Name: Metoda izolacji i identyfikacji mRNA, mikroRNA i składników białkowych kompleksów rybonukleoproteinowych z ekstraktów komórkowych za pomocą RIP-Chip (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Poznaj metodę izolacji kompleksów rybonukleoproteinowych z ekstraktów komórkowych przy użyciu immunoprecypitacji. Technika ta umożliwia identyfikację mRNA wiążących się z białkami RNA w badaniach nad regulacją genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ministerstwo Obrony USA (Idea Award W81XWH-07-0406) - dla To Ulus Atasoy
NIH RO1 A1080870 - To Ulus Atasoy
NIH R21 A1079341 - To Ulus Atasoy
Środki instytucjonalne Uniwersytetu Missouri - To Ulus Atasoy

Przygotowanie eksperymentu
Przed rozpoczęciem eksperymentu niezbędne jest, aby wszystkie odczynniki, pojemniki i przybory były wolne od RNaz. Szkło laboratoryjne należy potraktować inhibitorem RNaz (RNaseZAP, Ambion), a następnie wypłukać wodą traktowaną DEPC. Należy upewnić się, że wszystkie odczynniki są potwierdzone jako wolne od RNaz.
1. Przygotowanie lizatu mRNP
<ol>
 <li>Hodować i zbierać komórki tkankowe w fazie wzrostu wykładniczego, aby uzyskać od 2-5 mg całkowitego białka dla każdego RIP. 
 <ol class="lalpha">
 <li>Zazwyczaj wystarczające są dwie szalki hodowlane P150.</li>
 <li>Dla każdego badanego RBP należy zoptymalizować całkowitą liczbę komórek i ilość białka, aby zmaksymalizować odpowiednie interakcje między mRNA celu a RBP.</li>
 <li>RIP do analizy qRT-PCR może wymagać mniejszej ilości lizatu komórkowego (około 400 μg całkowitego białka) ze względu na metodę amplifikacji i detekcji, szczególnie w przypadku RBPs o wysokiej obfitości, takich jak HuR, AUF1, TIAR.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Osadzić komórki poprzez wirowanie przy 200 x g przez 8-10 min w 4 °C, a następnie trzykrotnie przemyć lodowatym PBS.</li>
 <li>Po ostatnim przemyciu delikatnie uderzyć w dno probówki i resuspender osad komórkowy w równych objętościach przygotowanego buforu do lizy polisomów (PLB) z inhibitorami RNazy i proteaz. 
 <ol class="lalpha">
 <li>Zaleca się odmierzenie dokładnej objętości osadu komórkowego.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Delikatnie pipetować mieszaninę (nie mieszać w vortexie), aby rozbić skupiska komórek, a następnie inkubować lizat na lodzie przez 5 min.</li>
 <li>Wirować przy 13 000 x g przez 20 min w 4 °C, aby oczyścić lizat z resztek komórkowych.</li>
 <li>Niezwłocznie przenieść oczyszczony nadsącz do schłodzonej probówki do mikrowirówki.</li>
 <li>Przechowywać na lodzie oraz w temperaturze -80 °C. 
 <ol class="lalpha">
 <li>Natychmiastowe zamrożenie kończy prawidłową lizę komórek i zapobiega niepożądanemu wiązaniu. Przystąpić do RIP niezwłocznie po rozmrożeniu próbki i utrzymywać próbki na lodzie, aby uniknąć degradacji RNA.</li>
 <li>Lizat ten można przechowywać do sześciu miesięcy w temperaturze -80 °C. Należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ może to prowadzić do degradacji białek i/lub mRNA.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Oznaczyć stężenie białka w lizacie, stosując standardowy test białkowy Bradforda.</li>
</ol>
2. Powlekanie kulek Protein A Sepharose przeciwciałem i ich przemywanie
<ol>
 <li>Nocnie pęcznienie kulek białka A Sepharose (PAS) w buforze NT2 (3-4 objętości) z dodatkiem 5% BSA. Przechowywać w temperaturze 4 °C. 
 <ol class="lalpha">
 <li>Długotrwałe przechowywanie do kilku miesięcy w temperaturze 4 °C jest możliwe po dodaniu 0,1% azotku sodu.</li>
 <li>Kuleczki białka Sepharose należy dobrać na podstawie izotypu przeciwciała przeciwko docelowemu białku wiążącemu RNA (RBP). Białka A, G oraz A/G mają specyficzne izotypy docelowe i różnią się powinowactwem. Kuleczki białka A sepharose zastosowano ze względu na specyficzność izotypową i powinowactwo do przeciwciała przeciwko białku HuR.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przed użyciem usunąć nadmiar buforu NT2, tak aby końcowy stosunek kuleczek do buforu wynosił 1:1.</li>
 <li>Do probówek mikrocentryfugowych o objętości 1,5 ml wolnych od RNazy przenieść 100 μl zawiesiny PAS i dodać 30 μg przeciwciała dla każdej pojedynczej reakcji IP (tj. dla specyficznego RBP oraz kontroli izotypowej).</li>
 <li>Do mieszaniny przeciwciała i kuleczek dodać 100-200 μl buforu NT2. 
 <ol class="lalpha">
 <li>Mieszaninę można przechowywać przez kilka tygodni w temperaturze 4 °C po dodaniu 0,1% azotku sodu.</li>
 <li>Przeciwciało dopasowane izotypowo lub kompletne normalne surowice z tego samego gatunku należy zastosować równolegle jako kontrolę przeciwciał pod kątem tła RNA.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Do mieszaniny kuleczek dodać odpowiednie przeciwciało i inkubować przez noc, obracając probówki nad odwrót w temperaturze 4 °C. 
 <ol class="lalpha">
 <li>Zoptymalizować miano przeciwciała dla badanego białka (zwykle wystarczające jest 1, 5, 10 lub 30 μg przeciwciała).</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Kuleczki pokryte przeciwciałami przygotować bezpośrednio przed użyciem, przemywając je 5 razy 1 ml lodowatego buforu NT2. 
 <ol class="lalpha">
 <li>Mieszaninę kuleczek przemywać poprzez wirowanie przy 13,000 x g przez 1-2 min w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Ostrożnie usunąć maksymalną ilość supernatantu za pomocą pipety ręcznej lub aspiratora, uważając, aby nie naruszyć osadu.</li>
 <li>Płukanie pomaga usunąć niezwiązane przeciwciała, a także zanieczyszczenia RNazami z mieszaniny przeciwciał.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Po zakończeniu ostatniego przemywania resuspender kuleczki w 700 μl lodowatego buforu NT2, a następnie zastosować różne inhibitory RNaz w celu ochrony docelowych mRNA, w tym 10 μl RNase Out o stężeniu 40 U/μl, 10 μl 100 mM DTT oraz 15 μl EDTA (15 mM). Uzupełnić objętość do 1,000 μl buforem NT2.
 <ol class="lalpha">
 <li>Kompleksy wanadylu z rybonukleozydami nie są stosowane ze względu na hamujący wpływ EDTA.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
3. Immunoprecypitacja i precypitacja RNA
<ol>
 <li>Opcjonalny krok wstępnego oczyszczania (preclear): 
 <ol class="lalpha">
 <li>W celu zmniejszenia tła do wstępnego oczyszczania lizatu można użyć kulek i przeciwciała kontrolnego. Może to jednak zmniejszyć sygnał końcowy.</li>
 <li>Krok ten może być konieczny w celu zmniejszenia tła podczas przeprowadzania IP z następującą po nim analizą microarray. Zazwyczaj nie jest on wymagany w przypadku IP z następującym po nim qRT-PCR.</li>
 <li>Przeprowadzić wstępne oczyszczanie przy użyciu 15 μg kontroli izotypowej przez 30 min w 4 °C podczas obrotu end-over-end.</li>
 <li>Dodać 50 μl uprzednio napęczniałych kulek PAS niepowlekanych przeciwciałem z kroku 2.1.</li>
 <li>Inkubować przez 30 min w 4 °C podczas obrotu end-over-end.</li>
 <li>Odwirować przy 10 000 x g w 4 °C. Zebrać supernatant do przeprowadzenia IP.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Dodać 100 μl wyizolowanego, oczyszczonego lizatu (około 2-5 mg) do przygotowanej mieszaniny przeciwciał.
 <ol class="lalpha">
 <li>Rozcieńczenie lizatu pomoże zmniejszyć tło oraz niespecyficzne wiązanie.</li>
 <li>Ilość dodawanego lizatu może się różnić w zależności od metody detekcji, zawartości RBP lub efektywności przeciwciała przeciwko RBP, zgodnie z uwagami w kroku 1.1.c.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>(Opcjonalnie) Natychmiast wymieszać zawartość probówki, delikatnie potrząsając nią kilka razy, a następnie krótko odwirować przy 10 000 x g w 4 °C, abyt scentryfugować kulki, i niezwłocznie pobrać 100 μl supernatantu jako reprezentatywną próbkę całkowitego wejściowego mRNA do analizy qPCR przy użyciu standardowych technik izolacji RNA.
 <ol class="lalpha">
 <li>Krok ten służy do potwierdzenia, że RNA w lizacie wejściowym jest optymalne do IP i powinien być wykonywany jedynie jako krok kontrolny lub w ramach rozwiązywania problemów po RIP z niską wydajnością odzysku RNA.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Owinąć probówkę parafinią, aby zapewnić szczelne zamknięcie, i inkubować w 4 °C od 2 do 4 h podczas obrotu end-over-end.
 <ol class="lalpha">
 <li>Czas inkubacji należy zoptymalizować w zależności od zawartości białka docelowego i zminimalizować, aby uniknąć reorganizacji kompleksów lub degradacji. W przypadku niektórych RBP optymalna może być krótsza inkubacja.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Scentryfugować kulki przy 5 000 x g przez 5 min w 4 °C i zachować supernatant do ewentualnej analizy metodą Western blot. Alikwoty przechowywać w -80 °C.
 <ol class="lalpha">
 <li>Obecność dużych ilości pozostałego białka docelowego w alikwotach supernatantu może wskazywać na brak wytrącenia białka przez kulki sefarozowe.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Zgodnie z wcześniejszym opisem, wyprać kulki 5 razy 1 ml lodowatego buforu NT2 i odwirować (5 000 x g przez 5 min w 4 °C), a następnie usunąć supernatant za pomocą pipety lub aspiratora.
 <ol class="lalpha">
 <li>W celu zmniejszenia tła można zastosować bardziej rygorystyczne metody płukania, uzupełniając bufor NT2 o deoksycholan sodu, mocznik lub SDS.</li>
 <li>Próbki należy trzymać na lodzie tak długo, jak to możliwe i pracować szybko, aby zminimalizować degradację docelowego mRNA.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Opcjonalnie: Zachować małą alikwotę (10%) mieszaniny kulek lub przeprowadzić dodatkową próbę równolegle w celu sprawdzenia wydajności IP białka docelowego za pomocą analizy Western blot.</li>
</ol>
4. Traktowanie DNazą i proteinazą K
<ol>
 <li>Po przemyciu resuspendować kuleczki w 100 μl buforu NT2 uzupełnionego o 5 μl DNazy 1 wolnej od RNaz (2 U/μl).</li>
 <li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-10 min. Dodać 1 ml buforu NT2 i wirować przy 5,000 x g przez 1 min w temperaturze pokojowej.
 <ol class="lalpha">
 <li>Niewielką alikwotę (~10%) kuleczek można wykorzystać do sprawdzenia wydajności IP za pomocą analizy SDS-PAGE. </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Resuspendować osad PAS w 100 μl buforu NT2, 5 μl Proteinazy K (10 mg/ml) i 1 μl 10% SDS. </li>
 <li>Inkubować resuspendowaną mieszaninę kuleczek przez 30 min w 55 °C w łaźni wodnej, delikatnie potrząsając probówką co 10 min.
 <ol class="lalpha">
 <li>Proteinaza K wspomaga uwalnianie komponentów RNP.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Zwiruć kuleczki przy 5,000 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT) i zebrać nadsącz (~100 μl). </li>
 <li>Dodać 200 μl buforu NT2 do kuleczek, wirować przy 5,000 x g przez 2 min w RT, zebrać nadsącz (~200 μl) i odrzucić kuleczki. </li>
 <li>Połączyć nadsącze (100 μl i 200 μl) i dodać 300 μl dolnej warstwy kwasowego fenolu-CHCl3.</li>
 <li>Wymieszać w wortexie, inkubować przez 1 min w RT (lub w 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem) i wirować przy 16,000 x g w RT przez 1 min.</li>
 <li>Zebrać 250 μl górnej warstwy (NIE naruszać interfazy), dodać 25 μl octanu sodu o pH 5.2, 625 μl 100% ETOH oraz 5 μl glycoblue i dobrze wymieszać.</li>
 <li>Przechowywać przez noc w temperaturze -20 °C.
 <ol class="lalpha">
 <li>Aby zapewnić odpowiedni odzysk RNA, dodatek glycoblue zwiększy widoczność osadu RNA, pełniąc rolę cząsteczki nośnika.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Następnego dnia wymieszać zawartość probówek poprzez 3-5 krotne odwrócenie, wirować przy 12,000 x g w 4 °C przez 30 min i odrzucić nadsącz.</li>
 <li>Dodać 1 ml 70% ETOH do niebieskiego osadu i wymieszać poprzez odwracanie lub wortexowanie.</li>
 <li>Wirować przy 12,000 x g w 4 °C przez 2 min.</li>
 <li>Odrzucić nadsącz i wirować przy 12,000 x g przez 1 min w 4 °C. </li>
 <li>Usunąć resztki 70% ETOH za pomocą pipety i suszyć osad na powietrzu w RT przez 5 min. </li>
 <li>Resuspendować w 20-40 μl wody wolnej od RNaz/DNaz lub innej odpowiedniej objętości w zależności od potrzeb.
 <ol class="lalpha">
 <li>Próbka jest teraz gotowa do dalszych zastosowań, takich jak qRT-PCR lub mikromacierze. </li>
 <li>Do oceny stężenia próbki można wykorzystać spektrofotometrię Nanodrop; jednak w przypadku cennych próbek zaleca się unikanie tej metody, ponieważ może być ona marnotrawna i stosunkowo niedokładna. Sugerujemy normalizację próbek względem transkryptów genów housekeepingowych w celu oceny czystości i wydajności IP dla cennych próbek lub próbek o niskiej wydajności. </li>
 </ol>
 </li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Jeśli procedura zostanie zoptymalizowana i przeprowadzona prawidłowo, immunoprecypitacja powinna przynieść znaczące wzbogacenie docelowych mRNA. Zazwyczaj, w zależności od białka RBP i jego docelowego(ych) mRNA, obserwujemy wzbogacenie od około 10- do 50-krotnego, oceniane za pomocą qRT-PCR. Wiele celów białek RBP można odkryć masowo, stosując analizę mikromacierzy. Metoda ta jest jednak bardziej wrażliwa na degradację w porównaniu z qRT-PCR. W zależności od RBP, liczby celów oraz wydajności reakcji, mikromacierze mogą ujawnić setki nowych celów lub jedynie kilka, o ile w ogóle jakieś. Na przykład jedno z lepiej scharakteryzowanych białek wiążących RNA, HuR, reguluje potranskrypcyjnie ekspresję i translację wielu ważnych genów fizjologicznych 1, 2. Izolacja kompleksu rybonukleoproteinowego HuR za pomocą RIP-Chip w liniach komórkowych raka piersi ujawniła, na przykład, wzbogacenie kilku ważnych, znanych celów HuR, w tym β-aktyny, co wykazano za pomocą qRT-PCR w Rysunku 1. W obu liniach komórkowych nowotworu β-aktyna jest wzbogacona 12- do 15-krotnie. Zazwyczaj, przy prawidłowym wykonaniu, obserwuje się znaczące wzbogacenie β-aktyny w różnych liniach komórkowych. Jednak jeśli RIP nie wykazuje żadnego znaczącego wzbogacenia dla β-aktyny, wskazuje to na problem z RIP i procedura może wymagać powtórzenia. Co więcej, analiza mikromacierzy próbek po immunoprecypitacji z tych linii komórkowych ujawniła odrębne podzbiory ekspresji celów HuR w komórkach raka MCF-7 dodatnich pod kątem receptora estrogenowego (ER) w porównaniu z liniami komórkowymi raka piersi MB-231 ujemnymi pod kątem ER, co przedstawiono na Rysunku 2 1. Cele te dzielą się na kilka kategorii: znane i nieznane cele HuR, które były powiązane lub nie były powiązane z nowotworem. Na przykład CALM2 i CD9 to geny nowotworowe, które nie zostały wcześniej zidentyfikowane jako cele HuR. Korzystając z mikromacierzy i potwierdzając wynik za pomocą qRT-PCR, stwierdzono, że CALM2 i CD9 są wzbogacone 5- do 180-krotnie w osadzie HuR, co wskazuje na silną interakcję między białkiem HuR a tymi genami docelowymi.
<img src="/files/ftp_upload/3851/3851fig1.jpg" alt="Analiza Western blot, wyniki ekspresji białek; β-Tubulin, HuR w liniach komórkowych MB-231, MCF-7." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Immunoprecypitacja i RIP w komórkach raka piersi MB-231 (ER-) i MCF-7 (ER+). Immunoprecypitacje przeprowadzono z lizatów komórkowych MB-231 lub MCF-7 przy użyciu monoklonalnego przeciwciała anty-HuR (3A2) oraz kontroli izotypowej IgG1. A. Western blot po IP dla HuR wykazał prążek o oczekiwanym rozmiarze, wykryty przez 3A2. Panel po prawej stronie przedstawia ilości HuR w lizatach wejściowych (input) z obu linii komórkowych, z β-tubuliną jako kontrolą ładowania. B. Weryfikacja za pomocą ilościowego RT-PCR wykazała odpowiednio piętnasto- i jednokrotne wzbogacenie β-aktyny, znanego celu HuR, w IP 3A2 z komórek MB-231 i MCF-7. Wszystkie wartości ΔΔCT znormalizowano do GAPDH. Eksperymenty wykonano w dubletach (n = 2).
 <img src="/files/ftp_upload/3851/3851fig2.jpg" alt="Równowaga statyczna; wykres XY; naukowa analiza danych; porównanie linii komórkowych; wpływ IgG." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. HuR RIP-CHIP identyfikuje odrębne profile genetyczne w komórkach raka piersi ER+ i ER-. Immunoprecypitacje HuR przeprowadzono z lizatów komórek MB-231 lub MCF-7 przy użyciu przeciwciała przeciwko HuR oraz kontroli izotypowej IgG1, a następnie hybrydyzowano je z macierzami Illumina Sentrix (47 000 genów). Odjęto sygnały kontrolne. Wyniki reprezentują skumulowane dane z 12 różnych macierzy. Eksperymenty wykonano w trzech powtórzeniach (n = 3) dla każdej linii komórkowej wraz z odpowiadającymi im kontrolami. Skale są w log2.

<ol><li>Calaluce, R., Gubin, M. M., Davis, J. W., Magee, J. D., Chen, J., Kuwano, Y., Gorospe, M., Atasoy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+binding+protein+HuR+differentially+regulates+unique+subsets+of+mRNAs+in+estrogen+receptor+negative+and+estrogen+receptor+positive+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer.</a> BMC Cancer. 10, 126-140 (2010).</li>
<li>Gubin, M. M., Calaluce, R., Davis, J. W., Magee, J. D., Strouse, C. S., Shaw, D. P., Ma, L., Brown, A., Hoffman, T., Rold, T. L., Ulus Atasoy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+RNA+binding+protein+HuR+impairs+tumor+growth+in+triple+negative+breast+cancer+associated+with+deficient+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the RNA binding protein HuR impairs tumor growth in triple negative breast cancer associated with deficient angiogenesis.</a> Cell Cycle. 9, 3337-3346 (2010).</li>
<li>Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIP-Chip%3A+the+isolation+and+identification+of+mRNAs%2C+microRNAs+and+protein+components+of+ribonucleoprotein+complexes+from+cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts.</a> Nature Protocols. 1, 302-307 (2006).</li>
<li>Tenenbaum, S. A., Lager, P. J., Carson, C. C., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonomics%3A+identifying+mRNA+subsets+in+mRNP+complexes+using+antibodies+to+RNA-binding+proteins+and+genomic+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Ribonomics: identifying mRNA subsets in mRNP complexes using antibodies to RNA-binding proteins and genomic arrays.</a> Methods. 26, 191-198 (2002).</li>
<li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Atasoy, U., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+regulatory+analysis+using+en+masse+nuclear+run-ons+and+ribonomic+profiling+with+autoimmune+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Genome-wide regulatory analysis using en masse nuclear run-ons and ribonomic profiling with autoimmune sera.</a> Gene. 317, 79-87 (2003).</li>
<li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14085-14090 (2000).</li>
<li>Baroni, T. E., Chittur, S. V., George, A. D., Tennebaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+RIP-Chip+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in RIP-Chip Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 419, 93-108 (2008).</li>
<li>de Silanes Lopez, I., Zhan, M., Lal, A., Yang, X., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+target+RNA+motif+for+RNA-binding+protein+HuR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2987-2992 (2004).</li>
<li>de Silanes Lopez, I., Lal, A., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HuR%3A+post-transcriptional+paths+to+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">HuR: post-transcriptional paths to malignancy.</a> RNA Biol. 2, 11-13 (2005).</li>
<li>Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+stability+using+transcription+inhibitors+and+microarrays+reveals+posttranscriptional+control+of+ribosome+biogenesis+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA stability using transcription inhibitors and microarrays reveals posttranscriptional control of ribosome biogenesis factors.</a> Mol. Cell Biol. 24, 5534-5547 (2004).</li>
<li>Hieronymus, H., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+RNA-protein+interactions+illustrates+specificity+of+the+mRNA+export+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of RNA-protein interactions illustrates specificity of the mRNA export machinery.</a> Nat. Genet. 33, 155-161 (2003).</li>
<li>Hieronymus, H., Yu, M. C., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mRNA+surveillance+is+coupled+to+mRNA+export%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mRNA surveillance is coupled to mRNA export.</a> Genes Dev. 18, 2652-2662 (2004).</li>
<li>Mukherjee, N., Corcoran, D. L., Nusbaum, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Regulatory+Mapping+Indicates+that+the+RNA-Binding+Protein+HuR+Couples+Pre-mRNA+Processing+and+mRNA+Stability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative Regulatory Mapping Indicates that the RNA-Binding Protein HuR Couples Pre-mRNA Processing and mRNA Stability.</a> Molecular Cell. 43, 1-13 (2011).</li>
</ol>

Autorzy declare, że nie mają żadnych konfliktów interesów.

Ze względu na charakter tego eksperymentu, jedynym gwarantowanym sposobem na pomyślne uzyskanie zamierzonych wyników są optymalizacja i doświadczenie. W wielu etapach tej procedury krytyczne znaczenie mają temperatura oraz sprawne obchodzenie się z odczynnikami i produktami. Odpowiednie planowanie i wykonanie techniki pomoże zapewnić, że eksperyment zostanie przeprowadzony w odpowiednim czasie i w zalecanych optymalnych temperaturach. Głównym problemem w eksperymentach z izolacją RNA jest wrażliwość cząsteczek RNA na degradację przez RNazy. Wszystkie odczynniki muszą być wolne od RNaz oraz przechowywane i używane w naczyniach wolnych od RNaz. Jest to kluczowy krok w zapewnieniu integralności próbki mRNA. Nawet w przypadku prawidłowego przeprowadzenia eksperymentu, pożądany rezultat może nie zostać osiągnięty ze względu na charakter oddziaływań między RBP a jego docelowymi mRNA.
Jednym z potencjalnych problemów jest słaby lub całkowity brak sygnału z RNA wyizolowanego metodą RIP-Chip. Choć sygnał z całkowitego RNA może wystąpić, może on być wynikiem niewystarczającego wyciągnięcia białka wiążącego przez koraliki. Pierwszym krokiem w rozwiązywaniu problemów jest potwierdzenie, że stosowany lizat komórkowy wykazuje odpowiednią ekspresję konkretnego RBP. Po potwierdzeniu białko można wyizolować po ostatnim praniu NT2, a następnie zawiesić w buforze Laemmliego lub innym odpowiednim buforze denaturującym i podgrzać w temperaturze 95 °C przez 5 min. Analizę Western blot tych próbek można przeprowadzić w zestawieniu z lizatem wejściowym oraz kontrolami negatywnymi, aby upewnić się, że doszło do wystarczającego wyciągnięcia powiązanego białka.
Ponadto, ponieważ dostęp do tych komponentów wymaga lizy komórek, może dojść do niepożądanych i nienaturalnych oddziaływań między białkami a mRNA, które w normalnych warunkach są od siebie odseparowane. Oddziaływania te mogą prowadzić do niespecyficznego wiązania i „wyłapywania” docelowych cząsteczek mRNA lub białek wiążących. Dodatkowo, białka w różnych warunkach mogą przyjmować wiele wariantów konformacyjnych, przez co ich motywy wiążące mogą stać się niedostępne dla docelowych mRNA, co uniemożliwi ich interakcję. Oba te czynniki podkreślają znaczenie sprawnej pracy oraz stosowania optymalnych temperatur wymienionych w protokole, aby ograniczyć te niepożądane oddziaływania. Ponadto kluczowa dla maksymalizacji czystości interakcji będzie optymalizacja warunków przemywania dla każdego konkretnego białka docelowego. Może być konieczne zastosowanie bardziej rygorystycznych warunków przemywania. Na przykład bufor do przemywania można uzupełnić o SDS lub odpowiednią ilość mocznika, aby zredukować niespecyficzne oddziaływania i tło w sygnale wyjściowym. Będzie to całkowicie zależne od badanego przez eksperymentatora RBP oraz docelowego mRNA w jego unikalnych warunkach fizjologicznych. Niektóre warunki nie będą odpowiednie dla określonych narzędzi analizy mRNA, co należy uwzględnić podczas przygotowywania próbek.
Wreszcie, mimo że metoda RIP skutecznie wzbogaca interakcje RNA-RBP, powszechnie znany problem z metodą RIP (CHIP) polega na niemożności zidentyfikowania specyficznych domen wiązania RBP na przejściowych celach mRNA. W celu izolacji unikalnych sekwencji docelowych można zastosować kilka technik sieciowania, po których następuje RIP; jednakże stosowanie krótkofalowego promieniowania UV wykazuje tendencję do powodowania uszkodzeń kwasów nukleotychowych. Nowa metoda znana jako PAR-CLIP, czyli sieciowanie fotoaktywnego rybonukleozydu i immunoprecypitacja, wykorzystuje długofalowe promieniowanie UV do wbudowania tiourydyny w nowo powstające RNA, co umożliwia identyfikację unikalnych miejsc wiązania zarówno w stabilnych, jak i przejściowych interakcjach RNA.
Ogólnie rzecz biorąc, metoda RIP-Chip została uznana przez naszą grupę, jak i przez wiele innych grup badawczych, za doskonałe narzędzie służące do izolacji i badania oddziaływań między białkami wiążącymi RNA a ich docelowymi cząsteczkami mRNA. Pomimo że procedura ta jest w swej naturze i praktyce wymagająca, jej prawidłowe wykonanie pozwoli na wyizolowanie tych kompleksów RNP, które do niedawna pozostawały nieosiągalne dla odkryć i analiz.

<table><tbody><tr><td>1 M ditiotreitol</td><td>Fisher</td><td>BP172-5</td><td>DTT</td></tr><tr><td>DNaza 1</td><td>Ambion</td><td>2235</td><td>wolna od RNaz</td></tr><tr><td>Kwas etylendiaminotetraoctowy</td><td>Fisher</td><td>BP118-500</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>Ambion</td><td>9516</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-100G</td><td>pH 7.0</td></tr><tr><td>Igepal Nonidet P-40</td><td>USB</td><td>78641</td><td>NP40</td></tr><tr><td>1 M KCl</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Bufor NT2</td><td>*Patrz poniżej</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy polisomów</td><td>*Patrz poniżej</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tabletki z koktajlem inhibitorów proteaz</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Kuleczki Protein A Sepharose</td><td>Sigma</td><td>P3391</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Fisher</td><td>BP1700-100</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNaz RNase Out</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td>40 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>1 M NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Fisher</td><td>BP166-500</td><td>SDS</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl</td><td>Fisher</td><td>BP153-500</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Kompleksy wanadyloribonukleozydowe</td><td>New England Labs</td><td>S1402S</td><td>VRC</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Przygotowanie odczynników&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przygotować odczynniki w szklanych naczyniach wolnych od RNaz/DNaz, traktowanych DEPC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bufor do lizy polisomów&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM HEPES (pH 7.0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5% NP40</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM DTT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 jednostek/ml RNase Out</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>400 &amp;mu;M VRC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tabletka z koktajlem inhibitorów proteaz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;5 ml buforu do lizy polisomów&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dodać 50 &amp;mu;l 1 M HEPES (pH 7.0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 &amp;mu;l 1 M KCL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 &amp;mu;l 1 M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 &amp;mu;l NP40</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4,7 ml H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O wolnej od RNaz-DNaz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;mu;l 1 M DTT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12,5 &amp;mu;l 100 U/ml RNase Out</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l koktajlu inhibitorów proteaz (rozpuszczonego zgodnie z instrukcją producenta)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;l 200 mM VRC (w momencie użycia)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bufor NT2&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris-HCl (pH 7.4)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>150 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,05% NP40</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;1 L buforu NT2&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tris (pH 7.4)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 ml 5 M NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml 1 M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 &amp;mu;l NP40</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>820 ml H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O wolnej od RNaz-DNaz </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metoda izolacji i identyfikacji mrna, mikrorna oraz komponentów białkowych kompleksów rybonukleoproteinowych z ekstraktów komórkowych z wykorzystaniem techniki rip-chip

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

W wyniku rozwoju sekwencjonowania wysokoprzepustowego i wydajnej analizy mikromacierzy, globalna analiza ekspresji genów stała się łatwą i powszechnie dostępną formą gromadzenia danych. Jednak w wielu modelach badawczych i chorobowych stacjonarne poziomy mRNA genów docelowych nie zawsze korelują bezpośrednio ze stacjonarnymi poziomami białek. Prawdopodobnym wyjaśnieniem tej rozbieżności jest potranskrypcyjna regulacja genów. Regulacja potranskrypcyjna, sterowana przez wiązanie białek wiążących RNA (RBP), wpływa na lokalizację, stabilność i translację mRNA poprzez tworzenie kompleksu rybonukleoproteinowego (RNP) z docelowymi cząsteczkami mRNA. Identyfikacja tych nieznanych celów mRNA de novo z ekstraktów komórkowych w kompleksie RNP jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów i funkcji RBP oraz ich końcowego wpływu na produkcję białek. Niniejszy protokół opisuje metodę zwaną immunoprecypitacją RNP z analizą na mikromacierzy (RIP-Chip), która umożliwia identyfikację specyficznych mRNA związanych w kompleksie rybonukleoproteinowym w zmiennych warunkach eksperymentalnych, wraz z opcjami dalszej optymalizacji eksperymentu dla poszczególnych badaczy. Dzięki temu istotnemu narzędziu eksperymentalnemu naukowcy mogą badać zawiłe mechanizmy związane z potranskrypcyjną regulacją genów, a także inne oddziaływania rybonukleoproteinowe.

Protokół krok po kroku dotyczący izolacji i identyfikacji kompleksów związanych z RNA za pomocą metody RIP-Chip.

Metoda izolacji i identyfikacji mRNA, mikroRNA oraz komponentów białkowych kompleksów rybonukleoproteinowych z ekstraktów komórkowych z wykorzystaniem techniki RIP-Chip

W wyniku rozwoju sekwencjonowania wysokoprzepustowego oraz efektywnej analizy mikromacierzy, globalna analiza ekspresji genów stała się łatwa i...

Celem tego filmu jest zaprezentowanie metody izolacji i identyfikacji RNA oraz komponentów białkowych kompleksów rybonukleoproteinowych z ekstraktów komórkowych przy użyciu metod immunoprecypitacji. Witam, nazywam się Garrett Dom i jestem doktorantem w departamencie biologii molekularnej, mikrobiologii i immunologii na University of Missouri, gdzie prowadzę badania pod kierownictwem dr. Eli sso. Dzięki postępowi w sekwencjonowaniu wysokoprzepustowym oraz wydajnej analizie mikromacierzy, globalna analiza i badanie ekspresji genów stały się łatwą i powszechnie dostępną formą gromadzenia danych w wielu modelach badawczych i chorobowych.Niemniej jednak stężenia mRNA genu docelowego w stanie stacjonarnym nie zawsze korelują bezpośrednio z poziomami białek w stanie stacjonarnym. Prawdopodobnym wyjaśnieniem tej rozbieżności jest potranskrypcyjna regulacja genów, sterowana przez oddziaływania białek wiążących RNA.Regulacja potranskrypcyjna wpływa na lokalizację, stabilność i translację mRNA poprzez tworzenie kompleksu rybonukleoproteinowego z docelowymi cząsteczkami mRNA. Identyfikacja nieznanych celów mRNA de novo w tym kompleksie z ekstraktów komórkowych jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów i funkcji białek wiążących RNA oraz ich wpływu na poziom syntezy białek. Niniejszy protokół opisuje metodę zwaną immunoprecypitacją białka rybonukleoproteinowego, lub RIP, która umożliwia identyfikację specyficznych cząsteczek mRNA związanych w kompleksie rybonukleoproteinowym.Przed rozpoczęciem eksperymentu kluczowe jest zgromadzenie wszystkich odczynników, pojemników i narzędzi. Szklane naczynia należy potraktować inhibitorem RNaz, takim jak RNA ZAP od firmy Ambion, a następnie wypłukać wodą traktowaną DPIC; należy upewnić się, że wszystkie odczynniki są potwierdzone jako wolne od RNaz. Pierwszym krokiem procedury jest wyizolowanie kompleksu rybonukleoproteinowego z lizatu komórkowego; należy zebrać komórki tkankowe w fazie wzrostu wykładniczego, aby uzyskać od 2 mg do 5 mg całkowitego białka dla każdej użytej próbki; zazwyczaj wystarczające są dwie szalki hodowlane P150.W niniejszym doświadczeniu przeprowadzamy zbiór linii komórkowych raka piersi u ludzi MB 2 31 oraz MC seven, a następnie badamy interakcje rybonukleoproteinowe białka wiążącego RNA. Należy zauważyć, że dla każdego badanego białka wiążącego RNA całkowita liczba komórek oraz ilość białka muszą zostać zoptymalizowane, aby zmaksymalizować odpowiednie interakcje między docelowym mRNA a białkiem wiążącym RNA. Komórki należy odwirować przy 1000 RPM przez około 8 do 10 minut w temperaturze 4°C, a następnie trzykrotnie przemyć lodowatym PBS. Po ostatnim przemyciu należy delikatnie uderzyć w dno probówki i resuspender osad komórkowy w równych objętościach przygotowanego buforu do lizy polisomalnej z inhibitorami RNaz i proteaz.Zaleca się dokładne odmierzenie objętości osadu komórkowego, delikatne pipetowanie mieszaniny w celu rozbicia skupisk komórek oraz inkubację lizatu na lodzie przez pięć minut. Odwiruj próbkę przy 13 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby oczyścić lizat z zanieczyszczeń, a następnie niezwłocznie przenieś oczyszczony nadsącz do schłodzonych wcześniej mikroprobówek do wirowania przeznaczonych do RNA, przechowując je na lodzie i w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Lizat ten można przechowywać do sześciu miesięcy w temperaturze -80 °C. Należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ mogą one prowadzić do degradacji białek i/lub mRNA. Zaleca się przeprowadzenie IP niezwłocznie.Należy szybko oznaczyć stężenie białka w lizacie, wykorzystując standardowy test Bradforda. Następnie należy przygotować materiały do izolacji konkretnego białka docelowego. W pierwszej kolejności należy przeprowadzić wstępne pęcznienie białka.Kuleczki Sphero inkubuje się przez noc w buforze NT two uzupełnionym o 5% BSA, przechowując w temperaturze 4°C. Bufor NT two stosuje się w stosunku 4:1 do kuleczek PAS. Możliwe jest długoterminowe przechowywanie do kilku miesięcy w temperaturze 4°C.W przypadku uzupełnienia o 0,1% azotku sodu przed użyciem, należy usunąć nadmiar buforu NT two, aby końcowy stosunek kulek do buforu wynosił jeden do jednego. Używając probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml wolnych od RNA, należy odobrać 100 µL zawiesiny SRO speed i dodać 30 µg przeciwciała dla każdej pojedynczej reakcji IP. Na przykład w naszym doświadczeniu stosujemy przeciwciało who are, którym jest przeciwciało mysie IgG1.W związku z tym naszym przeciwciałem kontrolnym jest również przeciwciało IgG. Następnie należy dodać od 100 do 200 µL buforu NT dwa do mieszaniny kulek z przeciwciałami. Dodatkowo, równolegle należy zastosować przeciwciało o tym samym izotypie lub pełne normalne serum z tego samego gatunku jako kontrolę przeciwciał w celu wykluczenia tła RNA.Dodaj odpowiednie przeciwciało do mieszaniny kulek i inkubuj przez noc, obracając w rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotuj kulki pokryte przeciwciałami bezpośrednio przed użyciem, przemywając je pięciokrotnie jednym mililitrem lodowatego buforu NT dwa. Przemywaj kulki poprzez wirowanie przy 13 000 G przez jedną do dwóch minut w temperaturze czterech stopni. Ostrożnie usuń nadsącz za pomocą pipety ręcznej lub aspiratora.To płukanie pomaga usunąć niezwiązane przeciwciała, a także zanieczyszczenia RNA z mieszaniny przeciwciał. Po zakończeniu ostatniego płukania, ponownie zawiesić kuleczki w 700 µL lodowatego buforu NT2, a następnie zastosować różne inhibitory RNaz w celu ochrony docelowych mRNA, w tym 10 µL RNazyze, 10 µL 100 mM DTT oraz 15 µL EDTA. Uzupełnić objętość do 900 µL za pomocą buforu NT2.Następnie przeprowadzimy immunoprecypitację docelowego kompleksu. W celu zredukowania sygnału tła w analizie RNA po procedurze RIP zdecydowanie zalecamy wykonanie etapu wstępnego oczyszczania (pre-clear): inkubować z 15 µg kontroli izotypowej przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Dodać 50 µL wstępnie napęczniałych kulek PAS niezwiązanych z przeciwciałem.Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C przy jednoczesnym rotowaniu, a następnie wirować w wirówce przy 10 000 g w temperaturze 4 °C. Odwirować osad. Nadnadczyn zachować do immunoprecypitacji (IP).Następnie dodaj 100 µL wyizolowanego, oczyszczonego lizatu zawierającego około dwóch do pięciu mg białka do przygotowanej mieszaniny przeciwciał. Rozcieńczenie lizatu pomoże zmniejszyć tło; zamknij probówkę i zaciśnij wieczko (Parafilm), a następnie inkubuj w temperaturze 4 °C przez cztery godziny w warunkach obrotowych. Następnie odwiruj kuleczki przy 5 000 G przez pięć minut w temperaturze 4 °C i zachowaj supernatant do ewentualnej analizy, przechowując go w temperaturze -80 °C, zgodnie z wcześniejszym opisem. Przemyj kuleczki pięć razy 1 mL lodowatego buforu TNT, wirując po każdym razie.Następnie usunąć supernatant za pomocą pipety ręcznej lub aspiratora. W celu zmniejszenia tła można zastosować bardziej rygorystyczne metody, uzupełniając bufor NT two o dodecylosiarczan sodu, mocznik lub SDS. Próbki należy przechowywać na lodzie tak długo, jak to możliwe, i pracować szybko, aby zminimalizować degradację docelowego mRNA.Na koniec zastosujemy traktowanie DNazą i proteinazą K, a następnie wytrącanie RNA w celu wyizolowania RNA z rybonukleoprotein; po przemyciu resuspenduj koraliki w 100 µL buforu N NT two uzupełnionego o 5 µL DNazy I wolnej od RNA. Przechowuj próbki w temperaturze 37 °C przez 5 do 10 minut. Dodaj 1 mL buforu N NT two i wiruj przy 5 000 ×g przez 5 minut.Odciąć supernatant, zawiesić osad SROs w 100 µL buforu NT2 z dodatkiem 5 µL proteinazy K o stężeniu 10 mg/mL oraz 1 µL 10% SDS. Inkubować zawiesinę kulek przez 30 minut w kąpieli wodnej o temperaturze 55 °C, delikatnie potrząsając naczyniem co 10 minut. Proteinaza K wspomaga uwalnianie komponentów rybonukleoproteinowych. Odwirować kulki w celu uzyskania osadu.Wiruj z prędkością 5 000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie zbierz nadsącz, którego objętość powinna wynosić około 100 µl. Następnie do kulek dodaj 200 µl buforu NT 2 i wiruj z prędkością 5 000 G przez dwie minuty. Zbierz około 200 µl nadsączu i odrzuć kulki.Połączyć supernatant i dodać 300 µL kwasowego fenolu do dolnej warstwy, a następnie wymieszać w wirówce vortex. Inkubować przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i wirować z maksymalną prędkością w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Zebrać 250 µL górnej warstwy.Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie zakłócić powierzchni rozdziału, ponieważ spowoduje to zanieczyszczenie. Do próbki RNA dodać 25 µL octanu sodu o pH 5,2, 625 µL schłodzonego 100% etanolu oraz 5 µL mieszaniny GlycoBlue. Dobrze wymieszać i przechowywać przez noc w temperaturze -20 °C.Dodatkowo, aby zapewnić prawidłowe odzyskanie RNA, dodanie glyco blue zwiększy widoczność osadu RNA, pełniąc rolę cząsteczki nośnika. Następnego dnia wymieszać zawartość probówek, odwracając je trzy do pięciu razy, a następnie wirować przy 12 000 G w temperaturze 4 °C przez 30 minut i odrzucić nadsącz. Do niebieskiego osadu dodać 1 ml schłodzonego 70% etanolu i wymieszać poprzez odwracanie lub wortexowanie, a następnie odwirować.Wirować próbkę przy 12 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie minuty. Odrzucić supernatant i wirować przy 12 000 G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć pozostały 70% etanol za pomocą pipety i wysuszyć osad na powietrzu.Pozostawić w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Rozpuścić ponownie w 20 do 40 µL wody wolnej od RNaz i DNaz. Próbka jest teraz gotowa do ilościowego oznaczenia za pomocą spektrometrii NanoDrop oraz do dalszych zastosowań, takich jak ilościowa PCR w czasie rzeczywistym lub analiza mikromacierzy. Po izolacji RNA przeprowadzono analizę mikromacierzy oraz ilościową PCR w czasie rzeczywistym, aby zidentyfikować cele mRNA białka wiążącego RNA who are oraz stopień ich wzbogacenia w wyniku immunoprecypitacji.Potwierdzenie za pomocą western blot wykazuje czystą izolację białek. Ilościowy PCR demonstruje krotność wzbogacenia mRNA beta actin w porównaniu z kontrolami IgG. Podczas gdy analiza mikromacierzy ujawnia unikalne profile genetyczne linii komórkowych raka piersi MC seven oraz MB 2 31, immunoprecypitacja rybonukleoprotein została uznana przez naszą grupę, jak i przez wiele innych grup badawczych, za doskonałe narzędzie służące do izolacji i badania oddziaływań między białkami wiążącymi RNA a ich celami mRNA. Pomimo że procedura ta jest z natury i w praktyce wymagająca, jej prawidłowe wykonanie pozwoli na izolację tych kompleksów rybonukleoproteinowych, które do niedawna były niedostępne dla odkryć i analiz.

method-for-isolation-identification-mrnas-micrornas-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda izolacji i identyfikacji mRNA, microRNA i białkowych składników kompleksów rybonukleoproteinowych z ekstraktów komórkowych za pomocą RIP-Chip

Ze względu na przejściowy charakter pre-mRNA, jego izolacja i badanie in vivo mogą być trudne. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście in vitro do badania oddziaływań RNA-białko z wykorzystaniem syntetycznej puli oligonukleotydów, która pokrywa wybrane regiony pre-mRNA.

Szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

Analiza ekspresji genów w podzbiorze komórek w określonej tkance stanowi duże wyzwanie. W tym artykule opisano, jak wyizolować wysokiej jakości całkowite RNA z określonej populacji komórek, łącząc metodę szybkiego znakowania immunologicznego z mikrodysekcją wychwytu laserowego.

Izolacja RNA z subpopulacji specyficznych dla komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej w połączeniu z szybkim znakowaniem immunologicznym

Ten manuskrypt opisuje podejście do izolacji wybranych pokrewnych RNP powstałych w komórkach eukariotycznych poprzez specyficzne wzbogacenie ukierunkowane na oligonukleotydy. Wykazujemy możliwość zastosowania tego podejścia poprzez wyizolowanie pokrewnego RNP związanego z retrowirusowym regionem 5' bez translacji, który składa się z helikazy DHX9 / RNA A.

Izolacja pokrewnych kompleksów RNA-białko z komórek za pomocą elucji kierowanej oligonukleotydami

Interakcje RNA-białko leżą u podstaw wielu procesów komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę in vivo do izolowania specyficznego RNA i identyfikowania nowych białek, które są z nim związane. Może to rzucić nowe światło na to, w jaki sposób RNA są regulowane w komórce.

Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

Ten raport opisuje szybką i niezawodną metodę walidacji celów mRNA komórkowych miRNA. Metoda wykorzystuje syntetyczne biotynylowane miRNA oparte na zablokowanych kwasach nukleinowych (LNA) do wychwytywania docelowego mRNA. Następnie kulki magnetyczne pokryte streptawidyną są wykorzystywane do ściągania docelowego mRNA w celu ilościowego oznaczania w reakcji łańcuchowej polimerazy qPCR.

Test pulldown na bazie biotyny do walidacji celów mRNA komórkowych miRNA

Opisano procedurę tandemowej izolacji RNA (TRIP) w celu odzyskania endogennie utworzonych kompleksów mRNA-białko. W szczególności kompleksy RNA-białko są sieciowane in vivo, poliadenylowane RNA są izolowane z ekstraktów z kulkami oligo(dT), a poszczególne mRNA są wychwytywane za pomocą zmodyfikowanych oligonukleotydów antysensownych RNA. Białka związane z mRNA są wykrywane za pomocą analizy immunoblot.

Procedura izolacji tandemowego RNA oparta na oligonukleotydach w celu odzyskania eukariotycznych kompleksów mRNA-białko

Przedstawiono szczegółowy protokół stosowania strategii CARIC (ang. click chemistry-assisted RNA-interactome capture) do identyfikacji białek wiążących się zarówno z kodującymi, jak i niekodującymi RNA.

Wychwytywanie i identyfikacja białek wiążących RNA za pomocą strategii wychwytywania interaktomu RNA wspomaganej chemią kliknięcia (CARIC)

Tutaj opisujemy krok po kroku strategię izolowania małych RNA, wzbogacania mikroRNA i przygotowywania próbek do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Następnie opisujemy, jak przetwarzać odczyty sekwencji i dopasowywać je do mikroRNA za pomocą narzędzi open source.

Kompletny potok do izolowania i sekwencjonowania mikroRNA oraz analizowania ich przy użyciu narzędzi open source

Tutaj prezentujemy protokół wzbogacania endogennych miejsc wiązania RNA lub "śladów" kompleksów RNA:białko (RNP) z komórek ssaków. Podejście to obejmuje dwie immunoprecypitacje podjednostek RNP i dlatego nazywa się immunoprecypitacją RNA w tandemie (RIPiT).

Identyfikacja śladów RNA:Kompleksy białkowe poprzez immunoprecypitację RNA w tandemie, a następnie sekwencjonowanie (RIPiT-Seq)

Tutaj opisujemy immunoprecypitację rybosomów i związanego z nimi RNA z wybranych populacji dorosłych męskich komórek rozrodczych myszy za pomocą systemu RiboTag. Strategiczna hodowla i staranna immunoprecypitacja skutkują czystymi, powtarzalnymi wynikami, które informują o translatomie komórek rozrodczych i dostarczają wglądu w mechanizmy zmutowanych fenotypów.

Immunoprecypitacja RiboTag w komórkach rozrodczych samca myszy

Poznaj metodę izolacji kompleksów rybonukleoproteinowych z ekstraktów komórkowych przy użyciu immunoprecypitacji. Technika ta umożliwia identyfikację mRNA wiążących się z białkami RNA w badaniach nad regulacją genów.

Metoda izolacji i identyfikacji mRNA, mikroRNA i składników białkowych kompleksów rybonukleoproteinowych z ekstraktów komórkowych za pomocą RIP-Chip (Wideo) | JoVE Journal

Metoda izolacji i identyfikacji mRNA, mikroRNA oraz komponentów białkowych kompleksów rybonukleoproteinowych z ekstraktów komórkowych z wykorzystaniem techniki RIP-Chip

Przeglądaj więcej filmów