Name: Izolacja chromatyny przez oczyszczanie RNA (ChIRP) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Poznaj metodę ChIRP do mapowania miejsc wiązania długich niekodujących RNA z genomem. Technika wykorzystuje biotynylowane oligonukleotydy do izolacji chromatyny z wysoką specyficznością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy T. Hung, MC. Tsai, O. Manor, E. Segal, M. Kuroda, T. Swigut oraz I. Shestopalov za dyskusje. Praca wspierana przez Agency of Science, Technology and Research of Singapore (C.C.), NIH R01-CA118750 i R01- HG004361 (H.Y.C.) oraz California Institute for Regenerative Medicine (H.Y.C.). H.Y.C. jest naukowcem na wczesnym etapie kariery w Howard Hughes Medical Institute.

1. Projektowanie sondy
Projektowanie antysensownych sond DNA typu tiling do selektywnego wyodrębniania docelowego RNA metodą ChIRP.
<ol>
	<li>Zaprojektuj oligosondy antysensowne, korzystając z internetowego projektanta sond na stronie <a href="http://singlemoleculefish.com">singlemoleculefish.com</a> 18.</li>
	<li>Zastosuj następujące parametry: liczba sond = 1 sonda / 100 bp długości RNA; 2) zawartość GC w sekwencji docelowej = 45%; 3) długość oligonukleotydu = 20; 4) długość odstępu = 60-80. Jeśli RNA jest zbyt długie dla programu do projektowania, podziel je na segmenty. Pomiń regiony powtórzeń lub obszary o znacznej homologii.</li>
	<li>Zamów sondy DNA antysensowne z BiotinTEG na końcu 3'.</li>
	<li>Oznakuj sondy zgodnie z ich pozycjami wzdłuż RNA. Rozdziel je na dwie pule w taki sposób, aby pula „parzysta” zawierała wszystkie sondy o numerach 2, 4, 6 itd., a pula „nieparzysta” sondy o numerach 1, 3, 5 itd. Rozcieńcz pule sond do stężenia 100 μM i przechowuj w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Wszystkie eksperymenty należy przeprowadzić z użyciem obu pul, które służą sobie nawzajem jako kontrole wewnętrzne. Prawdziwy sygnał zależny od RNA byłby obecny w obu pulach, podczas gdy szumy specyficzne dla sond byłyby unikalne dla każdej z pul. Dotyczy to zarówno metody ChIRP-qPCR, jak i ChIRP-seq.</li>
</ol>
2. Zbiór komórek
Zebrać komórki, które zostaną wykorzystane w eksperymencie ChIRP.
<ol>
	<li>Hodować komórki w płytkach do hodowli tkankowych lub kolbach do momentu osiągnięcia konfluencji. Przepłukać raz roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i poddać trypsynizacji. Zneutralizować trypsynę, dodając medium w objętości &gt;2x, pipetować w górę i w dół, aby odczepić komórki, a następnie resuspender do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. Przenieść całe medium wraz z resuspenderowanymi komórkami do probówek Falcon 50 ml. Zazwyczaj 20 milionów komórek jest wystarczające dla jednej próbki ChIRP.</li>
	<li>Wirować komórki przy 800RCF przez 4 min. Odessać medium i resuspender 40 milionów komórek w 40 ml PBS, w razie potrzeby łącząc probówki. Wirować komórki przy 800RCF przez 4 min. Odlać PBS, a następnie ostrożnie odessać pozostały płyn pod kątem.</li>
</ol>
3. Sieciowanie komórek i zbieranie osadu komórkowego
Usieciuj zebrane komórki za pomocą glutaraldehydu, aby zachować oddziaływania RNA-chromatyna i przygotować osad komórkowy.
<ol>
	<li>Wszystkie etapy należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 1% glutaraldehydu w PBS w temperaturze pokojowej. Przygotować 10 ml na 10 milionów komórek (0,4 mL 25% roztworu stokowego glutaraldehydu + 9,6 mL PBS). Glutaraldehyd musi być świeżo przygotowany.</li>
	<li>Opukać dno probówek typu Falcon, aby oderwać osady. Resuspender osad komórkowy w 1% glutaraldehydzie, zaczynając od małej objętości, aby uniknąć powstawania grudek, a następnie dopełnić do pełnej objętości. Wymieszać poprzez odwracanie probówek. Przeprowadzić sieciowanie przez 10 min w temperaturze pokojowej na wytrząsarce end-to-end lub rotatorze.</li>
	<li>Zahamować reakcję sieciowania, dodając 1/10 objętości 1,25 M glicyny, i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
	<li>Wirować przy 2000RCF przez 5 min. Odessać nadsącz i raz przemyć osad 20 mL schłodzonego PBS, wirować przy 2000RCF przez 5 min.</li>
	<li>Odessać nadsącz i resuspender przemyty, sieciowany osad w 1 ml schłodzonego PBS na 20 milionów komórek. Przenieść każdy 1 ml do probówki typu Eppendorf i wirować przy 2000RCF przez 3 min w 4 °C. Ostrożnie usunąć jak największą ilość PBS za pomocą końcówki pipety.</li>
	<li>Szybko zamrozić osady komórkowe w ciekłym azocie i przechowywać w -80 °C bez określonego terminu ważności.</li>
</ol>
4. Lizy komórek
Zlizuj sieciowane komórki w celu przygotowania lizatu komórkowego.
<ol>
	<li>Zamrożone pellety komórkowe rozmrozić w temperaturze pokojowej. Mocno opukać probówki, aby odczepić i wymieszać pellet komórkowy. Wirować pellet przy 2000RCF przez 3 min w 4 °C. Za pomocą ostrego końcówki do pipety 10 μl usunąć pozostały PBS.</li>
	<li>Na wadze elektronicznej (z dokładnością do 1mg) odtarcować masę pustej probówki Eppendorf (nasze probówki ważą bardzo stabilnie 1,060 grama). Zważyć każdy pellet i zapisać jego masę. Pełna szalka 15 cm z sieciowanymi komórkami HeLa waży zazwyczaj 100 mg.</li>
	<li>Uzupełnić bufor do lizy (10X masy pelletu, np. 1 ml na 100mg) świeżym inhibitorem proteaz, PMSF oraz Superase-in (patrz załączona lista buforów). Dokładnie wymieszać.</li>
	<li>Do każdej probówki dodać 10X objętości uzupełnionego buforu do lizy i resuspendować pellet. W przypadku małych pelletów &lt;25 mg, resuspendować w 250 μl uzupełnionego buforu do lizy. Suspensja powinna być jednorodna. Jeśli nie, podzielić zawiesinę na aliquoty 500 μl i użyć zmotoryzowanego mieszadła do pelletów, aby rozbić grudki. Niezwłocznie przystąpić do sonikacji.</li>
</ol>
5. Sonikacja
Rozfragmentuj DNA poprzez sonikację sieciowanych lizatów komórkowych.
<ol>
	<li>Poddać lizat komórkowy sonikacji w urządzeniu Bioruptor w probówkach Falcon 15 ml. W każdej probówce należy umieścić &lt;1,5 ml lizatu; aby przyspieszyć proces, sonikować nie więcej niż dwie probówki jednocześnie.</li>
	<li>Sonikować w kąpieli wodnej o temperaturze 4 °C na najwyższym ustawieniu, stosując impulsy 30 sekund włączania i 45 sekund przerwy. Kontrolować lizat co 30 min. Kontynuować sonikację do momentu, aż lizat komórkowy przestanie być mętny. Może to zająć od 30 min do 4 h. Czas trwania procesu zależy od liczby probówek, objętości próbki, temperatury kąpieli oraz całkowitego czasu sonikacji. Probówki mogą sonikować w różnym tempie, dlatego należy je co 30 min łączyć i ponownie rozdzielać do pierwotnych probówek w celu zapewnienia homogeniczności. Uwaga: komórki sieciowane glutaraldehydem wymagają znacznie dłuższego czasu sonikacji niż ich odpowiedniki sieciowane formaldehydem.</li>
	<li>Gdy lizat stanie się przejrzysty, przenieść 5 μL lizatu do nowej probówki Eppendorf. Dodać 90 μL buforu DNA Protease K (PK) (patrz lista buforów) oraz 5 μL PK. Wymieszać w wirówce typu vortex i krótko odwirować. Inkubować przez 45 min w temperaturze 50 °C.</li>
	<li>Wyekstrahować DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR firmy Qiagen. Eluować DNA w 30 μL buforu elucyjnego (EB) firmy Qiagen i sprawdzić wielkość DNA na 1% żelu agarozowym. Jeśli główna część smugi DNA mieści się w zakresie 100-500 bp, sonikacja jest zakończona. W przeciwnym razie kontynuować sonikację.</li>
	<li>Odwirować zsonikowane próbki przy 16100RCF przez 10 min w temperaturze 4 °C. Połączyć nadsączniki, rozdzielić na aliquoty po 1 mL i zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie. Przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
6. ChIRP
Hybrydyzacja biotynylowanych sond DNA z RNA i izolacja związanej chromatyny.
<ol>
	<li>Rozmrozić probówki z chromatyną w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować bufor do hybrydyzacji (patrz lista buforów, przygotować 2 ml na każdy 1 ml chromatyny). Wymieszać za pomocą wortexa.</li>
	<li>W przypadku typowej próbki ChIRP z użyciem 1 ml lizatu, pobrać 10 μL na RNA INPUT oraz 10 μL na DNA INPUT i przenieść do probówek typu Eppendorf. Przechowywać w lodzie do momentu użycia.</li>
	<li>Przenieść 1 mL chromatyny do probówki Falcon 15 mL. Do każdej probówki dodać 2 mL buforu do hybrydyzacji. W przypadku objętości całkowitej &lt;1,5 ml, należy użyć probówek typu Eppendorf.</li>
	<li>Rozmrozić sondy w temperaturze pokojowej. Zmierzyć stężenie sond za pomocą Nanodrop, aby sprawdzić ich ilość, jeśli nie były używane przez dłuższy czas (sondy 100 μM powinny wykazywać stężenie ~500-600 ng/μl przy ustawieniu dla jednoniciowego DNA). Dodać odpowiednią objętość sond do poszczególnych probówek (100 pmol sondy na 1 mL chromatyny, czyli 1 μL sondy o stężeniu 100 pmol/μL na 1 mL chromatyny). Dokładnie wymieszać. Inkubować w 37 °C przez 4 h z wytrząsaniem.</li>
	<li>Na 20 min przed zakończeniem hybrydyzacji przygotować magnetyczne kulki C-1 (przechowywane w 4 °C). Użyć 100 μL na każde 100 pmol sond. Przemyć trzykrotnie 1 mL nieuzupełnionego buforu do lizy, używając paska magnetycznego DynaMag-2 do oddzielenia kulek od buforu.</li>
	<li>Resuspendować kulki w pierwotnej objętości buforu do lizy; uzupełnić świeżym PMSF, P.I oraz Superase-in. Po zakończeniu 4-godzinnej reakcji hybrydyzacji dodać 100 μL kulek do każdej probówki. Dokładnie wymieszać. Inkubować w 37 °C przez 30 min z wytrząsaniem.</li>
	<li>Przygotować bufor do przemywania (5 mL na próbkę). Wymieszać za pomocą wortexa. Podgrzać wstępnie do 37 °C. Przed użyciem dodać PMSF.</li>
	<li>Przemyć kulki pięciokrotnie 1 mL buforu do przemywania. Podczas pierwszego przemywania użyć paska magnetycznego DynaMag-15 do oddzielenia kulek, odlać nadsącz i resuspendować w 1 mL buforu do przemywania. Przenieść objętość do probówki Eppendorf 1,5 mL. Inkubować w 37 °C z wytrząsaniem przez 5 min.</li>
	<li>Podczas kolejnych przemywań wirować każdą probówkę w mikrowirówce, następnie umieścić próbkę na pasku magnetycznym DynaMag-2 na 1 min. Odlać próbkę, wytrzeć ewentualne krople chusteczką Kimwipe i resuspendować w 1 mL buforu do przemywania. Inkubować w 37 °C z wytrząsaniem przez 5 min. Powtórzyć do uzyskania łącznie pięciu przemyć.</li>
	<li>Przy ostatnim przemywaniu dokładnie resuspendować kulki. Pobrać 100 μL i odstawić do izolacji RNA. Pozostałe 900 μL zarezerwować dla frakcji DNA. Umieścić wszystkie probówki na pasku magnetycznym DynaMag-2 i usunąć bufor do przemywania. Krótko odwirować wszystkie probówki, a następnie ponownie umieścić je na pasku magnetycznym. Całkowicie usunąć ostatnie pozostałości buforu do przemywania za pomocą ostrej końcówki pipety 10 μl.</li>
</ol>
7. Izolacja RNA
Wyodrębnij frakcję RNA z próbek ChIRP w celu ilościowego oznaczenia za pomocą qRT-PCR.
<ol>
	<li>Pobrać 100 μL próbek kulek oraz 10 μL próbki RNA INPUT. Do RNA INPUT dodać 85 μL buforu RNA PK Buffer pH 7.0. Resuspendować kulki w 95 μL buforu RNA PK Buffer pH 7.0. Dodać 5 μL proteinazy K i inkubować w temperaturze 50 °C przez 45 min przy jednoczesnym wstrząsaniu end-to-end.</li>
	<li>Krótko odwirować wszystkie probówki i gotować próbki przez 10 min w bloku grzewczym w temperaturze 95 °C.</li>
	<li>Schłodzić próbki na lodzie, dodać 500 μL TRIzol i intensywnie mieszać w wortexie przez 10 s. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min. Przechowywać w temperaturze -80 °C lub przejść do kroku 4.</li>
	<li>Do próbek traktowanych TRIzol dodać 100 μL chloroformu. Intensywnie mieszać w wortexie przez 10 s. Wirować w wirówce laboratoryjnej przy 16100RCF przez 15 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Pobrać ~400 μL wodnistego supernatantu, unikając fazy organicznej i interfazy.</li>
	<li>Dodać 600 μL (1,5 objętości) 100% etanolu i dokładnie wymieszać. Przepuścić próbkę przez kolumny MIRNeasy mini. Przemyć 1x buforem RWT (z zestawu MIRNeasy mini) oraz 2x buforem RPE zgodnie z protokołem producenta. Eluować w 30 μL wody wolnej od nukleaz nuclease-free H2O (nfH2O).</li>
	<li>Eluat RNA traktować zestawem DNA-free zgodnie z protokołem producenta. Po zakończeniu reakcji podgrzać próbkę przez 15 minut w temperaturze 65 °C, aby całkowicie inaktywować pozostałą DNazę.</li>
	<li>Do analizy qRT-PCR w celu potwierdzenia odzyskania lncRNA użyć 1 μL izolowanego RNA na dołek. Jako kontrolę negatywną często stosuje się GAPDH.</li>
</ol>
8. Izolacja DNA
Wyodrębnij frakcję DNA z próbek ChIRP w celu identyfikacji poprzez sekwencjonowanie lub ilościowego oznaczenia za pomocą qPCR.
<ol>
	<li>Przygotować bufor do elucji DNA (patrz lista buforów), 150 μl na próbkę, wliczając DNA INPUT.</li>
	<li>Do każdego ml buforu do elucji DNA dodać 10 μL RNazy A (10 mg/mL) oraz 10 μL RNazy H (10 U/μl), a następnie wymieszać na wirówce typu vortex.</li>
	<li>Każdą próbkę kulek resuspendować w 150 μL buforu do elucji DNA z RNazami. (DNA INPUT resuspendować w 140 μL). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min z wytrząsaniem.</li>
	<li>Oddzielić kulki od nadsączu za pomocą paska magnetycznego DynaMag-2. Usunąć nadsącz i przenieść go do oznakowanych probówek.</li>
	<li>Przygotować drugą porcję buforu do elucji DNA z 10 μL RNazy A (10 mg/mL) i RNazy H (10 U/μL) dokładnie tak, jak opisano w punkcie 8.2). Dodać 150 μL do każdej próbki (wliczając DNA INPUT), inkubować i usunąć nadsącz. Zebrać cały nadsącz (powinno być ok. 300 μL).</li>
	<li>Do każdej próbki dodać 15 μL PK. Inkubować w temperaturze 50 °C przez 45 min z wytrząsaniem.</li>
	<li>Wstępnie odwir {ować} żółte probówki z żelem fazowym (5PRIME). Przenieść próbki DNA do probówek z żelem fazowym i dodać 300 μL PhOH:Chloroform:Isoamyl na próbkę. Wstrząsać energicznie przez 10 min, a następnie wirować w wirówce laboratoryjnej przy 16100RCF przez 5 min w temperaturze 4 °C. Pobrać fazę wodną z góry (ok. 300 μL). Dodać 3 μL GlycoBlue, 30 μL NaOAc i 900 μL 100% EtOH. Dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze -20 °C przez noc.</li>
	<li>Wirować próbki przy 16100RCF przez 30 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie odlać nadsącz. Dodać 1 mL 70% EtOH i wymieszać na wirówce typu vortex. Wirować przy 16100RCF przez 5 min. Usunąć nadsącz za pomocą pipety. Suszyć na powietrzu przez 1 min. Resuspendować w 30 μL EB.</li>
	<li>Próbki DNA są gotowe do analizy metodą qPCR lub do przygotowania bibliotek do sekwencjonowania wysokoprzepustowego zgodnie z protokołem firmy Illumina.</li>
</ol>
10. Reprezentatywne wyniki
Rycina 1 przedstawia schemat procedury ChIRP. Pomyślny eksperyment ChIRP zazwyczaj prowadzi do znacznego wzbogacenia docelowego RNA w stosunku do RNA nieswoistych. Rycina 2 pokazuje wzbogacenie ludzkiego RNA telomerazy (TERC) z komórek HeLa w stosunku do GAPDH, obfitego RNA komórkowego, który służy jako kontrola negatywna. Większość cząsteczek RNA TERC (~88%) obecnych w komórce została wyizolowana za pomocą metody ChIRP, podczas gdy odzyskano jedynie 0,46% RNA GAPDH, co wykazuje współczynnik wzbogacenia wynoszący ok. 200 razy. Sondy nieswoiste, takie jak sondy celujące w RNA LacZ, który nie jest eksprymowany w komórkach ssaków (Rycina 2), mogą być stosowane jako dodatkowe kontrole negatywne.
Regiony DNA, w których oczekiwano wiązania docelowego lncRNA, są zazwyczaj wzbogacone w porównaniu do regionów negatywnych w pomiarach za pomocą qPCR. Rycina 3 przedstawia walidację qPCR czterech miejsc wiązania HOTAIR w pierwotnych fibroblastach napletka ludzkiego, które zidentyfikowano poprzez przeprowadzenie ChIRP-seq w tej samej linii komórkowej, podczas gdy miejsca DNA TERC i GAPDH służą jako negatywne regiony kontrolne. Zarówno „parzyste”, jak i „nieparzyste” zestawy sond wykazały porównywalne wzbogacenie oczekiwanych miejsc wiązania HOTAIR względem regionów negatywnych, co jest charakterystyczne dla rzeczywistych miejsc wiązania lncRNA.
Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie DNA wzbogaconego metodą ChIRP pozwala na uzyskanie globalnej mapy miejsc wiązania lncRNA. Znane jest, że lncRNA roX2 u Drosophila oddziałuje z chromosomem X w sposób niezbędny do kompensacji dawki. Rysunek 4 przedstawia profil wiązania roX2 na fragmencie chromosomu X. Zsekwencjonowano zarówno próbki „parzyste”, jak i „nieparzyste”, a ich specyficzny szum został wyeliminowany w celu uzyskania ścieżki sygnałów nakładających się. Każdy „pik” wskazuje tutaj na silne miejsce wiązania roX2. Pełna ścieżka oraz lista genów docelowych roX2 zostały opisane w pracy Chu et al. 2011 17.
<img alt="Schemat procesu ChiRP: analiza białek wiążących RNA z wykorzystaniem biotynilowanych oligosów i kulek magnetycznych." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1."> 
Rycina 1. Schemat procedury ChIRP. Chromatyna jest sieciowana z adduktami lncRNA:białko in vivo. Biotynilowane sondy mozaikowe (tiling probes) są hybrydyzowane z docelowym lncRNA, a kompleksy chromatyny są oczyszczane przy użyciu magnetycznych kulek streptawidynowych, a następnie poddawane rygorystycznym przemywaniom. Eluujemy DNA lub białka związane z lncRNA za pomocą koktajlu RNazy A i H. Domniemana sekwencja wiążąca lncRNA została przedstawiona schematycznie w kolorze pomarańczowym. Opublikowano wcześniej w pracy Chu et al. 2011.17
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający procent odzysku RNA; test ChIRP, porównanie TERC, GAPDH, LacZ." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2."> 
Rycina 2. ChIRP wzbogaca ludzkie RNA TERC. Sondy TERC-asDNA odzyskują ~88% komórkowego RNA TERC oraz niewykrywalną ilość GAPDH. Sondy LacZ-asDNA są wykorzystywane jako kontrole negatywne i nie odzyskują żadnego z tych RNA. Przedstawiono średnią + s.d. Opublikowano wcześniej w pracy Chu et al. 2011.17
<img alt="Wykres słupkowy HOTAIR ChIRP-qPCR, porównanie genów, NFKBIA do GAPDH, analiza procentowa wejściowa." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3."> 
Rycina 3. HOTAIR ChIRP-qPCR w pierwotnych ludzkich fibroblastach napletka. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 i ABCA2 to regiony oddziałujące z HOTAIR. TERC i GAPDH służyły jako kontrole negatywne. Przedstawiono średnią + s.d. Opublikowano wcześniej w pracy Chu et al. 2011.17
<img alt="Wykres analizy ChIRP-seq; geny RefSeq chromosomu X; piki miejsc wiązania RNA roX2; porównanie danych." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4."> 
Rycina 4. Dane ChIRP-seq dla RNA roX2 w komórkach Drosophila Sl2. Próbki „parzyste” i „nieparzyste” sekwencjonowano oddzielnie; ich dane połączono, aby odzwierciedlić tylko wspólne piki w obu grupach. Przedstawiono ścieżkę połączoną. Opublikowano wcześniej w Chu et al. 2011.17

<ol><li>Koziol, M. J., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+traffic+control+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">RNA traffic control of chromatin complexes.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 142-148 (2010).</li>
<li>Mercer, T. R., Dinger, M. E., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNAs%3A+insights+into+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNAs: insights into functions.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 155-159 (2009).</li>
<li>Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+demarcation+of+active+and+silent+chromatin+domains+in+human+HOX+loci+by+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs.</a> Cell. 129, 1311-1323 (2007).</li>
<li>Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+proteins+targeted+by+a+short+repeat+RNA+to+the+mouse+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome.</a> Science. 322, 750-756 (2008).</li>
<li>Kelley, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+spreading+of+the+Drosophila+dosage+compensation+complex+from+roX+RNA+genes+into+flanking+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenetic spreading of the Drosophila dosage compensation complex from roX RNA genes into flanking chromatin.</a> Cell. 98, 513-522 (1999).</li>
<li>Pandey, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kcnq1ot1+antisense+noncoding+RNA+mediates+lineage-specific+transcriptional+silencing+through+chromatin-level+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Kcnq1ot1 antisense noncoding RNA mediates lineage-specific transcriptional silencing through chromatin-level regulation.</a> Mol. Cell. 32, 232-246 (2008).</li>
<li>Wang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long+noncoding+RNA+maintains+active+chromatin+to+coordinate+homeotic+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A long noncoding RNA maintains active chromatin to coordinate homeotic gene expression.</a> Nature. 472, 120-124 (2011).</li>
<li>Khalil, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 11667-11672 (2009).</li>
<li>Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol. Cell. 40, 939-953 (2010).</li>
<li>Meller, V. H., Wu, K. H., Roman, G., Kuroda, M. I., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((roX1+RNA+paints+the+X+chromosome+of+male+Drosophila+and+is+regulated+by+the+dosage+compensation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">roX1 RNA paints the X chromosome of male Drosophila and is regulated by the dosage compensation system.</a> Cell. 88, 445-457 (1997).</li>
<li>Franke, A., Baker, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rox1+and+rox2+RNAs+are+essential+components+of+the+compensasome%2C+which+mediates+dosage+compensation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The rox1 and rox2 RNAs are essential components of the compensasome, which mediates dosage compensation in Drosophila.</a> Mol. Cell. 4, 117-122 (1999).</li>
<li>Gupta, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNA+HOTAIR+reprograms+chromatin+state+to+promote+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis.</a> Nature. 464, 1071-1076 (2010).</li>
<li>Tsai, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNA+as+modular+scaffold+of+histone+modification+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes.</a> Science. 329, 689-693 (2010).</li>
<li>Zappulla, D. C., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+as+a+flexible+scaffold+for+proteins%3A+yeast+telomerase+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol.%22%5BJournal%5D)">RNA as a flexible scaffold for proteins: yeast telomerase and beyond.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol.. 71, 217-224 (2006).</li>
<li>Nagano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Air+noncoding+RNA+epigenetically+silences+transcription+by+targeting+G9a+to+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Air noncoding RNA epigenetically silences transcription by targeting G9a to chromatin.</a> Science. 322, 1717-1720 (2008).</li>
<li>Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+chromatin+regulatory+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-range chromatin regulatory interactions in vivo.</a> Nature. 32, 623-626 (2002).</li>
<li>Chu, C., Qu, K., Zhong, F. L., Artandi, S. E., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Maps+of+Long+Noncoding+RNA+Occupancy+Reveal+Principles+of+RNA-Chromatin+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genomic Maps of Long Noncoding RNA Occupancy Reveal Principles of RNA-Chromatin Interactions.</a> Mol. Cell. , (2011).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).</li>
</ol>

C. Chu i H.Y. Chang są wymienieni jako wynalazcy w zgłoszeniu patentowym opartym na tej metodzie.

Opisano tutaj metodę ChIRP-seq, służącą do mapowania miejsc wiązania lncRNA in vivo w całej skali genomu. Kluczowymi parametrami warunkującymi sukces są podzielone pule płytek sond oligonukleotydowych oraz sieciowanie glutaraldehydem. Projektowanie sond powinowactwa jest proste, mając do dyspozycji sekwencję RNA, i nie wymaga wcześniejszej wiedzy o strukturze RNA czy domenach funkcjonalnych. Odniesione sukcesy w przypadku roX2, TERC oraz HOTAIR — trzech dość różnych RNA u dwóch gatunków — sugerują, że metoda ChIRP-seq jest prawdopodobnie możliwa do zastosowania w przypadku wielu lncRNA. Jak przy wszystkich eksperymentach, interpretacja wyników wymaga staranności i zastosowania odpowiednich kontroli. Różne lncRNA mogą wymagać miareczkowania warunków, a rozważna zmiana parametrów, takich jak wybór innych sond powinowactwa lub czynników sieciujących, może uwydatnić różne aspekty oddziaływań RNA z chromatyną. Podobnie jak w przypadku ChIP-seq, nie wszystkie zdarzenia wiązania sąkoniecznie funkcjonalne i wymagane są dodatkowe badania w celu ustalenia biologicznych konsekwencji obecności RNA na chromatynie. Niemniej jednak przewidujemy wiele interesujących zastosowań tej technologii dla badaczy innych lncRNA związanych z chromatyną, których liczba obecnie idzie w tysiące8,9. Tak jak ChIP-seq otworzył drogę do genomowych badań nad oddziaływaniami DNA-białko, tak badania "interaktomu RNA" za pomocą ChIRP-seq mogą ujawnić wiele nowych kierunków w biologii.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Lista buforów:</td></tr><tr><td colspan="4">Rozpuścić pellet kompletnego inhibitora proteaz w 1 ml wody jako roztwór stokowy 50x. Przygotować 100 mM PMSF w izopropanolu (roztwór stokowy 100x). Superase-in stosować jako roztwór stokowy 200x. Wszystkie odczynniki przechowywać w temperaturze -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Bufor do lizy:</td></tr><tr><td colspan="4">50 mM Tris-Cl pH 7.0&lt;br/&gt;10 mM EDTA&lt;br/&gt;1% SDS&lt;br/&gt;Zawsze dodawać świeży PMSF, inhibitor proteaz (P.I.) oraz Superase-in przed użyciem, z wyjątkiem etapu przemywania kulek</td></tr><tr><td colspan="4">Bufor do Proteinazy K (dla DNA)</td></tr><tr><td colspan="4">100 mM NaCl&lt;br/&gt;10 mM TrisCl pH 8.0 (dla RNA stosować pH 7.0)&lt;br/&gt;1 mM EDTA&lt;br/&gt;0.5% SDS&lt;br/&gt;Przed użyciem dodać 5% objętościowo świeżej Proteinazy K (Ambion AM2546 20 mg/ml)</td></tr><tr><td colspan="4">Bufor do hybrydyzacji</td></tr><tr><td colspan="4">750 mM NaCl&lt;br/&gt;1% SDS&lt;br/&gt;50 mM Tris-Cl pH 7.0&lt;br/&gt;1 mM EDTA&lt;br/&gt;15% formamidu (przechowywać w ciemności w temperaturze 4 &amp;deg;C)&lt;br/&gt;Zawsze dodawać świeży PMSF, inhibitor proteaz (P.I.) oraz Superase-in przed użyciem</td></tr><tr><td colspan="4">Bufor do przemywania</td></tr><tr><td colspan="4">2x NaCl i cytrynian sodu (SSC) (rozcieńczony z roztworu stokowego 20x SSC Invitrogen)&lt;br/&gt;0.5% SDS&lt;br/&gt;Zawsze dodawać świeży PMSF przed użyciem</td></tr><tr><td colspan="4">Bufor do elucji DNA</td></tr><tr><td colspan="4">50 mM NaHCO3&lt;br/&gt;1% SDS</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela specyficznych odczynników i sprzętu:</td></tr><tr><td>Glutaraldehyd (klasa EM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-10x10ml</td><td></td></tr><tr><td>Zmotoryzowany mieszalnik do pelletów</td><td>VWR international</td><td>V8185-904</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteaz</td><td>Roche Group</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Superase-in</td><td>Ambion</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?AM2696">AM2696&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Falcon (do sonikacji)</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania PCR</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczne kulki C-1</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-25G</td><td></td></tr><tr><td>Magnes DynaMag-15</td><td>Invitrogen</td><td>123-01D</td><td></td></tr><tr><td>Magnes DynaMag-2</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw MIRNeasy mini</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Rnaza H</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>R0601K</td><td></td></tr><tr><td>Rnaza A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy</td><td>5 PRIME</td><td>2302810</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:chloroform:izoamylol</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Ricca</td><td>RSOC0020-1C</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>JT Baker</td><td>4057-06</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do elucji (EB)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Invitrogen</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15553-027</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od &lt;em&gt;DNA&lt;/em&gt;</td><td>Ambion</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw buforów</td><td>Ambion</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Invitrogen</td><td>15515-026</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja chromatyny poprzez oczyszczanie rna (chirp)

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Długie niekodujące RNA są kluczowymi regulatorami stanów chromatyny w ważnych procesach biologicznych, takich jak kompensacja dawki, imprinting oraz ekspresja genów rozwojowych 1,2,3,4,5,6,7. Niedawne odkrycie tysięcy lncRNA powiązanych ze specyficznymi kompleksami modyfikacji chromatyny, takimi jak kompleks represyjny Polycomb 2 (PRC2), który pośredniczy w trymetylacji lizyny 27 histonu H3 (H3K27me3), sugeruje szeroką rolę licznych lncRNA w zarządzaniu stanami chromatyny w sposób specyficzny dla poszczególnych genów 8,9. Podczas gdy niektóre lncRNA działają prawdopodobnie w cis na sąsiednie geny, inne lncRNA działają w trans, regulując geny położone w odległości. Na przykład lncRNA roX1 i roX2 u Drosophila wiążą się z licznymi regionami chromosomu X w komórkach męskich i są kluczowe dla kompensacji dawki 10,11. Jednak dokładne lokalizacje ich miejsc wiązania nie są znane z wysoką rozdzielczością. Podobnie ludzkie lncRNA HOTAIR może wpływać na zajęcie PRC2 w setkach genów w całym genomie 3,12,13, ale sposób osiągania tej specyficzności pozostaje niejasny. LncRNA mogą również służyć jako modularne rusztowania do rekrutacji i montażu wielu kompleksów białkowych. Klasycznym przykładem rusztowania RNA działającego w trans jest RNA TERC, który służy jako matryca i rusztowanie dla kompleksu telomerazy 14; HOTAIR może również służyć jako rusztowanie dla PRC2 oraz kompleksu demetylazy H3K4 13.
Wcześniejsze badania mapujące zajętość RNA w chromatynie dostarczyły istotnych informacji 15,16, lecz jedynie w odniesieniu do pojedynczych loci genowych. Miejsca zajętości większości lncRNA nie są znane, a role lncRNA w regulacji chromatyny wnioskowano głównie na podstawie pośrednich efektów zaburzeń lncRNA. Podobnie jak immunoprecypitacja chromatyny z następującym po niej badaniem mikromacierzy lub głębokim sekwencjonowaniem (odpowiednio ChIP-chip lub ChIP-seq) znacznie poprawiła nasze zrozumienie oddziaływań białko-DNA w skali genomowej, tutaj prezentujemy niedawno opublikowaną strategię mapowania zajętości długich RNA w całym genomie z wysoką rozdzielczością 17. Metoda ta, izolacja chromatyny poprzez puryfikację RNA (ChIRP, ang. Chromatin Isolation by RNA Purification) (Rysunek 1), opiera się na wychwycie powinowactwa kompleksu lncRNA:chromatyna za pomocą mozaikowych oligosonda antisense, co pozwala na wygenerowanie mapy genomowych miejsc wiązania z rozdzielczością kilku stu zasad, wysoką czułością i niskim tłem. Metoda ChIRP jest możliwa do zastosowania w przypadku wielu lncRNA, ponieważ projektowanie sond powinowactwa jest proste przy znanej sekwencji RNA i nie wymaga wiedzy o strukturze RNA ani jego domenach funkcjonalnych.

ChIRP to nowatorska i szybka technika mapowania genomowych miejsc wiązania długich niekodujących RNA (lncRNAs). Metoda ta wykorzystuje specyficzność komplementarnych, kafelkowych oligonukleotydów, co pozwala na wyliczenie genomowych miejsc związanych z lncRNA.

Izolacja chromatyny poprzez oczyszczanie RNA (ChIRP)

Długie niekodujące RNA są kluczowymi regulatorami stanów chromatyny w istotnych procesach biologicznych, takich jak kompensacja dawki, imprinting oraz rozwój...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest określenie regionów DNA związanych ze specyficznym niekodującym RNA przy użyciu qPCR lub sekwencjonowania wysokoprzepustowego. Osiąga się to poprzez sieciowanie komórek w celu uchwycenia natywnych oddziaływań DNA-RNA in vivo. W drugim kroku komórki są lizowane i poddawane sonikacji, aby solubilizować lizat komórkowy i pociąć chromatynę na małe fragmenty.Następnie do lizatu komórkowego dodaje się biotynilowane oligosomy antysensowne w celu specyficznego wzbogacenia kompleksów R-N-A-D-N-A, które są przedmiotem zainteresowania; uzyskane wyniki pozwalają zidentyfikować genomowe miejsca wiązania niekodującego RNA na podstawie qPCR lub sekwencjonowania wysokoprzepustowego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak R-N-A-D-N-A FISH, jest to, że metoda CHIRP umożliwia tworzenie map miejsc wiązania niekodującego RNA w całym genomie z rozdzielczością zbliżoną do pojedynczej pary zasad. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie niekodującego RNA, na przykład w kwestii tego, w jaki sposób roX RNA u much samców zapewnia kompensację dawki.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapie chorób związanych z niekodującym RNA, ponieważ pozwala ona lepiej zrozumieć, w jaki sposób niekodujące RNA regulują stany chromatyny i ekspresję genów. W celu izolacji chromatyny poprzez oczyszczanie RNA lub eksperyment ChIRP, po wirowaniu zebrać zostanie 40 milionów komórek; należy odlać PBS i usunąć pozostały płyn, ostrożnie aspirując go pod kątem, a następnie oddzielić osad komórkowy poprzez ostukanie dna probówki typu Falcon. Należy dodać świeżo przygotowany 1% glutaraldehyd, zaczynając od małej objętości, i resuspender osad komórkowy, dopełniając do pełnej objętości, a następnie odwrócić probówkę, aby wymieszać; inkubować w celu sieciowania przez 10 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce end-to-end lub rotatorze. Reakcję sieciowania należy przerwać, dodając jedną dziesiątą objętości 1,25 M glicyny, i pozostawić na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez pięć minut; komórki przybiorą jaskrawopomarańczowy kolor.Następnie wiruj próbki przy 2000 RCF przez pięć minut, odlej i odessij nadsącz, a następnie przemyj osad 20 mililitrami schłodzonego PBS. Ponownie wiruj, odessij nadsącz i resuspenduj przemyty, sieciowany osad w schłodzonym PBS. Przenieś każdy mililitr komórek do probówki typu Eppendorf i wiruj przy 2000 RCF przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni celsius. Po wirowaniu, używając końcówki do pipety, ostrożnie usuń jak najwięcej PBS.Szybko zamroź wszystkie granulki komórkowe w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C przez czas nieokreślony. Aby przygotować lizat komórkowy do metody CHIRP, rozmroź zamrożone, sieciowane granulki komórkowe w temperaturze pokojowej. Mocno uderz w probówkę, aby odczepić i wymieszać granulkę komórkową.Odwirować osady i za pomocą ostrej końcówki pipety 10 µL usunąć pozostały PBS, ważąc próbki na wadze analitycznej o dokładności 1 mg. Odważyć pustą probówkę typu einor. Zważyć każdy osad i zapisać jego masę.Do każdej probówki dodać 10-krotną objętość buforu do lizy uzupełnionego świeżym inhibitorem proteaz PMSF oraz super ace, a następnie zresuspender osad. Lizat komórkowy musi zostać poddany obróbce natychmiast po przygotowaniu. Przenieść nie więcej niż 1,5 ml lizatu do każdej probówki typu Falcon o pojemności 15 ml i włożyć sondy sonikacyjne, mocno je przykręcając.Następnie umieść probówki w urządzeniu do rozbijania komórek (bio rupture) i poddaj je sonikacji w temperaturze 4 °C przy najwyższym ustawieniu, stosując interwały impulsowe 30 sekund pracy i 45 sekund przerwy. Kontroluj lizat co 30 minut. Kontynuuj sonikację, aż lizat komórkowy przestanie być mętny.Proces ten może trwać od 30 minut do czterech godzin, w zależności od liczby probówek, objętości próbki, temperatury kąpieli oraz czasu sonikacji. Gdy lizat stanie się klarowny, przenieś 5 µL do nowej probówki typu einor. Dodaj bufor do proteazy K DNA oraz proteazę K, wymieszaj w wstrząsarze typu vortex i krótko odwiruj; następnie inkubuj przez 45 minut w temperaturze 50 °C, po czym wyekstrahuj DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR.Sprawdź wielkość DNA na żelu agarozowym 1%. Większość smug DNA powinna znajdować się w zakresie od 100 do 500 par zasad, co wskazuje na pełną sonikację. Wirować jednofazowe próbki 1 ml po sonikacji z prędkością 16 100 RCF przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, przenieść nadsącz do nowych probówek Eppendorf i błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie przed rozpoczęciem procedury ChIP. Rozmrozić probówki z chromatyną w temperaturze pokojowej dla typowej próbki ChIP.Z jednego mililitra lizatu należy pobrać 10 µL jako materiał wyjściowy dla RNA oraz 10 µL jako materiał wyjściowy dla DNA i umieścić je w probówkach typu Eppendorf. Przechowywać w lodzie do czasu dalszego wykorzystania. Przenieść jeden mililitr każdej próbki chromatyny do probówki Falcon o pojemności 15 ml.Do każdej probówki dodaj dwa mililitry buforu do hybrydyzacji. Następnie rozmroź sondy w temperaturze pokojowej. Te biotynilowane oligosy kafelkowe są oznakowane zgodnie z ich położeniem w obrębie RNA i podzielone na dwie pule.Pula parzysta zawiera wszystkie sondy z numerami parzystymi, natomiast pula nieparzysta zawiera sondy z numerami nieparzystymi. Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane z wykorzystaniem obu pul, które służą sobie wzajemnie jako kontrole wewnętrzne.Jednym z najtrudniejszych aspektów właściwego protokołu jest konieczność przeprowadzania wszystkich etapów hybrydyzacji i przemywania w temperaturze 37 stopni. Aby zapewnić stałą temperaturę eksperymentu, należy wykonywać wszystkie kroki wewnątrz lub w pobliżu inkubatora. Do odpowiednich probówek należy dodać właściwą objętość sond. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 37 stopni przez cztery godziny z wytrząsaniem, kończąc proces na 20 minut przed pełnym zakończeniem hybrydyzacji.Przygotować magnetyczne kulki C one. Należy zużyć 100 µL na każde 100 pm sond. Przemyć trzykrotnie 1 mL nieuzupełnionego buforu lizującego, używając magnesu Dyna mag two strip do oddzielenia kulek od buforu.Po ostatnim przemyciu resuspenduj kuleczki w pierwotnej objętości buforu do lizy i uzupełnij o świeży PMSF oraz inhibitor proteaz. Po zakończeniu czterogodzinnej reakcji hybrydyzacji dodaj 100 µL kuleczek do każdej probówki i wymieszaj. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 °C przy wstrząsaniu, a następnie przemyj kuleczki 1 mL buforu do przemywania, wstępnie podgrzanego do 37 °C podczas pierwszego mycia.Użyj listwy magnetycznej DynaMag 15 do oddzielenia kulek, odlej nadsącz i zawieś je ponownie w 1 mL buforu płuczącego, a następnie przenieś do probówki EOR o pojemności 1,5 mL. Inkubuj w 37 °C z wytrząsaniem przez pięć minut. Podczas kolejnych etapów płukania wirować każdą probówkę w miniwirówce, a następnie umieścić próbkę na listwie magnetycznej DynaMag 2 na jedną minutę i odlać nadsącz. Wytrzyj ewentualne krople chusteczką Kimwipe i zawieś ponownie w 1 mL.Bufor płuczący, inkubować w temperaturze 37°C z wytrząsaniem przez pięć minut. Powtórzyć czynność łącznie pięć razy; przy ostatnim płukaniu resuspender. Dobrze zawiesić kuleczki, pobrać 100 µL i odstawić do izolacji RNA, a 900 µL zarezerwować dla frakcji DNA.Umieścić wszystkie probówki na magnetycznej listwie DynaMag i usunąć bufor piorący. Po krótkim wirowaniu ponownie umieścić probówkę na listwie magnetycznej, używając ostrej końcówki pipety o objętości 10 µL. Całkowicie usunąć pozostały bufor piorący z każdej probówki.Następnie z próbek chirp izoluje się frakcje RNA i DNA w celu przeprowadzenia analizy ilościowej oraz sekwencjonowania. Rysunek ten przedstawia wzbogacenie ludzkiej telomerazy, RNA lub Turk z komórek HELOC w porównaniu do GA dh. Jest to obfite komórkowe RNA służące jako kontrola negatywna.Większość obecnego w komórce RNA Turk, około 88%, została wyizolowana poprzez przeprowadzenie metody CHIRP, podczas gdy odzyskano jedynie 0,46% RNA GA DH, co wykazuje współczynnik wzbogacenia wynoszący około 200 razy. Jako dodatkowe kontrole negatywne można zastosować sondy nieswoiste, takie jak sondy skierowane przeciwko RNA LAC Z, które zazwyczaj nie jest ekspresowane w komórkach ssaków. Regiony DNA, których oczekuje się, że zwiążą cel. Długie niekodujące RNA są zazwyczaj wzbogacone w stosunku do regionów negatywnych w pomiarach metodą qPCR.Rysunek ten przedstawia walidację metodą QPCR czterech miejsc wiązania hot air w pierwotnych fibroblastach prąścia ludzkiego, wyznaczonych poprzez przeprowadzenie analizy chirp SSE w tej samej linii komórkowej, podczas gdy regiony DNA Turk i GA DH służą jako ujemne kontrole. Zarówno parzyste, jak i nieparzyste zestawy sond wykazały porównywalny poziom wzbogacenia oczekiwanych miejsc wiązania hot air w stosunku do regionów ujemnych. Jest to cecha charakterystyczna dla prawdziwych miejsc wiązania długich niekodujących RNA.Globalną mapę miejsc wiązania długich niekodujących RNA można uzyskać poprzez wysokoprzepustowne sekwencjonowanie DNA wzbogaconego metodą CHIRP, co zilustrowano na danych dla długiego niekodującego RNA roX2, o którym wiadomo, że oddziałuje z chromosomem X w sposób niezbędny dla kompensacji dawki. Próbki parzyste i nieparzyste sekwencjonowano oddzielnie, a ich unikalne szumy wyeliminowano w celu uzyskania ścieżki sygnałów nakładających się, gdzie każdy pik wskazuje na silne miejsce wiązania roX2. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zastosowanie prawidłowej techniki wolnej od RNaz. Po wykonaniu tej procedury.W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, jakie białka oddziałują z badanym nieklinicznym DRNA po jego opracowaniu, można zastosować inne metody, takie jak western blotting. Metoda CHI utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii RNA do mapowania RNA w komórkach hodowlanych i utrwalonych tkankach.

chromatin-isolation-by-rna-purification-chirp

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy tutaj procedurę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) służącą do analizy lokalizacji w całym genomie izoform białek różniących się domeną wiążącą histony. Zastosowaliśmy ją w analizie ChIP-Seq w celu zidentyfikowania celów demetylazy histonów KDM5A/JARID1A/RBP2.

Analiza całogenomowa z wykorzystaniem metody ChIP w celu identyfikacji specyficznych dla izoform celów genowych

Analiza oddziaływań chromatyny za pomocą sekwencjonowania parowanych końców (ChIA-PET) jest metodą detekcji oddziaływań chromatyny de novo, służącą lepszemu zrozumieniu kontroli transkrypcyjnej.

Analiza oddziaływań chromatyny z sekwencjonowaniem parowanych końców (ChIA-PET) w celu mapowania oddziaływań chromatyny i zrozumienia regulacji transkrypcji

Opisujemy solidną metodę immunoprecypitacji chromatyny przy użyciu pierwotnych limfocytów T. Metoda opiera się na standardowych podejściach, ale wykorzystuje określony zestaw warunków i odczynników, które poprawiają wydajność dla ograniczonej liczby komórek. Co ważne, przedstawiono szczegółowy opis fazy analizy danych.

Wydajna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu ograniczonych ilości biomasy

Połączenie immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania ultra-wysokoprzepustowego (ChIP-seq) może zidentyfikować i zmapować interakcje białko-DNA w danej tkance lub linii komórkowej. Przedstawiono sposób generowania wysokiej jakości szablonu ChIP do późniejszego sekwencjonowania, na przykładzie doświadczenia z czynnikiem transkrypcyjnym TCF7L2.

Generowanie wysokiej jakości matrycy DNA do immunoprecypitacji chromatyny do sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq)

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Identyfikacja cząsteczek związanych z konkretnymi regionami genomu będącymi przedmiotem zainteresowania jest konieczna, aby zrozumieć mechanizmy regulacji funkcji tych regionów. Protokół ten opisuje procedury przeprowadzania imunoprecipitacji chromatyny za pośrednictwem cząsteczki wiążącej DNA (enChIP) w celu identyfikacji białek i RNA związanych z określonym regionem genomu.

Izolacja określonych regionów genomu i identyfikacja powiązanych cząsteczek za pomocą enChIP

Tutaj opisujemy protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i przygotowania biblioteki ChIP-seq do generowania globalnych profili epigenomicznych z próbek embrionalnych kurczaków o niskiej liczebności.

Protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) dla próbek embrionalnych o niskiej liczebności

Tutaj opisujemy metody wykonywania ChIP-Seq i CARIP-Seq, w tym przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji, do generowania globalnych epigenomicznych i związanych z chromatyną map RNA w komórkach ES.

CARIP-Seq i ChIP-Seq: Metody identyfikacji RNA związanych z chromatyną i interakcji białko-DNA w embrionalnych komórkach macierzystych

Opisujemy krok po kroku protokół sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny tandemowej (tChIP-Seq), który umożliwia analizę specyficznej dla typu komórki modyfikacji histonów w całym genomie.

TChIP-Seq: Profilowanie epigenomu specyficzne dla typu komórki

Ten protokół skupia się na przygotowaniu chromatyny z zamrożonych tkanek i nadaje się do sieciowania immunoprecypitacji chromatyny (X-ChIP), a następnie analizy ilościowej PCR (X-ChIP-qPCR) lub sekwencjonowania nowej generacji (X-ChIP-seq).

Ekstrakcja chromatyny z zamrożonej chimerycznej tkanki wątroby do analizy immunoprecypitacji chromatyny

Poznaj metodę ChIRP do mapowania miejsc wiązania długich niekodujących RNA z genomem. Technika wykorzystuje biotynylowane oligonukleotydy do izolacji chromatyny z wysoką specyficznością.

Izolacja chromatyny poprzez oczyszczanie RNA (ChIRP)

Przeglądaj więcej filmów