Przetwarzanie pierwotnej tkanki guza mózgu do oznaczania komórek macierzystych i sortowania przepływowego

Ogólnym celem tej procedury jest badanie komórek inicjujących guz mózgu in vitro. Osiąga się to najpierw poprzez mechaniczną i enzymatyczną dysocjację pierwotnych nowotworów ludzkich, a następnie hodowlę ich w warunkach hodowli wolnej od surowicy komórek macierzystych. Formowanie się kolejnej kuli jest monitorowane przez trzy do pięciu dni.

Kule nowotworowe są następnie ponownie trawione enzymatycznie, a ich markery powierzchniowe są oceniane za pomocą cytometrii przepływowej. Ostatnim krokiem jest posortowanie żądanych komórek na 96-dołkowe płytki lub szkiełka siatkowe PL w celu dalszej charakteryzacji. Ostatecznie zdolność do samoodnawiania się i różnicową ekspresję genów w posortowanej populacji można ocenić za pomocą analizy rozcieńczenia ograniczającego i R-T-P-C-R pojedynczej komórki.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak analiza guza masowego, jest to, że prospektywnie izoluje ona populacje komórek inicjujących nowotwór mózgu lub rakowych komórek macierzystych. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, kiedy zastosowaliśmy warunki hodowli pierwotnie stosowane dla normalnych nerwowych komórek macierzystych do różnych ludzkich guzów mózgu i stwierdziliśmy, że ta metoda hodowli specjalnie wybrana dla populacji podobnych do komórek macierzystych, demonstrująca procedurę, będzie stosowana przez doktorantów CHITRA AL, doktorantów CHITRA AL, Bran Van Manen i Sarah Nolte, i nasz technik cytometrii przepływowej Nicole McFarland, wszyscy z naszego laboratorium Zacznij od dodania 200 mikrolitrów rozmrażania do 15 mililitrów sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego lub płynu mózgowo-rdzeniowego, a następnie umieść rurkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. W tym czasie również doprowadzić roztwór chlorku amonu do temperatury pokojowej.

Następnie w pięciu mililitrach płynu mózgowo-rdzeniowego do pojemnika na próbkę tkanki guza mózgu, zakręć pojemnikiem, aby spłukać, a następnie odciśnij go od płynu, aby usunąć czerwone krwinki. Teraz przenieś tkankę na sterylną 100-milimetrową szalkę Petriego i użyj drobnych nożyczek i kleszczy, aby zdezagregować tkankę do konsystencji zawiesiny. Następnie pobrać próbkę za pomocą zwykłej pipety o pojemności 10 mililitrów i kleszczyków i przenieść fragmenty tkanki do probówki zawierającej wstępnie podgrzany płyn mózgowo-rdzeniowy A.

Za pomocą liazy umieść probówkę na wytrząsarce inkubatora z prędkością 30 obr./min i 37 stopniami Celsjusza. A następnie po 15 minutach przefiltruj lizat tkankowy przez sitko komórkowe o wielkości siedmiu mikrometrów D do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Wirować filtrat przez pięć minut w temperaturze 280 GS w temperaturze pokojowej.

Następnie ostrożnie usuń snat i oceń rozmiar i kolor powstałego granulatu. Następnie ponownie zawieś osad w jednym mililitrze PBS, a następnie dodaj odpowiednią ilość roztworu chlorku amonu w zależności od wielkości osadu i zanieczyszczenia krwinkami czerwonymi. Następnie, po pięciominutowej inkubacji w temperaturze pokojowej, odwiruj komórki po drugim płukaniu w PBS, ponownie zawieś osad w pięciu mililitrach kompletnego podłoża z komórek macierzystych neuro, a następnie przenieś zawiesinę komórkową na 60-milimetrową płytkę do hodowli tkankowej o bardzo niskim poziomie wiązania na pierwsze kilka dni.

W razie potrzeby uzupełnij kultury jednym do dwóch mililitrów pożywki, zmieniając pożywkę tylko wtedy, gdy kolor stanie się lekko żółty. Zacznij od przeniesienia kultury spheal guza do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Dodaj dwa do trzech mililitrów sterylnego PBS, aby dokładnie wypłukać płytkę, a następnie dodaj płyn do płukania do probówki z guzem.

Po odwirowaniu komórek usuń snat i ponownie zawieś osad w jednym do dwóch mililitrów sterylnego PBS, a następnie dodaj 10 mikrolitrów liazy. Jednym z wyzwań związanych z tą techniką jest utrzymanie żywotności komórek macierzystych guza litego podczas przetwarzania. Każda manipulacja komórkami podczas hodowli i saacji wymaga delikatnego dotyku.

Następnie inkubuj probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po trzech minutach usuń zawiesinę i oceń wzrokowo. Jeśli widocznych jest wiele grudek, użyj końcówki pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby delikatnie powtórzyć klaster komórek.

Teraz umyj komórki w pięciu mililitrach sterylnego PBS, a następnie po usunięciu supernatantu S ponownie zawieś osad w 500 do 1000 mikrolitrach sterylnego PBS plus dwa milimolowe EDTA. Na koniec, po ocenie liczby komórek i żywotności za pomocą błękitu Trian, dostosuj liczbę komórek do 1 miliona komórek na mililitr w PBS plus EDTA. Rozpocznij od przeniesienia 100 mikrolitrów zawiesiny komórek na test do indywidualnych probówek o przepływie 12 na 75 milimetrów.

Po dodaniu odpowiednich przeciwciał inkubować próbki na lodzie przez 30 minut, a następnie zmyć wszelkie niezwiązane przeciwciała w dwóch mililitrach PBS plus EDTA na probówkę. Teraz zdekantuj roztwór do mycia, osusz probówki, a następnie ponownie zawieś granulki komórek w 300 dodatkowych mikrolitrach PBS plus EDTA. Następnie dodaj 10 mikrolitrów siedmiu barwników żywotności A D do każdej probówki.

Po inkubacji probówek przez co najmniej 15 minut na lodzie, komórki są gotowe do analizy metodą cytometrii przepływowej. Po użyciu próbki kontroli ujemnej do dostosowania parametrów rozproszenia do przodu i z boku, narysuj obszar wokół komórek zainteresowania podobny do tego, który pokazano na tym reprezentatywnym wykresie górnym. W razie potrzeby dostosuj napięcie w detektorach fluorescencyjnych używanych do umieszczenia ogniw ujemnych w ciągu pierwszych dwóch dekad.

Następnie użyj barwnika żywotności siedem A a d, aby utworzyć drugi region w celu wykluczenia martwych komórek podobny do regionu pokazanego na tym reprezentatywnym górnym wykresie. Następnie zastosuj zarówno bramki rozproszone, jak i żywe komórki do wszystkich wykresów fluorescencyjnych i użyj pojedynczych barwionych kontrolek, aby odjąć wszelkie nakładanie się widma. Na koniec uruchom przykłady.

Rozpocznij test rozcieńczenia granicznego, sortując zdysocjowane komórki w różnym rozcieńczeniu do pojedynczej komórki na studzienkę do pojedynczych dołków 96-dołkowej płytki zawierającej 200 mikrolitrów pożywki NSC, neurosfery zwykle tworzą się w ciągu siedmiu dni, a szybkość tworzenia się kolejnej kuli w ciągu ostatnich siedmiu dni w hodowli można obliczyć dla pojedynczej komórki R-T-P-C-R. Po posortowaniu pojedynczych komórek z populacji będących przedmiotem zainteresowania na miejsca reakcji szkiełka o dużej gęstości, dodaj jeden mikrolitr mieszanki wzorcowej do środka każdego miejsca reakcji, a następnie natychmiast pokryj każde miejsce pięcioma mikrolitrami roztworu sufitowego. Następnie, za pomocą cyklera do szkiełek o dużej prędkości, inkubuj szkiełko przez trzy cykle temperaturowe.

Po odwrotnej transkrypcji dodać trzy mikrolitry wody wolnej od rasy DN a do każdego miejsca reakcji. Następnie przenieś całą mieszaninę z każdego miejsca reakcji do poszczególnych probówek PCR. Na koniec, w celu ilościowego określenia ilości w czasie rzeczywistym, uruchom próbki na cyklerze BioRad.

Ten pierwszy rysunek przedstawia skan rezonansu magnetycznego reprezentatywnego pacjenta z glejakiem. Zdysocjowane komórki nowotworowe można znakować markerami komórek macierzystych powierzchni neuronów, CD 1 33 i CD 15, i analizować za pomocą cytometrii przepływowej, jak pokazano na tym reprezentatywnym wykresie kropkowym. Tutaj pokazano wykres amplifikacji dla reprezentatywnej reakcji R-T-P-C-R z pojedynczą komórką.

Wartości CT uzyskane z takiego wykresu można wykorzystać do obliczenia względnych poziomów ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak enzymatycznie dysocjować i hodować pierwotną tkankę guza mózgu w celu wzbogacenia populacji komórek macierzystych. Dowiesz się również, jak badać zdolność do samoodnawiania się i różnicową ekspresję genów w posortowanych populacjach komórek macierzystych, wykonując analizę rozcieńczenia ograniczającego lub R-T-P-C-R pojedynczej komórki.