Wydajna produkcja rekombinowanego parwowirusa z wykorzystaniem systemów pochodnych adenowirusa

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie rekombinowanych wirusów parwowirusowych (rec PV) o wysokich mianach, przy jednoczesnym zachowaniu ich jakości oraz skróceniu czasu i obniżeniu kosztów produkcji. Osiąga się to poprzez wstępne wytworzenie wyjściowego zapasu wirusowego rec PV za pomocą transfekcji komórek HEC 2 9 3 T plazmidami rec PV wraz z wektorem pochodzącym z adenowirusa typu 5. Wprowadzenie elementów genomowych ad do komórek HEC 2 9 3 T zwiększa bowiem produkcję rec PV ponad dziesięciokrotnie.

W porównaniu do istniejących protokołów opracowano nowy pomocniczy wektor AD VP, który zawiera genomiczne elementy adenowirusowe niezbędne do zwiększenia produkcji rekombinowanego parwowirusa, a także jednostkę genu VP parwowirusa. Kolejnym krokiem jest wytworzenie i oczyszczenie tego nowego pomocniczego wektora ADD VP zgodnie ze standardowymi protokołami.

Ostatnim krokiem w tej procedurze jest amplifikacja rec PVS poprzez koinfekcję komórek NB three 20 4K wirusami rec PV i AD ADP. Dzięki tej strategii wydajność produkcji rec PV wzrasta ponad 100-krotnie; może ona być stosowana wyłącznie po uzyskaniu niewielkiej ilości rec PVS w drodze transfekcji. W końcowym etapie do miareczkowania otrzymanych zapasów wirusa wykorzystuje się ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym lub test transdukcji.

Dodatkowo przeprowadza się test plackowy, aby potwierdzić, że podczas procesu produkcji nie powstały niepożądane wirusy zdolne do replikacji. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak klasyczna produkcja rekombinowanego parwowirusa za pomocą plazmidów w komórkach aktywnych i traktowanych, jest to, że po wytworzeniu początkowych zapasów rekombinowanego parwowirusa w pomocniczym adenowirusie VP, nasza produkcja będzie opierać się całkowicie na infekcji wirusowej. Pozwala to na zastosowanie komórek NBK, które są dobrymi producentami parwowirusa, ale są trudne do transfekcji.

W ten sposób możliwe jest namnażanie wirusów rekombinowanych i zwiększenie miana wirusa ponad 100-krotnie, co redukuje czas i koszt produkcji. Procedurę zaprezentuje Barbara Loic, kierownik jednostki produkcji wirusów, która opracowała z nami ten nowy protokół. Mamy nadzieję, że ten film będzie dla Państwa pomocny i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

Produkcja rekombinowanego parwowirusa lub rec PV poprzez transfekcję jest niezbędna w celu wytworzenia minimalnej ilości rec PVS, która posłuży jako inokulum w późniejszej produkcji rec PVS drogą infekcji. Do produkcji rec PVS wymagane jest laboratorium o drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego. Jeden dzień przed transfekcją wysiać 2 mln komórek HEC 2 9 3 T na płytce 10 centymetrowej, aby uzyskać 50% konfluencji komórkowej.

W dniu transfekcji hodować komórki w 10 ml DMEM uzupełnionego o 10% FBS, L-glutaminę, penicylinę i streptomycynę; inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 i przy 92% wilgotności. W dniu transfekcji przygotować mieszaninę do produkcji wirusa w probówce 1,5 ml. Dodać następujące odczynniki w stosunku molowym jeden do dwóch do jednego: 3 µg rekombinowanego wektora PV zawierającego interesujący transgen.

Sześć µg wektora P-C-M-V-V-P zawierającego jednostkę genu kapsydu parwowirusa oraz osiem µg pomocniczego plazmidu pochodzącej z adenowirusa. Rozcieńcz mieszaninę plazmidów w medium beztłuszczowym do objętości 850 µl, aby uzyskać stężenie końcowe 20 ng/µl. Następnie dodaj 42,5 µl odczynnika do transfekcji FU gene HD w stosunku 2,5:1 odczynnika FU gene do DNA.

Należy uważać, aby odczyn genu FU nie dotknął ścianek probówki; delikatnie wymieszać na wirówce typu vortex przez 5 do 10 s, a następnie inkubować mieszaninę do transfekcji w temperaturze pokojowej przez 30 min. Mieszaninę do transfekcji dodawać do komórek kroplami. Delikatnie potrząsnąć płytką, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę.

Inkubować płytkę przez 72 godziny w temperaturze 37°C przy 5% CO2 i 92% wilgotności. W tym czasie z plazmidów parcowirusowych powstają cząsteczki wirusa potomnego w celu ich późniejszego zbioru. Najpierw zdrapać komórki wraz z medium, a następnie odessać i przenieść zawiesinę z płytki do plastikowej probówki o pojemności 15 ml.

Wirować probówkę z prędkością 250 G przez pięć minut. W temperaturze pokojowej usunąć 95% nadsączu, pozostawiając około 0,5 milliliters. Delikatnie wymieszać zawartość probówki w wirówce typu vortex, aby resuspender osad w pozostałym nadsączu, a następnie przenieść do probówki typu eppendorf o pojemności 1,5 milliliter.

Zamrozić zawiesinę w kąpieli z ciekłego azotu, a następnie rozmrozić w ciepłej wodzie o temperaturze 37 °C. Energicznie mieszać probówkę w wstrząsarze typu vortex przez 15 sekund. Powtórzyć cykl zamrażania i rozmrażania jeszcze dwa razy.

Wirować probówkę przy 16 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie zebrać nadsącz do nowej probówki. Nadsącz na tym etapie zawiera surowy ekstrakt wirusowy, który może służyć jako inokulum do produkcji rec PVS poprzez infekcję. Przyrost wirusa.

Replikacja zależy od czynników komórkowych, które są eksprymowane w komórkach proliferujących. Dlatego ważne jest, aby komórki wykorzystywane do produkcji rekombinowanego wirusa mocy znajdowały się w optymalnym stanie i zostały wysiane z odpowiednią gęstością, zgodnie z opisem w niniejszym protokole. Na dzień przed infekcją wysiej 10 milionów komórek MB three 20 4K do kolby T 1 75, aby następnego dnia uzyskać 60 do 80% konfluencji komórkowej.

Przygotuj drugą kolbę zawierającą taką samą liczbę komórek jako kontrolę. Każda kolba T 175 powinna zawierać 20 mililitrów MEM jako objętość końcową, uzupełnioną o 5% FBS, L-glutaminę, penicylinę i streptomycynę w poranek w dniu infekcji. Przygotuj mieszaninę wirusa w dwumililitrowej probówce plastikowej.

Dodać te odczynniki. Dodać helper VP. Do 1,5 milliliters dodać rec PVS z wielokrotnością infekcji 10 przy MOI 0,5 oraz MEM.

Przenieś całą mieszaninę wirusową do jednej z kolb T 1 75. Inkubuj kolbę przez dwie godziny w temperaturze 37 °C, przy 92% wilgotności i 5% dwutlenku węgla, delikatnie wstrząsając co 15 minut. Inkubuj przez kolejne 20 do 24 godzin w temperaturze 37 °C, przy 92% wilgotności i 5% dwutlenku węgla.

Po 20 do 24 godzin należy wymienić pożywkę na świeżą i inkubować kolbę w tych samych warunkach przez 48 godzin, aby zapewnić wydajną produkcję wirusa. W kolbie zawierającej komórki zakażone wirusem powinny być widoczne wyraźne oznaki cytotoksyczności. Począwszy od 36 do 48 godzin po infekcji, po upływie 48 godzin należy odessać i przenieść nadsącz pożywki z kolby do probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów.

Komórki przemyć dwukrotnie 1,5 ml PBS, inkubować z trypsyną przez trzy do pięciu minut, a następnie dodać zawiesinę komórkową do usuniętego medium. Komórki wraz z nadsączem odwirować z prędkością 5 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej, odrzucić nadsącz i dodać 1 ml buforu TE do osadu komórkowego. Delikatnie wymieszać probówkę na wortexie, aby resuspenderować komórki. Następnie zamrozić zawiesinę komórkową w kąpieli z ciekłym azotem i rozmrozić w ciepłej wodzie o temperaturze 37 °C.

Intensywnie mieszaj probówkę na wirówce typu vortex przez 15 seconds. Powtórz cykl zamrażania i rozmrażania trzy razy. Następnie inkubuj zawiesinę komórkową z nukleazą Ben Nase przez 30 minutes w temperaturze 37 °C w celu strawienia genomowego DNA komórkowego oraz nieopakowanego DNA wirusowego.

Po 30 minutach odwiruj zawartość probówki z prędkością 5 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Na koniec zbierz nadsącz do nowej probówki. Nadsącz na tym etapie zawiera surowy ekstrakt wirusa.

Typowe wydajności rekombinowanego PV GFP uzyskiwane zgodnie z tym protokołem powinny mieścić się w zakresie od 1 do 10 × 10⁸ jednostek infekcyjnych wirusa. Przedstawiono tutaj przykład stymulacji produkcji rekombinowanego PV za pomocą plazmidu opartego na adenowirusie. Surowe ekstrakty wirusowe zawierające PHH one GFP erect PV przenoszące gen GFP lub go pozbawione.

Plazmidy PXX oparte na adenowirusach zastosowano w komórkach wskaźnikowych NBK; jak pokazują te mikrografie, w obecności PXX six stwierdzono większą liczbę komórek pozytywnych pod kątem GFP. Po przeprowadzeniu testów transdukcji GFP uzyskano wyraźny wzrost produkcji rec PV w obecności Pxx six. Produkcja wzrosła z poziomu 0,3 jednostek transdukcji GFP lub TU na komórkę, uzyskanego za pomocą konwencjonalnych protokołów, do około pięciu TU na komórkę uzyskanych przy zastosowaniu niniejszego protokołu.

Wyniki testu transdukcji GFP wskazują, że geny adenowirusowe E2a, E4 oraz VA RNA zawarte w PXX6 są w stanie zwiększyć produkcję parwowirusa. Następna rycina przedstawia reprezentatywny przykład produkcji rekombinowanego PV poprzez infekcję. Komórki NB320 4K zainfekowano oczyszczonym wirusem pomocniczym ADP, a następnie poddano superinfekcji jednym z dwóch rekombinowanych parwowirusów.

Surowe ekstrakty komórkowe wykorzystano do oznaczenia mian wirusa za pomocą testu transdukcji, który wykazał, że helper AD VP dodatkowo zwiększył produkcję rec PV do poziomu powyżej 70 T na komórkę. Na koniec partie wirusa otrzymane w obecności lub w nieobecności ADP przeanalizowano pod kątem zawartości cząsteczek wirusowych zdolnych do replikacji za pomocą testu plackowego na komórkach indykatorowych MB three 20 4K. Wyniki wskazują, że helper ADP zwiększył produkcję rec PV bez zwiększania liczby niepożądanych cząsteczek wirusowych zdolnych do replikacji po ich wytworzeniu.

Technika ta pozwala naukowcom z dziedziny terapii genowej i nowotworów na dalsze zwiększenie skali produkcji rekombinowanych wirusów mocy. Dzięki zastosowaniu bioreaktorów możliwe jest wytwarzanie wariantów w dużych ilościach niezbędnych w warunkach klinicznych.