Metoda izolacji i identyfikacji mRNA, mikroRNA i składników białkowych kompleksów rybonukleoproteinowych z ekstraktów komórkowych za pomocą RIP-Chip

Celem tego filmu jest zademonstrowanie metody izolacji i identyfikacji RNA i składników białkowych kompleksów rybonukleoproteinowych z ekstraktów komórkowych przy użyciu metod immunoprecypitacji. Witam, nazywam się Garrett Dom i jestem doktorantem na wydziale Mikrobiologii Molekularnej i Mikrobiologii oraz immunologii na Uniwersytecie Missouri, studiuję pod kierunkiem Dr.Eli sso. Dzięki postępowi w sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości i wydajnej analizie mikromacierzy, globalna ekspresja i analiza genów stała się łatwą i łatwo dostępną formą gromadzenia danych w wielu badaniach i modelach chorób.

Jednak poziomy mRNA w stanie badania genu docelowego nie zawsze są bezpośrednio skorelowane z poziomami białek w stanie stacjonarnym. Potranskrypcyjna regulacja genów jest prawdopodobnym wyjaśnieniem rozbieżności między nimi. Napędzany przez interakcje białek wiążących RNA.

Regulacja potranskrypcyjna wpływa na lokalizację, stabilność i translację mRNA poprzez tworzenie kompleksu białkowego nukleo żeberkowego z docelowymi mRNA. Identyfikacja tych nieznanych celów mRNA Denovo z ekstraktów komórkowych w tym kompleksie ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów i funkcji białka wiążącego RNA oraz ich wynikającego z tego wpływu na produkcję białka. Protokół ten przedstawia metodę określaną jako białko rybo, immunoprecypitacja immunologiczna lub rip, która pozwala na identyfikację specyficznych mRNA związanych z kompleksem rybonukleoproteinowym.

Przed rozpoczęciem eksperymentu bardzo ważne jest, aby mieć wszystkie odczynniki, pojemniki i przybory kuchenne. Naczynia szklane wolne od RNA należy traktować inhibitorem R nazy, takim jak RNA ZAP z ambionu, a następnie spłukiwać wodą uzdatnioną dpci i upewnić się, że wszystkie odczynniki są potwierdzone jako wolne od RNA. Pierwszym krokiem procedury jest zebranie kompleksu białkowego nukleo żeber z lizatu komórkowego w celu zebrania wykładniczo rosnących komórek tkankowych w celu wytworzenia od dwóch do pięciu miligramów całkowitego białka na każdą użytą próbkę, zwykle wystarczą dwie szalki hodowlane P one 50.

Tutaj zbieramy MB 2, 31 i MC, siedem linii komórkowych ludzkiego raka piersi i badamy interakcje nukleo ribonu białka wiążącego RNA. Kim są Ważne jest, aby pamiętać, że dla każdego badanego białka wiążącego RNA całkowita liczba komórek i ilość białka muszą być zoptymalizowane, aby zmaksymalizować odpowiednie docelowe interakcje mRNA i białek wiążących RNA. Komórki osadkowe przez wirowanie przy 1000 obr./min przez około osiem do 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie trzykrotnie przemyć lodowatym PBS Po końcowym płukaniu delikatnie przesunąć dno probówki i ponownie zawiesić osad komórkowy w równych objętościach przygotowanego buforu do lizy polisomalnej z RNA i inhibitorami proteazy.

Zaleca się dokładne odmierzenie objętości mieszaniny granulek komórkowych delikatnie pipetować, aby rozbić grudki komórek i inkubować lizat na lodzie przez pięć minut. Wirować w temperaturze 13 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby oczyścić lizat z zanieczyszczeń, natychmiast przenieść oczyszczony supernatant do wstępnie schłodzonego RNA. Wolne mikroprobówki wirówkowe trzyma się na lodzie i przechowuje w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Lizaat ten może być przechowywany do sześciu miesięcy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Unikaj powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ może to prowadzić do degradacji białka i/lub mRNA. Najlepiej zrobić IP od razu.

Wykonaj szybkie ilościowe określenie stężenia białka i lizatu za pomocą standardowego testu białka Bradforda. Następnie będziemy musieli przygotować materiały do wyizolowania naszego specyficznego białka, które nas interesuje. Pierwsze białko przed pęcznieniem.

Sphero kuli przez noc w buforze N NT two uzupełnionym 5% BSA przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Użyj buforu NT dwa w stosunku cztery do jednego z koralikami PAS. Możliwe jest długotrwałe przechowywanie do kilku miesięcy w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po uzupełnieniu 0,1% izodu sodu przed użyciem usuń nadmiar buforu NT dwa, tak aby końcowy stosunek kulek do buforu wynosił jeden do jednego. Używając mikroprobówek wirówkowych o pojemności 1,5 mililitra wolnych od RNA, usuń 100 mikrolitrów zawiesiny SRO i dodaj 30 mikrogramów przeciwciała na każdą pojedynczą reakcję IP. Na przykład w naszym eksperymencie używamy przeciwciała who are, które jest mysim przeciwciałem IgG one.

Dlatego nasze przeciwciało kontrolne jest również przeciwciałem IgG. Następnie dodaj 100 do 200 mikrolitrów buforu NT dwa do mieszanki kulek przeciwciał. Dodatkowo, przeciwciało zgodne z izotypem lub cała normalna surowica tego samego gatunku powinny być stosowane równolegle jako kontrola przeciwciał przeciwko RNA tła.

Dodaj odpowiednie przeciwciało do mieszanki kulek i inkubuj przez noc, przewracając się do góry w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotować kulki pokryte przeciwciałami bezpośrednio przed użyciem, przemywając jednym mililitrem lodowatego buforu NT dwa razy kulki przemyte przez odwirowanie w temperaturze 13 000 G przez jedną do dwóch minut w czterech stopniach. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipetera ręcznego lub aspiratora.

To płukanie pomaga usunąć niezwiązane przeciwciała, a także zanieczyszczenia RNA z mieszaniny przeciwciał. Po zakończeniu końcowego płukania resus zawiesić kulki i 700 mikrolitrów lodowatego buforu T dwa, a następnie poddać działaniu różnych inhibitorów RNA w celu ochrony docelowych mRNA, w tym 10 mikrolitrów RNA, 10 mikrolitrów 100 milimolowych DTT i 15 mikrolitrów EDTA. Doprowadzić objętość do 900 mikrolitrów za pomocą buforu NT dwa.

Następnie poddamy immunoprecyzację docelowego kompleksu. Zdecydowanie zalecamy użycie kroku wstępnego czyszczenia w celu zmniejszenia sygnału tła w analizie RNA po procedurze rozdarcia wstępnego czyszczenia za pomocą 15 mikrogramów kontroli izotypu przez 30 minut w czterech stopniach Celsjusza. Dodaj 50 mikrolitrów napęczniałych kulek PAS niepokrytych przeciwciałem.

Inkubować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza z rotacją i ponownie w wirówce w temperaturze 10 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dwa śruty. Zapisz super natin dla ip.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów izolowanego oczyszczonego lizatu z około dwoma do pięciu miligramów białka do przygotowanej mieszanki przeciwciał. Rozcieńczanie lizatu pomoże zredukować rurkę owijającą tło i paraformę, aby zapewnić szczelny sufit i inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery godziny, bębnąc i ponad w kolejnych kulkach granulek w temperaturze 5 000 G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza i zachować supernat do analizy potencjału poprzez przechowywanie w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, jak opisano wcześniej. Umyj koraliki pięć razy jednym mililitrem lodu i T dwa i odwirowanie.

Następnie usuń super natin za pomocą pipetara ręcznego lub aspiratora. Można zastosować bardziej rygorystyczne metody w celu zmniejszenia tła poprzez uzupełnienie buforu NT dwa deoksycoatem sodu, moczem lub SDS. Utrzymuj próbki na lodzie tak często, jak to możliwe i pracuj szybko, aby zminimalizować degradację docelowego mRNA.

Na koniec zastosujemy leczenie DNA i proteinazą K, a następnie wytrącanie RNA w celu wyizolowania RNA białka jądrowego ribonu po umyciu kulek ponownego zawieszenia 100 mikrolitrami buforu N NT dwa uzupełnionego pięcioma mikrolitrami wolnych DNA RNA jeden. Próbki należy przechowywać w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do 10 minut. Dodać jeden mililitr buforu N NT dwa i wirować w temperaturze 5 000 G przez pięć minut.

Odrzuć białko wirowe SUPERNAT Reese, osad SRO i 100 mikrolitrów buforu NT dwa z pięcioma mikrolitrami proteinazy K w ilości 10 miligramów na mililitr i jeden mikrolitr 10% SDS, inkubuj zawieszoną mieszaninę kulek przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 55 stopni Celsjusza, delikatnie przesuwając co 10 minut. Proteinaza K pomoże w uwalnianiu składników białkowych nukleo żeber. Koraliki pelletowe.

Dodaj 5 000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, zbierz super nazwę, która powinna mieć około 100 mikrolitrów objętości. Następnie dodać 200 mikrolitrów wirówki dwubuforowej NT o stężeniu 5 000 G przez dwie minuty. Zbierz około 200 mikrolitrów super natinu i wyrzuć koraliki.

Połącz super natin i dodaj 300 mikrolitrów wiru fenolowego z kwasem dolnej warstwy. Jedna minuta w temperaturze pokojowej i wirować z maksymalną prędkością w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Zbierz 250 mikrolitrów górnej warstwy.

Bądź bardzo ostrożny, aby nie zakłócać interfejsu, ponieważ spowoduje to zanieczyszczenie. Do próbki RNA dodać 25 mikrolitrów octanu sodu o pH 5,2 625 mikrolitrów schłodzonego, 100% etanolu i pięć mikrolitrów mieszanki glikoniebieskiej. Dobrze przechowywać przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Dodatkowo w celu zapewnienia prawidłowego odzysku RNA. Dodatek błękitu glikologicznego zwiększy widoczność pastylki RNA, działając jako cząsteczka nośnika następnego dnia, wymieszaj probówki, odwracając trzy do pięciu razy, a następnie wiruj w temperaturze 12 000 G w czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut i wyrzuć super natynę. Dodaj jeden mililitr schłodzonego, 70% etanolu do niebieskiego granulatu i wymieszaj za pomocą wirówki inwersyjnej lub wirowej.

Pobierać próbkę w temperaturze 12 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie minuty. Odrzucić supernat i odwirować w temperaturze 12 000 G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń wszelkie pozostałości, 70% etanol za pomocą pipety i suchego osadu na powietrzu.

Dodaj temperaturę pokojową przez pięć minut. Ponownie wydaj od 20 do 40 mikrolitrów RNA, wody wolnej od DNA. Próbka jest teraz gotowa do oceny ilościowej za pomocą spektrometrii NanoDrop i dalszych zastosowań, takich jak ilościowy PCR w czasie rzeczywistym lub analiza mikromacierzy po izolacji RNA, mikromacierz i ilościowy PCR w czasie rzeczywistym w celu ujawnienia celów mRNA białka wiążącego RNA, które są, i ich wynikającego wzbogacenia w wyniku immunoprecypitacji.

Potwierdzenie za pomocą western blot ujawnia czystą izolację tego, kim jest białko. Ilościowy PCR wykazuje wzbogacenie w fałd docelowej aktyny beta mRNA w porównaniu z kontrolami IgG one. Podczas gdy analiza mikromacierzy ujawnia unikalne profile genetyczne między MC 7 a MB 2 31, ogólna immunoprecypitacja białek jądra żeber linii komórkowych raka piersi została uznana za doskonałe narzędzie wykorzystywane do izolowania i badania interakcji między białkami wiążącymi RNA a ich MR. Cel naszej grupy, jak i wielu innych grup badawczych, choć wrażliwy w swej naturze i praktyce, prawidłowe wykonanie tej procedury zaowocuje wyizolowaniem tych kompleksów białkowych nukleowarstw żeber, które do niedawna były niedostępne do odkrycia i analizy.