Name: Oznaczanie aktywności fagocytarnej klinicznych próbek przeciwciał (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Poznaj metodę oznaczania aktywności fagocytarnej przeciwciał z próbek klinicznych przy użyciu cytometrii przepływowej. Technika wykorzystuje fluorescencyjne kuleczki pokryte antygenem i linię komórek monocytowych THP-1.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować za finansowanie z grantu NIH 3R01AI080289-02S1 oraz stypendium Harvard University Center for AIDS Research Scholar Fellowship w ramach grantu NIH/NIAID 2P30AI060354-07.

1. Hodowla komórek fagocytujących
<ol>
<li>Hodować komórki THP-110 w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej jako zawiesinę stacjonarną w kolbach typu T. Gęstość komórek powinna być utrzymywana poniżej 0,5x106/mL, aby zapewnić stałe poziomy ekspresji FcγR oraz powtarzalność wyników analizy.</li>
</ol>
2. Przygotowanie biotynilowanego antygenu
<ol>
<li>Obliczyć ilość zestawu odczynników do biotinylacji sulfo-NHS LC niezbędną do biotinylacji badanego antygenu docelowego zgodnie z instrukcją producenta.</li>
<li>Rozpuścić odczynnik do biotinylacji w wodzie i bezzwłocznie dodać obliczoną ilość do antygenu w buforze niezawierającym amin pierwszorzędowych. Pozostawić reakcję na 1 godzinę w temperaturze pokojowej, okazjonalnie mieszając.</li>
<li>Usunąć nadmiar nie sprzężonej biotyny poprzez wymianę buforu w odśrodkowej jednostce koncentrującej Amicon o odpowiednim progu odcięcia masy cząsteczkowej (molecular weight cutoff), aby zatrzymać antygen docelowy. Dodać próbkę do górnej komory jednostki koncentrującej i dolać PBS, aby zwiększyć całkowitą objętość do linii wypełnienia 15 mL. Odwirować przy 4000 x g, aby zmniejszyć objętość do około 1,5 mls. Powtórzenie tego procesu dwukrotnie usunie 99% wolnej biotyny, co zapewni maksymalne pokrycie kulek antygenem.</li>
</ol>
3. Przygotowanie kulek nasyconych antygenem
<ol>
<li>Wymyć 100 μl fluorescencyjnych kulek neutravidyny o stężeniu 1 mm dwukrotnie w 1 ml 0,1% PBS-BSA po odwirowaniu w mikrowirówce przy wysokiej prędkości. Ponownie zawiesić wymyte kulki w 100 μl PBS-BSA i podzielić na 10 probówek.</li>
<li>W celu określenia warunków powlekania antygenem, które nasycą kulki, połączyć 10 μl zawiesiny wymytych kulek z różnymi stężeniami biotynilowanego antygenu w dwukrotnych rozcieńczeniach. Inkubować przez noc w temperaturze 4°C w probówce do mikrowirówki na rotatorze.</li>
</ol>
UWAGA: Stopień nasycenia kulek musi zostać określony eksperymentalnie. Można to osiągnąć poprzez zidentyfikowanie warunków powlekania kulek, które zapewniają maksymalną fagocytozę, gdy kulki zostaną następnie opsonizowane kontrolnym przeciwciałem monoklonalnym.
<ol start="3">
<li>Usuń niezwiązany antygen, przemywając go 1 mL PBS-BSA, a następnie odwiruj z dużą prędkością aż do osadzenia kulek. Usuń PBS-BSA i powtórz czynność.</li>
<li>Resuspenduj kulki pokryte antygenem w końcowej objętości 1 ml PBS-BSA. Kulki można przechowywać do tygodnia w temperaturze 4°C przed użyciem.</li>
</ol>
4. Przygotowanie próbek przeciwciał
<ol>
<li>Kliniczne próbki przeciwciał można oczyścić z osocza, korzystając z zestawu do oczyszczania IgG Melon gel zgodnie z instrukcjami producenta. Oczyszczone IgG można przechowywać w temperaturze 4°C do momentu użycia.</li>
</ol>
UWAGA: Należy zawsze przestrzegać odpowiednich środków ostrożności podczas pracy z próbkami pochodzenia ludzkiego.
<ol start="2">
<li>Wyznaczyć stężenie oczyszczonych przeciwciał poprzez pomiar absorbancji przy A280, a następnie rozcieńczyć próbki do stężenia 1 mg/ml w PBS.</li>
<li>Przygotować pozytywne i negatywne przeciwciała kontrolne monoklonalne poprzez rozcieńczenie do stężenia 1 mg/ml w PBS.</li>
</ol>
5. Wysiewanie eksperymentu
<ol>
<li>Resuspender przygotowany wcześniej roztwór wypłukanych i nasyconych antygenem kulek poprzez mieszanie w wortexie, a następnie przenieść 10 μl do każdego dołka płytki 96-dołkowej z dnem okrągłym. Należy dbać o ciągłe mieszanie zawiesiny kulek, aby do każdego dołka trafiła taka sama liczba kulek fluorescencyjnych.</li>
<li>Do każdego dołka dodać przeciwciała o różnych stężeniach, tworząc krzywą zależności odpowiedzi od dawki dla każdego przeciwciała. Optymalne stężenia będą się różnić w zależności od miana przeciwciał obecnych w próbkach, jednak zakres końcowych stężeń od 0,01 do 100 μg/ml zapewni odpowiedni zakres i pozwoli na zidentyfikowanie interesującego przedziału stężeń. Należy upewnić się, że przeciwciała są dodawane w objętościach nieprzekraczających 20 μl.</li>
<li>Inkubować kulki i próbki przeciwciał przez 2 godziny w temperaturze 37°C, aby umożliwić opsonizację kulek przez przeciwciała.</li>
<li>Przygotować zawiesinę komórek THP-1 o stężeniu 2,5 x 105 komórek/ml i dodać 200 μl tej zawiesiny do każdego dołka, tak aby w każdym dołku znalazło się łącznie 5 x 104 komórek THP-1.</li>
<li>Inkubować przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2 w inkubatorze stacjonarnym, pozwalając komórkom i kulkom osadzić się pod wpływem grawitacji.</li>
</ol>
UWAGA: Stosunek sygnału do szumu można poprawić poprzez wyznaczenie optymalnych proporcji kulek:przeciwciał:komórek THP-1 dla danego antygenu i źródła przeciwciał.
6. Analiza cytometryczna
<ol>
<li>Odssać 100 μl supernatantu z każdej studni, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Supernatant można zachować, jeśli planowane jest oznaczanie sekrecji cytokin lub inne analizy.</li>
<li>W celu utrwalenia dodać 100 μl 4% paraformaldehydu do każdej studni, a następnie pipetować w celu resuspensji i wymieszania komórek.</li>
<li>Analizę cytometryczną wysokoprzepustową można przeprowadzić przy użyciu urządzenia BD LSR II wyposażonego w czytnik płytek HTS.</li>
<li>Zaprogramować oprogramowanie tak, aby mieszać każdą studnię trzykrotnie (objętość mieszania 100 μl) i analizować 30 μl lub co najmniej 2000 zdarzeń komórkowych z każdej próbki.</li>
<li>Zebrane dane można analizować w programie FlowJo lub równoważnym oprogramowaniu. Przydatne wskaźniki obejmują procent komórek bead+ lub fluorescencyjnych, co pozwala określić liczbę obecnych komórek fagocytujących, a także intensywność fluorescencji komórek fagocytujących, co pozwala określić liczbę sfagocytowanych kulek. Pomnożenie tych wartości pozwala uzyskać zintegrowaną średnią intensywność fluorescencji (iMFI).</li>
<li>Średnią liczbę kulek sfagocytowanych przez każdą komórkę fagocytującą można obliczyć, dzieląc iMFI przez średnią fluorescencję jednej kulki.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
Powinno wystąpić wyraźne rozróżnienie próbek przeciwciał pochodzących od osób chorych i zdrowych. Rysunek 1A przedstawia histogramy FACS z próbki przeciwciał od osoby HIV-ujemnej (linia czarna) oraz HIV-dodatniej (linia szara) i wykazuje zwiększoną fagocytozę indukowaną obecnością przeciwciał specyficznych dla antygenu.
Optymalna czułość testu zależy od nasycenia kulek antygenem biotynilowanym. Rycina 1B przedstawia fagocytozę zaobserwowaną w przypadku kulek pokrytych różnymi ilościami antygenu, które zostały opsonizowane trzema kontrolnymi przeciwciałami monoklonalnymi (w tym przeciwciałem niewiążącym, trójkąty), co pozwoliło ustalić stężenie 2μg antygenu/μl kulek jako stężenie nasycające dla tego antygenu.
Krzywa zależności dawka-odpowiedź została przedstawiona na rysunku 2 i wykazuje zróżnicowaną zdolność badanych próbek przeciwciał do indukowania fagocytozy w zakresie stężeń przeciwciał od 0,05-5 μg/ml. Ta zróżnicowana fagocytoza może wynikać z różnic w mianie lub właściwościach domeny Fc, takich jak podklasa IgG i stan glikozylacji.
Podczas obrazowania komórek THP-1 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej widoczne są wyraźne dowody na fagocytozę kulek. Rysunek 3 przedstawia dwa nieruchome obrazy komórek THP-1 przy powiększeniu 63x po inkubacji z kuleczkami opsonizowanymi przeciwciałem (zielone) oraz nieopsonizowanymi (czerwone), co demonstruje brak wychwytu fagocytarnego w przypadku braku przeciwciał. W przypadku zastosowania mikroskopii poklatkowej specyficzny dla przeciwciał wychwyt fagocytarny fluorescencyjnych kulek jest jeszcze bardziej uderzający (Film 1, powiększenie 20x).
Wcześniejsze prace potwierdziły internalizację kulek związanych z komórkami, a eksperymenty z monocytami pierwotnymi były zgodne z wynikami fagocytozy (wartości iMFI) w tym wysokoprzepustowym teście (dane nie zostały przedstawione).
<img src="/files/ftp_upload/3588/3588fig1.jpg" alt="Wykresy cytometrii przepływowej; powlekanie antygenem vs fagocytoza; % maksymalnego sygnału, analiza danych MFI." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. 
Kontrola jakości testu. 1A: Histogramy cytometrii przepływowej dla fagocytozy w próbce przeciwciał od osoby HIV-ujemnej (linia czarna) oraz osoby HIV-dodatniej (linia szara). 1B: Doświadczalne określenie optymalnych warunków powlekania kulek dla próbki antygenu. Monoklonalne przeciwciała specyficzne dla antygenu (koło, kwadrat) wykazują maksymalną fagocytozę kulek powlekanych ilością &gt;2 μg antygenu/μl kulek, podczas gdy przeciwciało kontrolne (trójkąt) nie wykazuje aktywności fagocytycznej.
<img src="/files/ftp_upload/3588/3588fig2.jpg" alt="Wykres wyniku fagocytozy w funkcji stężenia przeciwciał; cztery porównania grup badawczych; badanie immunologiczne." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. 
Krzywa zależności odpowiedzi fagocytozy od dawki. Kliniczne próbki przeciwciał od osób HIV-dodatnich (leczonych, nieleczonych oraz wykazujących kontrolę replikacji wirusa bez terapii antyretrowirusowej) i HIV-ujemnych w różny sposób stymulują fagocytozę kulek pokrytych gp120 (otoczką HIV).
<img src="/files/ftp_upload/3588/3588fig3.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej kultur komórkowych z zielonymi i czerwonymi markerami, wskazującymi na aktywność komórkową." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. 
Efektywna internalizacja. Mikroskopia potwierdza internalizację kulek opsonizowanych przeciwciałami (zielone), podczas gdy kuleczki nieopsonizowane pozostają w roztworze (powiększenie 63x).
Film 1. Mikroskopia poklatkowa fagocytozy indukowanej przeciwciałami była prowadzona przez 14 godzin i umożliwia wizualizację aktywności fagocytycznej komórek THP-1 wykorzystanych w teście wysokoprzepustowym. Zielone fluorescencyjne kuleczki są opsonizowane przeciwciałami, natomiast czerwone fluorescencyjne kuleczki stanowią kontrolę negatywną. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3588/3588movie1.mov">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.</a>

<ol><li>Cartron, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+activity+of+humanized+anti-CD20+monoclonal+antibody+and+polymorphism+in+IgG+Fc+receptor+FcgammaRIIIa+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Therapeutic activity of humanized anti-CD20 monoclonal antibody and polymorphism in IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene.</a> Blood. 99, 754-758 (2002).</li>
<li>Ahmad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+correlation+between+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity-mediating+anti-HIV-1+antibodies+and+prognostic+predictors+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a correlation between antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediating anti-HIV-1 antibodies and prognostic predictors of HIV infection.</a> J. Clin. Immunol. 21, 227-233 (2001).</li>
<li>Hashimoto, G., Wright, P. F., Karzon, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+against+influenza+virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against influenza virus-infected cells.</a> J. Infect Dis. 148, 785-794 (1983).</li>
<li>Anthony, R. M., Nimmerjahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th%09%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Th	.</a> Curr. Opin. Organ Transplant. , (2010).</li>
<li>Takai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+receptors+and+their+role+in+immune+regulation+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fc receptors and their role in immune regulation and autoimmunity.</a> J. Clin. Immunol. 25, 1-18 (2005).</li>
<li>Jefferis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+therapeutics%3A+isotype+and+glycoform+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Antibody therapeutics: isotype and glycoform selection.</a> Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 1401-1413 (2007).</li>
<li>Halstead, S. B., O'Rourke, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+viruses+and+mononuclear+phagocytes.+I.+Infection+enhancement+by+non-neutralizing+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Dengue viruses and mononuclear phagocytes. I. Infection enhancement by non-neutralizing antibody.</a> J. Exp. Med. 146, 201-217 (1977).</li>
<li>Subramaniam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+absence+of+serum+IgM+enhances+the+susceptibility+of+mice+to+pulmonary+challenge+with+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The absence of serum IgM enhances the susceptibility of mice to pulmonary challenge with Cryptococcus neoformans.</a> J. Immunol. 184, 5755-5767 (2010).</li>
<li>Ackerman, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust%2C+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> J. Immunol. Methods. 366, 8-19 (2011).</li>
<li>Tsuchiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1.</a> Int. J. Cancer. 26, 171-176 (1980).</li>
<li>Ward, E. S., Ghetie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effector+functions+of+immunoglobulins%3A+implications+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The effector functions of immunoglobulins: implications for therapy.</a> Ther. Immunol. 2, 77-94 (1995).</li>
<li>Winiarska, M., Glodkowska-Mrowka, E., Bil, J., Golab, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+the+antitumor+effects+of+anti-CD20+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of the antitumor effects of anti-CD20 antibodies.</a> Front. Biosci. 16, 277-306 (2011).</li>
<li>Takai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+receptors%3A+their+diverse+functions+in+immunity+and+immune+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Springer+Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Fc receptors: their diverse functions in immunity and immune disorders.</a> Springer Semin. Immunopathol. 28, 303-304 (2006).</li>
<li>Yamaguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoform-dependent+conformational+alteration+of+the+Fc+region+of+human+immunoglobulin+G1+as+revealed+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Glycoform-dependent conformational alteration of the Fc region of human immunoglobulin G1 as revealed by NMR spectroscopy.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1760, 693-700 (2006).</li>
<li>Anthony, R. M., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+the+IgG+Fc+glycan%3A+the+anti-inflammatory+activity+of+sialylated+IgG%5BTitle%5D)+AND+%22Fcs.+J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A novel role for the IgG Fc glycan: the anti-inflammatory activity of sialylated IgG.</a> Fcs. J. Clin. Immunol. 30, Suppl 1. S9-S14 (2010).</li>
<li>Nimmerjahn, F., Anthony, R. M., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agalactosylated+IgG+antibodies+depend+on+cellular+Fc+receptors+for+in+vivo+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Agalactosylated IgG antibodies depend on cellular Fc receptors for in vivo activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8433-8437 (2007).</li>
<li>Marchette, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+immune+status+on+dengue+2+virus+replication+in+cultured+leukocytes+from+infants+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Effect of immune status on dengue 2 virus replication in cultured leukocytes from infants and children.</a> Infect. Immun. 24, 47-50 (1979).</li>
<li>Fust, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralizing+and+enhancing+antibodies+measured+in+complement-restored+serum+samples+from+HIV-1-infected+individuals+correlate+with+immunosuppression+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Neutralizing and enhancing antibodies measured in complement-restored serum samples from HIV-1-infected individuals correlate with immunosuppression and disease.</a> AIDS. 8, 603-609 (1994).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Opisany tutaj test umożliwia wysokoprzepustową analizę aktywności fagocytycznej klinicznych próbek przeciwciał z wykorzystaniem linii komórek monocytarnych, długo stosowanej do badania procesów fagocytozy10, oraz automatycznej cytometrii przepływowej w płytkach. Test ten ma przewagę nad innymi metodami dzięki zdolności do precyzyjnej charakterystyki podzbiorów przeciwciał specyficznych dla antygenu, co pozwala nie tylko na badanie różnic w fagocytozie indukowanej przez przeciwciała specyficzne dla danej choroby u różnych osób, ale także na badanie wielu swoistości antygenowych u tego samego pacjenta. Ponieważ rekrutacja wrodzonych komórek efektorowych przez przeciwciała, w tym monocytów i innych komórek prezentujących antygen, silnie wpływa na wynik choroby11-13 i jest zmienna biologicznie w zależności od geometrii przeciwciała, podklasy IgG oraz glikozylacji asparaginy 297 w domenie Fc14-16, metoda ta umożliwia ocenę krytycznego mechanizmu działania przeciwciał. Ponadto, ponieważ fagocytoza pośredniczona przez przeciwciała jest wykorzystywana przez niektóre patogeny w przebiegu infekcji7,17,18, test ten daje nadzieję na ocenę procesu wzmocnienia zależnego od przeciwciał (antibody-dependent enhancement) i podkreśla dwoistą naturę fagocytozy jako potencjalnie ochronnej, a zarazem potencjalnie szkodliwej aktywności przeciwciał.
Opisany test może być wykorzystany do analizy przeciwciał z próbek klinicznych populacji pacjentów, a także osób zaszczepionych, i może zostać dostosowany do wykorzystania surowicy zamiast oczyszczonego IgG. Ponadto, sekrecję cytokin w odpowiedzi na fagocytozę można analizować w nadsączu hodowli, a wpływ konkretnych FcR można określić za pomocą przeciwciał blokujących FcR, co pozwala na ustalenie nie tylko różnic w potencjale fagocytarnym, ale także późniejszych zdarzeń sygnalizacyjnych, dając wgląd w mechanizm, co może pomóc w wyjaśnieniu i doprecyzowaniu zrozumienia tego mechanizmu odpornościowego.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do biotynylacji EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>&lt;p&gt;21935&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Wirówkowy moduł filtrujący Amicon Ultra-15 z membraną Ultracel-50</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC905024</td><td>Rozmiar modułu filtrującego może się różnić w zależności od wielkości antygenu</td></tr><tr><td>Mikrosfery FluoSpheres znakowane NeutrAvidyną, 1,0 &amp;mu;m, fluorescencyjne żółto-zielone (505/515)</td><td>Invitrogen</td><td>F-8776</td><td>Producenci oferują ten produkt w różnych kolorach</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania IgG Melon Gel IgG Purification Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>45212</td><td>Należy zadbać o weryfikację czystości próbek Ab za pomocą SDS-PAGE.</td></tr></tbody></table>

oznaczanie aktywności fagocytarnej próbek przeciwciał klinicznych

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Fagocytoza indukowana przeciwciałami jest wywoływana poprzez zaangażowanie receptorów Fc na wyspecjalizowanych fagocytach i może przyczyniać się zarówno do eliminacji, jak i do patologii choroby. Podczas gdy właściwości domen zmiennych przeciwciał od dawna są uważane za krytyczne dla funkcji in vivo, zdolność przeciwciał do rekrutacji komórek odporności wrodzonej poprzez ich domeny Fc jest coraz bardziej doceniana jako kluczowy czynnik ich skuteczności, zarówno w kontekście terapii rekombinowanymi przeciwciałami monoklonalnymi, jak i w przebiegu naturalnej infekcji lub szczepienia1-3.
Co istotne, pomimo nazwy wskazującej na stałą domenę, domena Fc przeciwciała nie wykazuje stałej funkcji i jest silnie modulowana przez podklasę IgG (IgG1-4) oraz glikozylację w Asparaginie 2974-6. Zatem ta metoda badania różnic funkcjonalnych przeciwciał swoistych dla antygenu w próbkach klinicznych ułatwi korelację potencjału fagocytarnego przeciwciał ze stanem choroby, podatnością na infekcję, progresją lub wynikiem klinicznym.
Ponadto funkcja efektorowa ta jest szczególnie istotna w świetle udokumentowanej zdolności przeciwciał do nasilania infekcji poprzez zapewnienie patogenom dostępu do komórek gospodarza za pośrednictwem fagocytozy zależnej od receptorów Fc7. Ponadto istnieją dowody na to, że fagocytarne pobieranie kompleksów immunologicznych może wpływać na polaryzację odpowiedzi immunologicznej Th1/Th28.
W niniejszej pracy opisujemy test zaprojektowany do wysokoprzepustowego wykrywania różnic w fagocytozie indukowanej przez przeciwciała, które mogą wynikać z odmiennych podklas IgG, struktury glikanów w pozycji Asn297, a także zdolności przeciwciał specyficznych dla antygenu do tworzenia kompleksów immunologicznych. W tym celu fluorescencyjne koraliki o średnicy 1 μm są powlekane antygenem, a następnie inkubowane z klinicznymi próbkami przeciwciał, co prowadzi do powstania fluorescencyjnych kompleksów immunologicznych specyficznych dla antygenu. Te opsonizowane przeciwciałami koraliki są następnie inkubowane z linią komórek monocytarnych wykazującą ekspresję wielu receptorów FcγR, w tym zarówno hamujących, jak i aktywujących. Wyniki testu mogą obejmować aktywność fagocytarną, sekrecję cytokin oraz wzorce wykorzystania FcγR i są one określane w sposób zstandaryzowany, co czyni ten system niezwykle użytecznym narzędziem do analizy różnic w tej efektorowej funkcji zależnej od przeciwciał, zarówno w kontekście infekcji, jak i ochrony indukowanej szczepionkami9.

Przedstawiamy wysokoprzepustowy test cytometrii przepływowej do określania aktywności fagocytarnej przeciwciał swoistych dla antygenu z próbek klinicznych, z wykorzystaniem kuleczek pokrytych fluorescencyjnym antygenem oraz linii komórkowej monocytów wykazującej ekspresję wielu receptorów Fc, co pozwala na standaryzowane i powtarzalne określanie wykorzystania receptorów oraz aktywności fagocytarnej dla dowolnego wybranego antygenu.

Oznaczanie aktywności fagocytarnej próbek przeciwciał klinicznych

Fagocytoza zależna od przeciwciał jest indukowana poprzez aktywację receptorów Fc na fagocytach zawodowych i może przyczyniać się zarówno do eliminacji, jak i ...

Celem poniższego eksperymentu jest wysokoprzepustowe oznaczenie aktywności fagocytarnej przeciwciał specyficznych dla antygenu w próbkach klinicznych. Osiąga się to poprzez uprzednie pokrycie fluorescencyjnych kulek wybranym antygenem, co umożliwia wychwycenie frakcji przeciwciał specyficznych dla tego antygenu obecnych w złożonych klinicznych próbkach przeciwciał. W drugim kroku komórki fagocytarne TP one są inkubowane z zjonizowanymi fluorescencyjnymi kulkami, które są następnie fagocytowane w zależności od liczby i charakterystyki domeny FC związanych przeciwciał.Następnie, za pomocą wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej na płytkach, wyznacza się intensywność fluorescencji komórek THP-1 w celu ilościowego określenia aktywności fagocytowej przeciwciał obecnych w próbce. Ostatecznie pozwala to ocenić zdolność swoistych dla antygenu przeciwciał w próbce do indukowania fagocytozy na podstawie różnic w pobieraniu opsonizowanych fluorescencyjnych kulek, wynikających albo ze zmiennego miana przeciwciał, albo ze zmiennego stopnia rozpoznawania przez receptory przeciwciał wykazujące się na komórkach fagocytarnych. Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak te wykorzystujące pierwotne komórki fagocytarne, są zwiększona przepustowość oraz lepsza standaryzacja.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące podstawowej immunologii adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej, na przykład czy różne schematy szczepień indukują przeciwciała o odmiennej aktywności. Znaczenie tej techniki rozciąga się na terapię chorób zakaźnych, ponieważ przeciwciała wnoszą istotny wkład w budowanie skutecznej, ochronnej odpowiedzi immunologicznej. Choć zastosowaliśmy tę metodę w celu uzyskania wglądu w aktywność przeciwciał w postępującej infekcji HIV oraz w procesie szczepień, może ona zostać zastosowana również w innych stanach chorobowych, takich jak grypa, autoimmunizacja i denga, gdzie przeciwciała fragmentaryczne mogą zaostrzać przebieg choroby zamiast zapewniać ochronę.Zacznij od rozcieńczenia antygenu w buforze niezawierającym amin pierwotnych. Następnie rozpuść odczynnik sulfa NHS lc, biotyna w wodzie. W dalszej kolejności niezwłocznie dodaj uwodniony odczynnik do antygenu i pozostaw do zajścia reakcji na jedną godzinę w temperaturze pokojowej, mieszając zawiesinę.Po zakończeniu reakcji próbkę należy przenieść do górnej komory jednostki do koncentracji odśrodkowej w celu usunięcia nadmiaru niewiązanej biotyny poprzez wymianę buforu. Następnie należy dodać PBS, aby doprowadzić całkowitą objętość do poziomu linii 15 mililitrów. Na koniec próbkę odwiruje się przy 4 000 ×g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż objętość zostanie zredukowana do około 1,5 mililitra.Powtórz ten krok trzykrotnie, aby osiągnąć niemal ilościowe usunięcie wolnej biotyny. Po odwirowaniu 100 µL fluorescencyjnych kulek streptawidynowych o średnicy 1 µm w mikrocentryfudze przy 13 000 ×g przez pięć minut, resuspenduj i przemyj kuleczki w 1 ml 0,1% P-B-S-B-S-A, stosując tę samą procedurę wirowania. Następnie, po resuspensji przemytych kulek w 100 µL P-B-S-B-S-A, ponownie rozdziel kuleczki do 10 probówek typu Eppendorf.Następnie połącz 10 µL zawiesiny wypłukanych kulek z różnymi stężeniami biotynilowanego antygenu w seriach rozcieńczeń. Następnie inkubuj zawiesiny kulek i antygenu przez noc w temperaturze 4 °C w probówce do mikrocentryfugi na rotatorze. Następnego dnia.Usuń niezwiązany antygen, płucząc zawiesiny dwukrotnie jednym mililitrem P-B-S-B-S-A, a następnie odwiruj próbki z dużą prędkością, tak jak wcześniej, aż do utworzenia osadu z kulek. Na koniec ponownie zawieś kulek pokryte antygenem w końcowej objętości jednego mililitra P-B-S-B-S-A, po uprzednim oczyszczeniu klinicznych próbek przeciwciał z osocza za pomocą zestawu do oczyszczania IgG z żelem melonowym. Zgodnie z instrukcjami producenta, wyznacz stężenie oczyszczonych przeciwciał, mierząc absorbancję przy 280 nm.Następnie rozcieńczyć przeciwciała do stężenia 1 mg/ml w PBS, przygotowując oddzielnie próbki dla pozytywnych i negatywnych przeciwciał kontrolnych monoklonalnych. Następnie zawiesinę kulek nasyconych antygenem wymieszać za pomocą wortexa, a następnie przenieść 10 µl roztworu do każdej studzienki okrągłodennej płytki 96-dołkowej, dbając o ciągłe mieszanie zawiesiny kulek, aby do każdej studzienki trafiła taka sama liczba kulek fluorescencyjnych. Stworzyć krzywą zależności odpowiedzi od dawki dla każdego przeciwciała kontrolnego, dodając do każdej studzienki różne stężenia badanych przeciwciał w objętościach nieprzekraczających 20 µl.Następnie inkubuj próbki z kuleczkami i przeciwciałami przez dwie godziny w temperaturze 37 °C, aby umożliwić związanie przeciwciał z kuleczkami przed zakończeniem procesu przygotowania kuleczek. Inkubując, rozcieńcz próbkę komórek THP-1 do stężenia 2,5 × 10⁵ komórek/ml w medium. Następnie dodaj 200 µL komórek do każdej próbki.Następnie inkubuj komórki z koralikami powleczonymi przeciwciałami przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze stacjonarnym, pozwalając komórkom i koralikom opaść pod wpływem grawitacji. Następnego dnia pobierz 100 µL supernatantu z każdej studzienki, uważając, aby nie naruszyć pelletu komórkowego. Utrwal komórki w 100 µL 4% paraformaldehydu, a następnie pipetuj w celu resuspensji i wymieszania komórek.Następnie umieść płytkę w czytniku płytek HTS cytometru przepływowego o wysokiej przepustowości, aby umożliwić zautomatyzowany pobór danych. Rejestrowana jest intensywność fluorescencji pojedynczej komórki HTHP. Intensywność fluorescencji jest następnie wykorzystywana do określenia liczby kulek fagocytowanych przez każdą komórkę, co definiuje aktywność fagocytarną badanej próbki przeciwciał.Powinno istnieć wyraźne rozróżnienie między próbkami przeciwciał od osób chorych i zdrowych. Na tej rycinie histogramy próbki przeciwciał od osoby HIV-ujemnej (reprezentowanej przez czarną linię) oraz osoby HIV-dodatniej (reprezentowanej przez szarą linię) wykazują zwiększoną fagocytozę stymulowaną przez obecność przeciwciał swoistych dla antygenu.Optymalna czułość tego testu zależy od nasycenia kulek antygenem biotynilowanym, co pokazano tutaj. Ustalono, że stężeniem nasycającym dla tego antygenu jest 2 µg antygenu na 1 µL kulek. Ta krzywa odpowiedzi na dawkę demonstruje zróżnicowaną zdolność próbek przeciwciał badanych osób do indukowania fagocytozy w zakresie stężeń przeciwciał od 0,05 do 5 µg/mL.Ta różnicowa fagocytoza może być napędzana albo różnicami w mianie, albo właściwościami domeny FC, takimi jak podklasa IgG lub stan glikozylacji. Podczas obrazowania komórek TP one za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej widoczne są wyraźne dowody na fagocytozę kulek. To statyczne zdjęcie komórek TP one po inkubacji z kuleczkami opsonizowanymi przeciwciałem w kolorze zielonym i kuleczkami nieopsonizowanymi w kolorze czerwonym wykazuje brak poboru fagocytarnego w przypadku braku przeciwciał, ponieważ tylko zielone kulki zostały sfagocytowane przez komórki TP one.Podczas wykonywania mikroskopii poklatkowej fagocytoza fluorescencyjnych kulek zależna od przeciwciał jest jeszcze bardziej uderzająca. Widoczne tutaj zielone fluorescencyjne kulki są jonizowane przeciwciałami. Czerwone fluorescencyjne kulki stanowią kontrolę negatywną. Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać inne testy funkcji przeciwciał, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące charakterystyki odpowiedzi przeciwciał na infekcję lub szczepienie.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak określić aktywność fagocytarną próbek przeciwciał przy użyciu wysokoprzepływowej cytometrii przepływowej. Prosimy pamiętać, że praca z klinicznymi próbkami krwi i osocza może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniej odzieży ochronnej oraz przestrzeganie zasad bezpiecznego obchodzenia się z materiałem.

determining-the-phagocytic-activity-of-clinical-antibody-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Określanie aktywności fagocytarnej próbek klinicznych przeciwciał

Źródło: Nagre, N. i inni. Fagocytoza makrofagów pęcherzykowych i usuwanie bakterii u myszy. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje ocenę fagocytozy pośredniczonej przez receptory komplementacyjne przy użyciu czerwonych krwinek owiec opsonowanych IgM i dopełniakiem, a następnie ich przyjmowania przez mysie makrofagi. Zakres fagocytozy mierzy się poprzez pomiar niebieskiego produktu chromogenicznego powstałego w wyniku katalyzowanej przez hemoglobinę utleniania diaminofluorenu.

Modelowanie fagocytozy podleganej komplementem za pomocą opsonizowanych czerwonych krwinek in vitro

Wideo pokazuje test zabijania in vitro opsonofagocytarnego przy użyciu kohodowli ludzkich neutrofili ze Streptococcus pneumoniae. Przeciwciała i białka dopełniacza ułatwiają opsonizację bakterii, umożliwiając neutrofilom rozpoznawanie i zabijanie bakterii, wykazując skuteczną aktywność opsonofagocytarną neutrofili.

Ocena zabijającej aktywność opsonofagocytarną wobec patogenów bakteryjnych

Ten film demonstruje test fagocytozy oparty na cytometrii przepływowej, obejmujący znakowane i opsonizowane erytrocyty zakażone Plasmodium falciparum przez monocyty. Cytometria przepływowa identyfikuje fluorescencję w monocytach, potwierdzając pomyślną identyfikację opsonizowanych erytrocytów poprzez fagocytozę.

Test do ilościowego określania fagocytozy erytrocytów zakażonych pasożytami za pośrednictwem przeciwciał

Ten film prezentuje jednowarstwowy test monocytów wykorzystujący pierwotne monocyty z krwi obwodowej do oceny fagocytozy za pośrednictwem receptora Fcγ z opsonizowanymi przeciwciałami poli D czerwonych krwinek R2R2.

Test do badania fagocytozy sterowanej receptorem fcγ w monowarstwach monocytów

Ten film demonstruje test do pomiaru fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCP) przez fagocyty mleka matki. Znakowane fluorescencyjnie mikrosfery sprzężone z kompleksem antygen-przeciwciało są łączone z zawiesiną komórkową wyizolowaną z mleka matki w celu wywołania zależnej od przeciwciał fagocytozy komórkowej przez leukocyty fagocytarne. Po znakowaniu komórek przeciwciałami przeciwko powszechnemu antygenowi leukocytarnemu (CD45), cytometria przepływowa służy do pomiaru intensywności...

Test in vitro do pomiaru fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał za pomocą fagocytów

Tutaj prezentujemy protokół ilościowego oznaczania fagocytozy cząstek fluorescencyjnych za pomocą przylegającej linii komórkowej makrofagów przy użyciu metody fluorometrycznej. Metoda ta ułatwia wysokoprzepustową kwantyfikację internalizacji cząstek, a także wynikającą z niej polimeryzację aktyny.

Wysokoprzepustowa technika fluorometryczna do oceny fagocytozy makrofagów i polimeryzacji aktyny

pH fagosomalne wpływa na dojrzewanie fagosomów, produkcję utleniaczy, zabijanie fagosomalów, a także na prezentację antygenu. W tym miejscu opisujemy ratiometryczną metodę pomiaru zmian pH w czasie i punkcie końcowym w poszczególnych fagosomach w żywych fagocytach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Pomiar pH fagosomu za pomocą ratiometrycznej mikroskopii fluorescencyjnej

Test monocytów (MMA) to test in vitro, który wykorzystuje izolowane pierwotne monocyty uzyskane z pełnej krwi obwodowej ssaków do oceny fagocytozy za pośrednictwem receptora Fcγ (FcγR).

Zastosowanie jednowarstwowego testu monocytowego monocytów do oceny fagocytozy za pośrednictwem receptora Fcγ

Opisujemy metodę pomiaru aktywacji funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc przez przeciwciała skierowane przeciwko hemaglutyniny wirusa grypy. Test ten można również dostosować do oceny zdolności przeciwciał monoklonalnych lub surowic poliklonalnych ukierunkowanych na inne glikoproteiny powierzchniowe wirusa do indukowania odporności zależnej od Fc.

Metoda oceny funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc indukowanych przez przeciwciała specyficzne dla hemaglutyniny grypy

Ogólnym celem tego protokołu jest dostarczenie instrukcji, jak mierzyć zdolność przeciwciał obecnych w surowicach lub osoczu osób, naturalnie narażonych na zakażenie Plasmodium falciparum, do opsonizacji i indukowania fagocytozy erytrocytów zakażonych pasożytami (IE).

Pomiar naturalnie nabytych przeciwciał indukujących fagocytozę przeciwko pasożytom Plasmodium falciparum za pomocą testu opartego na cytometrii przepływowej

Opracowaliśmy ulepszenia i zaktualizowane metody dla istniejącego testu monocytytowo-monowarstwowego (MMA), w którym makrofagi są używane do lepszego przewidywania klinicznego znaczenia alloprzeciwciał krwinek czerwonych w medycynie transfuzjologicznej i immunologii. Ten test nazywa się testem monocytów-makrofagów (M-MA).

Przewidywanie znaczenia przeciwciał przeciwko krwinkom czerwonym za pomocą testu monocytów-makrofagów

Poznaj metodę oznaczania aktywności fagocytarnej przeciwciał z próbek klinicznych przy użyciu cytometrii przepływowej. Technika wykorzystuje fluorescencyjne kuleczki pokryte antygenem i linię komórek monocytowych THP-1.

Oznaczanie aktywności fagocytarnej próbek przeciwciał klinicznych

Przeglądaj więcej filmów