Izolacja chromatyny poprzez oczyszczanie RNA (ChIRP)

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest określenie regionów DNA związanych ze specyficznym niekodującym RNA przy użyciu qPCR lub sekwencjonowania wysokoprzepustowego. Osiąga się to poprzez sieciowanie komórek w celu uchwycenia natywnych oddziaływań DNA-RNA in vivo. W drugim kroku komórki są lizowane i poddawane sonikacji, aby solubilizować lizat komórkowy i pociąć chromatynę na małe fragmenty.

Następnie do lizatu komórkowego dodaje się biotynilowane oligosomy antysensowne w celu specyficznego wzbogacenia kompleksów R-N-A-D-N-A, które są przedmiotem zainteresowania; uzyskane wyniki pozwalają zidentyfikować genomowe miejsca wiązania niekodującego RNA na podstawie qPCR lub sekwencjonowania wysokoprzepustowego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak R-N-A-D-N-A FISH, jest to, że metoda CHIRP umożliwia tworzenie map miejsc wiązania niekodującego RNA w całym genomie z rozdzielczością zbliżoną do pojedynczej pary zasad. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie niekodującego RNA, na przykład w kwestii tego, w jaki sposób roX RNA u much samców zapewnia kompensację dawki.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapie chorób związanych z niekodującym RNA, ponieważ pozwala ona lepiej zrozumieć, w jaki sposób niekodujące RNA regulują stany chromatyny i ekspresję genów. W celu izolacji chromatyny poprzez oczyszczanie RNA lub eksperyment ChIRP, po wirowaniu zebrać zostanie 40 milionów komórek; należy odlać PBS i usunąć pozostały płyn, ostrożnie aspirując go pod kątem, a następnie oddzielić osad komórkowy poprzez ostukanie dna probówki typu Falcon. Należy dodać świeżo przygotowany 1% glutaraldehyd, zaczynając od małej objętości, i resuspender osad komórkowy, dopełniając do pełnej objętości, a następnie odwrócić probówkę, aby wymieszać; inkubować w celu sieciowania przez 10 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce end-to-end lub rotatorze. Reakcję sieciowania należy przerwać, dodając jedną dziesiątą objętości 1,25 M glicyny, i pozostawić na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez pięć minut; komórki przybiorą jaskrawopomarańczowy kolor.

Następnie wiruj próbki przy 2000 RCF przez pięć minut, odlej i odessij nadsącz, a następnie przemyj osad 20 mililitrami schłodzonego PBS. Ponownie wiruj, odessij nadsącz i resuspenduj przemyty, sieciowany osad w schłodzonym PBS. Przenieś każdy mililitr komórek do probówki typu Eppendorf i wiruj przy 2000 RCF przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni celsius. Po wirowaniu, używając końcówki do pipety, ostrożnie usuń jak najwięcej PBS.

Szybko zamroź wszystkie granulki komórkowe w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C przez czas nieokreślony. Aby przygotować lizat komórkowy do metody CHIRP, rozmroź zamrożone, sieciowane granulki komórkowe w temperaturze pokojowej. Mocno uderz w probówkę, aby odczepić i wymieszać granulkę komórkową.

Odwirować osady i za pomocą ostrej końcówki pipety 10 µL usunąć pozostały PBS, ważąc próbki na wadze analitycznej o dokładności 1 mg. Odważyć pustą probówkę typu einor. Zważyć każdy osad i zapisać jego masę.

Do każdej probówki dodać 10-krotną objętość buforu do lizy uzupełnionego świeżym inhibitorem proteaz PMSF oraz super ace, a następnie zresuspender osad. Lizat komórkowy musi zostać poddany obróbce natychmiast po przygotowaniu. Przenieść nie więcej niż 1,5 ml lizatu do każdej probówki typu Falcon o pojemności 15 ml i włożyć sondy sonikacyjne, mocno je przykręcając.

Następnie umieść probówki w urządzeniu do rozbijania komórek (bio rupture) i poddaj je sonikacji w temperaturze 4 °C przy najwyższym ustawieniu, stosując interwały impulsowe 30 sekund pracy i 45 sekund przerwy. Kontroluj lizat co 30 minut. Kontynuuj sonikację, aż lizat komórkowy przestanie być mętny.

Proces ten może trwać od 30 minut do czterech godzin, w zależności od liczby probówek, objętości próbki, temperatury kąpieli oraz czasu sonikacji. Gdy lizat stanie się klarowny, przenieś 5 µL do nowej probówki typu einor. Dodaj bufor do proteazy K DNA oraz proteazę K, wymieszaj w wstrząsarze typu vortex i krótko odwiruj; następnie inkubuj przez 45 minut w temperaturze 50 °C, po czym wyekstrahuj DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR.

Sprawdź wielkość DNA na żelu agarozowym 1%. Większość smug DNA powinna znajdować się w zakresie od 100 do 500 par zasad, co wskazuje na pełną sonikację. Wirować jednofazowe próbki 1 ml po sonikacji z prędkością 16 100 RCF przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, przenieść nadsącz do nowych probówek Eppendorf i błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie przed rozpoczęciem procedury ChIP. Rozmrozić probówki z chromatyną w temperaturze pokojowej dla typowej próbki ChIP.

Z jednego mililitra lizatu należy pobrać 10 µL jako materiał wyjściowy dla RNA oraz 10 µL jako materiał wyjściowy dla DNA i umieścić je w probówkach typu Eppendorf. Przechowywać w lodzie do czasu dalszego wykorzystania. Przenieść jeden mililitr każdej próbki chromatyny do probówki Falcon o pojemności 15 ml.

Do każdej probówki dodaj dwa mililitry buforu do hybrydyzacji. Następnie rozmroź sondy w temperaturze pokojowej. Te biotynilowane oligosy kafelkowe są oznakowane zgodnie z ich położeniem w obrębie RNA i podzielone na dwie pule.

Pula parzysta zawiera wszystkie sondy z numerami parzystymi, natomiast pula nieparzysta zawiera sondy z numerami nieparzystymi. Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane z wykorzystaniem obu pul, które służą sobie wzajemnie jako kontrole wewnętrzne.

Jednym z najtrudniejszych aspektów właściwego protokołu jest konieczność przeprowadzania wszystkich etapów hybrydyzacji i przemywania w temperaturze 37 stopni. Aby zapewnić stałą temperaturę eksperymentu, należy wykonywać wszystkie kroki wewnątrz lub w pobliżu inkubatora. Do odpowiednich probówek należy dodać właściwą objętość sond. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 37 stopni przez cztery godziny z wytrząsaniem, kończąc proces na 20 minut przed pełnym zakończeniem hybrydyzacji.

Przygotować magnetyczne kulki C one. Należy zużyć 100 µL na każde 100 pm sond. Przemyć trzykrotnie 1 mL nieuzupełnionego buforu lizującego, używając magnesu Dyna mag two strip do oddzielenia kulek od buforu.

Po ostatnim przemyciu resuspenduj kuleczki w pierwotnej objętości buforu do lizy i uzupełnij o świeży PMSF oraz inhibitor proteaz. Po zakończeniu czterogodzinnej reakcji hybrydyzacji dodaj 100 µL kuleczek do każdej probówki i wymieszaj. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 °C przy wstrząsaniu, a następnie przemyj kuleczki 1 mL buforu do przemywania, wstępnie podgrzanego do 37 °C podczas pierwszego mycia.

Użyj listwy magnetycznej DynaMag 15 do oddzielenia kulek, odlej nadsącz i zawieś je ponownie w 1 mL buforu płuczącego, a następnie przenieś do probówki EOR o pojemności 1,5 mL. Inkubuj w 37 °C z wytrząsaniem przez pięć minut. Podczas kolejnych etapów płukania wirować każdą probówkę w miniwirówce, a następnie umieścić próbkę na listwie magnetycznej DynaMag 2 na jedną minutę i odlać nadsącz. Wytrzyj ewentualne krople chusteczką Kimwipe i zawieś ponownie w 1 mL.

Bufor płuczący, inkubować w temperaturze 37°C z wytrząsaniem przez pięć minut. Powtórzyć czynność łącznie pięć razy; przy ostatnim płukaniu resuspender. Dobrze zawiesić kuleczki, pobrać 100 µL i odstawić do izolacji RNA, a 900 µL zarezerwować dla frakcji DNA.

Umieścić wszystkie probówki na magnetycznej listwie DynaMag i usunąć bufor piorący. Po krótkim wirowaniu ponownie umieścić probówkę na listwie magnetycznej, używając ostrej końcówki pipety o objętości 10 µL. Całkowicie usunąć pozostały bufor piorący z każdej probówki.

Następnie z próbek chirp izoluje się frakcje RNA i DNA w celu przeprowadzenia analizy ilościowej oraz sekwencjonowania. Rysunek ten przedstawia wzbogacenie ludzkiej telomerazy, RNA lub Turk z komórek HELOC w porównaniu do GA dh. Jest to obfite komórkowe RNA służące jako kontrola negatywna.

Większość obecnego w komórce RNA Turk, około 88%, została wyizolowana poprzez przeprowadzenie metody CHIRP, podczas gdy odzyskano jedynie 0,46% RNA GA DH, co wykazuje współczynnik wzbogacenia wynoszący około 200 razy. Jako dodatkowe kontrole negatywne można zastosować sondy nieswoiste, takie jak sondy skierowane przeciwko RNA LAC Z, które zazwyczaj nie jest ekspresowane w komórkach ssaków. Regiony DNA, których oczekuje się, że zwiążą cel. Długie niekodujące RNA są zazwyczaj wzbogacone w stosunku do regionów negatywnych w pomiarach metodą qPCR.

Rysunek ten przedstawia walidację metodą QPCR czterech miejsc wiązania hot air w pierwotnych fibroblastach prąścia ludzkiego, wyznaczonych poprzez przeprowadzenie analizy chirp SSE w tej samej linii komórkowej, podczas gdy regiony DNA Turk i GA DH służą jako ujemne kontrole. Zarówno parzyste, jak i nieparzyste zestawy sond wykazały porównywalny poziom wzbogacenia oczekiwanych miejsc wiązania hot air w stosunku do regionów ujemnych. Jest to cecha charakterystyczna dla prawdziwych miejsc wiązania długich niekodujących RNA.

Globalną mapę miejsc wiązania długich niekodujących RNA można uzyskać poprzez wysokoprzepustowne sekwencjonowanie DNA wzbogaconego metodą CHIRP, co zilustrowano na danych dla długiego niekodującego RNA roX2, o którym wiadomo, że oddziałuje z chromosomem X w sposób niezbędny dla kompensacji dawki. Próbki parzyste i nieparzyste sekwencjonowano oddzielnie, a ich unikalne szumy wyeliminowano w celu uzyskania ścieżki sygnałów nakładających się, gdzie każdy pik wskazuje na silne miejsce wiązania roX2. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zastosowanie prawidłowej techniki wolnej od RNaz. Po wykonaniu tej procedury.

W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, jakie białka oddziałują z badanym nieklinicznym DRNA po jego opracowaniu, można zastosować inne metody, takie jak western blotting. Metoda CHI utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii RNA do mapowania RNA w komórkach hodowlanych i utrwalonych tkankach.