Hydrofobowy Nafion modyfikowany solą do immobilizacji i stabilizacji enzymów

Ogólnym celem niniejszej procedury jest synteza polimeru do unieruchamiania i stabilizacji enzymów w komórkach. Aby to osiągnąć, w pierwszej kolejności należy połączyć zawiesinę nafionową z solą bromku amonu, a następnie wymieszać zawiesinę za pomocą wortexa w celu wymiany formy protonowanej nafionu na sole amonowe. Drugim krokiem jest wysuszenie otrzymanego polimeru poprzez przelanie mieszaniny do łódeczki do ważenia i odparowanie rozpuszczalników.

Następnie polimer namaczamy w wodzie dejonizowanej przez 12 do 24 godzin w celu usunięcia nadmiaru soli. Po ekstrakcji soli polimer płuczemy wodą, a następnie pozostawiamy do całkowitego wyschnięcia poprzez odparowanie. W ostatnim kroku polimer przenosimy do czystej probówki i resuspendujemy w rozpuszczalniku w celu wykorzystania go w immobilizacji enzymów. Ostatecznie ten polimer do immobilizacji enzymów jest stosowany w celu poprawy stabilności enzymów w testach aktywności.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ procedura wydaje się niezwykle prosta, jednak proces suszenia ma krytyczne znaczenie dla wytworzenia funkcjonalnego polimeru. Procedurę tę zaprezentuje student studiów doktoranckich z mojego laboratorium. Aby rozpocząć procedurę modyfikacji nafionu solami amoniowymi Nerium, należy odmierzyć trzykrotną nadwyżkę molową bromku alkilammonium w stosunku do grup kwasu sulfonowego w polimerze nafionowym.

Przenieś sól bromku amonu AGU do szklanej fiolki, energicznie nią potrząsając. Wstrząśnij butelką z 5% (massa/objętość) zawiesiną Nafion przez około 30 sekund, aby upewnić się, że Nafion jest równomiernie zawieszony w roztworze. Odmierz pipetą dwa mililitry ponownie zawieszonego Nafionu i dodaj go do szklanej fiolki zawierającej sól bromku amonu AGU.

Mieszaj zawartość probówki na wirówce typu vortex z prędkością 900 RPM przez 10 do 15 minut. Następnie przelej lepki roztwór do plastikowej łódeczki wagowej i za pomocą pipety przenieś pozostały w probówce roztwór do łódeczki. W tym przykładzie łódeczka jest częściowo przykryta i pozostawiona na blacie laboratoryjnym, aby rozpuszczalniki całkowicie odparowały z naczynia w tempie parowania przekraczającym sześć godzin.

Całkowite odparowanie całego rozpuszczalnika przy odpowiedniej szybkości parowania powinno pozostawić na dnie tacki wagowej żółty lub brązowy przezroczysty film, jak pokazano tutaj. Jeśli rozpuszczalnik odparuje zbyt szybko, zamiast przezroczystego filmu utworzy się materiał skorupowy lub krystaliczny, co wskazuje na zniszczenie struktury micelarnej polimeru. Jeśli odparowanie rozpuszczalnika przebiega zbyt wolno lub sól amonowa reaguje zbyt długo i pochłonie zbyt dużo pary wodnej, utworzy się lepki pomarańczowy żel lub biały materiał krystaliczny.

W obu przypadkach procedurę należy rozpocząć od nowa. Po odparowaniu całego rozpuszczalnika z odpowiednią szybkością odparowania, należy wypełnić tackę wagową od 10 do 20 mililitrów wody dejonizowanej o rezystywności 18 mega ohm centymetr, przykryć i namaczać przez 12 do 24 godzin w celu usunięcia nadmiaru soli bromku amonu i HBR. Po 12 do 24 godzinach wodę należy odessać pipetą i dodać odpowiednią ilość wody dejonizowanej, aby ponownie wypełnić tackę. Należy zachować ostrożność i zawsze pobierać wodę pipetą w kierunku oddalonym od błony polimerowej, aby uniknąć jej utraty.

Wypłucz próbkę łącznie trzy razy po wykonaniu płukania. Pozostaw tackę wagową nieprzykrytą aż do całkowitego wyschnięcia polimeru. Po całkowitym wyschnięciu polimer powinien mieć postać przejrzystej i nieco kruchej błony plastikowej.

W przeciwieństwie do nich, polimery, które nie zostały prawidłowo wysuszone, będą miały po ekstrakcji solnej zupełnie inny wygląd, co pokazano tutaj. Używając szpatułki, ostrożnie usuń wysuszony film z tacki wagowej i przenieś go do czystej szklanej fiolki. Dodaj dwa mililitry etanolu oraz trzy ceramiczne kulki do mieszania i inkubuj w wstrząsarku typu vortex przez cztery godziny lub do momentu całkowitego resuspensowania filmu polimerowego.

Roztwór nanułomodu modyfikowanego chlorkiem alkiloamoniowym jest teraz gotowy do immobilizacji enzymu. Jeśli enzym przeznaczony do immobilizacji jest w formie proszku, odważ jeden miligram enzymu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 mililitra i dodaj jeden mililitr 100 mM buforu fosforanowego o pH 7, aby przygotować roztwór enzymu o stężeniu 1 mg/ml. Przenieś 120 µL roztworu enzymu o stężeniu 1 mg/ml do nowej probówki.

Dodaj 60 µL zmodyfikowanego roztworu nafionu z ALK amonu i mieszaj w wirówce (vortex) przez 10 sekund. Stosunek enzymu do roztworu polimeru musi wynosić dwa do jednego, jeśli mieszanina ta ma zostać przygotowana w większej ilości dla licznych powtórzeń. Na koniec pipetuj 60 µL roztworu enzym-polimer na dno każdej z trzech oddzielnych kuwet o powierzchni jednej centymetra kwadratowego i pozostaw je do wyschnięcia na noc.

Stabilność enzymu w filmie polimerowym można następnie ocenić za pomocą testów aktywności enzymatycznej, zgodnie z przedstawioną procedurą. Aby rozpocząć ten test, należy dodać do kuwety z odlanym zmodyfikowanym polimerem Nafion oraz enzymem dehydrogenazą zależną od NAD następujące odczynniki: 1,3 ml 50 mM pirofosforanu sodu, 1,5 ml świeżo przygotowanego 15 mM nikotynamido-adenina-dinukleotydu (NAD) oraz 0,1 ml wody.

Umieść kuwetę w spektrofotometrze UV-Vis ustawionym na długość fali 340 nanometrów i wyzeruj urządzenie. Do kuwety dodaj 0,1 mililitra etanolu i wymieszaj odczynniki, delikatnie pipetując roztwór w górę i w dół pięć razy; w przypadku próby ślepej zamiast 0,1 mililitra etanolu użyj 0,1 mililitra wody. Pięć minut po dodaniu odczynników do kuwety zmierz absorbancję przy 340 nanometrach.

Ponownie zmierz absorbancję po 20 minutach od dodania odczynników do qve; te dwa punkty danych zostaną naniesione na wykres w celu wyznaczenia nachylenia linii, które zostanie wykorzystane do obliczeń aktywności przy oznaczaniu specyficznej aktywności enzymatycznej unieruchomionego pq. W przypadku dehydrogenaz zależnych od PQQ, odczynniki te należy pipetować do qve współodtwarzanego z modyfikowanym polimerem nafion i dehydrogenazą zależną od PQQ. 1.5 ml fosforanu sodu oraz 200 µl 600 µM siarczanu fenylometylu lub PMS.

Umieść kuwetę w spektrofotometrze UV-vis ustawionym na długość fali 600 nm i wyzeruj urządzenie. Do próbki dodaj 100 µL mieszaniny składającej się z 700 µL 2-chloro-6-nitrophenolu lub DCIP oraz 200 µL badanego substratu. Wymieszaj odczynniki, delikatnie pipetując roztwór w górę i w dół pięć razy, aby przygotować próbę ślepą.

Użyć 200 µL wody zamiast badanego substratu. Pięć minut po dodaniu odczynników zmierzyć absorbancję przy 600 nm.

Zmierz ponownie absorbancję 20 minut po dodaniu odczynników niezbędnych do rozpoczęcia tego testu. Do Q VET odlanego z modyfikowanego polimeru Nafion i oksydazy glukozowej dodaj dwa mililitry roztworu zawierającego: 0,2 M kwasu p-hydroksybenzoowego, 0,02% azotku sodu, 128 jednostek peroksydazy, 0,3 mM 4-aminoantipiryny, 1 M fosforanu potasu oraz 50 mM glukozy.

Przygotować roztwór, pipetując go pięciokrotnie w górę i w dół. Umieścić cuwetę w spektrofotometrze UV-Vis ustawionym na długość fali 510 nm. Pomiary należy wykonać pięć minut po dodaniu odczynników do cuwety.

Zmierz absorbancję przy 510 nanometrach. Następnie ponownie zmierz absorbancję po 20 minutach od dodania odczynników. W poniższej tabeli przedstawiono wyniki analizy aktywności dehydrogenazy glukozowej zależnej od NAD unieruchomionej na wybranych modyfikowanych polimerach nafionu.

Zaobserwowano, że unieruchomiona dehydrogenaza glukozowa zależna od NAD wykazuje niższą aktywność właściwą niż enzym w roztworze buforowym. Wynika to z faktu, że membrany polimerowe ograniczają transport dużych cząsteczek; choć glukoza, będąca substratem w teście, jest mała, koenzym NAD musi dyfundować do wnętrza membrany i z powrotem. W przypadku dehydrogenazy zależnej od NAD ograniczenia transportowe wynikające z unieruchomienia w polimerze zmniejszają obserwowaną aktywność enzymatyczną.

Następna tabela przedstawia wyniki analizy aktywności dehydrogenazy glukozowej zależnej od PQQ unieruchomionej na wybranych modyfikowanych polimerach nafionowych. Warto zwrócić uwagę na wyższą aktywność enzymów unieruchomionych na większości błon nafionowych w porównaniu z enzymami w roztworze buforowym. Ponieważ dehydrogenaza glukozowa zależna od PQQ jest białkiem związanym z błoną, hydrofobowo modyfikowany, komórkowy nafion zapewnia środowisko bardziej zbliżone do błony niż bufor w celu stabilizacji aktywnej dehydrogenazy glukozowej zależnej od PQQ, co zwiększa aktywność enzymu.

Na koniec przedstawiono reprezentatywne wyniki testów aktywności specyficznej oksydazy glukozowej. W poniższej tabeli zaprezentowano polimery Nafion unieruchomione i wybrane zmodyfikowane. Analizy enzymatyczne każdego z polimerów z każdym z trzech enzymów wykazują, że trendy w względnej aktywności specyficznej w porównaniu z enzymem i roztworem są funkcją systemu enzymatycznego.

W konsekwencji należy zoptymalizować dokładny rodzaj polimeru potrzebny dla każdego enzymu. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że etap suszenia jest krytyczny dla tej konkretnej metody.