Wielkoskalowa rejestracja neuronów za pomocą ruchomych sond krzemowych u gryzoni podczas zachowań

Cześć Shane, mówi Monty z laboratorium Bija. Dzisiaj pokażę ci, jak wykorzystać sondy krzemowe do przeprowadzania wysokogęstościowych rejestracji elektrofizjologicznych aktywności jednostek oraz potencjałów polowych lokalnych u budzącego się, wykazującego określone zachowania szczura. Pokażę ci, jak zbudować niewielki mikronapęd, przymocować do niego sondę krzemową, a następnie implantować sondę do mózgu w celu prowadzenia przewlekłych rejestracji.

Proces ten jest dość prosty, ale składa się z kilku etapów. Zacznijmy zatem. Oto niewielka kolekcja mikromnapędów dla szczurów i myszy, obejmująca urządzenia do przesuwania wielu pojedynczych drucików, tetrod oraz sond krzemowych, które zaprojektowaliśmy i wykonaliśmy na przestrzeni lat.

Sondy krzemowe mogą być przytwierdzone do sztywnych płytek drukowanych lub elastycznych kabli poliamidowych. Pokażemy tutaj, jak przymocować tę sondę czterorendzeniową do mikronapędu. Aby przygotować napęd, potrzebna jest mosiężna płytka, wiertła o rozmiarach 55 i 65, gwintownik, pojedynczy rząd pinów żeńskich, śruba 0 0 90 z odpowiadającą jej nakrętką, uchwyt wiertła oraz śrubokręt.

Pierwszym krokiem jest odłamanie trzypinowego elementu z listwy pinowej. Delikatnie wyciągnij środkowy pin, a następnie powiększ otwór, wiercąc w nim wiertłem o rozmiarze 65. Następnie wykonaj gwint za pomocą gwintownika.

Wytnij dwa kawałki z mosiężnej płytki. Wygładź krawędzie płytki za pomocą narzędzia Dremel i wykonaj otwór w środku obu elementów, używając wiertła o rozmiarze 55. Napęd zostaje tymczasowo zmontowany w taki sposób, aby mosiężne płytki stykały się z pinami; delikatnie dokręć śruby, aby konstrukcja stała się stabilna.

Końce pinów zostają wystawione, a następnie przylutowane do mosiężnych płytek. Mikro-napęd jest prawie gotowy. Wystający koniec śruby zostaje opiłowany, a następnie zostaje on przylutowany do śruby. W ten sposób otrzymujemy superlekki mikro-napęd 2.

Obracanie w prawo podniesie plastikowy mostek. Sonda krzemowa może zostać przymocowana do napędu za pomocą dwóch komponentów. Waga elastomeru ochronnego z jedwabiu.

Wymieszać składniki w stosunku 10:1. Za pomocą zaostrzonego aplikatora bawełnianego nanieść warstwę ochronną na górny koniec sondy. Pozostawić do wyschnięcia w piekarniku rozgrzanym do 60 °C przez co najmniej dwie godziny.

Aby upewnić się, że miejsca rejestracji są wolne od wszelkich zanieczyszczeń, końcówki muszą zostać oczyszczone. Przygotuj czterokrotne rozcieńczenie detergentu contra. Pozostaw sondę do namoczenia w detergencie w temperaturze 63°C przez co najmniej dwie godziny.

Detergent należy spłukać, wielokrotnie zanurzając sondę w wodzie destylowanej przed zamocowaniem sondy do napędu. Impedancję każdego miejsca rejestracji należy sprawdzić przy użyciu żyletki. Używając dwóch mikromanipulatorów, należy naciąć w mostku wiele rowków, aby stworzyć chropowatą powierzchnię.

Sondę ustawia się naprzeciwko mostka napędu. Następnie, przed rozpoczęciem operacji, sonda zostaje przymocowana do mostka za pomocą kleju do uchwytów. Przygotowywane są elektrody referencyjne i uziemiające.

Zlutuj jeden koniec izolowanego miedzianego drutu na długości około jednego milimetra. Za pomocą igły zeskrob warstwę z głowicy śruby ze stali nierdzewnej 0 0 90 i przylutuj do niej miedziany drut. Ostrożnie dopilnuj, aby lut nie wpłynął w rowek śruby.

Wytnij trapezowate kawałki z miedzianej siatki. Elementy te zostaną złożone w celu zabezpieczenia etapu głowowego (head stage). Instrumenty chirurgiczne oraz przygotowanie są takie same, jak w wielu zabiegach chirurgicznych u małych zwierząt.

Należy pamiętać, że zabieg pokazany w tym filmie służy wyłącznie celom demonstracyjnym, aby zapewnić odpowiednią widoczność i możliwość filmowania. Niektóre etapy przygotowawcze, środki ostrożności chirurgiczne oraz procedury pooperacyjne nie zostały tutaj przedstawione. Prosimy o zapoznanie się z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi chirurgii gryzoni.

Cały zabieg przeprowadzono w znieczuleniu ogólnym i gazowym, zachowując warunki aseptyczne. Po nacięciu skóry w linii środkowej usunięto skórę oraz okostną, a czaszkę oczyszczono i osuszono. Zmierzono położenie oraz odległość między punktami bregma i lambda, aby możliwe było wyznaczenie i zaznaczenie współrzędnych X i Y miejsca nacięcia przed otwarciem czaszki.

W celu implantacji sondy, kilka śrub zostaje wkręconych do połowy w kość; zarówno na górze, jak i po bokach otworów przygotowuje się również miejsca powyżej nich, aby wprowadzić elektrody. Użycie wielu śrub jest kluczowe dla stabilnego zamocowania modułu głowicowego do czaszki w długoterminowych eksperymentach chronicznych. Za pomocą małego pędzelka nanieś aktywator Meta upon Dentin na całą powierzchnię czaszki.

Następnie należy opłukać go solą fizjologiczną. W kolejnym kroku ostrożnie nakłada się warstwę cementu dentystycznego, pokrywając nią zestaw łańcuchowy. Następnie cztery miedziane zakładki są mocowane do czaszki za pomocą cementu.

Przechodzimy teraz do najkrytyczniejszego etapu operacji. Jest to przygotowanie miejsca implantacji sondy za pomocą wiertła z okrągłym końcem. Wiercenie odbywa się w wielu etapach, a kość jest na bieżąco nawilżana solą fizjologiczną.

Placek kostny jest ostrożnie usuwany, a powierzchnię przemywa się w celu usunięcia szczątków tkankowych. Potrzebne są dwa narzędzia. Hak wykonany z igły owadziej oraz ostre ostrze skalpela służą do podważenia i wycięcia go. Niewielkie krwawienie można opanować poprzez irygację solą fizjologiczną.

W przypadku wystąpienia dużego krwawienia lub jakiegokolwiek uszkodzenia nowokory, należy rozważyć przerwanie operacji i przygotowanie innego zwierzęcia. Teraz implantujemy sondę krzemową. Sondę należy wprowadzić w obszarze wolnym od naczyń krwionośnych, używając w razie potrzeby ligniny w celu zatamowania niewielkich krwawień.

Sondę umieszcza się w odległości około jednego milimetra nad zamierzonym celem. Otwór zostaje zamknięty poprzez nałożenie ciepłej, stopionej mieszaniny parafiny i oleju mineralnego. Dół prowadnicy zostaje przymocowany do czaszki w obszarze kory za pomocą cementu dentystycznego.

Część łącząca sondy zostaje w podobny sposób przymocowana do czaszki. Ostatnim i krytycznym etapem operacji jest uformowanie z płatów miedzianej siatki ochronnego cylindra wokół sondy i napędu. Cylinder ten służy również jako ekran elektryczny przeciwko szumom środowiskowym i artefaktom wolnych fal generowanym przez naładowane wibrysy.

U zwierzęcia w stanie aktywności wysokość można dostosować poprzez odcięcie nadmiaru materiału. Przewód z punktu odniesienia do masy zostaje przylutowany do odpowiednich pinów złącza. Masa jest również przylutowana do miedzianej siatki.

Miedziane klapy mocujące są łączone poprzez lutowanie i wzmacniane cementem. Ruch śruby napędowej jest ponownie testowany pod koniec zabiegu, a górna część stelaża głowowego zostaje przykryta kawałkiem wyciętym z gumowej rękawiczki po odpowiedniej opiece pooperacyjnej. Zwierzę jest zdrowe, współpracuje i czuje się świetnie następnego dnia.

Aby umożliwić zwierzęciu swobodne poruszanie się, zalecamy stosowanie ultralekkich, ultregietkich przewodów wielożyłowych. Cienki kabel wymaga minimalnego przeciwważenia i pozwala na nieograniczoną ruchomość. Jakość rejestracji jest sprawdzana każdego dnia w klatce domowej.

Położenie miejsca rejestracji szacuje się na podstawie zarówno wzorców wyładowań pojedynczych jednostek, jak i kształtu lokalnych potencjałów polowych. Nasz film przedstawia implantację pojedynczej sondy silikonowej, jednak po zdobyciu odpowiedniej wprawy można z łatwością przeprowadzić rejestrację z wielu miejsc, wykorzystując wiele sond i napędów. Używamy również podobnych, ale mniejszych napędów do implantacji sond silikonowych w mózgu myszy.

Na koniec, rejestracje z użyciem sond krzemowych mogą być skutecznie łączone z lokalną stymulacją świetlną tkanki nerwowej w eksperymentach optogenetycznych. Dziękujemy za obejrzenie.