Name: Hydrofobowy nafion modyfikowany solą do immobilizacji i stabilizacji enzymów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Poznaj metodę syntezy hydrofobowego nafionu modyfikowanego solą do immobilizacji i stabilizacji enzymów. Ta technika poprawia trwałość enzymów w badaniach aktywności enzymatycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Office of Naval Research, United Soybean Board oraz National Science Foundation za dofinansowanie.

1. Modyfikacja Nafionu solami amonu czwartorzędowego
<ol>
	<li>Energicznie wstrząsać butelką z 5% w/v zawiesiną Nafion przez około 30 sekund, aby zapewnić jednolite zawieszenie Nafion w roztworze.</li>
	<li>Odpipetować 2 mL ponownie zawieszonego Nafion do szklanej fiolki (pojemność fiolki może wynosić od 2,5 mL do 10 mL).</li>
	<li>Odważyć 3-krotny nadmiar molowy (w stosunku do grup kwasu sulfonowego w polimerze Nafion) soli bromku alkiloamoniowego (odpowiednie masy przedstawiono w Tabeli 1) i dodać go do fiolki zawierającej 2 mL Nafion.</li>
	<li>Mieszać fiolkę na wstrząsarce typu Vortex z prędkością 1500 rpm przez 10-15 minut.</li>
	<li>Wlać lepki roztwór do plastikowej tacki wagowej o wymiarach około 3 x 3 cali, a następnie za pomocą pipety przenieść resztę roztworu z fiolki do tacki wagowej.</li>
	<li>Pozostawić rozpuszczalniki do odparowania z tacki wagowej, aż na dnie powstanie żółto-brązowa, przezroczysta błona (Rycina 2). Szybkość odparowania rozpuszczalnika powinna być taka, aby odparowanie całego rozpuszczalnika trwało ponad 6 godzin. Jeśli rozpuszczalnik odparuje zbyt szybko, zamiast przezroczystej błony utworzy się biały, skorupowaty materiał, co wskazuje na zniszczenie struktury micelarnej polimeru i konieczność powtórzenia procedury. Jeśli odparowanie rozpuszczalnika jest zbyt wolne, może być konieczne zastosowanie osuszacza powietrza, ponieważ zbyt powolne odparowanie zazwyczaj prowadzi do powstania lepkiego, pomarańczowego żelu i wymaga powtórzenia procedury. Typowy zakres temperatur odparowania rozpuszczalnika wynosi 20 - 37 °C. Rzeczywiste warunki suszenia zależą od wilgotności względnej i temperatury w pomieszczeniu, jednak ważne jest, aby suszenie przebiegało powoli w celu zachowania struktury miceli, ale nie tak wolno, by doprowadzić do powstania żelu.</li>
	<li>Wypełnić tackę wagową wodą dejonizowaną o rezystywności 18M Ωcm (10-20 mL wody), przykryć i pozostawić do namoczenia na 12-24 godziny, aby usunąć nadmiar soli bromku alkiloamoniowego i HBr.</li>
	<li>Wylać (lub odpipetować) wodę i wypłukać 3 razy wystarczającą ilością wody DI, aby za każdym razem wypełnić tackę. Należy uważać, aby nie uszkodzić i nie zgubić błony polimerowej podczas tego etapu.</li>
	<li>Pozostawić tackę wagową bez przykrycia, aż polimer całkowicie wyschnie. W tym momencie polimer powinien być przejrzystą i nieco kruchą błoną plastikową. Ponownie, jeśli powietrze jest bardzo wilgotne, może być konieczne zastosowanie osuszacza powietrza, aby zakończyć odparowanie w odpowiednim czasie.</li>
	<li>Za pomocą szpatułki ostrożnie usunąć wysuszoną błonę z tacki wagowej i przenieść ją do czystej szklanej fiolki.</li>
	<li>Dodać 2 mL etanolu oraz 3 ceramiczne kulki do mieszania i mieszać na wstrząsarce Vortex przez 4 godziny lub do całkowitego ponownego zawieszenia błony polimerowej.</li>
</ol>
2. Immobilizacja enzymów w Nafionie zmodyfikowanym TBAB do testów aktywności
<ol>
	<li>W przypadku enzymu w formie proszku, odważ 1-10 mg enzymu do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL i dodaj 1 mL 100 mM buforu fosforanowego o pH 7, aby przygotować roztwór enzymu o stężeniu 1-10 mg/mL. W przypadku enzymu w formie roztworu, przeprowadź analizę kwasu bicinchoniminowego (BCA)13 w celu oznaczenia ilości białka, a następnie dodaj odpowiednią ilość 100 mM buforu fosforanowego, aby uzyskać stężenie białka 1-10 mg/mL. Stężenie 1-10 mg/mL zazwyczaj odpowiada 1-50 nanomolom/mL.</li>
	<li>Do 120 μL roztworu enzymu o stężeniu 1 mg/mL dodaj 60 μL roztworu Nafionu modyfikowanego alkilowym amoniakiem i mieszaj w wirówce typu vortex przez 10 sekund. (Mieszaninę tę można przygotować w większej objętości dla dużej liczby powtórzeń. Zachowaj stosunek roztworu enzymu do polimeru wynoszący 2:1).</li>
	<li>Pipetą nanieś 60 μL roztworu enzymu/polimeru na dno 3 oddzielnych kuwet o powierzchni 1 cm2 i pozostaw do wyschnięcia przez noc.</li>
</ol>
3. Analiza aktywności unieruchomionego enzymu dehydrogenazy zależnej od NAD
<ol>
	<li>Do kuwety dodać 1,3 mL 50 mM pirofosforanu sodu (pH 8,8), 1,5 mL 15 mM NAD (świeżo przygotowanego) oraz 0,1 mL wody.</li>
	<li>Kuwetę umieścić w spektrofotometrze UV/Vis (np. ThermoScientific Evolution 260 Bio lub Thermo Spectronic Genesys 20) ustawionym na długość fali 340 nm.</li>
	<li>Wyzerować spektrometr, a następnie dodać 0,1 mL etanolu. Wymieszać odczynniki, delikatnie pipetując roztwór w górę i w dół 5 razy. W celu przygotowania próby ślepej zamiast 0,1 mL etanolu dodać 0,1 mL wody.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję przy 340 nm w 5. i 20. minucie po dodaniu odczynników do kuwety. Wykreślić dwa punkty danych, aby wyznaczyć nachylenie linii, które zostanie wykorzystane do obliczeń aktywności.</li>
</ol>
4. Analiza aktywności unieruchomionych dehydrogenaz zależnych od PQQ
<ol>
	<li>Do kuwety dodać 1,5 mL fosforanu sodu (pH 7,3) oraz 200 μL PMS o stężeniu 600 μM.</li>
	<li>Umieścić kuwetę w spektrofotometrze UV/Vis ustawionym na długość fali 600 nm, a następnie wyzerować spektrometr.</li>
	<li>Dodać 100 μL DCIP o stężeniu 700 μL oraz 200 μL odpowiedniego substratu (etanolu, acetaldehydu, glicerolu, glukozy lub gliceraldehydu) i wymieszać odczynniki, delikatnie pipetując roztwór w górę i w dół 5 razy. W przypadku próby ślepej zamiast substratu użyć 200 μL wody.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję przy 600 nm w 5. oraz 20. minucie po dodaniu odczynników do kuwety.</li>
</ol>
5. Analiza aktywności unieruchomionej oksydazy glukozowej
<ol>
	<li>Do kuwety dodać 2,0 mL roztworu zawierającego 0,2 M kwas p-hydroksybenzoowy, 0,02 % (w/v) azoteku sodu, 128 U peroksydazy, 0,3 mM 4-aminoantipiryny, 1 M fosforanu potasu oraz 50 mM glukozy. Wymieszać roztwór, pipetując go w górę i w dół 5 razy.</li>
	<li>Umieścić kuwetę w spektrofotometrze UV/Vis ustawionym na długość fali 510 nm.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję przy 510 nm w 5. minucie po dodaniu odczynników do kuwety oraz ponownie w 20. minucie.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Struktura micelarna zmodyfikowanego polimeru Nafion może zostać zniszczona w przypadku zbyt szybkiego suszenia oryginalnej folii współodtłuszczonej z soli i polimeru. Rysunek 2 przedstawia mieszaninę soli i polimeru, która została wysuszona prawidłowo, w wyniku czego powstała przezroczysta, jasnobrązowa folia. Zbyt szybkie suszenie folii może doprowadzić do powstania nieprzezroczystych, białych płatków polimeru z powodu faktu, że proces suszenia może zniszczyć strukturę micelarną.
Po zmieszaniu zmodyfikowanego polimeru Nafion z enzymem i ich wspólnym odlewaniu na dno kuwety, można przeprowadzić testy aktywności enzymatycznej w celu oceny stabilności enzymu wewnątrz filmu polimerowego. Tabele 2-4 przedstawiają odpowiednio wyniki testów dla dwóch dehydrogenaz oraz oksydazy glukozowej unieruchomionych w różnych zmodyfikowanych filmach Nafion. Należy zwrócić uwagę na wyższą aktywność enzymów unieruchomionych w porównaniu do enzymów w roztworze buforowym, co wskazuje, że zmodyfikowane polimery Nafion mogą w rzeczywistości zwiększać aktywność niektórych enzymów (zjawisko to nazywa się superaktywnością). Inne enzymy wykazują ograniczenia transportowe, które zmniejszają ich aktywność właściwą po unieruchomieniu w polimerze (np. celulazy i amylazy, których substraty są bardzo dużymi makrocząsteczkami).
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zastosowana sól quaternaryjna amoniaku</td>
			<td>trzykrotny nadmiar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3A (bromek tetrapropylammonium)</td>
			<td>32,37 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBAB (bromek tetrabutylammoniumu)</td>
			<td>39,19 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPAB (bromek tetrapentyloammony)</td>
			<td>46,01 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEHA (bromek trietyloheksyloamoniowy)</td>
			<td>32,37 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMHA (bromek trimetyloheksyloamoniu)</td>
			<td>27,25 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMOA (bromek trimetylooctyloamoniowy)</td>
			<td>30,66 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMDA (bromek trimetyldecyloamoniowy)</td>
			<td>34,07 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMDDA (bromek trimetyldodecyloamoniu)</td>
			<td>37,48 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMTDA (bromek trimetylotetradecyloamoniowy)</td>
			<td>40,89 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMHDA (bromek trimetyluheksadecyluamoniowy)</td>
			<td>44,31 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMODA (bromek trimetylooktadecyloamoniu)</td>
			<td>47,71 mg/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Ilości soli tetra-alkilowych amonu do modyfikacji polimeru Nafion.
<table border="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Typ Nafionu </td >
			<td >Aktywność enzymatyczna (U/g)</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Bufor (bez polimeru)</td >
			<td >16.63 ± 8.11</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Nafion (niemodyfikowany)</td >
			<td >9.25 ± 2.21</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >TMTDA</td >
			<td >3.23 ± 2.92</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >TBAB</td >
			<td >3.93 ± 3.33</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >TMDDA</td >
			<td >4.19 ± 1.04</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >TMOA</td >
			<td >3.51 ± 1.11</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >TMDA</td >
			<td >8.00 ± 4.53</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >TMHA</td >
			<td >1.68 ± 1.39</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >TMHDA</td >
			<td >4.83 ± 0.99</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >TMODA</td >
			<td >10.45 ± 3.20</td >
		</tr >
	</tbody >
</table >
Tabela 2. Aktywność dehydrogenazy glukozowej zależnej od NAD unieruchomionej w wybranych modyfikowanych polimerach Nafion (uwaga: aktywność unieruchomiona jest funkcją początkowej aktywności specyficznej enzymu).
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Typ membrany Nafion </td>
			<td>Aktywność enzymatyczna (mU/g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor (bez polimeru)</td>
			<td>7.18 ± 0.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nafion (niezmodyfikowany)</td>
			<td>70.1± 0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMTDA</td>
			<td>133 ± 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBAB</td>
			<td>244 ± 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMDDA</td>
			<td>221 ± 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMOA</td>
			<td>1.78 ± 0.63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMDA</td>
			<td>206 ± 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEHA</td>
			<td>40.1 ± 50.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMHDA</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMODA</td>
			<td>1.45 ± 0.06</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3. Aktywność immobilizowanej glukozodehydrogenazy zależnej od PQQ w wybranych modyfikowanych polimerach Nafion (uwaga: aktywność immobilizowana jest funkcją początkowej aktywności specyficznej enzymu).
<table border="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Typ Nafionu </td >
			<td >Aktywność enzymatyczna (U/g)</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Bufor (bez polimeru)</td >
			<td >103.61 ± 3.15</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Nafion (niemodyfikowany)</td >
			<td >19.93 ± 10.10</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >TMTDA</td >
			<td >247.25 ± 12.49</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >TBAB</td >
			<td >152.27 ± 5.29</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >TMDDA</td >
			<td >262.05 ± 6.26</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >TMOA</td >
			<td >129.18 ± 2.31</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >TMDA</td >
			<td >141.23 ± 1.97</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >TMHA</td >
			<td >131.75 ± 2.89</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >TMHDA</td >
			<td >132.50 ± 1.18</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >TMODA</td >
			<td >136.50 ± 0.96</td >
		</tr >
	</tbody >
</table >
Tabela 4. Reprezentatywna aktywność specyficzna oksydazy glukozowej unieruchomionej w wybranych modyfikowanych polimerach Nafion (uwaga: aktywność unieruchomiona jest funkcją początkowej aktywności specyficznej enzymu).
<img alt="Schemat błony komórkowej; dodatek czwartorzistej soli amoniowej wykazujący oddziaływania białko-lipid." src="/files/ftp_upload/3949/3949fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat wbudowania TBAB w polimer Nafion i jego późniejszego zastosowania w unieruchamianiu enzymów.
<img alt="Sześciokątna szalka Petri z hodowlą bakterii do eksperymentu analizy równowagi statycznej." src="/files/ftp_upload/3949/3949fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Fotografia optyczna początkowych filmów współodlewanych z Nafion i TBAB. Powolne suszenie pozwala na uzyskanie przezroczystej, jasnobrązowej błony pokrywającej dno naczynia wagowego.

<ol><li>Calabrese-Barton, S., Gallaway, J., Atanassov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+biofuel+cells+for+implantable+and+microscale+devices+Chem%5BTitle%5D)+AND+%22Rev%22%5BJournal%5D)">Enzymatic biofuel cells for implantable and microscale devices Chem.</a> Rev. 104, 4867-4886 (2004).</li>
<li>Cracknell, J. A., Vincent, K. A., Armstrong, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymes+as+Working+or+Inspirational+Electrocatalysts+for+Fuel+Cells+and+Electrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Enzymes as Working or Inspirational Electrocatalysts for Fuel Cells and Electrolysis.</a> Chem. Rev. 108, 2439-2461 (2008).</li>
<li>Minteer, S. D., Liaw, B. Y., Cooney, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-Based+Biofuel+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Enzyme-Based Biofuel Cells.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 18, 228-234 (2007).</li>
<li>Callahan, J. W., Kosicki, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Lipid+Micelles+on+Mitochondrial+Malate+Dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Effect of Lipid Micelles on Mitochondrial Malate Dehydrogenase.</a> Canadian Journal of Biochemistry. 45, 839-851 (1967).</li>
<li>Martinek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+the+Membrane+Environment+of+Enzymes%3A+Superactivity+of+Laccase+Entrapped+into+Surfactant+Reversed+Micelles+in+Organic+Solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Biokhimiya%22%5BJournal%5D)">Modeling of the Membrane Environment of Enzymes: Superactivity of Laccase Entrapped into Surfactant Reversed Micelles in Organic Solvents.</a> Biokhimiya. 53, 1013-1016 (1988).</li>
<li>Moore, C. M., Akers, N. L., Hill, A. D., Johnson, Z. C., Minteer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+Environment+for+Immobilized+Dehydrogenase+Enzymes+by+Modifying+Nafion+with+Tetraalkylammonium+Bromides%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Improving the Environment for Immobilized Dehydrogenase Enzymes by Modifying Nafion with Tetraalkylammonium Bromides.</a> Biomacromolecules. 5, 1241-1247 (2004).</li>
<li>Schrenk, M. J., Villigram, R. E., Torrence, N. J., Brancato, S. J., Minteer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Mixture+Casting+Nafion+with+Quaternary+Ammonium+Bromide+Salts+on+the+Ion-Exchange+Capacity+and+Mass+Transport+in+the+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of Mixture Casting Nafion with Quaternary Ammonium Bromide Salts on the Ion-Exchange Capacity and Mass Transport in the Membranes.</a> J. Membr. Sci. 205, 3-10 (2002).</li>
<li>Akers, N. L., Moore, C. M., Minteer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Alcohol%2FO2+Biofuel+Cells+Using+Salt-Extracted+Tetrabutylammonium+Bromide%2FNafion+Membranes+to+Immobilize+Dehydrogenase+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Electrochim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of Alcohol/O2 Biofuel Cells Using Salt-Extracted Tetrabutylammonium Bromide/Nafion Membranes to Immobilize Dehydrogenase Enzymes.</a> Electrochim. Acta. 50, 2521-2525 (2005).</li>
<li>Sokic-Lazic, D., Minteer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citric+Acid+Cycle+Biomimic+on+a+Carbon+Electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Citric Acid Cycle Biomimic on a Carbon Electrode.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 939-944 (2008).</li>
<li>Arechederra, R. L., Minteer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+Oxidation+of+Glycerol+in+an+Enzymatic+Biofuel+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Fuel+Cells%22%5BJournal%5D)">Complete Oxidation of Glycerol in an Enzymatic Biofuel Cell.</a> Fuel Cells. 9, 63-69 (2009).</li>
<li>Germain, M., Arechederra, R. L., Minteer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroaromatic+Actuation+of+Mitochondrial+Bioelectrocatalysis+for+Self-Powered+Explosive+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Nitroaromatic Actuation of Mitochondrial Bioelectrocatalysis for Self-Powered Explosive Sensors.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 15272-15273 (2008).</li>
<li>Addo, P. K., Arechederra, R. L., Minteer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+Enzyme+Cascades+for+Methanol%2FAir+Biofuel+Cells+Based+On+NAD%2B-Dependent+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Electroanalysis%22%5BJournal%5D)">Evaluating Enzyme Cascades for Methanol/Air Biofuel Cells Based On NAD+-Dependent Enzymes.</a> Electroanalysis. 22, 807-812 (2010).</li>
<li>Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J., Klenk, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

W opisanym procesie sole tetra-alkiloamoniowe są wykorzystywane do modyfikacji handlowego Nafionu w celu stworzenia polimerów micelarnych, które mogą służyć do unieruchamiania i stabilizacji enzymów. Analizy opisane w procedurze wykazują, że polimer ten może być stosowany do unieruchamiania szerokiej gamy enzymów przy zachowaniu wysokiej aktywności. Jeśli badany enzym wykazuje bardzo niską aktywność lub jest nieczysty, może być wymagane zastosowanie wyższego stężenia, co nie powinno wpływać na proces unieruchamiania, chy...

<table><tbody><tr><td>Nafion</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70160</td><td></td></tr><tr><td>Sole bromki tetraalkiloamoniowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Dehydrogenaza alkoholowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3263</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamidoadenindynukleotyd (NAD)</td><td>Simga-Aldrich</td><td>N7004</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosforan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8010</td><td></td></tr><tr><td>Metosiarzan fenazyny (PMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>2,6-Dichlorindofenol (DCIP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1878</td><td></td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7141</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 4-hydroksybenzoesowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240141</td><td></td></tr><tr><td>Azotek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Peroksydaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8375</td><td></td></tr><tr><td>4-aminoantipiryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>06800</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV/Vis</td><td>Thermo</td><td>Evolution 260 Bio lub Spectronic Genesys 20</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło Vortex Genie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hydrofobowy nafion modyfikowany solą do immobilizacji i stabilizacji enzymów

Hydrophobic Salt-modified Nafion for Enzyme Immobilization and Stabilization

W ciągu ostatniej dekady pojawiło się wiele zastosowań unieruchomionych i stabilizowanych enzymów, w tym w biokatalizie, biosensorach i ogniwach paliwowych.1-3 W większości zastosowań bioelektrochemicznych enzymy lub organella są unieruchamiane na powierzchni elektrody przy użyciu odpowiedniego rodzaju macierzy polimerowej. Rusztowanie polimerowe powinno zapewniać stabilność enzymów oraz umożliwiać łatwą dyfuzję cząsteczek i jonów do macierzy i z niej. Większość polimerów stosowanych do tego typu unieruchamiania opiera się na poliaminach lub polialkoholach – polimerach, które naśladują naturalne środowisko kapsułkowanych enzymów i stabilizują je poprzez wiązania wodorowe lub jonowe. Inna metoda stabilizacji enzymów polega na wykorzystaniu miceli, które zawierają regiony hydrofobowe zdolne do kapsułkowania i stabilizacji enzymów.4,5 W szczególności grupa Minteera opracowała polimer micelarny na bazie komercyjnie dostępnego Nafionu.6,7 Sam Nafion jest polimerem micelarnym, który umożliwia wspomaganą kanałami dyfuzję protonów i innych małych kationów, jednak micele i kanały są niezwykle małe, a polimer jest bardzo kwasowy ze względu na łańcuchy boczne kwasu sulfonowego, co jest niekorzystne dla unieruchamiania enzymów. Jednakże, gdy Nafion zostanie zmieszany z nadmiarem hydrofobowych soli alkilowych amoniu, takich jak bromek tetrabutylamoniu (TBAB), kationy amoniowe czwartorzędowe zastępują protony i stają się przeciwjonami grup sulfonowych w łańcuchach bocznych polimeru (Rysunek 1). Prowadzi to do powstania większych miceli i kanałów wewnątrz polimeru, które umożliwiają dyfuzję dużych substratów i jonów niezbędnych do funkcji enzymatycznych, takich jak nikotynamido-adenyno-dinukleotyd (NAD). Ten zmodyfikowany polimer Nafion był wykorzystywany do unieruchamiania wielu różnych typów enzymów, a także mitochondriów, w zastosowaniach w biosensorach i ogniwach paliwowych.8-12 Niniejsza praca opisuje nową procedurę wytwarzania tej micelarnej polimerowej membrany do unieruchamiania enzymów, która pozwala na ich stabilizację. Poniżej szczegółowo opisano syntezę micelarnej membrany do unieruchamiania enzymów, procedurę unieruchamiania enzymów w membranie oraz analizy służące do badania aktywności specyficznej unieruchomionego enzymu.

W niniejszym artykule opisano procedurę syntezy hydrofobowo modyfikowanej membrany Nafion do unieruchamiania enzymów, sposób unieruchamiania białek i/lub enzymów wewnątrz membrany oraz metodę testowania ich aktywności specyficznej.

Hydrofobowy Nafion modyfikowany solą do immobilizacji i stabilizacji enzymów

W ciągu ostatniej dekady opracowano wiele zastosowań unieruchomionych i stabilizowanych enzymów, obejmujących biokatalizę, biosensory oraz biopaliwa...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest synteza polimeru do unieruchamiania i stabilizacji enzymów w komórkach. Aby to osiągnąć, w pierwszej kolejności należy połączyć zawiesinę nafionową z solą bromku amonu, a następnie wymieszać zawiesinę za pomocą wortexa w celu wymiany formy protonowanej nafionu na sole amonowe. Drugim krokiem jest wysuszenie otrzymanego polimeru poprzez przelanie mieszaniny do łódeczki do ważenia i odparowanie rozpuszczalników.Następnie polimer namaczamy w wodzie dejonizowanej przez 12 do 24 godzin w celu usunięcia nadmiaru soli. Po ekstrakcji soli polimer płuczemy wodą, a następnie pozostawiamy do całkowitego wyschnięcia poprzez odparowanie. W ostatnim kroku polimer przenosimy do czystej probówki i resuspendujemy w rozpuszczalniku w celu wykorzystania go w immobilizacji enzymów. Ostatecznie ten polimer do immobilizacji enzymów jest stosowany w celu poprawy stabilności enzymów w testach aktywności.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ procedura wydaje się niezwykle prosta, jednak proces suszenia ma krytyczne znaczenie dla wytworzenia funkcjonalnego polimeru. Procedurę tę zaprezentuje student studiów doktoranckich z mojego laboratorium. Aby rozpocząć procedurę modyfikacji nafionu solami amoniowymi Nerium, należy odmierzyć trzykrotną nadwyżkę molową bromku alkilammonium w stosunku do grup kwasu sulfonowego w polimerze nafionowym.Przenieś sól bromku amonu AGU do szklanej fiolki, energicznie nią potrząsając. Wstrząśnij butelką z 5% (massa/objętość) zawiesiną Nafion przez około 30 sekund, aby upewnić się, że Nafion jest równomiernie zawieszony w roztworze. Odmierz pipetą dwa mililitry ponownie zawieszonego Nafionu i dodaj go do szklanej fiolki zawierającej sól bromku amonu AGU.Mieszaj zawartość probówki na wirówce typu vortex z prędkością 900 RPM przez 10 do 15 minut. Następnie przelej lepki roztwór do plastikowej łódeczki wagowej i za pomocą pipety przenieś pozostały w probówce roztwór do łódeczki. W tym przykładzie łódeczka jest częściowo przykryta i pozostawiona na blacie laboratoryjnym, aby rozpuszczalniki całkowicie odparowały z naczynia w tempie parowania przekraczającym sześć godzin.Całkowite odparowanie całego rozpuszczalnika przy odpowiedniej szybkości parowania powinno pozostawić na dnie tacki wagowej żółty lub brązowy przezroczysty film, jak pokazano tutaj. Jeśli rozpuszczalnik odparuje zbyt szybko, zamiast przezroczystego filmu utworzy się materiał skorupowy lub krystaliczny, co wskazuje na zniszczenie struktury micelarnej polimeru. Jeśli odparowanie rozpuszczalnika przebiega zbyt wolno lub sól amonowa reaguje zbyt długo i pochłonie zbyt dużo pary wodnej, utworzy się lepki pomarańczowy żel lub biały materiał krystaliczny.W obu przypadkach procedurę należy rozpocząć od nowa. Po odparowaniu całego rozpuszczalnika z odpowiednią szybkością odparowania, należy wypełnić tackę wagową od 10 do 20 mililitrów wody dejonizowanej o rezystywności 18 mega ohm centymetr, przykryć i namaczać przez 12 do 24 godzin w celu usunięcia nadmiaru soli bromku amonu i HBR. Po 12 do 24 godzinach wodę należy odessać pipetą i dodać odpowiednią ilość wody dejonizowanej, aby ponownie wypełnić tackę. Należy zachować ostrożność i zawsze pobierać wodę pipetą w kierunku oddalonym od błony polimerowej, aby uniknąć jej utraty.Wypłucz próbkę łącznie trzy razy po wykonaniu płukania. Pozostaw tackę wagową nieprzykrytą aż do całkowitego wyschnięcia polimeru. Po całkowitym wyschnięciu polimer powinien mieć postać przejrzystej i nieco kruchej błony plastikowej.W przeciwieństwie do nich, polimery, które nie zostały prawidłowo wysuszone, będą miały po ekstrakcji solnej zupełnie inny wygląd, co pokazano tutaj. Używając szpatułki, ostrożnie usuń wysuszony film z tacki wagowej i przenieś go do czystej szklanej fiolki. Dodaj dwa mililitry etanolu oraz trzy ceramiczne kulki do mieszania i inkubuj w wstrząsarku typu vortex przez cztery godziny lub do momentu całkowitego resuspensowania filmu polimerowego.Roztwór nanułomodu modyfikowanego chlorkiem alkiloamoniowym jest teraz gotowy do immobilizacji enzymu. Jeśli enzym przeznaczony do immobilizacji jest w formie proszku, odważ jeden miligram enzymu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 mililitra i dodaj jeden mililitr 100 mM buforu fosforanowego o pH 7, aby przygotować roztwór enzymu o stężeniu 1 mg/ml. Przenieś 120 µL roztworu enzymu o stężeniu 1 mg/ml do nowej probówki.Dodaj 60 µL zmodyfikowanego roztworu nafionu z ALK amonu i mieszaj w wirówce (vortex) przez 10 sekund. Stosunek enzymu do roztworu polimeru musi wynosić dwa do jednego, jeśli mieszanina ta ma zostać przygotowana w większej ilości dla licznych powtórzeń. Na koniec pipetuj 60 µL roztworu enzym-polimer na dno każdej z trzech oddzielnych kuwet o powierzchni jednej centymetra kwadratowego i pozostaw je do wyschnięcia na noc.Stabilność enzymu w filmie polimerowym można następnie ocenić za pomocą testów aktywności enzymatycznej, zgodnie z przedstawioną procedurą. Aby rozpocząć ten test, należy dodać do kuwety z odlanym zmodyfikowanym polimerem Nafion oraz enzymem dehydrogenazą zależną od NAD następujące odczynniki: 1,3 ml 50 mM pirofosforanu sodu, 1,5 ml świeżo przygotowanego 15 mM nikotynamido-adenina-dinukleotydu (NAD) oraz 0,1 ml wody.Umieść kuwetę w spektrofotometrze UV-Vis ustawionym na długość fali 340 nanometrów i wyzeruj urządzenie. Do kuwety dodaj 0,1 mililitra etanolu i wymieszaj odczynniki, delikatnie pipetując roztwór w górę i w dół pięć razy; w przypadku próby ślepej zamiast 0,1 mililitra etanolu użyj 0,1 mililitra wody. Pięć minut po dodaniu odczynników do kuwety zmierz absorbancję przy 340 nanometrach.Ponownie zmierz absorbancję po 20 minutach od dodania odczynników do qve; te dwa punkty danych zostaną naniesione na wykres w celu wyznaczenia nachylenia linii, które zostanie wykorzystane do obliczeń aktywności przy oznaczaniu specyficznej aktywności enzymatycznej unieruchomionego pq. W przypadku dehydrogenaz zależnych od PQQ, odczynniki te należy pipetować do qve współodtwarzanego z modyfikowanym polimerem nafion i dehydrogenazą zależną od PQQ. 1.5 ml fosforanu sodu oraz 200 µl 600 µM siarczanu fenylometylu lub PMS.Umieść kuwetę w spektrofotometrze UV-vis ustawionym na długość fali 600 nm i wyzeruj urządzenie. Do próbki dodaj 100 µL mieszaniny składającej się z 700 µL 2-chloro-6-nitrophenolu lub DCIP oraz 200 µL badanego substratu. Wymieszaj odczynniki, delikatnie pipetując roztwór w górę i w dół pięć razy, aby przygotować próbę ślepą.Użyć 200 µL wody zamiast badanego substratu. Pięć minut po dodaniu odczynników zmierzyć absorbancję przy 600 nm.Zmierz ponownie absorbancję 20 minut po dodaniu odczynników niezbędnych do rozpoczęcia tego testu. Do Q VET odlanego z modyfikowanego polimeru Nafion i oksydazy glukozowej dodaj dwa mililitry roztworu zawierającego: 0,2 M kwasu p-hydroksybenzoowego, 0,02% azotku sodu, 128 jednostek peroksydazy, 0,3 mM 4-aminoantipiryny, 1 M fosforanu potasu oraz 50 mM glukozy.Przygotować roztwór, pipetując go pięciokrotnie w górę i w dół. Umieścić cuwetę w spektrofotometrze UV-Vis ustawionym na długość fali 510 nm. Pomiary należy wykonać pięć minut po dodaniu odczynników do cuwety.Zmierz absorbancję przy 510 nanometrach. Następnie ponownie zmierz absorbancję po 20 minutach od dodania odczynników. W poniższej tabeli przedstawiono wyniki analizy aktywności dehydrogenazy glukozowej zależnej od NAD unieruchomionej na wybranych modyfikowanych polimerach nafionu.Zaobserwowano, że unieruchomiona dehydrogenaza glukozowa zależna od NAD wykazuje niższą aktywność właściwą niż enzym w roztworze buforowym. Wynika to z faktu, że membrany polimerowe ograniczają transport dużych cząsteczek; choć glukoza, będąca substratem w teście, jest mała, koenzym NAD musi dyfundować do wnętrza membrany i z powrotem. W przypadku dehydrogenazy zależnej od NAD ograniczenia transportowe wynikające z unieruchomienia w polimerze zmniejszają obserwowaną aktywność enzymatyczną.Następna tabela przedstawia wyniki analizy aktywności dehydrogenazy glukozowej zależnej od PQQ unieruchomionej na wybranych modyfikowanych polimerach nafionowych. Warto zwrócić uwagę na wyższą aktywność enzymów unieruchomionych na większości błon nafionowych w porównaniu z enzymami w roztworze buforowym. Ponieważ dehydrogenaza glukozowa zależna od PQQ jest białkiem związanym z błoną, hydrofobowo modyfikowany, komórkowy nafion zapewnia środowisko bardziej zbliżone do błony niż bufor w celu stabilizacji aktywnej dehydrogenazy glukozowej zależnej od PQQ, co zwiększa aktywność enzymu.Na koniec przedstawiono reprezentatywne wyniki testów aktywności specyficznej oksydazy glukozowej. W poniższej tabeli zaprezentowano polimery Nafion unieruchomione i wybrane zmodyfikowane. Analizy enzymatyczne każdego z polimerów z każdym z trzech enzymów wykazują, że trendy w względnej aktywności specyficznej w porównaniu z enzymem i roztworem są funkcją systemu enzymatycznego.W konsekwencji należy zoptymalizować dokładny rodzaj polimeru potrzebny dla każdego enzymu. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że etap suszenia jest krytyczny dla tej konkretnej metody.

hydrophobic-salt-modified-nafion-for-enzyme-immobilization

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Hydrofobowe Nafion zmodyfikowane solami do unieruchomienia i stabilizacji enzymów

Prezentujemy syntezę hydrożelu białkowego, w którym pośredniczy rozszczepiona inteina. Budulcem tego hydrożelu są dwa kopolimery białkowe, z których każdy zawiera podjednostkę białka trimerycznego, która służy jako środek sieciujący i połowę rozszczepionej inteiny. Zmieszanie dwóch kopolimerów białkowych wyzwala reakcję splicingu trans-inteinowego, w wyniku której powstaje jednostka polipeptydowa, która samoorganizuje się w hydrożel. Ten hydrożel jest wysoce stabilny pod względem pH i...

Synteza sztucznego hydrożelu białkowego za pośrednictwem inteiny

Adhezyjna komórka jest kluczem do wielu podejść w badaniach nad biomateriałami i inżynierii tkankowej. Przedstawiono technikę krok po kroku wykorzystującą chemię mokrą do modyfikacji powierzchni ważnego polimeru PTFE za pomocą peptydów.

Chemia mokra i immobilizacja peptydów na politetrafluoroetylenie w celu poprawy adhezji komórek

Ten artykuł opisuje praktyczne metody przygotowania hydrożeli w foliach wolnostojących i impregnowanych membranach oraz charakteryzuje ich właściwości fizyczne, w tym właściwości transportu wody.

Synteza hydrożeli o właściwościach przeciwporostowych jako membran do oczyszczania wody

Skuteczna metoda szybkiego i jonoselektywnego odsalania radioaktywnego jodu w kilku roztworach wodnych jest opisana za pomocą filtrów membranowych z octanu celulozy immobilizowanych nanocząstkami złota.

Skuteczna metoda selektywnego odsalania radioaktywnych anionów jodu przy użyciu filtra membranowego z nanocząstkami złota

Ten protokół opisuje kowalencyjną immobilizację białek za pomocą heterobifunkcyjnego czynnika sprzęgającego silan z powierzchniami tlenku krzemu, przeznaczoną do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na mikroskopii sił atomowych, której przykładem jest oddziaływanie RrgA (adhezyna końcówki pilus-1 S. pneumoniae) z fibronektyną.

Kowalencyjna immobilizacja białek do spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki

Przedstawiono proste, powtarzalne i wszechstronne podejście do syntezy przerośniętych, polikrystalicznych metaloorganicznych membran szkieletowych na szerokiej gamie niemodyfikowanych porowatych i nieporowatych podpór.

Krystalizacja elektroforetyczna ultracienkich, wysokowydajnych membran metaloorganicznych

Flash NanoPrecipitation (FNP) to skalowalne podejście do produkcji polimerowych nanocząstek typu rdzeń-powłoka. Opisano preparaty na skalę laboratoryjną do kapsułkowania terapii hydrofobowych lub hydrofilowych.

Nanoprecypitacja błyskawiczna do enkapsulacji związków hydrofobowych i hydrofilowych w nanocząstkach polimerowych

Ekspresja i oczyszczanie białek zawierających hydrolazę hydrolazy fumaryloacetooctanu jest opisane przykładami (ekspresja w E. coli, FPLC). Oczyszczone białka są używane do krystalizacji i produkcji przeciwciał oraz wykorzystywane do testów enzymatycznych. Przedstawiono wybrane testy fotometryczne w celu wykazania wielofunkcyjności FAHD1 jako dekarboksylazy szczawiooctanu i hydrolazy acylopirogronianowej.

Ekspresja, oczyszczanie, krystalizacja i oznaczanie enzymatyczne białek zawierających hydrolazę hydrolazy fumaryloacetooctanu

To badanie opisuje klasyczną hydratację przy użyciu metody cienkiego filmu lipidowego do przygotowania nanoliposomów, a następnie charakterystyki nanocząstek. Hydrofilowe i globularne białko o masie 47 kDa, taryna, jest z powodzeniem kapsułkowane jako strategia poprawiająca stabilność, unikająca szybkiego klirensu i promująca kontrolowane uwalnianie. Metoda może być dostosowana do enkapsulacji cząsteczek hydrofobowych.

Otrzymywanie i charakterystyka nanoliposomów do uwięzienia bioaktywnych hydrofilowych białek kulistych

Niniejsze badanie opisuje procedurę rekonstrukcji błonowego białka TWIK, kanału K+ wrażliwego na kwasy 2 (Zadanie 2) w nanodyski. Pomyślny montaż potwierdzono za pomocą mikroskopii krio-elektronowej z pojedynczą cząstką, która dała dobrze określone dwuwymiarowe średnie klasowe.

Technika stabilizacji białek błonowych w nanodyskach

Ten protokół opisuje reproduktywalną metodę wytwarzania trwałych metalowo-organicznych ramek/polimerowych membran mieszanych i dokładnego pomiaru ich przewodnictwa protonowego w płaszczyźnie pod zmienną temperaturą i wilgotnością z wykorzystaniem spektroskopii impedancji elektrochemicznej, co może być przydatne dla ogniw paliwowych z membranami wymienników protonowych (PEMFC).

Pomiar przewodności protonowej w membranie matrycowej mieszanej na bazie MOF za pomocą spektroskopii impedancji elektrochemicznej

Poznaj metodę syntezy hydrofobowego nafionu modyfikowanego solą do immobilizacji i stabilizacji enzymów. Ta technika poprawia trwałość enzymów w badaniach aktywności enzymatycznej.

Hydrofobowy Nafion modyfikowany solą do immobilizacji i stabilizacji enzymów

Przeglądaj więcej filmów