowania wektora Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 o nazwie Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 poprzez wykorzystanie strategii inkorporacji antygenu kapsydu. Wykazano, że wektor ten wykazuje przydatność jakościową, zdolność do ucieczki z surowic Ad5-dodatnich in vitro oraz antygenowość i immunogenność w stosunku do włączonych antygenów.

Wykorzystanie strategii inkorporacji kapsydu antygenu do opracowania metod szczepień z wektorem 5 serowirusa

Przedstawiono protokół generowania wektorów adenowirusowych o dużej pojemności, pozbawionych wszystkich sekwencji kodujących wirusy. Klonowanie transgenów zawartych w genomie wektora opiera się na endonukleazach naprowadzających. Amplifikacja wirusa w komórkach produkcyjnych hodowanych jako komórki adherentne i w zawiesinie opiera się na wirusie pomocniczym dostarczającym geny wirusowe w trans.

Klonowanie i produkcja na dużą skalę wektorów adenowirusowych o dużej pojemności na bazie ludzkiego adenowirusa typu 5

Opisujemy metodę generowania i amplifikacji genetycznie modyfikowanych syncytialnych wirusów oddechowych (RSV) oraz zoptymalizowany test płytki nazębnej dla RSV. Ilustrujemy ten protokół, tworząc dwa rekombinowane wirusy, które odpowiednio umożliwiają ilościowe określenie replikacji RSV i analizę na żywo ciał inkluzyjnych RSV i dynamiki granulek związanych z ciałami inkluzyjnymi.

Wytwarzanie, amplifikacja i miareczkowanie rekombinowanych syncytialnych wirusów oddechowych

Generowanie rekombinowanych rotawirusów z plazmidowego DNA dostarcza niezbędnego narzędzia do badania replikacji i patogenezy rotawirusów oraz rozwoju wektorów ekspresyjnych rotawirusów i szczepionek. W niniejszym artykule opisano uproszczone podejście genetyki odwrotnej do generowania rekombinowanych rotawirusów, w tym szczepów eksprymujących fluorescencyjne białka reporterowe.

Uproszczona metoda genetyki odwrotnej do odzyskiwania rekombinowanych rotawirusów wykazujących ekspresję białek reporterowych

To jest metoda generowania "bezbliznowatych" rekombinowanych wirusów krowianki przy użyciu wyboru zakresu gospodarzy i wizualnej identyfikacji rekombinowanych wirusów.

Szybkie, bezproblemowe generowanie rekombinowanych pokswirusów przy użyciu zakresu gospodarzy i selekcji wizualnej

Tutaj prezentujemy protokół produkcji adenowirusa za pomocą systemu pAdEasy. Technologia obejmuje rekombinację plazmidów pAdTrack i pAdEasy-1, pakowanie i amplifikację adenowirusa, oczyszczanie cząstek adenowirusa z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej, miareczkowanie wirusa oraz testowanie funkcjonalne adenowirusa.

Skuteczna metoda produkcji adenowirusa

Szybkość wymiany wirusów w systemach morskich i słodkowodnych można oszacować za pomocą techniki redukcji i ponownego pojawienia się. Uzyskane dane pozwalają badaczom wywnioskować tempo śmiertelności mikroorganizmów indukowanej przez wirusy w systemach wodnych.

Szacowanie szybkości produkcji wirusów w systemach wodnych

Poznaj wydajną metodę produkcji rekombinowanych parwowirusów z wykorzystaniem wektora pomocniczego adenowirusa typu 5. Protokół zwiększa wydajność ponaddziesięciokrotnie, zachowując jakość wirusa i redukując koszty.

Wydajna produkcja rekombinowanego parwowirusa z wykorzystaniem systemów pochodnych adenowirusa

Przeglądaj więcej filmów