Izolacja chromatyny przez oczyszczanie RNA (ChIRP)

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest określenie regionów DNA, które są związane ze specyficznym niekodującym RNA za pomocą QPCR lub sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Osiąga się to poprzez sieciowanie komórek w celu wychwytywania natywnych interakcji D-N-A-R-N-A in vivo. W drugim etapie komórki są poddawane lizie i poddawane sonikacji w celu rozpuszczenia lizatu komórkowego i czystej chromatyny na małe fragmenty.

Następnie do lizatu komórkowego dodaje się biotynylowane oligonukleotydy antysensowne w celu specyficznego wzbogacenia interesujących kompleksów R-N-A-D-N-A, które wyjaśniają tożsamość niekodujących miejsc genomowych związanych z RNA w oparciu o QPCR lub sekwencjonowanie wysokoprzepustowe. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak R-N-A-D-N-A FISH, jest to, że chirp umożliwia mapowanie całego genomu niekodujących miejsc wiązania RNA w rozdzielczościach bliskich parom zasad. Ta metoda może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie niekodującego RNA, takie jak to, w jaki sposób skały, RNA i samce much osiągają kompensację dawki.

Implikacje tej techniki, zakres w kierunku terapii chorób związanych z niekodującym NA, ponieważ pozwala lepiej zrozumieć, w jaki sposób niekodujące RNA regulują stany chromatyny i ekspresję genów. W przypadku tej izolacji chromatyny przez oczyszczanie RNA lub eksperyment z ćwierkaniem, 40 milionów komórek zostanie zebranych po odwirowaniu, zdekantacji PBS i usunięciu pozostałej cieczy, ostrożnie zasysając pod kątem, usuwając osad komórkowy, stukając w dno rurki sokoła. Dodać świeżo przygotowany 1% aldehyd glutarowy, zaczynając od małej objętości i ponownie zawiesić osad komórkowy, uzupełnić do pełnej objętości, a następnie odwrócić, aby wymieszać usieciowanie przez 10 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce typu end-to-end lub rotatorze, wygasić reakcję sieciowania jedną dziesiątą objętością 1,25 molowej glicyny i pozostawić na wytrząsarce w temperaturze pokojowej na pięć minut, Komórki zmienią kolor na jasnopomarańczowy.

Następnie wirować w temperaturze 2000 RCF przez pięć minut, zdekantować i odessać supernatant i ponownie przemyć osad 20 mililitrami schłodzonego wirowania PBS, zassać supernatant i ponownie zawiesić umyte usieciowane podniebienie schłodzonym PBS. Przenieś każdy mililitr komórek do probówki einor i wiruj w temperaturze 2000 RCF przez trzy minuty w czterech stopniach Celsjusza. Po odwirowaniu użyj końcówki pipety, aby ostrożnie usunąć jak najwięcej PBS.

Flash, zamroź wszystkie granulki komórkowe w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w nieskończoność. Aby przygotować lizat komórkowy do ćwierkania, rozmrozić zamrożone usieciowane granulki komórkowe w temperaturze pokojowej. Stuknij mocno, aby usunąć i wymieszać osad komórkowy.

Zakręć granulki i użyj ostrej końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby usunąć wszelkie pozostałe PBS na wadze elektronicznej z dokładnością do jednego miligrama. Rozerwij masę pustej rurki einor. Zważ każdą granulkę i zapisz jej wagę.

Dodać 10 razy większą objętość buforu do lizy uzupełnionego świeżym inhibitorem proteazy PMSF i super ace do każdej probówki i ponownie zawiesić osad. Lizat komórkowy musi być zowany natychmiast po jego przygotowaniu. Przenieś nie więcej niż 1,5 mililitra lizatu do każdej 15-mililitrowej probówki Falcona i włóż sondy sonikacyjne, mocno je przykręcając.

Następnie umieść probówki w pęknięciu biologicznym, sonikuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy najwyższym ustawieniu z 30 sekundami na 45 sekund przerwy w impulsach. Sprawdzaj lizat co 30 minut. Kontynuuj sonikację, aż lizat komórkowy przestanie być mętny.

Może to trwać od 30 minut do czterech godzin, w zależności od liczby probówek, objętości próbki, temperatury kąpieli i czasu sonikacji. Gdy lizat stanie się klarowny, przenieś pięć mikrolitrów do świeżej probówki einor. Dodaj bufor proteazy DNA K i wir proteazy K, aby wymieszać i krótko odwirować, inkubować przez 45 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza po ekstrakcji DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR.

Sprawdź rozmiar DNA na żelu 1%aros. Większość rozmazu DNA powinna składać się z 100 do 500 par zasad, co wskazuje na pełne wirowanie sonikacyjne. Jednomililitrowe podwielokrotności sonikowanych próbek w temperaturze 16, 100 RCF przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, przenieść supernatant do świeżych probówek einor i błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie, aby rozpocząć procedurę rozmrażania probówek z chromatyną w temperaturze pokojowej dla typowej próbki ćwierkania.

Używając jednego mililitra lizatu, usuń 10 mikrolitrów na wprowadzenie RNA i 10 mikrolitrów na wprowadzenie DNA i umieść w probówkach einor. Trzymaj na lodzie do końca. Posługiwać się: przenieś jeden mililitr każdej próbki chromatyny do 15-mililitrowej probówki Falcona.

Dodaj dwa mililitry buforu hybrydyzacyjnego do każdej probówki. Następnie rozmrozić sondy w temperaturze pokojowej. Te biotynylowane oligonukleotydy kafelkowe są znakowane zgodnie z ich położeniem wzdłuż RNA i rozdzielane na dwie pule.

Pula parzysta zawiera wszystkie sondy z liczbami parzystymi. A pula nieparzysta zawiera sondy o liczbach nieparzystych. Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane przy użyciu obu pul, które służą sobie nawzajem jako wewnętrzna kontrola.

Jednym z najtrudniejszych aspektów prawdziwego protokołu jest to, że wszystkie etapy hybrydyzacji i prania muszą być wykonywane w temperaturze 37 stopni. Aby zapewnić stałą temperaturę eksperymentalną, wykonaj wszystkie czynności w piecu mieszkalnym lub w jego pobliżu, Dodaj odpowiednią objętość sond do określonych probówek. Dobrze wymieszaj, inkubuj w temperaturze 37 stopni przez cztery godziny, wstrząsając 20 minut przed zakończeniem hybrydyzacji.

Przygotuj koraliki magnetyczne Cone. Użyj 100 mikrolitrów na 100 piko moli sond. Przemyć jednym mililitrem buforu do lizy uzupełnionego unsu trzykrotnie za pomocą magnesu dwupaskowego Dyna mag, aby oddzielić kulki od buforu.

Po ostatnim płukaniu resus zawiesić kulki w pierwotnej objętości buforu do lizy i uzupełnić superiną fresh PMSF i inhibitorem proteazy. Po zakończeniu czterogodzinnej reakcji hybrydyzacji dodaj 100 mikrolitrów kulek do każdej mieszanki probówek. Dobrze inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut z potrząsającymi kulkami myjącymi z jednym mililitrem bufora do prania podgrzanego do 37 stopni Celsjusza przy pierwszym praniu.

Użyj paska magnetycznego dyna mag 15, aby oddzielić kulki, zdekantować i ponownie zawiesić w jednym mililitrowym buforze do mycia, przenieść do 1,5 mililitrowej probówki EOR. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przez pięć minut przy kolejnych płukaniach, odwirować każdą probówkę w mini wirówce i umieścić próbkę na pasku magnetycznym dyna mag two na jedną minutę dekantacji próbki. Przetrzyj wszelkie krople chusteczką Kim i ponownie zamieszaj w jednym mililitrze.

Przemyć bufor, inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając przez pięć minut. Powtórz w sumie pięć prań przy ostatnim myciu Resus. Zawieś dobrze kulki, usuń 100 mikrolitrów i odłóż na bok do izolacji RNA, zarezerwuj 900 mikrolitrów na frakcję DNA.

Umieść wszystkie probówki na pasku magnetycznym rurki dyna mag i wyjmij bufor do mycia. Po krótkim zawirowaniu ponownie umieść probówkę na pasku magnetycznym z ostrą końcówką pipety o pojemności 10 mikrolitrów. Całkowicie usuń pozostały bufor płuczący z każdej probówki.

Frakcje RNA i DNA są następnie izolowane z próbek ćwierkania w celu oceny ilościowej i sekwencjonowania. Ten rysunek pokazuje wzbogacenie ludzkiej telomerazy, RNA lub Turka z komórek HELOC przez GA dh. Obfite komórkowe RNA, które służy jako kontrola negatywna.

Większość tureckiego RNA obecnego w komórce, około 88%, została ściągnięta w dół przez wykonanie ćwierkania, podczas gdy tylko 0,46% GA DH RNA zostało pobrane, wykazując około 200-krotny współczynnik wzbogacenia Niespecyficzne sondy, takie jak sondy ukierunkowane na LAC ZRNA, który zwykle nie ulega ekspresji w komórkach ssaków, mogą być stosowane jako dodatkowe kontrole ujemne. Oczekuje się, że regiony DNA zwiążą cel. Długie niekodujące RNA są zwykle wzbogacane w regiony ujemne, gdy są mierzone za pomocą QPCR.

Rysunek ten przedstawia walidację QPCR czterech miejsc związanych z gorącym powietrzem w pierwotnych ludzkich fibroblastach napletka, określonych przez wykonanie chirp SSE w tej samej linii komórkowej, podczas gdy miejsca DNA Turk i GA DH służą jako regiony kontroli ujemnej. Zarówno parzyste, jak i nieparzyste zestawy sond dały porównywalne wzbogacenie oczekiwanych miejsc związanych z gorącym powietrzem nad obszarami ujemnymi. Cecha charakterystyczna prawdziwych długich, niekodujących miejsc wiązania RNA.

Globalną mapę długich niekodujących miejsc wiązania RNA można uzyskać przez wysokoprzepustowe sekwencjonowanie DNA wzbogaconego w ćwirk, jak ilustrują te dane z długiego, niepowlekającego RNA TRLA Rocks two, o którym wiadomo, że oddziałuje z chromosomem X w sposób wymagany do kompensacji dawki. Zarówno parzyste, jak i nieparzyste próbki zostały zsekwencjonowane oddzielnie, a ich unikalne szumy wyeliminowane, aby wytworzyć ścieżkę nakładających się sygnałów, gdzie każdy szczyt wskazuje na silny widok skał dwóch wiążących się podczas próby tej procedury. Ważne jest, aby ćwiczyć prawidłową technikę wolnego od RNA, postępując zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak białko, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, jakie białka wchodzą w interakcje z nieklinicznym DRNA, które jest przedmiotem zainteresowania po jego opracowaniu. CHI utorował drogę naukowcom zajmującym się biologią RNA do mapowania aact RN w komórkach hodowlanych i utrwalonych tkankach.