Name: Masowa produkcja genetycznie zmodyfikowanych Aedes aegypti do wypuszczenia w terenie w Brazylii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 41 s
Description: Poznaj techniki masowej hodowli genetycznie zmodyfikowanych samców Aedes aegypti w systemie RIDL® w Brazylii. Metoda obejmuje sztuczne karmienie, sortowanie płciowe i kontrolę jakości dla skutecznej supresji populacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Biofábrica Moscamed Brasil, Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) oraz Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologia (CNPq) za wsparcie finansowe. &#160;Chcielibyśmy również podziękować za pomoc następującym osobom: Miriam dos Santos, Gildeane Silva, Gessilane dos Santos, Fabio Gonçalves, John Paul Oliveira, Luiza Garziera, José Carlos Valença.

Wymagania dotyczące insekterium
1. Przegląd
<ol>
	<li>Masowa hodowla składa się z kilku faz, z których każda jest przeprowadzana w oddzielnej strefie jednostki hodowlanej. Rysunek 1 przedstawia główne fazy hodowli oraz miejsca, w których odbywają się one w zakładzie masowej hodowli.</li>
</ol>
2. Kwestie bezpieczeństwa biologicznego w insekterium
<ol>
	<li>Projekt został zatwierdzony przez komisję etyki badań nad zwierzętami Uniwersytetu w São Paulo w Brazylii, a wszystkie niezbędne zezwolenia i zgody zostały uzyskane.&#160;</li>
	<li>System RIDL&#160;wykorzystuje letalność warunkową; suplement diety (tetracyklina) zapobiega ekspresji systemu RIDL&#160;, umożliwiając masową hodowlę owadów; bez tetracykliny komary giną. Tetracyklina nie występuje w naturalnych miejscach rozrodu Ae. aegypti, więc żadne potomstwo powstałe z osobników, które uciekły, nie przeżyje. &#160;Zapewnia to dodatkowy poziom bezpieczeństwa w porównaniu do stosowania owadów typu dzikiego (WT) sterylizowanych innymi metodami (np. radiacją).</li>
	<li>W insekterium należy stosować wejście z podwójnymi drzwiami, tabliczki „Wstęp tylko dla osób upoważnionych” oraz siatki przeciw owadom. Wszelkie okna powinny być uszczelnione, aby uniknąć zanieczyszczenia kolonii owadami typu WT i pomóc zapobiec ucieczkom z wnętrza insekterium.</li>
	<li>Lokalne przepisy i organy nadzorcze mogą mieć specyficzne dodatkowe lub alternatywne wymagania. Należy skontaktować się z odpowiednimi organami w celu uzyskania informacji/wytycznych na wczesnym etapie i uzyskać wszystkie niezbędne zezwolenia i zgody przed wprowadzeniem szczepu RIDL&#160;do insekterium.</li>
	<li>Insekterium do hodowli masowej powinno być wykorzystywane wyłącznie do hodowli RIDL&#160;. Nie powinny w nim przebywać żadne inne szczepy ani owady. Ma to na celu uniknięcie zanieczyszczenia szczepu RIDL&#160;oraz kontaminacji patogenami, które mogą wpływać na kondycję i przeżywalność, obniżając produktywność i skuteczność wypuszczanych samców.</li>
</ol>
3. Projekt insektarium
<ol>
	<li>Rysunek 2 przedstawia plan insekterium wykorzystywanego w Biofábrica Moscamed w Brazylii.</li>
	<li>Temperatura we wszystkich pomieszczeniach wynosiła 26 °C ± 2) przy wilgotności względnej około 70-80% i cyklu światło:ciemność 12:12 h z zastosowaniem świetlówek.</li>
	<li>Ten projekt może być modyfikowany zgodnie z konkretnymi wymaganiami przestrzennymi, np. skala wypuszczeń określi całkowity rozmiar. Jednak produkcja jaj, hodowla i sortowanie, kontrola jakości (QC) oraz wypuszczenia powinny być podzielone na cztery odrębne obszary: kolonię produkcji jaj, generację wypuszczaną, QC oraz magazyn dorosłych osobników do wypuszczenia.</li>
	<li>Pomieszczenie kolonii produkcji jaj (około 20 m2) służy do produkcji jaj dla generacji wypuszczanej.</li>
	<li>Obszar kontroli jakości to miejsce, w którym przeprowadza się eksperymenty w celu sprawdzenia procedur i sprawności linii RIDL&#160;, w tym&#160;pomiarów wskaźnika wyklucia, liczby poczwarek, wielkości poczwarek oraz pomiaru skuteczności sortowania i usuwania samic. Przeprowadzane są również testy na kontaminację WT poprzez sprawdzanie obecności markera fluorescencyjnego i fenotypu przy użyciu testów przesunięcia mierzących śmiertelność.</li>
	<li>Pomieszczenie generacji wypuszczanej (około 36 m2) wymaga odpowiedniej przestrzeni na tace oraz sortowanie larw i poczwarek. Tace umieszczane są w specjalnie zaprojektowanych aluminiowych regałach. Do hodowli i sortowania wymagany jest duży obszar roboczy i zlewozmywak, a inny duży zlewozmywak jest niezbędny do mycia tac i klatek. W odpływie ścieków ze zlewozmywaków zamontowano pułapkę z filtrem, aby ograniczyć ucieczkę żywych komarów do kanalizacji.&#160;</li>
	<li>Woda zużywana do tac jest odprowadzana przez odpływ, który posiada komorę z siatką zapobiegającą ucieczce owadów na każdym etapie rozwoju.</li>
	<li>Wymagany jest obszar do przechowywania dorosłych osobników do wypuszczenia (Magazyn dorosłych osobników do wypuszczenia, Rysunek 2) zawierający regały do przechowywania urządzeń wypuszczających, podczas gdy osobniki dorosłe dojrzewają przed wypuszczeniem.</li>
</ol>
Metody produkcji dla masowej hodowli RIDL:
Kolonia Produkcji Jaj produkuje jaja, które są wykorzystywane w Generacji Uwalniania (Rysunek 1) do uzyskania osobników dorosłych. Istnieje wiele podobieństw między obiema metodami hodowli, ale występują również wyraźne różnice. Procesy hodowlane, które są identyczne dla obu procedur, opisano wyłącznie w sekcji Kolonia Produkcji Jaj.
Kolonia produkująca jaja
4. Produkcja larw
Kolonia Produkcji Jaj generuje homozygotyczne jaja RIDL&#160;OX513A8 przeznaczone do Generacji Uwolnienia. Ścisła kontrola jakości zapewnia żywotność, kondycję oraz integralność szczepu dostarczanych jaj.
<ol>
	<li>Bodźcem do wyklucia jest zanurzenie w wodzie o niskim poziomie rozpuszczonego tlenu. Aby obniżyć poziom tlenu w wodzie, należy zagotować wodę, a następnie niezwłocznie przelać 400 ml do szklanych słoików o pojemności 500 ml (obwód otworu 74 mm), szczelnie zakręcić i pozostawić w temperaturze pokojowej na kilka godzin do wystygnięcia.</li>
	<li>Do słoika z przegotowaną wodą należy włożyć 1 g&#160;jaj, ponownie zamknąć i odczekać godzinę. Zawartość należy przenieść do kuwety z 2 L wody i pozostawić na noc w warunkach insektarium.</li>
	<li>Wyklute larwy należy przenieść do znanej objętości wody i mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego z mieszadełkiem przez czas wystarczający do pobrania alikwotów; intensywne lub przedłużone mieszanie uszkadza larwy i powinno być ograniczone do minimum. Standardowa objętość stosowana do wykluwania larw to 1 L, jednak zagęszczenia przekraczające 300 larwy/ml są trudne do przeliczenia i mogą być szkodliwe. Dlatego nie należy wykluwać więcej niż około 300 000 jaj/L&#160;wody.</li>
	<li>Wskaźnik wyklucia należy określić, pobierając trzy alikwoty po 1 ml i umieszczając je na arkuszu papieru chłonnego z siatką kwadratów 1 cm, położonym na chłonnej gąbce w celu wchłonięcia nadmiaru wody. &#160;Należy policzyć liczbę jaj wyklutych i niewyklutych w trzech kwadratach, szukając brakującej pokrywki wyklutego jaja. Oczekiwany wskaźnik wyklucia wynosi około 80-90%.</li>
	<li>Należy pobrać cztery alikwoty po 1 ml każdy i umieścić je w czterech czarnych łódkach wagowych (larwy są białe, zatem są lepiej widoczne na czarnym tle), a następnie wzrokowo policzyć liczbę żywych larw; zaleca się użycie licznika. Średnia liczba larw na ml jest następnie wykorzystywana do obliczenia objętości wody, którą należy dodać do każdej kuwety, aby uzyskać pożądaną liczbę larw na kuwetę.</li>
	<li>Między szczepami i gatunkami mogą występować duże różnice w zagęszczeniu, przy którym można hodować larwy. Pożądane jest również porównanie wielkości dorosłych samców RIDL&#160;z samcami typu dzikiego; idealnie jest uzyskać samce RIDL&#160;o wielkości zbliżonej lub większej, które mogą skutecznie konkurować z samcami dzikimi. W związku z tym dla każdego szczepu RIDL&#160;należy określić optymalne zagęszczenie larw, co stanowi kompromis między ograniczeniami przestrzeni hodowlanej a skalą produkcji. Zagęszczenia w zakresie 0,1-2,5 larwy/ml okazały się &#160;dobrym połączeniem wydajności produkcji i jakości; kwestię tę omówił również Medici23.</li>
	<li>Larwy należy przenieść do kuwet. W naszej placówce stosujemy kuwety o wymiarach około 53 cm x 37 cm &#160;x 8 cm (D x Sz x W) i dodajemy wymaganą ilość wody, aby osiągnąć zagęszczenie larw niezbędne do produkcji.</li>
	<li>Do kuwet należy dodać roztwór stokowy tetracykliny (3 mg/ml w wodzie) w rozcieńczeniu 1:100, aby uzyskać wymaganą stężenie końcowe 30 µg/ml.</li>
	<li>Larwy należy codziennie karmić pokarmem dla ryb w płatkach (<a href="http://www.sera.de">www.sera.de</a>), który został rozkruszony na drobny proszek. Tabela 1 przedstawia typowy schemat żywienia w mg pokarmu na larwę na dzień. Larwy należy karmić aż do odpowiedniego dnia sortowania w warunkach insektarium opisanych powyżej.</li>
</ol>
5. Sortowanie larw od poczwarek oraz rozdzielanie poczwarek męskich i żeńskich
<ol>
	<li>8 dni po wykluciu oddziel larwy od poczwarek. Następnie przeprowadź segregację poczwarek ze względu na płeć w celu wyselekcjonowania samców. Urządzenie znane jako separator płytowy24,25 umożliwia oddzielenie larw od poczwarek samców oraz poczwarek samic. Rycina 3 ilustruje zastosowanie tego separatora płytowego do oddzielenia larw od poczwarek samców i samic.</li>
	<li>Używając łyżki mierniczej z sitkiem na dnie, skalibruj ją przy użyciu 500 lub więcej poczwarek, a następnie wykorzystaj ją do przygotowania klatek i oszacowania całkowitej liczby wyprodukowanych poczwarek samców i samic.</li>
	<li>W pierwszym dniu segregacji (dzień 8.) większość poczwarek to samce; należy zatem umieścić posegregowane larwy z powrotem w tacy i hodować je do następnego dnia, kiedy większość poczwarek to samice (Rycina 4).</li>
	<li>Powtarzaj proces segregacji każdego dnia zgodnie z opisem w krokach 2.1-2.3, aż wszystkie larwy przejdą w stadium poczwarki lub do końca tygodnia roboczego.</li>
	<li>Umieść 1 000 poczwarek samców (używając łyżki mierniczej) w klatce, a w 9. dniu dodaj 3 000 poczwarek samic do tej samej klatki (stosujemy rury PVC o wysokości 30 cm i średnicy 30 cm, przystosowane za pomocą siatki na górze i otworu dostępowego z siatką, ale dostępne są również plastikowe klatki o wymiarach 30 cm x 30 cm x 30 cm firmy BugDorm).</li>
	<li>Pozostaw dorosłe osobniki do kopulacji przez co najmniej 2 dni i zapewnij im dostęp do roztworu sacharozy (10%) na mokrej wacie ad libitum przed karmieniem krwią. Zbieraj jaja przez dwa tygodnie (~dwa cykle gonotroficzne) przy dwóch karmieniach krwią w tygodniu. Pozwala to uzyskać średnio 143 000 jaj z klatki zawierającej 3 000 samic (średnio 48 jaj/samicę). Aby uzyskać 4 miliony jaj tygodniowo, każdego tygodnia należy przygotować około 28 klatek.</li>
</ol>
6. Karmienie krwią
<ol>
	<li>System podawania na płycie aluminiowej zapewnia dostarczanie krwi do klatek dwa razy w tygodniu. Po jednej stronie płyty aluminiowej (10 cm x 10 cm x 3 mm) tworzy się zbiorniczek z krwią za pomocą Parafilmu (Rycina 5). Aby pobudzić owady do żerowania, krew jest podgrzewana poprzez umieszczenie nagrzanego woreczka z ziarnami na górze podajnika. Woreczek składał się z około 250 g ziaren pszenicy w materiałowej osłonce, którą podgrzewano przez około 10 sec w kuchence mikrofalowej. Krew wykorzystywana do karmienia pochodzi z lokalnej rzeźni; ponieważ zwierzęta te (głównie kozy i owce) są przeznaczone do spożycia przez ludzi, przechodzą badania w celu wykluczenia obecności patogenów.</li>
	<li>Trzy dni po karmieniu krwią udostępnia się samicom miejsce do składania jaj. Miejsce to stanowi okrągły plastikowy pojemnik wypełniony wodą do około ¼ wysokości, z papierem filtracyjnym pokrywającym wnętrze. Po dwóch dniach miejsce składania jaj jest usuwane. Aby uzyskać maksymalną produkcję jaj, należy upewnić się, że papier filtracyjny pokrywa całą dostępną powierzchnię wewnątrz pojemnika i pozostaje wilgotny.</li>
	<li>Należy wyjąć papier z jajami i położyć go na papierze chłonnym do wyschnięcia w warunkach insektarium; jaja wymagają okresu kondycjonowania przy wysokiej wilgotności (powyżej 70%) przez co najmniej 48 hr&#160;po złożeniu. Jaja mogą pozostawać w insektarium do 3 miesięcy przy minimalnym spadku odsetka wylęgnięć, pod warunkiem utrzymania wysokiej wilgotności25.</li>
	<li>Kolonia produkcyjna musi być odpowiednio duża, aby zapewnić liczbę jaj wymaganą w ujęciu tygodniowym dla programu uwalniania. Opisana powyżej instalacja może wyprodukować około 4 milionów jaj przy zastosowaniu 28 klatek tygodniowo. Zaleca się przechowywanie zapasu jaj gwarantującego co najmniej 4 tygodnie dostaw dla Generacji Uwalnianej oraz Kolonii Produkcji Jaj.</li>
</ol>
Generowanie uwalniania
7. Produkcja larw
Procesy wylęgu, hodowli i sortowania dla generacji przeznaczonej do wypuszczenia są identyczne z wcześniej opisaną metodą stosowaną dla kolonii Produkcji Jaj. Jednak skala produkcji jest znacznie większa, co wymaga zastosowania większej liczby tacek i większego nakładu pracy.
8. Sortowanie larw, poczwarek samców i poczwarek samic
<ol>
	<li>Sortowanie larw, poczwarek samców i poczwarek samic odbywa się w sposób identyczny z metodą opisaną dla sekcji Produkcja jaj.</li>
	<li>Po posortowaniu poczwarek samców przed wypuszczeniem ważne jest sprawdzenie stopnia zanieczyszczenia samicami; ich udział nie powinien przekraczać 1%. Należy pobrać trzy alikwoty po 500 poczwarek (trzy losowe miarki do poczwarek) i policzyć liczbę obecnych poczwarek samic. Samice można zidentyfikować po tym, że są zazwyczaj większe od samców oraz po różnicach w kształcie płata genitalnego (Rycina 6)27. Jeśli zawartość samic przekracza 1%, należy je ponownie posortować i sprawdzić raz jeszcze.</li>
	<li>Do wypuszczenia należy używać wyłącznie samców z dnia 8. i 9.; pozostałe larwy i poczwarki należy poddać autoklawowaniu. W Brazylii odpady te muszą być traktowane tak samo jak odpady medyczne, jednak przepisy w innych krajach mogą być odmienne. Nie należy wykorzystywać poczwarek samic ani larw z generacji wypuszczanej do kolonii Produkcji jaj ze względu na różnice w kontroli jakości, hodowli oraz ryzyko zanieczyszczeń wynikające z większej liczebności i słabszej kontroli jakości.</li>
</ol>
Przechowywanie dorosłych osobników przed wypuszczeniem: Umieść samce w urządzeniach do uwalniania, aby mogły się wykluć i dojrzeć przed wypuszczeniem. Szczegóły dotyczące urządzeń do uwalniania nie zostały opisane w tej metodzie. Niemniej jednak pojemność stosowanych przez nas urządzeń do uwalniania wynosi około 1 000 samców. Szczegóły dotyczące metody uwalniania (urządzenie i system uwalniania) nie są opisane w tej metodzie.

<ol><li>Dyck, V., et al. Sterilizing Insects with Ionizing Radiation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDyck%2C+V+%22Sterile+Insect+Technique%22">Sterile Insect Technique</a>. , Springer. Netherlands. 233-268 (2005).</li>
<li>Dyck, V., Hendrichs, J., Robinson, A. S., Klassen, W., Curtis, C. History of the Sterile Insect Technique.. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDyck%2C+V+%22Sterile+Insect+Technique%22">Sterile Insect Technique</a>. , Springer. Netherlands. 3-36 (2005).</li>
<li>Alphey, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile-insect+methods+for+control+of+mosquito-borne+diseases+%E2%80%93+an+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Vector+Borne+Zoonotic+Dis%22%5BJournal%5D)">Sterile-insect methods for control of mosquito-borne diseases – an analysis.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 10, 295-311 (2010).</li>
<li>Thomas, D. D., Donnelly, C. A., Wood, R. J., Alphey, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+population+control+using+a+dominant%2C+repressible%2C+lethal+genetic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Insect population control using a dominant, repressible, lethal genetic system.</a> Science. 287, 2474-2476 (2000).</li>
<li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female-specific+insect+lethality+engineered+using+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Female-specific insect lethality engineered using alternative splicing.</a> Nat. Biotechnol. 25, 353-357 (2007).</li>
<li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female-specific+flightless+phenotype+for+mosquito+control%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Female-specific flightless phenotype for mosquito control.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4550-4554 (2010).</li>
<li>Gong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dominant+lethal+genetic+system+for+autocidal+control+of+the+Mediterranean+fruitfly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly.</a> Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).</li>
<li>Phuc, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late-acting+dominant+lethal+genetic+systems+and+mosquito+control%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control.</a> BMC Biol. 5 (11), (2007).</li>
<li>Harris, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+suppression+of+a+field+mosquito+population+by+sustained+release+of+engineered+male+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes.</a> Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).</li>
<li>Harris, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+performance+of+engineered+male+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Field performance of engineered male mosquitoes.</a> Nat. Biotechnol. 29, 1034-1037 (2011).</li>
<li>Bailey, D. L., Lowe, R. E., Dame, D. A., Seawright, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+rearing+the+genetically+altered+MACHO+strain+of+Anopheles+albimanus+Wiedemann%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Mass rearing the genetically altered MACHO strain of Anopheles albimanus Wiedemann.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 29, 141-149 (1980).</li>
<li>Benedict, M. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonisation+and+mass+rearing%3A+learning+from+others%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J.%22%5BJournal%5D)">Colonisation and mass rearing: learning from others.</a> Malar. J.. 8 Suppl 2 (S4), (2009).</li>
<li>Alphey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-engineering+the+sterile+insect+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Re-engineering the sterile insect technique.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1243-1247 (2002).</li>
<li>Wise de Valdez,, R, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+elimination+of+dengue+vector+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic elimination of dengue vector mosquitoes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4772-4775 (2011).</li>
<li>Macoris Mde,, L,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+of+Aedes+aegypti+from+the+state+of+Sao+Paulo%2C+Brazil%2C+to+organophosphates+insecticides.%5BTitle%5D)+AND+%22Mem.+Inst.+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Resistance of Aedes aegypti from the state of Sao Paulo, Brazil, to organophosphates insecticides.</a> Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 98, 703-708 (2003).</li>
<li>Campos, J., Andrade, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+susceptibility+of+Aedes+aegypti+and+Culex+quinquefasciatus+populations+to+chemical+insecticides%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Saude+Publica%22%5BJournal%5D)">Larval susceptibility of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus populations to chemical insecticides.</a> Rev. Saude Publica. 37, 523-527 (2003).</li>
<li>Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resurgent+vector-borne+diseases+as+a+global+health+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Resurgent vector-borne diseases as a global health problem.</a> Emerg. Infect. Dis. 4, 442-450 (1998).</li>
<li>Harris, A. F., Rajatileka, S., Ranson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrethroid+resistance+in+Aedes+aegypti+from+Grand+Cayman%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Pyrethroid resistance in Aedes aegypti from Grand Cayman.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 83, 277-284 (2010).</li>
<li>Lima, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+of+Aedes+aegypti+to+organophosphates+in+several+municipalities+in+the+State+of+Rio+de+Janeiro+and+Espirito+Santo%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Resistance of Aedes aegypti to organophosphates in several municipalities in the State of Rio de Janeiro and Espirito Santo.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 68, Brazil. 329-333 (2003).</li>
<li>Paris, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+Bacillus+thuringiensis+israelensis+%28Bti%29+in+the+environment+induces+resistance+to+multiple+Bti+toxins+in+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag.+Sci%22%5BJournal%5D)">Persistence of Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) in the environment induces resistance to multiple Bti toxins in mosquitoes.</a> Pest Manag. Sci. 67, 122-128 (2010).</li>
<li>Rendon, P., McInnis, D., Lance, D., Stewart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medfly+%28Diptera%3A+Tephritidae%29+genetic+sexing%3A+large-scale+field+comparison+of+males-only+and+bisexual+sterile+fly+releases+in+Guatemala%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Econ.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Medfly (Diptera: Tephritidae) genetic sexing: large-scale field comparison of males-only and bisexual sterile fly releases in Guatemala.</a> J. Econ. Entomol. 97, 1547-1553 (2004).</li>
<li>Papathanos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+separation+strategies%3A+past+experience+and+new+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J.%22%5BJournal%5D)">Sex separation strategies: past experience and new approaches.</a> Malar. J.. 8 Suppl 2 (S5), (2009).</li>
<li>Medici, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+Aedes+albopictus+larval+mass-rearing+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Econ.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Studies on Aedes albopictus larval mass-rearing optimization.</a> J. Econ. Entomol. 104, 266-273 (2011).</li>
<li>Focks, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+separator+for+the+developmental+stages%2C+sexes+and+species+of+mosquito+%28Diptera+Culicidae%29.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Entomol%22%5BJournal%5D)">An improved separator for the developmental stages, sexes and species of mosquito (Diptera Culicidae).</a> J. Med. Entomol. 17, 567-568 (1980).</li>
<li>Fay, R. W., McCray, E. M., Kilpatrick, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+production+of+sterilized+male+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Mosquito+News%22%5BJournal%5D)">Mass production of sterilized male Aedes aegypti.</a> Mosquito News. 23, 210-214 (1963).</li>
<li>Christophers, S. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChristophers%2C+SR+%22Aedes+aegypti+the+yellow+fever+mosquito%3A+Its+life+history%2C+Bionomics+and+Structure%22">Aedes aegypti the yellow fever mosquito: Its life history, Bionomics and Structure</a>. , Cambridge University Press. (2009).</li>
<li>Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+sexing+living+Anopheles+Larvae+%28diptera%2C+culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Entomol.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">A simple method for sexing living Anopheles Larvae (diptera, culicidae).</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 50, 104-106 (1957).</li>
<li>Koenraadt, C. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pupal+Dimensions+as+Predictors+of+Adult+Size+in+Fitness+Studies+of+Aedes+aegypti+%28Diptera+Culicidae%29.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Pupal Dimensions as Predictors of Adult Size in Fitness Studies of Aedes aegypti (Diptera Culicidae).</a> J. Med. Entomol. 45, 331-336 (2008).</li>
<li>Alphey, L., Nimmo, D., O'Connell, S., Alphey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+population+suppression+using+engineered+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Insect population suppression using engineered insects.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 627, 93-103 (2008).</li>
<li>Alphey, N., Bonsall, M. B., Alphey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+resistance+to+genetic+control+of+insects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling resistance to genetic control of insects.</a> J. Theor. Biol. 270, 42-55 (2011).</li>
<li>Atkinson, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+the+control+of+mosquito-borne+diseases+by+a+dominant+lethal+genetic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Analyzing the control of mosquito-borne diseases by a dominant lethal genetic system.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9540-9545 (2007).</li>
<li>Bargielowski, I., Nimmo, D., Alphey, L., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+life+history+characteristics+of+the+genetically+modified+OX513A+line+and+a+wild+type+strain+of+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of life history characteristics of the genetically modified OX513A line and a wild type strain of Aedes aegypti.</a> PLoS One. 6 (e20699), (2011).</li>
<li>Bargielowski, I., Alphey, L., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost+of+mating+and+insemination+capacity+of+a+genetically+modified+mosquito+Aedes+aegypti+OX513A+compared+to+its+wild+type+counterpart%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cost of mating and insemination capacity of a genetically modified mosquito Aedes aegypti OX513A compared to its wild type counterpart.</a> PLoS One. 6 (26086), (2011).</li>
</ol>

Autorzy powiązani z Oxitec są zatrudnieni i/lub posiadają udziały w Oxitec Ltd. Oxitec Ltd oraz Uniwersytet Oksfordzki posiadają prawa własności intelektualnej związane z tematyką niniejszej pracy. &#160;

RIDL&#160;jest skuteczną i bezpieczną dla środowiska metodą zwalczania komarów3,29-31. Technika ta znajduje zastosowanie w zintegrowanych programach zarządzania szkodnikami&#160;, a większość aktualnych metod kontroli, w tym larwicydy, ograniczanie miejsc lęgowych i adultycydy, jest z nią kompatybilna. Niniejsza metoda opisuje sposób produkcji do 570 000 poczwarek samców RIDL&#160; tygodniowo do wykorzystania w zwalczaniu Ae. aegypti; z naszej wiedzą jest to pierwszy opis produkcji transgenicznych komarów na taką skalę. Niektóre porównywalne systemy produkcji opracowano dla dzikiego typu Ae. aegypti w latach 60. i 70.25, jednak od tego czasu nie prowadzono produkcji o porównywalnej skali. W Brazylii od lutego 2011 do lutego 2012 roku wypuszczono około 11 milionów samców. Liczba samców wymagana do opanowania danego obszaru zależy od wielu czynników, w tym od wielkości populacji dzikiej, rozprzestrzeniania się wypuszczonych samców, ich przeżywalności i konkurencyjności w kojeniu po wypuszczeniu, a także od warunków środowiskowych.&#160; Wcześniejsze badania wykazały, że RIDL&#160; może zredukować populację komarów o co najmniej 80%9.
Konieczne jest zachowanie równowagi między optymalizacją masowej hodowli pod kątem skali produkcji i kosztów a jakością samców. Na przykład zwiększenie zagęszczenia larw może zwiększyć wydajność produkcji poprzez zmniejszenie wymaganej przestrzeni, nakładów pracy oraz czasu do przepocz워cenia32. Jednak zbyt wysokie zagęszczenie larw może prowadzić do uzyskania mniejszych i krócej żyjących samców o obniżonej zdolności do kopulacji32,33. Jakość samców w kontekście programu SIT zostanie ostatecznie oceniona na podstawie zdolności wypuszczonych samców do kopulacji z samicami w terenie. Do oceny konkurencyjności w kopulacji w stosunku do osobników dzikich wymagane są rozległe badania terenowe9,10. Często sprawia to, że niepraktyczne jest precyzyjne określenie, które czynniki decydują o tym, że komar jest samcem „wysokiej jakości”. Niemniej jednak utrzymanie spójnej produkcji i jakości (w zakresie, w jakim można ją rutynowo oceniać) w masowej hodowli na dużą skalę jest kwestią kluczową. Wymaga to wysokiego poziomu czujności i standaryzacji wszystkich procesów, gdyż niewielkie wahania mogą mieć znaczący wpływ na wynik. Podział larw L1 na porcje (alikwotowanie) jest krytycznym etapem i obrazuje tę kwestię. Przeniesienie prawidłowej liczby larw do tacek jest niezbędne dla uzyskania produkcji wysokiej jakości. System karmienia jest precyzyjnie dostosowany do konkretnej liczby larw. Zbyt mała lub zbyt duża liczba larw doprowadzi do przeżywienia lub niedożywienia, co wpływa na przeżywalność larw, wielkość pocieczek i czas do przepocz워cenia. Jeśli istnieje sekret sztuki masowej hodowli, polega on na zapewnieniu, że wiele małych kroków w cyklu produkcyjnym jest przeprowadzanych spójnie, precyzyjnie i z wysokim poziomem kontroli jakości, zgodnie z opisem w niniejszej pracy.

Komary przenoszą wiele patogenów, które mogą wywoływać szereg chorób u ludzi, a walka z tymi owadami trwa od stuleci. Strategie kontroli owadów oparte na metodach chemicznych i biologicznych odniosły pewne znaczące sukcesy, jednak w wielu przypadkach kontrola ta nie była zrównoważona w dłuższej perspektywie czasowej. Na przykład Brazylia osiągnęła eradykację Ae. aegypti w latach 50., lecz w ciągu ostatnich 40-50 lat komar ten ponownie zainfekował te tereny. Można to przypisać wielu przyczynom, w tym oporności na insektycydy, zniszczeniu środowiska, wadliwemu wdrażaniu programów kontrolnych&#160;15-20 oraz szybkiej reinwazji przy braku odpowiedniego monitoringu lub reakcji.
Poszukiwane są nowe techniki i metody, aby spróbować wygrać tę walkę z komarami. &#160;Ostatnie postępy w technikach molekularnych doprowadziły do opracowania nowych i innowacyjnych metod kontroli komarów opartych na technice sterylizacji owadów (SIT)1-3. Metoda kontroli znana jako RIDL&#160;(uwalnianie owadów niosących dominujący gen letalny)4 opiera się na SIT, ale wykorzystuje metody genetyczne, aby wyeliminować konieczność sterylizacji radiacyjnej. Linie RIDL&#160;skonstruowano dla kilku gatunków szkodników, w tym Ae. aegypti 5-8, linia RIDL&#160; Ae. aegypti została z sukcesem przetestowana w warunkach polowych na Wielkim Kajmanie9,10; dalsze zastosowania polowe są planowane lub realizowane w innych krajach na świecie.&#160; Tłumienie populacji komarów przy użyciu RIDL&#160; będzie wymagało hodowli licznej populacji wysokiej jakości dorosłych samców3,14.
W przypadku programu SIT&#160;za pożądane uważa się wypuszczanie wyłącznie samców; samice komarów kąsają i przenoszą choroby. Ponadto wypuszczone sterylne samce mogą być „rozpraszane” przez wypuszczone samice, co obniża skuteczność programu&#160;. W dużych eksperymentach polowych z napromieniowanymi muszkami śródziemnomorskimi wykazano, że wypuszczanie wyłącznie samców było od 3 do 5 razy skuteczniejsze niż wypuszczanie osobników obu płci21.
W programie masowej hodowli RIDL&#160;proces produkcji samców do wypuszczenia składa się z kilku etapów. &#160;Pierwszym z nich jest wytworzenie jaj niezbędnych dla pokolenia przeznaczonego do wypuszczenia (Rycina 1). Następny etap obejmuje hodowlę jaj aż do stadium poczwarek lub osobników dorosłych, z oddzieleniem larw od poczwarek oraz poczwarek samców &#160;od poczwarek samic. Masowa separacja samców od samic wymaga istnienia różnic między płciami na konkretnym etapie rozwoju, które umożliwiają sortowanie na dużą skalę22. U Ae. aegypti (oraz innych gatunków komarów) występuje znaczna różnica w wielkości między poczwarkami samców a samic, co można wykorzystać w technikach separacji płci. Posortowani &#160;samce RIDL&#160;są następnie uwalniani w ramach programu kontroli&#160;w stadium poczwarki lub osobnika dorosłego11,12.
Poniżej opisano metody masowej hodowli OX513A, szczepu RIDL&#160; Ae. Aegypti, przeznaczonego do wypuszczenia na wolność. Opisane metody obejmują techniki niezbędne do produkcji jaj oraz samców RIDL&#160; na potrzeby programu kontroli populacji.

<table><tbody><tr><td> &lt;p&gt;Vipan Premium&lt;/p&gt; </td><td>Sera GmbH</td><td>&lt;p&gt;190&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;a href=&quot;Sera vipan 3

Sera vipan 3 to wysokiej jakości preparat witaminowy w formie granulek, przeznaczony do podawania rybom w pokarmie. Witaminy są niezbędne dla prawidłowego funkcjonowania organizmu ryb, ponieważ pełnią one funkcję katalizatorów w procesach metabolicznych, wspierają wzrost oraz wzmacniają układ odpornościowy.

Wiele witamin ulega rozkładowi podczas procesu produkcji pokarmu lub w trakcie jego przechowywania. Dlatego też regularne uzupełnianie witamin w diecie ryb jest kluczowe, szczególnie w okresach zwiększonego zapotrzebowania, takich jak:
- okres tarła,
- wzrost młodych ryb,
- rekonwalescencja po chorobie,
- stres związany z transportem lub zmianami parametrów wody.

Sera vipan 3 zawiera optymalnie dobrany kompleks witamin, które wspierają witalność, poprawiają kolorystykę ryb oraz zwiększają ich odporność na infekcje.

Sposób zastosowania:
Sera vipan 3 należy mieszać z pokarmem dla ryb. Zalecane dawkowanie to 4 g produktu na 100 g pokarmu. Tak przygotowaną mieszankę należy przechowywać w chłodnym i ciemnym miejscu, aby zapobiec utlenianiu witamin.

Skład:
Preparat zawiera zestaw witamin rozpuszczalnych w wodzie i w tłuszczach, dostosowany do specyficznych potrzeb ryb ozdobnych.&quot;&gt;sera vipan 3

Sera vipan 3 to specjalistyczny preparat do leczenia i zapobiegania infekcjom bakteryjnym u ryb ozdobnych. Jest to produkt szerokiego działania, przeznaczony do walki z szerokim spektrum bakterii patogennych, w tym z takimi jak *Aeromonas* czy *Pseudomonas*.

Zastosowanie i działanie:
Preparat jest skuteczny w przypadku objawów takich jak:
- czerwone krawędzie płetw,
- zapalenie pęcherza pławnego,
- infekcje skóry i tkanek miękkich,
- ogólne objawy chorób bakteryjnych.

Sera vipan 3 działa bakteriobójczo, hamując namnażanie się patogenów i wspomagając procesy regeneracyjne organizmu ryb.

Sposób użycia i dawkowanie:
Przed zastosowaniem preparatu zaleca się wykonanie podmiany wody w akwarium.
Dawkowanie: 250 mg preparatu na 10 litrów wody.
Czas trwania kuracji: zazwyczaj od 3 do 5 dni. Po zakończeniu leczenia zaleca się ponowną podmianę wody.

Ważne uwagi:
- Stosować zgodnie z instrukcją na opakowaniu.
- Przechowywać w suchym i chłodnym miejscu, poza zasięgiem dzieci.
- Przed użyciem zapoznać się z pełnym składem i ostrzeżeniami zawartymi w ulotce dołączonej do produktu.&lt;/a&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Tetracyklina&lt;/p&gt; </td><td>Sigma Aldrich</td><td>&lt;p&gt;T7660&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?D7=0&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO|KLUCZ_MARKI&amp;amp;N4=T7660|SIGMA&amp;amp;N25=0&amp;amp;QS=ON&amp;amp;F=SPEC&quot;&gt;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?D7=0&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO|KLUCZ_MARKI&amp;amp;N4=T7660|SIGMA&amp;amp;N25=0&amp;amp;QS=ON&amp;amp;F=SPEC&lt;/a&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Separator płytek&lt;/p&gt; </td><td>J.W. Hock</td><td>&lt;p&gt;5412&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;a href=&quot;Instrukcja obsługi: Separator 5412

Krótki opis:
Separator 5412 służy do oddzielania frakcji stałych od cieczy w próbkach biologicznych i chemicznych. Urządzenie zapewnia precyzyjną kontrolę parametrów procesu, umożliwiając odzyskanie czystych osadów i klarownych nadsączków.

Specyfikacja techniczna:
- Maksymalna prędkość obrotowa: [Wartość] obr./min
- Pojemność wirówki: [Wartość] ml
- Napięcie zasilania: [Wartość] V
- Wymiary: [Wartość] x [Wartość] x [Wartość] mm

Procedura obsługi:

1. Przygotowanie urządzenia:
Upewnij się, że separator jest ustawiony na stabilnej, poziomej powierzchni. Przed pierwszym uruchomieniem sprawdź, czy wszystkie elementy mocujące są prawidłowo dokręcone.

2. Załadunek próbek:
Wlej próbkę do odpowiedniego naczynia separatora. Pamiętaj o zachowaniu symetrii obciążenia, aby uniknąć wibracji i uszkodzenia urządzenia.

3. Ustawianie parametrów:
Za pomocą panelu sterowania ustaw pożądaną prędkość oraz czas trwania procesu separacji. 

4. Uruchomienie:
Zamknij szczelnie pokrywę urządzenia i naciśnij przycisk start. Nie otwieraj pokrywy, dopóki rotor całkowicie się nie zatrzyma.

5. Odzyskiwanie frakcji:
Po zakończeniu cyklu ostrożnie wylej nadsączek, zachowując osad wewnątrz naczynia.

Konserwacja i czyszczenie:
Po każdym użyciu naczynia należy dokładnie umyć wodą z łagodnym detergentem i opłukać wodą destylowaną. Regularnie sprawdzaj stan uszczelek i elementów mechanicznych.

Bezpieczeństwo:
- Nigdy nie uruchamiaj separatora bez zamkniętej pokrywy.
- W przypadku nadmiernych wibracji natychmiast wyłącz urządzenie.
- Stosuj wyłącznie certyfikowane naczynia odporne na siłę odśrodkową.

Rozwiązywanie problemów:
- Urządzenie nie uruchamia się: Sprawdź połączenie zasilania oraz czy pokrywa jest całkowicie zamknięta.
- Nadmierne wibracje: Sprawdź, czy próbki są rozmieszczone symetrycznie w rotorze.&quot;&gt;Sepsarator 5412
Instrukcja obsługi

WSTĘP
Sepsarator 5412 jest wysokowydajnym, zautomatyzowanym systemem do separacji ciał stałych z cieczy, zaprojektowanym z myślą o zastosowaniach laboratoryjnych i przemysłowych. Urządzenie wykorzystuje siłę odśrodkową do szybkiego i efektywnego oddzielania zawiesin, osadów oraz innych cząstek stałych z próbek ciekłych, zapewniając wysoką czystość separatu.

CECHY URZĄDZENIA
• Precyzyjna kontrola prędkości obrotowej dla zoptymalizowanej separacji.
• Wytrzymała konstrukcja odporna na korozję, odpowiednia do pracy z różnymi odczynnikami chemicznymi.
• Intuicyjny panel sterowania z cyfrowym wyświetlaczem parametrów.
• System automatycznego wyważania zapobiegający wibracjom podczas pracy.
• Bezpieczniki ochronne i blokady pokrywy zapewniające bezpieczeństwo operatora.

ZASADY BEZPIECZEŃSTWA
Przed uruchomieniem urządzenia należy zapoznać się z poniższymi zasadami bezpieczeństwa:
1. Nigdy nie otwieraj pokrywy urządzenia podczas jego pracy.
2. Upewnij się, że wszystkie naczynia i próbki są prawidłowo rozmieszczone i wyważone.
3. Urządzenie musi być podłączone do uziemionego gniazda zasilania.
4. W przypadku wystąpienia nadmiernych wibracji lub nietypowych dźwięków należy natychmiast wyłączyć urządzenie.
5. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) podczas pracy z materiałami niebezpiecznymi.

INSTRUKCJA OBSŁUGI
1. Przygotowanie próbek: Nalej ciecz z zawiesiną do odpowiednich naczyń separatora, dbając o to, aby poziom cieczy był zgodny ze specyfikacją producenta.
2. Załadunek: Umieść naczynia w rotorze w sposób symetryczny, aby zapewnić prawidłowe wyważenie układu.
3. Konfiguracja parametrów: Włącz urządzenie i za pomocą panelu sterowania ustaw pożądaną prędkość obrotową oraz czas separacji.
4. Uruchomienie: Zamknij i zablokuj pokrywę, a następnie naciśnij przycisk START.
5. Zakończenie pracy: Po upływie zaprogramowanego czasu rotor zatrzyma się automatycznie. Odczekaj do całkowitego zatrzymania, zanim otworzysz pokrywę.
6. Odzyskiwanie separatu: Ostrożnie usuń naczynia i oddziel klarowną ciecz od zgromadzonego osadu.

KONSERWACJA I CZYSZCZENIE
• Po każdym użyciu należy oczyścić komorę urządzenia z ewentualnych rozlanej cieczy za pomocą wilgotnej szmatki i łagodnego detergentu.
• Regularnie sprawdzaj stan uszczelek i elementów ruchomych pod kątem zużycia.
• Rotory i naczynia odporne na autoklawowanie powinny być sterylizowane zgodnie z procedurami laboratoryjnymi.
• Przeglądy techniczne i kalibracja powinny być przeprowadzane okresowo przez autoryzowany serwis.

ROZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW
Problem: Urządzenie nie uruchamia się.
Możliwa przyczyna: Pokrywa nie jest domknięta lub zablokowana.
Rozwiązanie: Sprawdź blokadę pokrywy i upewnij się, że jest ona całkowicie zamknięta.

Problem: Nadmierne wibracje podczas pracy.
Możliwa przyczyna: Nieprawidłowe wyważenie próbek w rotorze.
Rozwiązanie: Wyłącz urządzenie, sprawdź rozmieszczenie naczyń i upewnij się, że masy próbek są identyczne.

Problem: Błąd wyświetlacza.
Możliwa przyczyna: Błąd systemowy lub awaria czujnika.
Rozwiązanie: Zrestartuj urządzenie; jeśli problem nie ustąpi, skontaktuj się z serwisem technicznym.

SPECYFIKACJA TECHNICZNA
Prędkość obrotowa: [Wartość] obr./min
Pojemność maksymalna: [Wartość] ml
Napięcie zasilania: [Wartość] V / [Wartość] Hz
Wymiary: [Wartość] x [Wartość] x [Wartość] mm
Masa: [Wartość] kg&lt;/a&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Parafilm M&lt;/p&gt; </td><td>Wypełnienie plastikowe Pechiney</td><td>&lt;p&gt;PM-996&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;a href=&quot;http://www.parafilm.com&quot;&gt;www.parafilm.com&lt;/a&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Kuwety hodowlane dla generacji przeznaczonej do wypuszczenia (53 cm x 38 cm x 8 cm)&lt;/p&gt; </td><td>Pleion</td><td>&lt;p&gt;0757&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;a href=&quot;To jest link do strony internetowej firmy Pleion, która specjalizuje się w produkcji i sprzedaży produktów do konserwacji i ochrony drewna. Strona zawiera sekcję „Produkty”, w której przedstawiono ofertę firmy.&quot;&gt;http://pleion.actcenter.com.br/produtos.asp?opcao=1&lt;/a&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Mikroskop fluorescencyjny&lt;/p&gt; </td><td>Leica Microsystems</td><td>&lt;p&gt;MZ FLIII&lt;/p&gt; &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;a href=&quot;Szeroki zakres możliwości dla każdego laboratorium

Nowy system Leica MZ FLIII oferuje niespotykaną dotąd elastyczność w konfiguracji, pozwalając na dostosowanie mikroskopu do specyficznych wymagań każdego użytkownika. Dzięki modułowej budowie możliwe jest szybkie przejście od podstawowej konfiguracji do zaawansowanego systemu obrazowania.

Kluczowe cechy:

Elastyczność i modułowość: System został zaprojektowany tak, aby umożliwić łatwą rozbudowę i modyfikację w zależności od potrzeb badawczych.

Wysoka jakość optyki: Zastosowanie zaawansowanych obiektywów i okularów zapewnia wyjątkową ostrość obrazu oraz wysoką rozdzielczość, co jest kluczowe przy analizie szczegółów struktur komórkowych i tkankowych.

Ergonomia: Intuicyjna obsługa i komfort pracy minimalizują zmęczenie operatora podczas długotrwałych sesji mikroskopowych.

Wszechstronne oświetlenie: Zintegrowany system oświetlenia pozwala na optymalizację kontrastu i jasności próbki, co umożliwia precyzyjną wizualizację różnych typów preparatów.

Zastosowania:
Idealny do rutynowych badań morfologicznych, kontroli jakości w laboratoriach klinicznych oraz zaawansowanych projektów badawczych w naukach biologicznych i medycznych.

Specyfikacja techniczna i konfiguracje:
W ofercie dostępne są różnorodne zestawy obiektywów oraz akcesoria, które pozwalają na dostosowanie powiększenia i głębi ostrości do analizowanych obiektów.

Leica Microsystems – Innowacje w obrazowaniu naukowym.&quot;&gt;Szybka i łatwa w obsłudze metoda do analizy tkanek

Zapewnij sobie pewność i powtarzalność wyników dzięki systemowi do cięcia tkanek Leica MZ FLIII.

Przeznaczony do cięcia tkanek w temperaturze zamrażania, system Leica MZ FLIII to wszechstronne narzędzie do preparatyki histologicznej, które łączy w sobie najwyższą precyzję z łatwością obsługi.

Właściwości urządzenia:

* Możliwość cięcia w temperaturze zamrażania (kryostatyka) i w temperaturze pokojowej.
* Wbudowana komora chłodząca z regulacją temperatury.
* Precyzyjny mechanizm posuwu dla zapewnienia powtarzalności grubości przekrojów.
* Intuicyjny panel sterowania ułatwiający szybką zmianę parametrów.
* Ergonomiczna konstrukcja zapewniająca komfort pracy użytkownika.
* Wysoka stabilność i sztywność konstrukcji eliminująca drgania podczas cięcia.

Zastosowania:

System Leica MZ FLIII idealnie nadaje się do szerokiego zakresu zastosowań w laboratoriach patomorfologicznych, ośrodkach badawczych i jednostkach akademickich, w tym do:

* Szybkiego przygotowywania skrawków tkanek do diagnostyki śródoperacyjnej.
* Analizy tkanek utrwalonych w materiale mrożonym.
* Badania struktur komórkowych i tkankowych z zachowaniem wysokiej morfologii.
* Przygotowywania próbek do immunohistochemii i innych metod barwienia specyficznego.

Zalety systemu:

* Wysoka jakość skrawków: Minimalizacja artefaktów i zniekształceń tkanek dzięki precyzyjnemu prowadzeniu noża.
* Elastyczność: Szybkie przejście między różnymi trybami pracy i temperaturami.
* Niezawodność: Wykorzystanie wysokiej klasy materiałów odpornych na korozję i zużycie.
* Bezpieczeństwo: Zastosowanie osłon i blokad chroniących operatora przed ostrym ostrzem.

Leica Microsystems – partner w precyzyjnej analizie obrazu i preparatyce tkanek.&lt;/a&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Klatki dla osobników dorosłych&lt;/p&gt; </td><td>BugDorm</td><td>&lt;p&gt;DP1000&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;a href=&quot;Klatka do hodowli owadów 30x30x30 cm, opakowanie 1 szt.&quot;&gt;Klatka do hodowli owadów, 30x30x30 cm, opakowanie 1 szt.&lt;/a&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Papier filtracyjny&lt;/p&gt; </td><td>CELAB</td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;Proszę o podanie tekstu źródłowego do tłumaczenia.&gt;&lt;a href=&quot;Sonda dla PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Sondy dla qPCR są zaprojektowane w celu zwiększenia specyficzności i czułości detekcji w porównaniu z metodami opartymi na barwnikach wiążących DNA, takich jak SYBR Green. Wykorzystują one zasadę transferu energii między fluorescencyjnym donorem (reporterem) a akceptorem (wygaszaczem/quencherem).

Zalety zastosowania sond:
* Większa specyficzność: Sonda wiąże się z konkretną sekwencją między dwiema starterami, co zapewnia, że sygnał fluorescencyjny pochodzi wyłącznie z pożądanego amplikonu.
* Możliwość multipleksowania: Używając sond z różnymi fluorochromami, można wykrywać wiele celów w jednej reakcji.
* Wyższa czułość: Pozwalają na dokładniejszą kwantyfikację niskich poziomów kwasów nukleinowych.

Typy sond:
1. Sondy typu TaqMan: Najbardziej powszechnie stosowane. Wykorzystują aktywność egzonukleazy polimerazy Taq, która degraduje sondę podczas elongacji, uwalniając reportera od wygaszacza i generując sygnał fluorescencyjny.
2. Sondy typu Molecular Beacons (Molekularne Latarnie): Tworzą strukturę spinki, która fluorescuje tylko po hybrydyzacji z docelową sekwencją DNA.
3. Sondy PNA (Peptydowe Kwasy Nukleinowe): Posiadają szkielet pseudopeptydowy, co zwiększa stabilność wiązania i specyficzność, szczególnie przy niskich stężeniach celu.

Parametry projektowania sond:
* Długość: Zazwyczaj od 20 do 30 nukleotydów.
* Temperatura topnienia (Tm): Powinna być o 5–10°C wyższa niż Tm starterów, aby zapewnić pełną hybrydyzację sondy przed rozpoczęciem elongacji.
* Pozycja: Sonda musi być umieszczona w obrębie regionu amplifikowanego przez startery.
* Unikanie struktur drugorzędowych: Projekt musi wykluczać tworzenie dimerów lub spinek w obrębie samej sondy.

Aplikacje:
* Diagnostyka kliniczna (wykrywanie patogenów, wirusów i bakterii).
* Analiza ekspresji genów (RT-qPCR).
* Wykrywanie mutacji punktowych i polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP).
* Badania onkologiczne i genetyczne.&quot;&gt;http://www.casadolaboratorio.com.br/subpage118.html&lt;/a&gt;&lt;/p&gt; </td></tr></tbody></table>

masowa produkcja genetycznie zmodyfikowanych aedes aegypti do wypuszczeń w terenie w brazylii

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

Poszukiwane są nowe techniki i metody, aby spróbować wygrać walkę z komarami. Ostatnie postępy w technikach molekularnych doprowadziły do opracowania nowych i innowacyjnych metod kontroli komarów opartych na technice sterylnych owadów (SIT)1-3. Metoda kontroli znana jako RIDL&#160;(uwalnianie owadów przenoszących dominujący gen letalny)4 opiera się na SIT, ale wykorzystuje metody genetyczne, aby wyeliminować konieczność sterylizacji radiacyjnej5-8. Szczep RIDL&#160; Ae. aegypti został pomyślnie przetestowany w warunkach terenowych na Wielkim Kajmanie9,10; dalsze zastosowania terenowe są planowane lub w toku w innych krajach na całym świecie.
Masowa hodowla owadów została opracowana dla wielu gatunków i osiąga poziomy liczone w miliardach osobników tygodniowo. Jednak w przypadku komarów hodowla była zazwyczaj prowadzona na znacznie mniejszą skalę, a większość wielkoskalowych przedsięwzięć miała miejsce w latach 70. i 80. XX wieku. W programie RIDL&#160;pożądane jest uwalnianie jak najmniejszej liczby samic, ponieważ kąsają one i przenoszą choroby. W programie masowej hodowli&#160;wyróżnia się kilka etapów produkcji samców przeznaczonych do wypuszczenia: produkcję jaj, hodowlę jaj aż do przepociwienia oraz sortowanie samców od samic przed wypuszczeniem. Samce te są następnie wykorzystywane w programie kontroli RIDL&#160;,&#160;uwalniane jako poczwarki lub osobniki dorosłe11,12.
Aby zredukować populację komarów przy użyciu RIDL&#160;, konieczne jest wyhodowanie dużej liczby wysokiej jakości osobników dorosłych płci męskiej13,14. Poniżej opisano metody masowej hodowli OX513A, szczepu RIDL&#160; Ae. aegypti 8, przeznaczonego do wypuszczenia, a także techniki niezbędne do produkcji jaj i masowej hodowli samców RIDL&#160; na potrzeby programu kontroli.

Oczekiwane wyniki przepoczwarzenia dla produkcji przedstawiono na Rysunku 4. Samce przepoczwarzają się jako pierwsze, osiągając szczyt w 8. dniu, natomiast samice osiągają szczyt w 9. dniu po wykluciu. Ważne jest zmierzenie tej krzywej przepoczwarzenia, aby wyznaczyć optymalny czas oddzielenia samców od samic.
Wyniki z ponad 6 miesięcy sortowania poczek męskich i żeńskich wskazują, że zanieczyszczenie osobnikami żeńskimi wynosi średnio 0,02% (Rysunek 5; SEM = 0,004%). Ten poziom zanieczyszczenia odpowiada zaledwie 400 samicom wypuszczonym w ciągu miesiąca wypuszczania (ok. dwóch milionów samców). Obecna tygodniowa produkcja jaj wynosi 4 miliony. Z tej liczby 3,5 miliona jest wykluwanych na potrzeby kolonii jajowej i produkcji, a pozostałe są przechowywane jako zapas. Około 11% jaj jest wykorzystywanych do kolonii produkującej jaja, a reszta do generacji przeznaczonej do wypuszczenia. Średni procent wyklucia jaj wynosi 87,3% (SEM = 0,5%), a uzyski poczek męskich z larw L1 średnio 29,5% (SEM = 1,2). Co tydzień w kolonii generacji przeznaczonej do wypuszczenia hodowanych jest dwa miliony larw, co daje około 571 000 poczek męskich (SEM = 14 000). Średnia śmiertelność poczek i dorosłych osobników podczas wykluwania i wypuszczania wynosi 5%, co skutkuje wypuszczeniem około 543 000 (SEM = 13 000) dorosłych samców komarów tygodniowo. Przewiduje się, że obecna produkcja 4 milionów jaj/tydzień mogłaby zostać zredukowana do ~3 milionów/tydzień dzięki dalszej optymalizacji w celu ograniczenia strat wynikających z marnotrawstwa i przechowywania. Do opisanej produkcji potrzeba łącznie 6 pracowników: czterech pracujących przy generacji przeznaczonej do wypuszczenia i pozostałych dwóch przy kolonii jajowej.

Kontrola jakości

Kontrola jakości jest niezbędna dla utrzymania jakości osobników dorosłych, efektywności hodowli, nakładów pracy oraz kosztów.

Kontrola fenotypu transgenu
W celu weryfikacji ekspresji genu RIDL przeprowadza się dwie kontrole: najpierw sprawdzaną jest ekspresja markera fluorescencyjnego, a następnie ekspresja cechy letalności RIDL wywołanej brakiem tetracykliny. Wszystkie larwy powinny wykazywać ekspresję markera fluorescencyjnego. Aby sprawdzić, czy marker fluorescencyjny jest wyrażany zgodnie z oczekiwaniami, 2 000 larw pierwszego stadium rozwojowego poddaje się oględzinom pod stereomikroskopem Leica MZFLIII z filtrem DsRed2 (Texas Red) w celu ustalenia, czy występują osobniki niefluorescencyjne. Bez tetracykliny gen RIDL ulega ekspresji, co przekłada się na oczekiwaną przeżywalność do stadium imago na poziomie 3-4%8. Aby to zweryfikować, dla każdej partii wypuszczonej przygotowuje się dodatkową taczkę bez tetracykliny. Jedyną różnicą w stosunku do standardowej hodowli jest redukcja ilości pokarmu o 2/3 od 6. dnia, ponieważ nagromadzenie nadmiaru pokarmu w wyniku zamierania larw może prowadzić do nadmiernego wzrostu bakterii.

Kontrola hodowli
Cztery tacki z generacji wypuszczalnej są losowo wybierane do osobnego sortowania i przeliczania. Każdego dnia z każdej tacki zapisywana jest liczba poczek męskich i żeńskich (Rysunek 4). Jakiekolwiek odchylenie od oczekiwanej liczby samców i samic wskazuje na potencjalny problem, który mógłby wpłynąć na produkcję i/lub kondycję, i może być porównane z kolonią jaj w celu pomocy w ustaleniu źródła problemów.

Pomiary poczwarek
Wykazano, że rozmiar pocieczek jest skorelowany z rozmiarem osobników dorosłych28. W ramach kontroli jakości rozmiaru dorosłych osobników mierzy się szerokość głowotułowia co najmniej 30 pocieczek samców dla każdego dnia sortowania z Generacji Uwalnianej; w przypadku Kolonii Produkcji Jaj mierzone są również pocieczki samic. Średnia szerokość głowotułowia wynosiła 1,05 mm (SEM 0,005) dla uwalnianych samców oraz odpowiednio 1,04 mm (SEM = 0,006) i 1,29 mm (SEM = 0,006) dla samców i samic w Kolonii Produkcji Jaj; podobne wyniki uzyskano podczas masowej hodowli Ae. albopictus24.
<img alt="Proces produkcji jaj i uwalniania samców; schemat przedstawia cykl życiowy i strategię masowego hodowli." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/3579/3579fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3579/3579fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Etapy masowej hodowli komarów do zastosowania w programie RIDL/SIT. Kolonia Produkcji Jaj podlega wysokiemu poziomowi kontroli jakości, aby zapewnić jakość jaj dostarczanych do generacji uwalnianej. Jaja są hodowane do stadium poczwarki w kolonii uwalnianej, gdzie samce są oddzielane od samic. Dorosłe samce są następnie wykorzystywane w programie kontroli RIDL.
<img alt="Diagram przepływu pracy w laboratorium z wyznaczonymi strefami roboczymi, regałami, zlewozmywakami, wózkami, zamrażarkami i punktami dostępu." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/3579/3579fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3579/3579fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Schemat zaplecza hodowlanego do produkcji samców RIDL na potrzeby programu wypuszczania. W pomieszczeniu kolonii produkcji jaj odbywa się ciągła produkcja jaj wysokiej jakości, które następnie są hodowane do stadium poczwarki w pomieszczeniu generacji wypuszczanej. Następnie larwy i poczwarki są rozdzielane, a poczwarki sortowane pod kątem płci w celu wyselekcjonowania samców. Samce są następnie umieszczane w urządzeniach do wypuszczania i pozostawiane do osiągnięcia stadium imago w pomieszczeniu do przechowywania i wypuszczania dorosłych osobników.
<img alt="Eksperyment rozdzielania płci komarów przy użyciu elektroforezy; schemat krok po kroku z opisanym zestawem." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/3579/3579fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3579/3579fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Rozdzielanie larw, poczeku samców i poczeku samic przy użyciu separatora płytowego26.  Separator płytowy wykorzystuje różnice w rozmiarach larw, poczeku samców i poczeku samic do sortowania tych trzech różnych stadiów rozwojowych; larwy są zazwyczaj mniejsze niż poczeku samców, które z kolei są mniejsze niż poczeku samic. Instrument składa się z dwóch szklanych płyt; jedna jest przymocowana do pochylonej metalowej ramy, a druga spoczywa na pierwszej płycie i może być przemieszczana względem niej za pomocą czterech śrub regulacyjnych (A). Cztery śruby regulacyjne pozwalają ustawić płytę zewnętrzną pod kątem względem płyty tylnej, tak aby między płytami powstała przestrzeń w kształcie klina, zwężająca się ku dołowi. Larwy i poczeku są wlewane pomiędzy szklane płyty (B) i delikatnie przemywane za pomocą węża wodnego (C). Poprzez regulację kąta nachylenia płyty można rozdzielić larwy, poczeku samców i poczeku samic (D). Przy ciągłym płukaniu i zwiększaniu kąta nachylenia płyty, w pierwszej kolejności można wypłukać larwy (do sita), następnie poczeku samców, a na koniec poczeku samic.
<img alt="Wykres procentu przepoczwarczenia w zależności od dni po wykluciu dla samców i samic; analiza biologii rozwoju." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/3579/3579fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3579/3579fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Krzywe przepoczwarzenia dla masowo hodowanych Ae. aegypti RIDL.  Wykres ten przedstawia średni procent przepoczwarzenia dla masowo hodowanych poczwarek samców i samic RIDL podczas 23-tygodniowej obserwacji, przy odzyskaniu ok. 135 000 poczwarek tygodniowo. Słupki błędu = standardowy błąd średniej, n = 23. Podczas pierwszej kolekcji (dzień 8) odzyskano średnio 59% poczwarek samców i 30% poczwarek samic z całkowitej liczby poczwarek zebranych z tacek w ciągu 5 dni.
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający procent zanieczyszczenia osobnikami żeńskimi od grudnia 2012 do maja 2012, trend spadkowy." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/3579/3579fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3579/3579fig5.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Średnie zanieczyszczenie osobnikami żeńskimi w posortowanych poczwarkach samców. Wykres przedstawia średni miesięczny procent zanieczyszczenia osobnikami żeńskimi podczas sortowania samców w 8. dniu po wykluciu w okresie sześciu miesięcy.
<img alt="Proces testowania materiałów z różnymi podłożami; laboratoryjna konfiguracja analizy sprzętu eksperymentalnego." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/3579/3579fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3579/3579fig6.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. System zasilania krwią z płytką aluminiową. Płytka (B) jest pokryta Parafilmem (A), krew jest pipetowana do kieszeni, a następnie uszczelniana (D). Płytka jest umieszczana w klatce i ogrzewana poprzez położenie ogrzanej poduszki żelowej (C) na górze (E).
<img alt="Obraz mikroskopowy larw owadów przedstawiający widok grzbietowy i brzuszny ze skalą dla porównania rozmiarów." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/3579/3579fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3579/3579fig7.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7. Rozróżnianie poczwarek samców i samic Ae. aegypti. Płeć poczwarek Ae. aegypti można wiarygodnie określić na podstawie różnic w kształcie płatów genitalnych (na końcu segmentów odwłoka poczwarki, tuż poniżej wiośieł). Dodatkowo samce mają tendencję do bycia mniejszymi od samic.
<img alt="wykres danych dotyczących karmienia larw; dzienna ilość pokarmu na larwę (mg) w ciągu 11 dni; analiza badawcza" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/3579/3579table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3579/3579table1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1. Ogólny schemat karmienia larw Ae. aegypti RIDL (mg pokarmu na larwę na dobę). Aby obliczyć rzeczywistą ilość wymaganego pokarmu, należy pomnożyć tę wartość przez całkowitą liczbę larw w tacy.

Aby osiągnąć supresję populacji Aedes aegypti przy użyciu systemu RIDL® (Release of Insects carrying a Dominant Lethal), konieczne jest uwolnienie dużych liczb samców komarów. Wymaga to zastosowania technik i technologii masowej hodowli w celu zapewnienia niezawodnych systemów pozwalających na uzyskanie maksymalnej liczby wysokiej jakości samców komarów.

Masowa produkcja genetycznie zmodyfikowanych Aedes aegypti do wypuszczeń w terenie w Brazylii

Poszukiwane są nowe techniki i metody, aby spróbować wygrać walkę z komarami. Niedawne postępy w technikach molekularnych doprowadziły do...

Kontrola populacji komarów Aegypti może być osiągnięta przy użyciu owadów posiadających modyfikację genetyczną, która powoduje śmierć ich potomstwa. Po wypuszczeniu samców na wolność, zapładniają one samice, natomiast potomstwo powstałe z tych kopul ginie. Kontrola populacji jest możliwa dzięki ciągłemu uwalnianiu genetycznie sterylnych samców.Gen powodujący śmierć może być kontrolowany poprzez dodanie antidotum do diety, co pozwala owadom z modyfikacją genetyczną przetrwać. Aby osiągnąć supresję populacji aegypti, przy użyciu genetycznie zmodyfikowanej linii komarów konieczne jest uwolnienie dużej liczby samców komarów.Wymaga to zastosowania technik hodowli masowej w celu uzyskania maksymalnej liczby samców komarów o najwyższej możliwej jakości i kondycji. Hodowlę masową OX 5 1 3 A można podzielić na trzy główne obszary: produkcję jaj, produkcję samców oraz wyklucie i dojrzewanie samców przed wypuszczeniem. Przedstawiony schemat obrazuje zaplecze hodowlane wykorzystywane do produkcji OX 5 1 3 A. W Moscamed w Brazylii w pomieszczeniu kolonii produkcyjnej nieprzerwanie produkowane są jaja wysokiej jakości.Jaja te są następnie hodowane aż do stadium poczwarki w obszarze produkcji samców, gdzie następnie przeprowadza się sortowanie poczwarek ze względu na płeć. Dla samców wydzielono specjalny obszar do kontroli jakości. Samce są następnie umieszczane w urządzeniach do wypuszczania, gdzie mogą się wykluć i dojrzeć przed zwolnieniem na wolność.Techniki przedstawione w tym filmie mają zastosowanie w obszarach produkcji jaj oraz produkcji samców. W celu uzyskania jaj do produkcji samców stosujemy sztuczne karmienie błony przy użyciu krwi zwierzęcej pochodzącej z lokalnej rzeźni. Materiały niezbędne do tego procesu to biofilm oraz płytka anin o powierzchni około 10 cm² z wypukłym wzorem bieżnika.Po jednej stronie znajduje się krew oraz woreczek wypełniony około 250 gramami ziaren pszenicy. System podawania pokarmu z płytki wykorzystuje parafilm jako membranę, przez którą żywią się komary, aby stymulować pobieranie pokarmu. Parafilm jest rozciągnięty nad ludzką skórą.Następnie paraformę ostrożnie rozciąga się, aby zmniejszyć jej grubość. Stronę z wzorem płytki aluminiowej pokrywa się paraformą z trzech stron, dbając o to, aby nie uszkodzić paraformy i starannie uszczelnić krawędzie. Następnie przez otwartą stronę płytki i paraformy dodaje się krew.Do karmnika wlewa się krew do około jednej trzeciej jego objętości. Następnie biofilm zostaje starannie uszczelniony, aby zapobiec wyciekowi krwi. Płytki karmnika z krwią są następnie umieszczane na górnej części klatek dla osobników dorosłych.Workowce z granulatem są podgrzewane w kuchence mikrofalowej przez 10 sekund, a następnie kładzie się je na płytce w celu podgrzania krwi. W razie potrzeby workowiec można ponownie podgrzewać co 10 do 15 minut. Miejsce do badania kontrolnego (FU) jest udostępniane trzy dni po karmieniu krwią.Miejscem składania jaj są papierowe filtry umieszczone w okrągłym plastikowym pojemniku wypełnionym do połowy wodą. Umieść miejsce składania jaj w klatce dla osobników dorosłych, aby samice mogły złożyć jaja. Po dwóch dniach wyjmij papier z jajami i przełóż go na papier chłonny w celu wysuszenia w warunkach insektarium.Po wyschnięciu jaja usuwa się z papieru. Za pomocą pędzla delikatnie przenosi się jaja do dużej tacy, uważając, aby ich nie uszkodzić. Aby uniknąć zbyt silnego nacisku, jaja przepuszcza się przez sito w celu usunięcia martwych owadów i innych zanieczyszczeń, co pomaga zapobiec powstawaniu pleśni.W celu dokładniejszego przeliczania jaj według masy, wysuszone jaja rozdziela się na alikwoty o masie 1 g. Odpowiada to 100 000 jaj. Przy użyciu wagi analitycznej jaja przenosi się do małych plastikowych pojemników, w których mogą być przechowywane w warunkach insektarium do sześciu tygodni.W celu wykluwania jaj przygotowuje się słoiki, do których wlewa się przegotowaną wodę, zamyka pokrywkę i pozostawia do ostygnięcia. Pozwala to na zmniejszenie zawartości tlenu w wodzie, co indukuje wyklucie się jaj. Do słoika dodaje się jeden gram jaj i ponownie zamyka pokrywkę.Przez jedną godzinę przenosić zawartość słoika do kuwety z dwoma litrami wody i pozostawić na noc w warunkach insekterium. Dzień po wykluciu larwy należy oddzielić od kuwety, przeciskając je przez sito ze stali nierdzewnej o rozmiarze oczek 200.Średnica otworów w sicie wynosi około 0,075 milimetra. Następnie larwy umieszcza się w zlewce o pojemności dwóch litrów. Zlewkę dopełnia się wodą do poziomu dwóch litrów.Umieść zlewkę na mieszadle magnetycznym i dodaj duży mieszalnik magnetyczny. Ustaw prędkość mieszania tak, aby odpowiednio wymieszać larwy, ale nie zbyt szybko. Ponieważ zbyt intensywne mieszanie może spowodować uszkodzenia, proces ten należy przeprowadzić w możliwie najkrótszym czasie, aby zapobiec uszkodzeniom w ramach kontroli jakości.Wskaźnik wykluwalności określa się po inkubacji jaj w wyciągu przez jedną godzinę, a następnie następnego dnia, przenosząc trzy alikwoty o objętości 1 mL na biały kawałek papieru chłonnego z gąbką absorpcyjną. Pod papierem chłonnym znajduje się siatka kwadratów służąca do liczenia. Należy policzyć liczbę wyklutych i niewyklutych jaj z trzech różnych pól siatki.Wylęgłe jajo jest łatwe do zidentyfikowania. Ponieważ z górnej części jaja brakuje czepka, spodziewamy się wskaźnika wylęgu na poziomie około 80 do 90%. Średnia liczba larw na 1 ml jest wykorzystywana do obliczenia objętości wody, którą należy dodać do każdej tacy. Aby uzyskać pożądaną liczbę larw na tacę, należy pobrać trzy alikwoty po 1 ml każda i umieścić je w oddzielnych szalkach Petriego.Dodaj kolejne 10–20 ml wody, aby rozproszyć larwy w celu łatwiejszego ich policzenia. Policz larwy, wykorzystując czarne tło, ponieważ larwy są białe, co ułatwia zliczanie. Do rejestracji zaleca się użycie licznika, pipety oraz pewnej ręki.Całkowita liczba larw na tysiąc, odpowiednia objętość wody i larwy są następnie rozdzielane do kubków. Należy uważać, aby pobierać larwy z tego samego miejsca w zlewce. Za każdym razem larwy są następnie dodawane do kuwet, które zostały uprzednio napełnione wodą.Tace zawierają odtrutkę tetracyklinę w stężeniu 30 µg/ml. Gęstość larw w tacy musi zostać zoptymalizowana pod kątem głębokości, powierzchni oraz rozmiaru osobników dorosłych. Ustaliliśmy, że optymalna gęstość wynosi od jednej do trzech larw na ml.Do karmienia larw używamy pokarmu dla ryb w płatkach. Pokarm jest rozdrabniany w blenderze. Aby uzyskać jednorodny, drobny proszek, na każdym etapie rozwoju wymagane są nieco inne ilości pokarmu.Dieta została zoptymalizowana dla każdego dnia i w celu zmniejszenia nakładu pracy na każdą taczkę stosowana jest określona waga pokarmu. Zaprojektowaliśmy i wykonaliśmy łyżki wolumetryczne, które pozwalają na łatwe i wydajne dozowanie wymaganej ilości pokarmu. U samców pierwsze oznaki dojrzałości pojawiają się w siódmym dniu, a do ósmego dnia około 70% samców osiągnie ten stan.Samiczki pupują później niż samczyki, jednak w ósmym dniu wciąż obecna jest znaczna liczba samic. Sortowanie samców pupu odbywa się w ósmym i dziewiątym dniu. Aby odzyskać maksymalną możliwą liczbę samców PPE, zawartość tacy należy przesiać i przelać do dzbanka w celu przygotowania do sortowania płytek.Separator wykorzystuje różnice morfologiczne i wielkościowe między larwami a samcami i samicami w celu ich rozdzielenia. Instrument składa się z dwóch równoległych szklanych płyt. Płytę zewnętrzną można przesuwać do przodu i do tyłu za pomocą czterech śrub regulacyjnych.Śruby regulacyjne pozwalają na ustawienie zewnętrznej płyty pod kątem, dzięki czemu między płytami powstaje przestrzeń w kształcie klina, zwężająca się ku dołowi. Separator płyt jest ustawiony z pojemnikiem pod spodem w celu zbierania wody. Larwy i małże z tacy są wlewane do górnej części separatora płyt, pomiędzy szklane płyty.Samicie pope są większe od samców pope i oddzielają się nad nimi. Larwy mają spłaszczony kształt i są cieńsze niż samce pube; oddzielają się one niżej poprzez płukanie wodą i regulację kąta nachylenia. Larwy oraz samce i samice pube można oddzielić dalej, stosując ciągłe płukanie i regulując kąt nachylenia płytki. Za pomocą dolnych śrub regulacyjnych larwy można wypłukać do pojemnika.Naczynie z larwami zostaje usunięte, a pod separator płyty wstawia się nowe naczynie. Następnie można spłukać samce puy do nowego naczynia. Należy uważać, aby nie spłukać żadnych samic puy wraz z samcami.Należy usunąć pojemnik z samicą i zastąpić go nowym. Następnie samice zostają przeniesione do świeżego pojemnika. Samice poddawane są kontroli jakości w celu wykluczenia zanieczyszczenia osobnikami męskimi.Po sortowaniu pobiera się trzy alikwoty po 500 męskich poczwarek i pod mikroskopem zlicza liczbę obecnych wśród nich samic. Samice można zidentyfikować po kształcie płata genitalnego. Płat genitalny samicy jest znacznie mniejszy i bardziej zaokrąglony niż u samca.Jeśli odsetek samic przekracza 1%, partia powinna zostać ponownie posegregowana i sprawdzona. Posegregowane młode samce są umieszczane w urządzeniach wypuszczających, aby mogły się wykluć i dojrzeć przed zwolnieniem do środowiska naturalnego. Wyniki z ponad sześciomiesięcznego sortowania samców i samic.Pupi wykazali, że średnie zanieczyszczenie osobnikami żeńskimi wynosiło 0,02%. Ten poziom zanieczyszczenia odpowiada zaledwie 400 osobnikom żeńskim uwalnianym każdego miesiąca. Wykres ten przedstawia średnie dane dotyczące przepoczwarzenia samców i samic w ciągu sześciomiesięcznego okresu produkcji. Samce przepoczwarzają się głównie ósmego dnia, a samice dziewiątego dnia.Zmierzono i porównano wielkość poczwarek, określając szerokość klatki piersiowej za pomocą zdjęć poczwarek pływających w wodzie, wykorzystując skalę w postaci greika. Samce są konsekwentnie mniejsze od samic, przy bardzo niewielkim nakładaniu się rozmiarów, co wskazuje na osiągnięcie jednolitych parametrów hodowlanych w zakładzie produkcji jaj. Na obszarze około 19 metrów kwadratowych, w sekcji produkcji samców, produkowano ponad 4 miliony jaj tygodniowo.Średnio w każdym tygodniu wyprodukowano 571 000 osobników męskich. Wydajność produkcji od jaja do posegregowanych poczwerek męskich wynosiła około 26%. Część osobników męskich utracono podczas wykluwania, a całkowita liczba wypuszczonych samców tygodniowo wynosiła średnio 543 000.

mass-production-genetically-modified-aedes-aegypti-for-field-releases

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Masowa produkcja genetycznie zmodyfikowanych Aedes aegypti dla uwolnienia w terenie w Brazylii

W tym filmie Nijole Jasinskiene prezentuje metodologię wykorzystywaną do tworzenia transgenicznych komarów Aedes aegypti, które są wektorami gorączki Denga. Przedstawione zostają techniki prawidłowego przygotowania igieł do mikroiniekcji, wysuszania embrionów oraz przeprowadzania mikroiniekcji.

Mikroiniekcja zarodków A. aegypti w celu uzyskania transgenicznych komarów

W tym szczerym wywiadzie Anthony A. James wyjaśnia, w jaki sposób genetyka komarów może zostać wykorzystana do kontrolowania transmisji malarii i dengi. Przedstawiono strategię zastępowania populacji, opierającą się na założeniu, że do środowiska naturalnego można wprowadzić transgeniczne komary w celu ograniczenia rozprzestrzeniania się chorób, a także omówiono koncepcję napędu genetycznego oraz kryteria projektowania skutecznego systemu napędu genetycznego. Omówiono również kwestie etyczne...

Zapobieganie rozprzestrzenianiu się malarii i dengi z wykorzystaniem genetycznie zmodyfikowanych komarów

Śródziemnomorska muszka owocowa (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) jest światowym szkodnikiem rolnictwa. Głębsze zrozumienie jego biologii jest kluczem do kontrolowania populacji medfly, a tym samym zmniejszenia wpływu na gospodarkę. Mikroiniekcja zarodka jest podstawowym narzędziem umożliwiającym zarówno transformację linii zarodkowej, jak i odwrotne badania genetyczne u tego gatunku.

Dostarczanie kwasów nukleinowych poprzez mikroiniekcję zarodka u światowej populacji szkodników rolniczych, Ceratitis capitata

Komary Aedes aegypti zakażone Wolbachią są uwalniane do naturalnych populacji w celu zahamowania transmisji arbowirusów. Opisujemy metody hodowli Ae. aegypti z infekcjami Wolbachia w laboratorium do eksperymentów i uwolnienia w terenie, podejmując środki ostrożności w celu zminimalizowania adaptacji i selekcji laboratoryjnej.

Utrzymywanie komarów Aedes aegypti zakażonych Wolbachia

Technika sterylnych owadów (SIT) jest używana do kontrolowania określonych, ważnych z medycznego punktu widzenia populacji komarów, które mogą być odporne na chemiczne kontrole. W tym miejscu opisujemy metodę masowego chowu i przygotowania bezpłodnych samców komarów do wypuszczenia na wolność w operacyjnym programie SIT ukierunkowanym na komara Aedes aegypti.

Przygotowanie napromieniowanych i oznakowanych samców komarów Aedes aegypti do uwolnienia w operacyjnym programie techniki sterylnych owadów

Tutaj prezentujemy protokół badania konkurencyjności godowej samców Aedes aegypti przy użyciu barwnika fluorescencyjnego jako markera. Samice komarów są narażone na kontakt zarówno z oznaczonymi, jak i nieoznaczonymi samcami w celu kopulacji. Po kryciu ich plemniki są badane pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu określenia ich partnera godowego.

Wykorzystanie barwnika fluorescencyjnego, rodaminy B, do badania konkurencyjności godowej samców komarów Aedes aegypti

Przedstawione tutaj protokoły ilustrują trzy alternatywne sposoby oceny wydajności genetycznie modyfikowanych komarów przeznaczonych do kontroli wektorów w laboratoryjnych próbach z małymi klatkami. Każdy protokół jest dostosowany do konkretnej modyfikacji, jaką niesie ze sobą szczep komarów (napęd genowy lub nie-genowy) oraz rodzajów mierzonych parametrów.

Badania laboratoryjne w małych klatkach genetycznie modyfikowanych komarów anofeliny

Techniki mikroiniekcji są niezbędne do wprowadzenia egzogennych genów do genomów komarów. Protokół ten wyjaśnia metodę stosowaną przez laboratorium Jamesa do mikrowstrzykiwania konstruktów DNA do embrionów Anopheles gambiae w celu wygenerowania przekształconych komarów.

Metoda mikroiniekcji dla zarodków Anopheles gambiae

Grzyby entomopatogeniczne zyskały na znaczeniu jako środki biologicznej kontroli szkodników rolniczych. W tym badaniu z powodzeniem przeprowadzono masową produkcję wystarczającej liczby odpornych zakaźnych propagul południowoafrykańskich izolatów zarówno Metarhizium robertsii, jak i M. pinghaense do komercyjnego stosowania przeciwko szkodnikom owadzim, przy użyciu rolnych produktów zbożowych.

Masowa produkcja grzybów entomopatogenicznych, Metarhizium robertsii i Metarhizium pinghaense, do komercyjnego stosowania przeciwko szkodnikom owadzim

Obecny protokół opisuje, jak mierzyć dane dotyczące typowych parametrów życia komarów Aedes aegypti, w tym płodności, rozmiaru skrzydeł, płodności, stosunku płci, żywotności, czasu rozwoju, wkładu samców i długowieczności dorosłych. Pomiary te można wykorzystać do oceny przydatności komarów transgenicznych.

Ilościowe określanie kosztów przystosowania u transgenicznych komarów Aedes aegypti

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół edycji genomu poprzez mikroiniekcję embrionalną u komara A. aegypti przy użyciu technologii CRISPR-Cas9.

Edycja genomu u komara Aedes aegypti z żółtą febrą przy użyciu CRISPR-Cas9

Poznaj techniki masowej hodowli genetycznie zmodyfikowanych samców Aedes aegypti w systemie RIDL® w Brazylii. Metoda obejmuje sztuczne karmienie, sortowanie płciowe i kontrolę jakości dla skutecznej supresji populacji.

Masowa produkcja genetycznie zmodyfikowanych Aedes aegypti do wypuszczeń w terenie w Brazylii

Przeglądaj więcej filmów