Name: Funkcjonalna jednostka ruchowa w naczyniu hodowlanym: kokultura eksplantatów rdzenia kręgowego i komórek mięśniowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Poznaj metodę kokultury eksplantatów rdzenia kręgowego szczura z ludzkimi komórkami mięśniowymi w celu odtworzenia funkcjonalnej jednostki ruchowej in vitro. Technika umożliwia badanie unerwienia mięśni i różnicowania komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nasza praca jest wspierana przez Swiss National Science Foundation (SNF), Swiss Initiative in Systems Biology (SystemsX.ch), Muscular Dystrophy Association USA (MDA), Association Française contre les Myopathies (AFM), United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF), Gebert-Rüf Foundation Rare Diseases Programme (GRF), Swiss Society for Research of the Muscle Diseases (SSEM/FSRMM), Swiss Life „Jubiläumsstiftung für Volksgesundheit und medizinische Forschung”, Roche Research Foundation oraz Uniwersytet w Bazylei.

1. Przygotowanie pierwotnej hodowli ludzkich komórek mięśniowych
<ol>
 <li>Utworzyć kultury ludzkich komórek mięśniowych zgodnie z techniką eksplantacji-reeksplantacji4. Najpierw usunąć tkankę pozamięśniową z biopsji. Następnie osadzić eksplanty mięśni o wielkości 1 mm3 w koagulum osocza, co umożliwi wyjście fibroblastów z eksplantów.</li>
 <li>Osadzone eksplanty przenieść na płytkę pokrytą żelatyną z osocza i pozostawić do wzrostu w zwykłej pożywce wzrostowej (MEM uzupełniony o 25% medium 199, 10% płodowej surowicy bydlęcej [FBS], 1% penicyliny/streptomycyny, 10 μg/ml insuliny, 10 ng/ml ludzkiego czynnika wzrostu naskórka [EGF], 12,5 ng/ml ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów [FGF]) w monowarstwie. Komórki, które wyłaniają się z eksplantów w tych warunkach, są komórkami mięśniowymi. Komórki te będą nadal rosnąć w monowarstwie po usunięciu eksplantów.</li>
 <li>Hodować komórki bezunerwione na płytkach pokrytych 0,1% żelatyną w zwykłej pożywce wzrostowej. Komórki mogą być hodowane bezunerwione i namnażane w razie potrzeby. Do tworzenia kokultur najlepiej używać komórek mięśniowych z pasażu od 3 do 8. Kluczowe jest unerwienie młodych miotub; po tym etapie kokultury są obarczone wysokim ryzykiem niepowodzenia. Ponadto miotuby nie powinny być zbyt duże i zbyt grube.</li>
 <li>Na dwa dni przed planowanym unerwieniem wysiać komórki mięśniowe na 35 mm płytki do hodowli tkankowej (lub płytki 6-dołkowe) z gęstością 500 000 komórek na płytkę w zwykłej pożywce wzrostowej. Przy tej gęstości komórki osiągają odpowiednią konfluencję, aby następnego dnia rozpocząć fuzję, a dzień później przeprowadzić unerwienie. W tych warunkach miotuby znajdują się we właściwym stadium dla optymalnego unerwienia, a w konsekwencji późniejszego skurczu włókien.</li>
 <li>Następnego dnia zastąpić zwykłą pożywkę wzrostową pożywką do fuzji składającą się z MEM uzupełnionego o 25% medium 199, 5% FBS, 10 μg/ml insuliny i 1% penicyliny/streptomycyny.</li>
</ol>
2. Izolacja eksplantów rdzenia kręgowego zarodka szczura
Cała procedura izolacji eksplantów rdzenia kręgowego jest przeprowadzana pod mikroskopem binokularnym w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS, Gibco/Invitrogen ref 14170) zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
<ol>
 <li>Kluczowe jest, aby zarodki szczura znajdowały się między 13. a 14. dniem embrionalnym (ED 13 i 14), ponieważ inny stopień rozwoju mógłby zagrozić całej procedurze. Uśmierć ciężarną samicę za pomocą CO2 i pobierz cały łańcuch zarodków do medium HBSS. Wyizoluj każdy zarodek i dokonaj dekapitacji w celu eutanazji.</li>
 <li>Wypreparuj rdzeń kręgowy zarodka z reszty ciała w jednym kawałku, usuwając otaczające mięśnie i tkankę łączną. Należy zachować szczególną ostrożność, aby zwoje korzeni grzbietowych (DRGs) pozostały przytwierdzone do rdzenia kręgowego, co zapewni funkcjonalną innerwację.</li>
 <li>Przekrój każdy rdzeń kręgowy poprzecznie w taki sposób, aby każdy eksplant zawierał co najmniej 2 przytwierdzone do niego DRG (eksplanty o objętości 1 mm3).</li>
</ol>
3. Innerwacja ludzkich komórek mięśniowych za pomocą eksplantów rdzenia kręgowego embriona szczura
<ol>
 <li>Usunąć medium do fuzji z hodowli komórek mięśniowych, pozostawiając na monowarstwie cienką warstwę medium.</li>
 <li>Ostrożnie umieścić eksplantaty na warstwie komórek mięśniowych, w liczbie pięciu równomiernie rozmieszczonych eksplantatów na szalkę 35 mm.</li>
 <li>Bardzo powoli, kroplami, dodawać medium do fuzji na każdy eksplantat. Konieczne jest dodanie medium, aby komórki mięśniowe przeżyły, jednak w ilości niewystarczającej do tego, by eksplantaty zdążyły najpierw przywrzeć i nawiązać kontakt z komórkami. Jeśli medium nie zostanie dodane prawidłowo (zbyt silnym strumieniem lub w zbyt dużej ilości), eksplantaty będą pływać i nie dojdzie do unerwienia komórek mięśniowych.</li>
 <li>Gdy eksplantaty zaczną przywierać, uzupełnić medium do fuzji do objętości 2 ml na szalkę 35 mm i bardzo ostrożnie umieścić szalki z powrotem w inkubatorze.</li>
</ol>
4. Utrzymywanie heterologicznych kokultur nerwowo-mięśniowych
<ol>
 <li>Wymieniaj medium do fuzji dwa razy w tygodniu.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Już dwa dni po unerwieniu można zaobserwować neuryty wyłaniające się z każdego eksplantu i nawiązujące kontakty z komórkami mięśniowymi, co objawia się obecnością struktur przypominających wypustki (Rys 1).
Już 4-6 dni po unerwieniu kilka pojedynczych włókien zacznie się kurczyć.
Skurcze utrzymują się przez wiele miesięcy, a ich trwałość jest zapewniona poprzez prostą wymianę pożywki dwa razy w tygodniu.
Po około 2 tygodniach sam eksplant rdzenia kręgowego ulega degeneracji, jednak unerwienie zostaje zachowane. Jest to zjawisko normalne. Cienka warstwa komponentów nerwowych pozostaje na powierzchni warstwy komórek mięśniowych. Ta sieć nerwowa jest wystarczająca do utrzymania funkcjonalności jednostki motorycznej.
Jeśli eksplanty pływają w pożywce w dniu następującym po unerwieniu, nigdy nie przywrą do podłoża. Dzieje się tak, gdy warstwa komórek mięśniowych nie jest wystarczająco konfluentna lub gdy pożywka została dodana zbyt gwałtownie. Czasami eksplant przylega, ale nie powstają neuryty. Jest to prawdopodobnie spowodowane brakiem przytwierdzonego do niego zwoju korzenia tylnego (DRG). W takim przypadku unerwienie również nie zostanie ustanowione. W pierwszym tygodniu należy manipulować szalkami bardzo ostrożnie, ponieważ eksplanty wciąż mogą się łatwo odkleić. Aby wymienić pożywkę do fuzji, należy dodawać płyn kroplami z minimalną prędkością, aby uniknąć odklejenia się komórek.
<img alt="Obrazy z mikroskopii time-lapse pokazujące wzrost komórek w ciągu 15 dni, analizujące rozwój hodowli tkankowej." src="/files/ftp_upload/3616/3616fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Współhodowle eksplantów rdzenia kręgowego i komórek mięśniowych od dnia 1. do dnia 15.

<ol><li>Delaporte, C., Dautreaux, B., Fardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+myotube+differentiation+in+vitro+in+different+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Human myotube differentiation in vitro in different culture conditions.</a> Biol. Cell. 57, 17-22 (1986).</li>
<li>Kobayashi, T., Askanas, V., Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+muscle+cultured+in+monolayer+and+cocultured+with+fetal+rat+spinal+cord%3A+importance+of+dorsal+root+ganglia+for+achieving+successful+functional+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human muscle cultured in monolayer and cocultured with fetal rat spinal cord: importance of dorsal root ganglia for achieving successful functional innervation.</a> J. Neurosci. 7, 3131-3141 (1987).</li>
<li>Braun, S., Croizat, B., Lagrange, M. C., Warter, J. M., Poindron, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+muscular+abnormalities+in+culture+in+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Constitutive muscular abnormalities in culture in spinal muscular atrophy.</a> Lancet. 345, 694-695 (1995).</li>
<li>Askanas, V., Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+program+for+investigating+adult+human+skeletal+muscle+grown+aneurally+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">A new program for investigating adult human skeletal muscle grown aneurally in tissue culture.</a> Neurology. 25, 58-67 (1975).</li>
<li>Guettier-Sigrist, S., Coupin, G., Warter, J. M., Poindron, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+required+to+efficiently+innervate+human+muscle+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cell types required to efficiently innervate human muscle cells in vitro.</a> Exp. Cell Res. 259, 204-212 (2000).</li>
<li>Lefebvre, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+spinal+muscular+atrophy-determining+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene.</a> Cell. 80, 155-165 (1995).</li>
<li>Schrank, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+survival+motor+neuron+gene%2C+a+candidate+gene+for+human+spinal+muscular+atrophy%2C+leads+to+massive+cell+death+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the survival motor neuron gene, a candidate gene for human spinal muscular atrophy, leads to massive cell death in early mouse embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 9920-9925 (1997).</li>
<li>Hsieh-Li, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A mouse model for spinal muscular atrophy.</a> Nat. Genet. 24, 66-70 (2000).</li>
<li>Monani, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+centromeric+survival+motor+neuron+gene+%28SMN2%29+rescues+embryonic+lethality+in+Smn%28-%2F-%29+mice+and+results+in+a+mouse+with+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The human centromeric survival motor neuron gene (SMN2) rescues embryonic lethality in Smn(-/-) mice and results in a mouse with spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 9, 333-339 (2000).</li>
<li>Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+mouse+models+to+understanding+the+pathogenesis+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model.+Mech%22%5BJournal%5D)">The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy.</a> Dis. Model. Mech. 4, 457-467 (2011).</li>
<li>Durbeej, M., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+dystrophies+involving+the+dystrophin-glycoprotein+complex%3A+an+overview+of+current+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models.</a> 12, 349-361 (2002).</li>
<li>Schnabel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroscience%3A+Standard+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuroscience: Standard model.</a> Nature. 454, 682-685 (2008).</li>
<li>Benatar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lost+in+translation%3A+treatment+trials+in+the+SOD1+mouse+and+in+human+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Lost in translation: treatment trials in the SOD1 mouse and in human ALS.</a> Neurobiol. Dis. 26, 1-13 (2007).</li>
<li>Dorchies, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+innervation+and+differentiation+of+X-linked+myotubular+myopathy+muscle+cells+in+a+nerve-muscle+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul.+Disord%22%5BJournal%5D)">Normal innervation and differentiation of X-linked myotubular myopathy muscle cells in a nerve-muscle coculture system.</a> Neuromuscul. Disord. 11, 736-746 (2001).</li>
<li>McFerrin, J., Engel, W. K., Askanas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+innervation+of+cultured+human+muscle+overexpressing+betaAPP+experimentally+and+genetically%3A+relevance+to+inclusion-body+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Impaired innervation of cultured human muscle overexpressing betaAPP experimentally and genetically: relevance to inclusion-body myopathies.</a> Neuroreport. 9, 3201-3205 (1998).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Fizjologiczne narzędzie in vitro do badania funkcji komórek mięśniowych w kontekście prawidłowym i patologicznym jest przedmiotem szczególnego zainteresowania myologów, ponieważ hodowle komórek mięśniowych zazwyczaj nie odtwarzają znaczenia interakcji między wieloma komórkami i połączeń między różnymi typami komórek. Dodanie oczyszczonych neuronów ruchowych do komórek mięśniowych jest niewystarczające do uzyskania funkcjonalnej jednostki motorycznej, ponieważ do efektywnej innerwacji niezbędna jest obecność komó...

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31095</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199 </td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31153</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Fetal Clone Perbio</td><td>SH30066.03</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki FGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny/streptomycyny</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr></tbody></table>

funkcjonalna jednostka motoryczna w szalce hodowlanej: współhodowla eksplantów rdzenia kręgowego i komórek mięśniowych

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Ludzkie pierwotne komórki mięśniowe hodowane aneuralnie w monowarstwie rzadko kurczą się spontanicznie, ponieważ wobec braku komponentu nerwowego różnicowanie komórek jest ograniczone i brakuje stymulacji neuronów ruchowych1. Ograniczenia te utrudniają badanie wielu chorób nerwowo-mięśniowych in vitro w hodowlach komórek mięśniowych. Co istotne, ograniczenia eksperymentalne związane z monowarstwowymi hodowlami komórek mięśniowych można pokonać poprzez funkcjonalną innerwację włókien mięśniowych eksplantami rdzenia kręgowego w kokulturach.
W niniejszej pracy przedstawiamy poszczególne etapy niezbędne do uzyskania efektywnej i prawidłowej innerwacji ludzkich pierwotnych komórek mięśniowych, prowadzącej do pełnego różnicowania i skurczu włókien zgodnie z metodą opracowaną przez Askanasa2. W tym celu komórki mięśniowe są współhodowane z eksplantami rdzenia kręgowego embrionów szczura w dniu ED 13.5, przy czym ziarenka zwojów rdzeniowych pozostają przytwierdzone do skrawków rdzenia kręgowego. Po kilku dniach włókna mięśniowe zaczynają się kurczyć i ostatecznie stają się poprzecznie prążkowane w wyniku innerwacji przez funkcjonalne neuryty wyrastające z eksplantów rdzenia kręgowego i łączące się z komórkami mięśniowymi. Strukturę tę można utrzymać przez wiele miesięcy, stosując regularną wymianę pożywki hodowlanej.
Zastosowania tego nieocenionego narzędzia są liczne, ponieważ stanowi ono funkcjonalny model dla wielodyscyplinarnych analiz rozwoju i unerwienia mięśni ludzkich. W rzeczywistości w szalce hodowlanej dochodzi do pełnej instalacji złącza nerwowo-mięśniowego de novo, co pozwala na łatwy pomiar wielu parametrów na każdym etapie, w kontekście fundamentalnym i fizjologicznym.
Przywołując zaledwie kilka przykładów, badania genomiczne i/lub proteomiczne można przeprowadzać bezpośrednio na ko-kulturach. Ponadto efekty presynaptyczne i postsynaptyczne mogą być oceniane w sposób specyficzny i oddzielny w obrębie złącza nerwowo-mięśniowego, ponieważ oba komponenty pochodzą od różnych gatunków, odpowiednio od szczura i człowieka. Ko-kulturę nerwu i mięśnia można również prowadzić z ludzkimi komórkami mięśniowymi wyizolowanymi od pacjentów cierpiących na choroby mięśni lub choroby nerwowo-mięśniowe3, dzięki czemu może ona służyć jako narzędzie przesiewowe dla potencjalnych leków. Wreszcie, do odtworzenia funkcjonalnej jednostki motorycznej w szalce hodowlanej nie jest potrzebny żaden specjalistyczny sprzęt, a jedynie standardowe laboratorium BSL2. Metoda ta jest zatem cenna zarówno dla społeczności badającej mięśnie, jak i złącza nerwowo-mięśniowe, w zakresie fizjologicznych i mechanistycznych badań funkcji nerwowo-mięśniowej w kontekście prawidłowym oraz chorobowym.

Hodowlane komórki mięśniowe są niewystarczającym modelem do odtworzenia unerwionego mięśnia in vivo. Funkcjonalną jednostkę motoryczną można odtworzyć in vitro poprzez unerwienie zróżnicowanych ludzkich pierwotnych komórek mięśniowych przy użyciu eksplantatów rdzenia kręgowego embrionu szczura. Niniejszy artykuł opisuje sposób tworzenia kokultur eksplantatów rdzenia kręgowego i komórek mięśniowych.

Funkcjonalna jednostka motoryczna w szalce hodowlanej: współhodowla eksplantów rdzenia kręgowego i komórek mięśniowych

Ludzkie pierwotne komórki mięśniowe hodowane aneuralnie w monowarstwie rzadko kurczą się samoistnie, ponieważ wobec braku komponentu nerwowego komórki...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest odtworzenie funkcjonalnej jednostki motorycznej in vitro. Osiąga się to poprzez hodowlę pierwotnych ludzkich komórek mięśniowych wraz z wyizolowanym eksplantem rdzenia kręgowego z embrionów szczura. Następnie pozwala się implantom rdzenia kręgowego na unerwienie ludzkich komórek mięśniowych przy zachowaniu przytwierdzonego eksplantu.Kulturę ostrożnie dokarmia się pożywką, aż komórki mięśniowe w pełni się zróżnicują. Następnie fenotyp molekularny i/lub komórkowy zróżnicowanych komórek mięśniowych można ocenić za pomocą wybranych narzędzi molekularnych. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ po pierwsze trudno jest nauczyć się, jak izolować rdzeń kręgowy.Przede wszystkim należy zachować szczególną ostrożność podczas dodawania pożywki hodowlanej do innowacyjnych komórek mięśniowych. Uśmierć ciężarną szczurzycę z embrionami w stadium między ED 12.5 a ED 13.5.Należy zachować precyzję, ponieważ etap rozwoju jest kluczowy dla całej procedury. Pod stereomikroskopem wypreparować macicę i zebrać cały łańcuch embrionów do medium HBSS z dodatkiem 10% FBS, a następnie odizolować i odciąć głowę każdego embrionu. Wyizolować rdzeń kręgowy w jednym kawałku, usuwając otaczające mięśnie i tkankę łączną.Aby to zrobić, najpierw unieruchom zarodki za pomocą mikronożyczek. Przetnij skórę wzdłuż każdego boku rdzenia kręgowego i ostrożnie ją odważ. Następnie ułóż zarodek na boku i starannie wyizoluj rdzeń kręgowy wraz z przytwierdzonymi zwojami korzeni grzbietowych (DRG).Funkcjonalna innowacja nie nastąpi, jeśli zwoje korzeni grzbietowych (DRG) nie pozostaną przytwierdzone do rdzenia kręgowego. Rdzeń kręgowy jest bielszy niż otaczająca go różowa tkanka łączna i mięśnie. Ostrożnie usuń otaczające tkanki, nie uszkadzając DRG.Po wyizolowaniu, za pomocą igły mikrostrzykawki, należy przeciąć każdy rdzeń kręgowy w przekroju poprzecznym na kostki, z których każda zawiera co najmniej dwa zwoje korzeni grzbietowych (DRG). Te fragmenty tkanek będą miały objętość około jednego milimetra sześciennego i będą gotowe do kokultury ze standardową hodowlą ludzkich komórek mięśniowych. Niniejszy protokół wymaga hodowli ludzkich komórek mięśniowych uzyskanych z biopsji tkankowych.Szczegółowe informacje na temat tej procedury znajdują się w protokole pisemnym. Należy rozpocząć od usunięcia medium do fuzji z hodowli komórek mięśniowych, pozostawiając cienką warstwę medium na monowarstwie. Następnie należy ostrożnie umieścić x explan na komórkach mięśniowych.Na każdej 35 milimetrowej płytce można równomiernie rozmieścić pięć eksplantów X. Powoli, kroplami, dodawaj pożywkę do fuzji na każdy eksplant X. Nie dodawaj pożywki do fuzji zbyt szybko ani w zbyt dużej objętości.W przeciwnym razie eksplanty x będą pływać, co uniemożliwi unerwienie komórek mięśniowych. Następnie bardzo ostrożnie umieść szalki z powrotem w inkubatorze. Kontynuuj powolne dodawanie pożywki.Przy ostrożnej manipulacji x eksplanty przestaną unosić się w medium i przywrą do komórek w ciągu około jednej godziny. Po przywarciu należy zwiększyć objętość medium do fuzji do 2 ml na każdą szalkę o średnicy 35 mm. Jeśli po odczekaniu nocy eksplanty X nadal unoszą się w medium, oznacza to, że warstwa komórek mięśniowych nie była wystarczająco konfluencyjna lub dodano medium.Około dwóch. Te X explan nigdy nie będą przylegać dwa razy w tygodniu. Wymień całe medium do fuzji, dodając je powoli kroplami, aby uniknąć odklejenia się komórek.Wyjaśnienia X są dość kruche w ciągu pierwszego tygodnia i mogą łatwo się odczepić. Jest to bardzo przydatna technika, ponieważ po innowacji, jedynie poprzez pomiar lub zbieranie pożywki hodowlanej, można zmierzyć omę ko-kultur. A jeśli starannie dobierze się narzędzia molekularne, można odróżnić to, co pochodzi z mięśnia, od tego, co pochodzi z nerwu.Dwa dni po innowacji neuryty wyrosły z każdego eksplantu i nawiązały kontakty z komórkami mięśniowymi, reprezentowane przez struktury przypominające guzki. W przypadku braku wzrostu neurytów innowacja nie powiedzie się, co prawdopodobnie wynika z braku przylegania DRG. Już od czwartego do szóstego dnia po innowacji kilka pojedynczych włókien zaczęło się kurczyć.Skurcze utrzymywały się przez wiele miesięcy, dzięki zwykłej wymianie pożywki hodowlanej dwa razy w tygodniu. Po około dwóch tygodniach, zgodnie z oczekiwaniami, same eksplanty rdzenia kręgowego uległy degeneracji, jednak unerwienie zostało zachowane. Na powierzchni warstwy komórek mięśniowych pozostała cienka warstwa komponentów nerwowych, a ta sieć nerwowa była wystarczająca do utrzymania funkcjonalności jednostki motorycznej.Jedną z głównych zalet tej techniki jest możliwość pobierania próbek od pacjentów oraz mierzenia lub porównywania fenotypu kokultur między próbką kontrolną a próbką pacjenta. Postępując zgodnie z tą procedurą, można zastosować standardowe klasyczne techniki, takie jak qPCR, Western blot oraz immunohistochemia, co pozwala na badanie fenotypu mięśniowego lub nerwowego kokultur.

a-functional-motor-unit-culture-dish-co-culture-spinal-cord-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Jednostka ruchowa w naczyniu hodowli: Współhodowla eksplantatów rdzenia kręgowego i komórek mięśniowych

Technika mikrodysekcji eksplantów jest solidną i niezawodną metodą izolacji proliferujących komórek mięśni szkieletowych z mięśni młodocianych, dorosłych lub embrionalnych w celu pozyskania macierzystych komórek mięśni szkieletowych. Wyjątkowo komórki te zostały wyprowadzone klonalnie, co pozwoliło na stworzenie linii macierzystych komórek mięśni szkieletowych wykorzystywanych do transplantacji in vivo.

Kultura mikroeksplantów szkieletowych mięśni dorosłych i embrionalnych oraz izolacja komórek macierzystych mięśni szkieletowych

Opisano alternatywną metodę izolacji embrionalnych motoneuronów mysich z rdzenia kręgowego. Metoda ta wykorzystuje fakt, że lektyna może wiązać się z niskopodobnym receptorem czynnika wzrostu nerwów p75NTR. To oparte na lektynach wstępne wysiewanie (preplating) pozwala na puryfikację podobną do tej uzyskiwanej za pomocą specyficznego przeciwciała przeciwko p75NTR.

Izolacja i hodowla embrionalnych motoneuronów myszy z wykorzystaniem lektyn

Demonstrujemy sposób wycinania i hodowli eksplantów zwoju statoakustycznego w dniu E4 oraz rdzenia kręgowego w dniu E6 zarodka kurczaka. Eksplanty są hodowane w warunkach bezsurowiczych w trójwymiarowych żelach kolagenowych przez 24 godziny. Reaktywność neurytów jest badana przy użyciu pożywki uzupełnionej o czynniki wzrostu oraz koralików pokrytych białkiem.

Disekcja i hodowla eksplantów zrazustatoakustycznego i rdzenia kręgowego kurczaka w żelach kolagenowych do testów wzrostu neurytów

Sztucznie wytworzona tkanka mięśniowa ma ogromny potencjał w medycynie regeneracyjnej, jako model chorób, a także jako alternatywne źródło mięsa. W niniejszej pracy opisujemy proces tworzenia konstruktu mięśniowego, w tym przypadku z progenitorowych mioblastów mysich, oraz jego stymulację impulsami elektrycznymi.

Inżynieria tkanek mięśni szkieletowych z murynych komórek progenitorowych mioblastów i zastosowanie stymulacji elektrycznej

Kultury Slice ułatwiają manipulowanie rozwojem zarodka za pomocą zaburzeń genowych i farmakologicznych. Jednakże warunki hodowli muszą zapewniać, że normalny rozwój może przebiegać w ograniczonym środowisku wycinka. Ilustrujemy protokół, który ułatwia prawidłowy rozwój rdzenia kręgowego, aby przebiegał przez co najmniej 24 godziny.

Protokół hodowli plastrów rdzenia kręgowego zarodków kurczaka

Tutaj prezentujemy protokół, który opiera się na wycinkach rdzenia kręgowego hodowanych na układach wieloelektrodowych w celu zbadania funkcjonalnej regeneracji połączeń propriordzeniowych in vitro.

Badanie regeneracji funkcjonalnej w organotypowych kokulturach rdzenia kręgowego hodowanych na matrycach wieloelektrodowych

Transport aksonalny jest kluczowym mechanizmem dla zdrowia neuronów ruchowych. W tym protokole przedstawiamy szczegółową metodę śledzenia transportu aksonalnego przedziałów kwasowych i mitochondriów w aksonach neuronów ruchowych za pomocą komór mikroprzepływowych.

Transport aksonalny organelli w kulturach neuronów ruchowych z wykorzystaniem systemu komór mikroprzepływowych

W tym protokole opisana jest metoda hodowli in vitro i analizy funkcjonalnej komórek macierzystych mięśni, która zachowuje większość ich interakcji z ich endogenną niszą.

Test pojedynczej hodowli włókien mięśniowych do oceny funkcjonalności dorosłych komórek macierzystych mięśni ex vivo

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół tworzenia matryc 3D mikrotkanek ludzkich mięśni szkieletowych oraz minimalnie inwazyjnych testów funkcji in situ, w tym analizy siły skurczu i obchodzenia się z wapniem.

Ocena funkcjonalnych wskaźników zdrowia mięśni szkieletowych w mikrotkankach mięśni szkieletowych człowieka

Opisujemy metodę generowania ludzkich jednostek motorycznych w komercyjnie dostępnych urządzeniach mikroprzepływowych poprzez kokulturację ludzkich indukowanych pluripotencjalnych neuronów ruchowych pochodzących z komórek macierzystych z ludzkimi pierwotnymi miotubami pochodzącymi z mezoangioblastów, co prowadzi do powstania funkcjonalnie aktywnych połączeń nerwowo-mięśniowych.

Generacja jednostek motorycznych człowieka z funkcjonalnymi połączeniami nerwowo-mięśniowymi w urządzeniach mikroprzepływowych

Poznaj metodę kokultury eksplantatów rdzenia kręgowego szczura z ludzkimi komórkami mięśniowymi w celu odtworzenia funkcjonalnej jednostki ruchowej in vitro. Technika umożliwia badanie unerwienia mięśni i różnicowania komórek.

Funkcjonalna jednostka motoryczna w szalce hodowlanej: współhodowla eksplantów rdzenia kręgowego i komórek mięśniowych

Przeglądaj więcej filmów