Name: Rejestracja neuronów na dużą skalę za pomocą ruchomych sond krzemowych u zachowujących się gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 37 s
Description: Poznaj metodę rejestracji neuronów na dużą skalę za pomocą ruchomych sond krzemowych u zachowujących się gryzoni. Technika ta umożliwia długoterminowe badania aktywności mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Stypendium Marie Curie International Outgoing Fellowship (umowy o granty Unii Europejskiej FP/2007-2013 nr 221834 i 254780), Fundacja J.D. McDonnell, grant NSF SBE 0542013, grant National Institutes of Health NS034994, grant National Institute of Mental Health MH5467 oraz Howard Hughes Medical Institute (grant Janelia Farm Research Campus).

1. Budowa mikropopychacza
Wszystkie napędy są zbudowane z tych samych podstawowych elementów: części ruchomej, która przenosi elektrodę, oraz części stałej, przymocowanej do czaszki. Idealny mikronapęd umożliwia płynny, ale wystarczająco długi ruch elektrody w wielu małych krokach, jest na tyle wytrzymały, by zapobiec przypadkowemu przesunięciu elektrody, łatwy w obsłudze przez eksperymentatora bez zakłócania zachowania zwierzęcia, a także niewielki i lekki. W wyniku tych sprzecznych wymagań, różne rodzaje napędów są dostosowane do różnych zastosowań.
Do zbudowania naszego podstawowego napędu potrzebne są tylko 4 elementy: mosiężna śruba z płaskim łbem, pasująca nakrętka, plastikowy mostek przygotowany z pojedynczego rzędu listwy pinowej oraz dwie mosiężne płytki docięte na zamówienie.
<ol>
 <li>Odłam 3-pinowy fragment z listwy pinowej</li>
 <li>Ostrożnie wyciągnij środkowy pin.</li>
 <li>Powiększ otwór, wiercąc w nim wiertłem rozmiaru #55.</li>
 <li>Nawierć gwint za pomocą gwintownika 00-90.</li>
 <li>Wytnij dwa elementy z mosiężnej blachy.</li>
 <li>Wygładź krawędzie blach za pomocą narzędzia Dremmel.</li>
 <li>Wywierć otwór na środku obu elementów, używając wiertła rozmiaru #65.</li>
 <li>Złóż elementy napędu tak, aby mosiężne blachy dotykały pinów. W tym celu przełóż mosiężną śrubę kolejno przez blachę mosiężną, otwór w gwintowanej listwie pinowej, drugą blachę mosiężną oraz nakrętkę. Delikatnie dokręć śrubę, aby konstrukcja stała się stabilna.</li>
 <li>Przylutuj końce pinów do mosiężnych blach.</li>
 <li>Opiłuj wystający koniec śruby.</li>
 <li>Przylutuj nakrętkę do śruby. Należy uważać, aby nie przylutować nakrętki do mosiężnej blachy.</li>
 <li>Przetestuj ruch napędu: przekręć śrubę zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby unieść plastikowy mostek.</li>
</ol>
2. Przygotowanie sondy krzemowej
Przed przymocowaniem sondy do napędu, należy nałożyć dodatkową izolację na obszar połączeń sondy, aby zapobiec powstawaniu zwarć spowodowanych przez płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) lub wilgoć:
<ol>
 <li>Odważ i wymieszaj składniki elastomeru Sylgard w stosunku 10:1.</li>
 <li>Za pomocą zaostrzonego aplikatora watowego nanieś Sylgard na górny koniec sondy.</li>
 <li>Pozostaw do wyschnięcia w piekarniku rozgrzanym do 60°C przez 2 godziny.</li>
</ol>
Aby upewnić się, że miejsca rejestracji są wolne od wszelkich zanieczyszczeń, należy oczyścić końcówki sond:
<ol start="4">
 <li>Przygotować 4 % roztwór detergentu Contrad.</li>
 <li>Moczyć sondę w detergencie w temperaturze 63°C przez co najmniej 2 godziny.</li>
 <li>Spłukać detergent, wielokrotnie zanurzając sondę w wodzie destylowanej.</li>
</ol>
Przed przymocowaniem sondy do napędu należy sprawdzić impedancję każdego miejsca rejestracji:
<ol start="7">
 <li>Zanurz sondę w 0,9% roztworze soli fizjologicznej i podłącz ją do miernika impedancji. Jeśli zbyt wiele miejsc rejestracji wykazuje nieprawidłową impedancję, powtórz kroki 2.4-2.6 lub rozważ użycie innej sondy. W niniejszym protokole stosujemy moduł kondycjonowania impedancji Impedance Conditioning Module firmy Frederick Haer, Co. (FHC) w połączeniu z własnoręcznie wykonanym selektorem kanałów. Alternatywnie, urządzenia niPOD firmy NeuroNexus, Inc. lub NanoZ firmy Neuralynx, Inc. umożliwiają jednoczesne monitorowanie impedancji wszystkich kanałów sondy.</li>
</ol>
3. Mocowanie sondy do mikropopychacza
<ol>
 <li>Za pomocą żyletki należy wykonać w mostku kilka nacięć, aby stworzyć chropowatą powierzchnię.</li>
 <li>Sondę należy przyłożyć do mostka napędu. Procedurę tę najlepiej przeprowadzić pod mikroskopem operacyjnym, mocując napęd zaciskiem i regulując sondę za pomocą mikromanipulatora tak, aby trzpienie były idealnie równoległe do śruby napędowej. Zapewnia to, że podczas wprowadzania trzpienie sondy wnikają w tkankę mózgową, nie „przecinając” jej. Na tym etapie należy określić dokładną głębokość końcówek sondy względem podstawy napędu, biorąc pod uwagę głębokość struktury docelowej od powierzchni czaszki.</li>
 <li>Następnie sondę mocuje się do mostka za pomocą cementu grip.</li>
 <li>Opcjonalnie: w celu wizualizacji toru sondy w mózgu można na tym etapie nanieść na tył sondy roztwór DiI (1-2% w etanolu).</li>
</ol>
4. Przygotowanie czaszki
Przed operacją przygotowuje się elektrody referencyjne i uziemiające oraz elementy klatki Faradaya montowanej na głowie:
<ol>
 <li>Odetnij dwa odcinki miedzianego drutu o długości 2", a następnie polutuj końcówkę każdego izolowanego drutu miedzianego na długości około 1 mm.</li>
 <li>Za pomocą igły zeskrob powłokę z łba śruby ze stali nierdzewnej 00-90 o średnicy 1/8" i przylutuj do niej jeden odcinek drutu miedzianego. Lutowanie takich uziemiających elektrod ze śrub ze stali nierdzewnej wymaga zastosowania odpowiedniego topnika (np. N-3 All purpose flux od La-Co) oraz wysokiej temperatury grotu lutownicy. Należy uważać, aby cyny nie wpłynęła do rowka śruby. Element ten będzie służył jako elektroda uziemiająca. Powtórz czynność z drugą śrubą i drutem miedzianym, aby przygotować elektrodę odniesienia.</li>
 <li>Wytnij trapezowate fragmenty z siatki miedzianej. Elementy te zostaną zmontowane w celu ochrony stopnia wejściowego wzmacniacza (headstage).</li>
</ol>
Instrumentarium chirurgiczne oraz przygotowanie są takie same, jak w przypadku wielu operacji na małych zwierzętach. Cały zabieg przeprowadzono w głębokiej anestezji izofluranem, w warunkach aseptycznych, zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez NIH. Należy pamiętać, że operacja (pozorna) pokazana w tym filmie służy wyłącznie celom demonstracyjnym. Ze względu na odpowiednią widoczność i potrzeby filmowania, niektóre kroki przygotowawcze, środki ostrożności chirurgiczne oraz procedury pooperacyjne nie są pokazane/widoczne ani omawiane.
Przed operacją wszystkie elementy i materiały powinny zostać wysterylizowane zgodnie z odpowiednimi procedurami (patrz: Guidelines for Survival Rodent Surgery; http://oacu.od.nih.gov/ARAC/surguide.pdf). Podczas operacji przygotowuje się sterylne pole na czaszce, które zostaje odizolowane za pomocą sterylnych obłożeń. Po zakończeniu zabiegu miejscowo podaje się antybiotyk o szerokim spektrum działania, a domięśniowo podaje się długo działający lek przeciwbólowy (np. buprenorfinę, [Buprenex] 0.05 mg/kg). Dodatkowo lek przeciwbólowy (np. ibuprofen) jest dostarczany w wodzie pitnej w dawce około 60 mg/kg/24 hrs przez 5 dni. W celu zapewnienia prawidłowego przebiegu procedur chirurgicznych i anestezjologicznych należy skonsultować się z odpowiednimi źródłami12.
<ol start="4">
 <li>Umieść zwierzę w aparacie stereotaksycznym, ogól i oczyść skórę głowy13.</li>
 <li>Nacinając skórę wzdłuż linii pośrodkowej, odsunie ją na bok. Usuń okostną, a następnie oczyść i osusz czaszkę.</li>
 <li>Zmierz położenie oraz odległość między bregma a lambda, a następnie na podstawie atlasu stereotaksycznego14 wyznacz odpowiednio współrzędne x i y miejsca implantacji sondy. Zaznacz to miejsce, wydrapując skalpelem krzyżyk na czaszce.</li>
 <li>Wywierć otwory w czaszce za pomocą wiertła z okrągłą główką (rozmiar ¼) i wkręć do połowy w kość śruby stabilizujące (ze stali nierdzewnej, 000-120, 1/16"), umieszczając je w różnych płytkach kostnych na górnej i bocznej części czaszki. Śruby posłużą jako kotwice do bezpiecznego przymocowania zestawu nagłownego do czaszki.</li>
 <li>Wywierć otwory nad móżdżkiem i wprowadź elektrody uziemiające oraz referencyjne przygotowane w kroku 4.2. W przypadku rejestracji lokalnych potencjałów polowych (LFP), wybór miejsca referencyjnego jest krytyczny. Miejsce to wybiera się dlatego, że LFP móżdżku jest najniższe spośród wszystkich obszarów kory, a artefakty mięśniowe w tej lokalizacji pośrodkowej są minimalne.</li>
 <li>Za pomocą małego pędzelka nanieś aktywator dentynowy (zestaw Metabond) na całą powierzchnię czaszki. Przepłucz go 0.9% solą fizjologiczną.</li>
 <li>Nanieś cement dentystyczny (zestaw Metabond; mieszanie zgodnie z instrukcją producenta) na czaszkę, uważnie pokrywając śruby kotwiące oraz elektrody uziemiające i referencyjne, pozostawiając jednak wolne miejsce implantacji sondy.</li>
 <li>Przymocuj do czaszki cztery klapki z miedzianej siatki (przygotowane w kroku 4.3). W tym celu przyklej cementem wąską podstawę każdej z nich do przedniej, lewej, prawej i tylnej strony czaszki. Miedź nie może mieć bezpośredniego kontaktu z kością i powinna być zawsze oddzielona warstwą cementu.</li>
</ol>
5. Przygotowanie powierzchni mózgu
<ol>
 <li>Używając wiertła z okrągłym grotem, wykonaj wiercenie wokół miejsca implantacji w kilku etapach, często nawadniając kość solą fizjologiczną.</li>
 <li>Ostrożnie usuń płat kostny i przemyj powierzchnię mózgu.</li>
 <li>W przypadku wprowadzania sondy wielopunktowej usuwany jest duży pas opony twardej. Do usunięcia opony twardej potrzebne są dwa narzędzia: skalpel oraz haczyk wykonany z igły entomologicznej (alternatywnie standardowa mikroelektroda wolframowa). Zegnij końcówkę igły, dociskając ją do twardej powierzchni (np. szkiełka przedmiotowego), a następnie przymocuj ją do uchwytu (w tym przypadku kawałka drewnianego patyczka higienicznego; alternatywnie uchwytu do mikroigieł sekcyjnych).</li>
 <li>Podnieś oponę twardą za pomocą haczyka i przetnij ją skalpelem. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić opony miękkiej, naczyń oraz powierzchni nowokory. Niewielkie krwawienie można opanować poprzez przemywanie solą fizjologiczną. W przypadku wystąpienia silnego krwawienia lub jakiegokolwiek uszkodzenia nowokory należy rozważyć przerwanie zabiegu i przygotowanie innego zwierzęcia.</li>
</ol>
6. Implantacja sondy
Na tym etapie dokładnie ocenia się gęstość i orientację naczyń powierzchniowych kory. Należy skorygować współrzędne stereotaktyczne, ponieważ sonda musi penetrować mózg w obszarze wolnym od większych naczyń.
W celu implantacji zespół napędowy można przymocować za pomocą klipsa krokodylka do uchwytu stereotaktycznego. Niezakłócona widoczność powierzchni mózgu oraz końcówek sondy jest kluczowa dla prawidłowego wprowadzenia.
<ol>
 <li>Powoli opuść sondę na wysokość około 1 mm nad zamierzonym celem, stale nawadniając miejsce kraniotomii solą fizjologiczną. W przypadku rejestracji z neocortyksu końcówki sondy opuszcza się do kory na głębokość około 0,5 mm, a następnie podnosi z powrotem w okolice powierzchni.</li>
 <li>Uszczelnij kraniotomię, aplikując za pomocą igły ciepłą, roztopioną mieszaninę wosku i oleju parafinowego (10-20 g wosku w 10 mL oleju parafinowego, podgrzewanych do 65°C). Przed aplikacją schłodź mieszaninę do 30°C i sprawdź jej gęstość; powinna być na tyle miękka, aby umożliwić swobodny ruch sondy. W celu zapewnienia pełnego pokrycia mieszaninę można stopić in situ, zbliżając końcówkę mikro-kauteryzatora do stwardniałego wosku.</li>
 <li>Przymocuj dół mechanizmu napędowego do czaszki za pomocą cementu dentystycznego (grip cement), uważając, aby nakrętka mogła się swobodnie obracać. Na tym etapie niezwykle ważne jest unikanie jakichkolwiek przypadkowych uderzeń w mechanizm napędowy, w przeciwnym razie sonda uszkodzi korę mózgową. Po zabezpieczeniu mechanizmu napędowego do czaszki należy zweryfikować płynność ruchu sondy.</li>
 <li>Przyklej część złącza sondy do czaszki.</li>
</ol>

7. Budowa klatki Faradaya na głowę
<ol>
 <li>Podnieś i zmontuj miedziane zakładki z siatki w cylindryczną osłonę wokół sondy i napędu. Cylinder ten służy również jako ekran elektryczny przeciwko zakłóceniom środowiskowym oraz artefaktom wolnofalowym generowanym przez naładowane wibrysy u zachowującego aktywność zwierzęcia.</li>
 <li>Dostosuj wysokość cylindra, odcinając nadmiar materiału tak, aby siatka miedziana znajdowała się na poziomie górnej krawędzi złącza sondy.</li>
 <li>Przylutuj przewody ze śrub referencyjnej i uziemiającej do odpowiednich pinów złącza. Przylutuj również do siebie sąsiednie zakładki miedzianej siatki, aby zapewnić ciągłość elektryczną, a przewód uziemiający przylutuj do miedzianej siatki.</li>
 <li>Nałóż warstwę kleju modelarskiego na miedzianą siatkę, aby ją wzmocnić i zapobiec bezpośredniemu kontaktowi metalu ze skórą zwierzęcia.</li>
 <li>Sprawdź ruchomość śruby napędowej.</li>
 <li>Przykryj górną część nakładki na głowę kawałkiem wyciętym z gumowej rękawiczki.</li>
</ol>
8. Rejestracja u swobodnie poruszającego się zwierzęcia
<ol>
 <li>Po zapewnieniu odpowiedniej opieki pooperacyjnej podłącz zwierzę do systemu rejestrującego, używając przedwzmacniacza o wysokiej impedancji oraz lekkiego, ultraelastycznego kabla wielożyłowego. Zrównoważ ciężar urządzenia zamocowanego na głowie.</li>
 <li>Codziennie sprawdzaj jakość rejestracji w klatce domowej. Położenie miejsc rejestracji ocenia się na podstawie wzorców wyładowań pojedynczych jednostek oraz kształtu lokalnych potencjałów polowych. Stopniowo obniżaj sondę, przekręcając śrubę o niewielkie wartości (zazwyczaj od 1/8 do 1/4 obrotu na dzień, czyli 35-70 micrometers), aż do osiągnięcia docelowej struktury.</li>
</ol>
9. Reprezentatywne wyniki
Sygnały elektrofizjologiczne (potencjał polowy i aktywność jednostek) różnią się w zależności od rejestrowanej struktury oraz aktualnego zachowania zwierzęcia. Rysunek 1 przedstawia przykłady 32-kanałowych rejestracji z obszaru CA1 hipokampa podczas eksploracji otwartego pola przez szczura. Zwróć uwagę na wyraźną oscylację 8 Hz (pasmo theta) potencjału polowego podczas eksploracji z nałożonymi impulsami (spikes) na wielu trzpieniach i w wielu miejscach (przykłady impulsów wskazane grotami strzałek). W celu analizy aktywności jednostek neuronalnych, impulsy są wykrywane i segregowane na pojedyncze jednostki przy użyciu analizy skupień ich przebiegów czasowych15-16.
<img src="/files/ftp_upload/3568/3568fig1.jpg" alt="Rejestracja sygnału neuronalnego, wielokanałowe dane elektrofizjologiczne, schemat, analiza szeregów czasowych." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Rejestracje z obszaru CA1 hipokampa u szczura podczas zachowania z wykorzystaniem sondy krzemowej o układzie 4 shanks x 8 sites. Rejestracje są szerokopasmowe i próbkowane z częstotliwością 20 000 Hz, co pozwala na badanie zarówno oscylacji lokalnego potencjału polowego (np. rytmu 8 Hz w paśmie „theta”), jak i aktywności impulsowej neuronów.
<img src="/files/ftp_upload/3568/3568table1.jpg" alt="Tabela metod mocowania elektrod; szczegóły dotyczące materiałów, zamienników i komentarzy w badaniach z zakresu neuronauki." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1. Alternatywy dla użytych odczynników i sprzętu. Proszę <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3568/3568table1_lg.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.

<ol><li>Buzsáki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+network+oscillation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-frequency network oscillation in the hippocampus.</a> Science. 256, 1025-1027 (1992).</li>
<li>Wilson, M. A., McNaughton, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+hippocampal+ensemble+code+for+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the hippocampal ensemble code for space.</a> Science. 261, 1055-1058 (1993).</li>
<li>Buzsáki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+recording+of+neuronal+ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale recording of neuronal ensembles.</a> Nat. Neurosci. 7, 446-451 (2004).</li>
<li>Buzsáki, G. Visualizing Large-Scale Patterns of Activity in the Brain: Optical and Electrical Signals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuzs%C3%A1ki%2C+G+%22Society+for+Neuroscience%22">Society for Neuroscience</a>. , Washington, DC. (2004).</li>
<li>Nicolelis, M. A. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNicolelis%2C+MAL+%22Methods+for+Neural+Ensemble+Recordings%22">Methods for Neural Ensemble Recordings</a>. , 2nd edition, CRC Press. Boca Raton, FL. (2008).</li>
<li>Hatsopoulos, N. G., Donoghue, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+science+of+neural+interface+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The science of neural interface systems.</a> Annu. Rev. Neurosci. 32, 249-266 (2009).</li>
<li>Battaglia, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lantern%3A+an+ultra-light+micro-drive+for+multi-tetrode+recordings+in+mice+and+other+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">The Lantern: an ultra-light micro-drive for multi-tetrode recordings in mice and other small animals.</a> J. Neurosci. Methods. 178, 291-300 (2009).</li>
<li>Kloosterman, F., Davidson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-drive+Array+for+Chronic+in+vivo+Recording%3A+Drive+Fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication.</a> J. Vis. Exp. 26, e1094-e1094 (2009).</li>
<li>Nguyen, D. P., Layton, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-drive+Array+for+Chronic+in+vivo+Recording%3A+Tetrode+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly.</a> J. Vis. Exp. (26), e1098-e1098 (2009).</li>
<li>Haiss, F., Butovas, S., Schwarz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miniaturized+chronic+microelectrode+drive+for+awake+behaving+head+restrained+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A miniaturized chronic microelectrode drive for awake behaving head restrained mice and rats.</a> J. Neurosci. Methods. 187, 67-72 (2010).</li>
<li>Cerf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-line%2C+voluntary+control+of+human+temporal+lobe+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">On-line, voluntary control of human temporal lobe neurons.</a> Nature. 467, 1104-1108 (2010).</li>
<li>Kohn, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+and+Analgesia+in+Laboratory+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22American+College+of+Laboratory+Animal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals.</a> American College of Laboratory Animal Medicine. series, (1997).</li>
<li>Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+Large-scale+Neuronal+Ensembles+with+Silicon+Probes+in+the+Anesthetized+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat.</a> J. Vis. Exp. (56), e3282-e3282 (2011).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22Stereotaxic+Coordinates%22">Stereotaxic Coordinates</a>. , Elsevier Academic. Amsterdam. (1982).</li>
<li>Harris, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+tetrode+spike+separation+as+determined+by+simultaneous+intracellular+and+extracellular+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Accuracy of tetrode spike separation as determined by simultaneous intracellular and extracellular measurements.</a> J. Neurophysiol. 84, 401-414 (2000).</li>
<li>Hazan, L., Zugaro, M., Buzsáki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klusters%2C+NeuroScope%2C+NDManager%3A+a+Free+Software+Suite+for+Neurophysiological+Data+Processing+and+Visualization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Klusters, NeuroScope, NDManager: a Free Software Suite for Neurophysiological Data Processing and Visualization.</a> J. Neurosci. Methods. 155, 207-216 (2006).</li>
<li>Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+neurotechnologies+for+chronic+neural+interfaces%3A+new+horizons+and+clinical+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Advanced neurotechnologies for chronic neural interfaces: new horizons and clinical opportunities.</a> J. Neurosci. 28, 11830-11838 (2008).</li>
<li>Csicsvari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+recording+of+unit+and+local+field+potentials+with+silicon-based+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Massively parallel recording of unit and local field potentials with silicon-based electrodes.</a> J. Neurophysiol. 90, 1314-1323 (2003).</li>
<li>Sodagar, A. M., Wise, K. D., Najafi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fully+integrated+mixed-signal+neural+processor+for+implantable+multichannel+cortical+recording%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">A fully integrated mixed-signal neural processor for implantable multichannel cortical recording.</a> IEEE Trans. Biomed. Eng. 54, 1075-1088 (2007).</li>
<li>O'Connor, D. H., Huber, D., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+engineering+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reverse engineering the mouse brain.</a> Nature. 461, 923-929 (2009).</li>
<li>Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit-breakers%3A+optical+technologies+for+probing+neural+signals+and+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Circuit-breakers: optical technologies for probing neural signals and systems.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8, 577-581 (2007).</li>
<li>Royer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-array+silicon+probes+with+integrated+optical+fibers%3A+light-assisted+perturbation+and+recording+of+local+neural+circuits+in+the+behaving+animal%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multi-array silicon probes with integrated optical fibers: light-assisted perturbation and recording of local neural circuits in the behaving animal.</a> Eur. J. Neurosci. 31, 2279-2291 (2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Film ten ilustruje procedurę implantacji sond krzemowych do chronicznych rejestracji wielkoskalowych u szczura w trakcie zachowań. Krytyczne kroki zapewniające wysoką jakość rejestracji aktywności neuronalnej wynikają z kruchości zarówno materiałów biologicznych (tkanka mózgowa), jak i technicznych (sonda krzemowa). Należy zachować szczególną ostrożność podczas manipulowania sondą, aby uniknąć kontaktu trzonów z jakąkolwiek twardą powierzchnią (na przykład trzony pękłyby przy próbie implantacji w mózgu bez usunięcia opon...

<table><tbody><tr><td>Krzemowa sonda Buzsaki32, 4 ramiona x 8 punktów. Opakowanie: elastyczny kabel poliamidowy</td><td>Materiał</td><td>NeuroNexus Technologies</td><td>Sonda: buzsaki32 Opakowanie: HC32</td><td>Sonda rejestrująca</td></tr><tr><td>Okrągła śruba mosiężna, 00-90 x 1/2 Okrągłe śruby mosiężne</td><td>Materiał</td><td>JIMorris</td><td>R0090B500</td><td>Element napędowy</td></tr><tr><td>Mosiężna nakrętka sześciokątna, 00-90</td><td>Materiał</td><td>JIMorris</td><td>N0090B</td><td>Element napędowy</td></tr><tr><td>Pasek mosiężny C260, ASTM-B36 Grubość: 0.025&quot;, Długość: 12&quot;, Szerokość: 1/2&quot;</td><td>Materiał</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>B000FMYU72</td><td>Element napędowy</td></tr><tr><td>Złącze żeńskie (header), rozstaw 2mm, męskie, jednorzędowe, proste, 36 pozycji</td><td>Materiał</td><td>Digi-Key</td><td>2163S-36-ND</td><td>Element napędowy</td></tr><tr><td>2-składnikowy elastomer silikonowy Sylgard</td><td>Materiał</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SYLG184</td><td>Do dodatkowej izolacji sondy</td></tr><tr><td>Płynny detergent Decon Contrad 70</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355 Decon Laboratories Nr:1002</td><td>Do czyszczenia punktów rejestrujących</td></tr><tr><td>Moduł kondycjonowania impedancji</td><td>Urządzenie</td><td>FHC, Inc.</td><td>55-70-0</td><td>Omomierz</td></tr><tr><td>niPOD - 32 kanały</td><td>Urządzenie</td><td>NeuroNexus Technologies</td><td>niPOD -32</td><td>Omomierz</td></tr><tr><td>Cement mocujący klasy przemysłowej (Grip Cement)</td><td>Materiał</td><td>Caulk Dentsply</td><td>675571 (proszek) 675572 (rozpuszczalnik</td><td>Cement mocujący</td></tr><tr><td>1,1&amp;rsquo;-dioctadecylo-3,3,3&amp;rsquo;,3&amp;rsquo;-tetrametylindokarbocyjanina nadnadchloran (&amp;rsquo;DiI&amp;rsquo;; DiIC18(3))</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>D282</td><td>Do barwienia toru sondy w mózgu</td></tr><tr><td>Maszynowa śruba ze stali nierdzewnej, łeb wiążący, nacięcie wprost, #00-90, 1/8&quot; </td><td>Materiał</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>MX-0090-02B</td><td>Śruby uziemiające i referencyjne</td></tr><tr><td>Drut magnetowy, 20G, powłoka nylonowo-poliuretanowa, MW80</td><td>Materiał</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>B000IJYRP2</td><td>Przewód uziemiający i referencyjny</td></tr><tr><td>Maszynowa śruba ze stali nierdzewnej, łeb wiążący, nacięcie wprost, #000-120, 1/16&quot;</td><td>Materiał</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>MX-000120-01B</td><td>Śruby kotwiące</td></tr><tr><td>Uniwersalny płynny topnik N-3</td><td>Odczynnik</td><td>La-Co (Markal</td><td>23512</td><td>Umożliwia lutowanie stali nierdzewnej</td></tr><tr><td>Precyzyjna miedź rozprężna MicroGrid</td><td>Materiał</td><td>Dexmet</td><td>3 CU6-050 FA</td><td>Siatka miedziana do klatki Faradaya na głowie</td></tr><tr><td>System cementujący C&amp;amp;B-METABOND Quick! - Aktywator dentyny</td><td>Materiał</td><td>Parkell</td><td>S380</td><td></td></tr><tr><td>System cementujący C&amp;amp;B-METABOND Quick! - Cement stomatologiczny</td><td>Materiał</td><td>Parkell</td><td>S380</td><td></td></tr><tr><td>Igła wolframowa o ostrym czubku wraz z uchwytem</td><td>Narzędzie</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6064 oraz RS-6061</td><td>Do wykonania haczyka do uniesienia opony twardej</td></tr><tr><td>Wiertło węglikowe HP 1/4</td><td>Narzędzie</td><td>Henry Schein</td><td>9990013</td><td></td></tr><tr><td>Parafina (granulki)</td><td>Materiał</td><td>Fisher Scientific</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny, lekki (NF/FCC)</td><td>Materiał</td><td>Fisher Scientific</td><td>O121-1</td><td></td></tr><tr><td>2-składnikowy klej epoksydowy GC ELECTRONICS 10-114</td><td>Materiał</td><td>Newark Inc</td><td>00Z416</td><td></td></tr><tr><td>Typ 1 LITZ 21 AWG 40/36 Czerwony Pojedynczy Poliuretan-Nylon (MW80-C) DO 0.041&quot;+/-0.002&quot; ŚR. ZEW.</td><td>Materiał</td><td>New England Biolabs</td><td>N28-36E-400-2</td><td>Do wykonania kabla między przedwzmacniaczem głowicowym a wzmacniaczem</td></tr><tr><td>32-kanałowa głowica VLSI (Very Large Scale Integration), wzmocnienie 20x</td><td>Urządzenie</td><td>Plexon</td><td>HST/32V-G20</td><td>Głowica (headstage)</td></tr></tbody></table>

wielkoskalowa rejestracja neuronów za pomocą ruchomych sond krzemowych u gryzoni podczas zachowań

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

Głównym wyzwaniem w neuronauce jest powiązanie zachowania z kolektywną aktywnością zespołów neuronalnych. Zrozumienie relacji wejście-wyjście neuronów i obwodów wymaga metod o selektywności przestrzennej i rozdzielczości czasowej odpowiedniej do analizy mechanistycznej zespołów neuronalnych u zwierzęcia wykazującego określone zachowanie, tzn. rejestracji reprezentatywnie dużych próbek odizolowanych pojedynczych neuronów. Monitorowanie aktywności neuronalnej w obrębie zespołów poczyniło w ostatniej dekadzie znaczące postępy zarówno u zwierząt o małym, jak i dużym mózgu, w tym u ludzi1-11. Rejestracja wielopunktowa za pomocą urządzeń opartych na krzemie jest szczególnie skuteczna ze względu na ich skalowalność, małą objętość i konstrukcję geometryczną.
W niniejszym opracowaniu opisujemy metody rejestracji aktywności wielu pojedynczych neuronów oraz lokalnego potencjału polowego u gryzoni w trakcie zachowań, z wykorzystaniem komercyjnie dostępnych mikroobrabianych sond krzemowych z niestandardowymi komponentami akcesoryjnymi. Istnieją dwie podstawowe opcje łączenia sond krzemowych z przedwzmacniaczami: płytki drukowane oraz kable elastyczne. Firmy dostarczające sondy (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) zazwyczaj oferują usługę bondowania i dostarczają sondy przylutowane do płytek drukowanych lub kabli elastycznych. Tutaj opisujemy implantację sondy 4-ramiennej z 32 punktami pomiarowymi, przymocowanej do elastycznego kabla polimidowego i zamontowanej na ruchomym mikroprzesuwaczu. Każdy etap przygotowania sondy, konstrukcji mikroprzesuwacza oraz zabiegu chirurgicznego został zilustrowany w taki sposób, aby użytkownik końcowy mógł łatwo powtórzyć cały proces.

Opisujemy metody wielkoskalowej rejestracji wielu pojedynczych jednostek oraz lokalnych potencjałów polowych u gryzoni podczas zachowań, z wykorzystaniem sond krzemowych. Procesy wykonania napędu, mocowania sondy do napędu oraz implantacji sondy zostały przedstawione w wystarczających szczegółach, aby umożliwić łatwą replikację.

Wielkoskalowa rejestracja neuronów za pomocą ruchomych sond krzemowych u gryzoni podczas zachowań

Głównym wyzwaniem w neuronauce jest powiązanie zachowania z kolektywną aktywnością zespołów neuronalnych. Zrozumienie relacji wejście-wyjście w ...

Cześć Shane, mówi Monty z laboratorium Bija. Dzisiaj pokażę ci, jak wykorzystać sondy krzemowe do przeprowadzania wysokogęstościowych rejestracji elektrofizjologicznych aktywności jednostek oraz potencjałów polowych lokalnych u budzącego się, wykazującego określone zachowania szczura. Pokażę ci, jak zbudować niewielki mikronapęd, przymocować do niego sondę krzemową, a następnie implantować sondę do mózgu w celu prowadzenia przewlekłych rejestracji.Proces ten jest dość prosty, ale składa się z kilku etapów. Zacznijmy zatem. Oto niewielka kolekcja mikromnapędów dla szczurów i myszy, obejmująca urządzenia do przesuwania wielu pojedynczych drucików, tetrod oraz sond krzemowych, które zaprojektowaliśmy i wykonaliśmy na przestrzeni lat.Sondy krzemowe mogą być przytwierdzone do sztywnych płytek drukowanych lub elastycznych kabli poliamidowych. Pokażemy tutaj, jak przymocować tę sondę czterorendzeniową do mikronapędu. Aby przygotować napęd, potrzebna jest mosiężna płytka, wiertła o rozmiarach 55 i 65, gwintownik, pojedynczy rząd pinów żeńskich, śruba 0 0 90 z odpowiadającą jej nakrętką, uchwyt wiertła oraz śrubokręt.Pierwszym krokiem jest odłamanie trzypinowego elementu z listwy pinowej. D

large-scale-recording-neurons-movable-silicon-probes-behaving

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Dużo neuronów rejestrowane przez ruchome silikonowe sondy u gryzoni wykonujących zachowania

Opisane zostaną zewnątrzkomórkowe rejestracje aktywności neuronalnej z wykorzystaniem sond krzemowych u znieczulonego szczura. Technika ta pozwala na pozyskiwanie informacji z wielu obszarów mózgu od ponad 100 neuronów jednocześnie. Dostarcza ona informacji z rozdzielczością pojedynczych komórek na temat dynamiki zespołów neuronalnych w wielu obwodach lokalnych.

Rejestracja wielkoskalowych zespołów neuronalnych za pomocą sond krzemowych u znieczulonego szczura

Ten film przedstawia protokół wszczepienia wielozębowej liniowej sondy krzemowej do mózgu myszy w celu pomiaru lokalnych potencjałów pola. Procedura polega na przymocowaniu sondy do jednostki stereotaktycznej, ustawieniu jej dokładnie nad docelowym obszarem mózgu, wprowadzeniu jej do mózgu i zabezpieczeniu cementem dentystycznym. Po implantacji zespół zabezpieczany jest obudową. Po powrocie do zdrowia konfiguracja pozwala na rejestrowanie lokalnych potencjałów pola, zapewniając wgląd w...

Rejestrowanie aktywności elektrycznej mózgu u zachowujących się myszy za pomocą liniowych sond krzemowych z wieloma zębami

Wszczepianie zorganizowanych układów mikroprzewodów do użycia w jednojednostkowych zapisach elektrofizjologicznych stanowi szereg wyzwań technicznych. Opisano również metody wykonywania tej techniki i niezbędny sprzęt. Omówiono również korzystne wykorzystanie zorganizowanych układów mikroprzewodów do nagrywania z różnych podregionów neuronowych o wysokiej selektywności przestrzennej.

Procedura wszczepiania zorganizowanych układów mikroprzewodów do nagrań pojedynczych jednostek u obudzonych, zachowujących się zwierząt

Ten protokół opisuje projektowanie i chirurgiczne wszczepienie mechanizmu krępującego głowę do monitorowania aktywności neuronalnej w podkorowych strukturach mózgu u szczurów czujnych.  Wyznacza procedury izolowania pojedynczych neuronów w konfiguracji przyściennej i skutecznego identyfikowania ich lokalizacji anatomicznych.

Monitorowanie i lokalizacja pojedynczych neuronów w podkorowych strukturach mózgu czujnych, skrępowanych głową szczurów

Wprowadzono bezprzewodowy, dwukierunkowy system do wielokanałowych zapisów neuronowych i stymulacji u swobodnie zachowujących się szczurów. System jest lekki i kompaktowy, dzięki czemu ma minimalny wpływ na repertuar behawioralny zwierzęcia. Co więcej, ten dwukierunkowy system zapewnia wyrafinowane narzędzie do oceny związków przyczynowo-skutkowych między wzorcami aktywacji mózgu a zachowaniem.

Bezprzewodowy, dwukierunkowy interfejs do rejestrowania in vivo i stymulacji aktywności neuronalnej u swobodnie zachowujących się szczurów

Opisujemy różne etapy wszczepiania przewlekłych sond silikonowych i rejestrowania komórek miejsca u myszy, które biegają z głową na bieżni wzbogaconej o wskazówki.

Wszczepienie przewlekłych sond krzemowych i zapis komórek miejsca hipokampa we wzbogaconym aparacie bieżni

Prezentujemy konstrukcję hipernapędu do druku 3D z osiemnastoma niezależnie regulowanymi tetrodami. Hipernapęd ma za zadanie rejestrować aktywność mózgu swobodnie zachowujących się szczurów przez okres kilku tygodni.

Budowa ulepszonego hipernapędu wielotetrodowego do wielkoskalowej rejestracji neuronalnej u zachowujących się szczurów

Ten protokół opisuje rejestrację lokalnych potencjałów pola za pomocą wielozębowych liniowych sond krzemowych. Konwersja sygnałów za pomocą analizy gęstości źródła prądu pozwala na rekonstrukcję lokalnej aktywności elektrycznej w hipokampie myszy. Dzięki tej technice można badać ograniczone przestrzennie oscylacje mózgu u swobodnie poruszających się myszy.

Rejestrowanie przestrzennie ograniczonych oscylacji w hipokampie zachowujących się myszy

Ten protokół opisuje budowę hybrydowego układu mikronapędów, który umożliwia wszczepienie dziewięciu niezależnie regulowanych tetrod i jednej regulowanej sondy opto-krzemowej w dwóch obszarach mózgu u swobodnie poruszających się myszy. Zademonstrowano również metodę bezpiecznego odzyskiwania i ponownego wykorzystania sondy optokrzemowej do wielu celów.

Hybrydowy system mikronapędowy z odzyskiwalną sondą optokrzemową i tetrodą do nagrywania w dwóch lokalizacjach o wysokiej gęstości w swobodnie poruszających się myszach

Specjalnie zbudowane mikronapędy umożliwiają submilimetrowe celowanie w miejsca zapisu kory mózgowej za pomocą liniowych układów krzemowych.

Elektrofizjologia aktywności kory laminarnej u marmozety zwyczajnej

Tutaj przedstawiamy lekki, opłacalny system implantacji sond dla przewlekłej elektrofizjologii u gryzoni, zoptymalizowany pod kątem łatwości użycia, odzyskiwania sondy, wszechstronności eksperymentalnej oraz zgodności z zachowaniem.

Implant DREAM: lekki, modułowy i opłacalny system implantów do przewlekłej elektrofizjologii u myszy zamocowanych na głowie i swobodnie zachowujących się

Poznaj metodę rejestracji neuronów na dużą skalę za pomocą ruchomych sond krzemowych u zachowujących się gryzoni. Technika ta umożliwia długoterminowe badania aktywności mózgu.

Wielkoskalowa rejestracja neuronów za pomocą ruchomych sond krzemowych u gryzoni podczas zachowań

Przeglądaj więcej filmów