Wytwarzanie, oczyszczanie i charakterystyka inwazyjnych dla komórek form białka DISC1

Ogólnym celem poniższych procedur jest wytworzenie oczyszczonego dysku. Jedna agregacja jest w stanie zaatakować komórki biorcy. Pierwsza metoda zademonstruje dwie różne metody osiągnięcia tego celu.

Asom tworzący fluorescencyjny dysk białkowy jedno białko fuzyjne ulega nadekspresji w ludzkich komórkach dawcy nerwiaka zarodkowego NLF. Komórki są następnie myte zebranym PBS i układane bez użycia detergentów. DNA jest trawione, a strefy agro są oczyszczane za pomocą systemu gradientu sacharozy.

Agrio oczyszczone tą metodą mają niską skuteczność inwazji komórek. Alternatywnym podejściem jest nadekspresja aminokwasów od 5 98 do 7 85 rekombinowanego białka krążka jednego w E coli. Fragment białka jest następnie znakowany DITE 5 94, dializowany i oczyszczany przy użyciu matrycy NI NTA, która usuwa pozostały niezwiązany krążek multimeryczny barwnika.

Jeden fragment wygenerowany tą metodą ma wysoką skuteczność inwazji komórek w celu oceny inwazji komórek gospodarza. Albo oczyszczony fluorescencyjny krążek białkowy, jeden rysomy lub znakowany krążek rekombinowany. Jeden fragment inkubuje się z komórkami biorcy, które są przedmiotem zainteresowania.

Następnie dodaje się błękit trianowy w celu wygaszenia fluorescencji zewnątrzkomórkowej, a inwazja jest wizualizowana za pomocą mikroskopii konfokalnej. Do tej pory agregacja białek nie była rozpoznaną cechą przewlekłych chorób psychicznych, takich jak schizofrenia. Tam, gdzie w schizofrenii jedno białko jest zaburzone w komórce kandydującej, inwazyjność agregatów białkowych jest cechą charakterystyczną dla chorób potwierdzających białka.

Tutaj pokazujemy za pomocą dwóch metod, że agregaty białkowe dysku pierwszego są inwazyjne dla komórek, a zatem zaburzenia związane z dyskiem pierwszym lub neuropatie dysku pierwszego są zaburzeniami potwierdzającymi białka. Dwie metody to po pierwsze oczyszczenie krążka o pełnej długości, jeden ASOS z linii komórkowych nerwiaka zarodkowego, a po drugie, ekspresja C-końcowego dysku multimerycznego. Jeden fragment w E. coli, a także oczyszczanie i znakowanie barwnikiem fluorescencyjnym.

Podczas gdy pierwsza metoda prowadzi tylko do mało wydajnej inwazji komórek o 0,3% komórek pobierających oczyszczone mikrosomy, rekombinowany fragment białka pur infekuje do 20% narażonych komórek. Opisane tutaj metody powinny być możliwe do przeniesienia na inne białka, w których tworzenie akrosomów lub składanie multimeryczne zostało przekonująco wykazane. W każdej z 10 10 centymetrowych naczyń.

Wysiewaj 1,5 razy 10 do sześciu ludzkich komórek nerwiaka zarodkowego i LF w uzupełnionym pożywce RPMI 1640 i rosnąć przez noc. Następnego dnia komórki powinny składać się w 70 do 80% ze zlewem, oznaczyć pięć szalek do transfekcji z PC, DNA, 3.1, MRFP i EGFP, oznaczone ludzkim krążkiem o pełnej długości, pierwszy i piąty do transfekcji samym plazmidem EGFP. Na każde 10-centymetrowe naczynie połącz 15 mikrogramów plazmidowego DNA 30 mikrolitrów wpływających i 750 mikrolitrów.

Opti MEM w mikroprobówce wirówkowej i wytwarza pipetowanie w górę iw dół, inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie, aby transfekować komórki, dodaj roztwór odczynnika do transfekcji DNA, kroplami do komórek inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO 2 48 godzin po transfekcji monitorowałem ekspresję MRFP na całej długości krążka i potwierdziłem tworzenie się stref agro pod mikroskopem fluorescencyjnym. Niektóre komórki zawierają masywne włączenie białka fluorescencyjnego, jak pokazano tutaj.

Protokół ten łączy w sobie metodę oczyszczania ciał Lewy'ego z tkanki mózgowej oraz protokół izolowania większych agregatów lub stref rolniczych, ponieważ już istniejące metody opierają się na użyciu detergentów, izolacja białka wolnego od detergentów do zastosowania w testach inwazyjności komórek ma kluczowe znaczenie. Następnie odessać pożywkę z PBS i dodać 400 mikrolitrów PBS zawierającego koktajl inhibitorów proteazy. Następnie zeskrob komórki i dodaj jeden mililitr zawiesiny komórek i 10 kulek ceramicznych do dwumililitrowej probówki do lizy.

Lys komórki za pomocą trzech 62. impulsów na homogenizatorze przed lizą komórkową 24. Siła mechaniczna procesu może spowodować wzrost temperatury w próbce do ponad 37 stopni Celsjusza. Dlatego należy zachować ostrożność, aby schłodzić próbkę na lodzie Po procedurze lizy, po schłodzeniu komórek na lodzie, dodać 10 milimolowy chlorek magnezu 40 jednostek na mililitr DNAA i inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem.

Przygotuj po 10 mililitrów 80%50% i 20% masy sacharozy na objętość w PBS. Następnie w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów przygotuj gradient sacharozy, zaczynając od dwóch mililitrów 80% sacharozy, a następnie dwóch mililitrów 50% i dwóch mililitrów 20% sacharozy. Wlewaj gradient powoli i uważaj, aby nie naruszyć już wylanych warstw.

Następnie ułóż strawiony lizat na wierzchu gradientu i wiruj przez 15 minut w temperaturze 1000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po oderwaniu ostrożnie zebrać granicę faz między warstwą 50 do 80% sacharozy za pomocą pipety i mieszać z pięcioma objętościami 15-mililitrowej wirówki stożkowej przez 15 minut w temperaturze 1000 razy G w czterech stopniach Celsjusza. Ostrożnie usunąć supernatant i pozostawić strefę rolniczą zawierającą osad

Powtórz pranie jeszcze dwa razy w tym interfejsie. Strefy rolnicze są fluorescencyjne i można je uwidocznić pod mikroskopem w świetle UV po ostatnim praniu, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulat w 250 do 500 mikrolitrach PBS. Ten pellet zawiera oczyszczone strefy agro

Dodać 10 mikrolitrów krążka MRFP, po jednej zawiesinie asomemu do każdej studzienki 24-dołkowej płytki zawierającej SHSY pięć komórek ludzkiego nerwiaka zarodkowego. Rozpuszczalny krążek GFP ulega konstytutywnej ekspresji na jednym końcu C na sterylnych szkiełkach nakrywkowych i inkubować przez 48 do 72 godzin po inkubacji. Umyj komórki trzykrotnie PBS i wygasić fluorescencję zewnątrzkomórkową 0,04% błękitem trianowym przez pięć minut.

Następnie umyj PBS, aby usunąć błękit trian. Następnie umieść naczynie na lodzie i dodaj 4% PFA i PBS na 10 minut, aby utrwalić komórki. Następnie umyj raz sterylną wodą i zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach z przedłużonym złotem z medium montażowym DPI.

Potwierdź wychwyt w inwazji egzogennej. Zastosowano strefy aggro poprzez kolokalizację z rekrutowanymi białkami ulegającymi ekspresji przez komórki biorcze na obrazach Zacka. Ten Zack obejmuje około sześciu mikrometrów głębokości.

24 zdjęcia wykonane w krokach co 200 nanometrów. Fluorescencja krążka MRFP w jednej strefie rolniczej pokazana na czerwono rekrutuje cytozolowy dysk końcowy GFPC. Jeden fragment pokazany w zielonej kolokalizacji przedstawia się jako żółty i wskazuje, że strefy rolnicze weszły do cytozolu biorcy i zrekrutowały wcześniej rozpuszczalne białko krążka pierwszego.

W tej części protokołu ludzki dysk będzie oznaczony jako DITE 5 94. Ten D pozwala na bezpośrednie monitorowanie rekombinowanego białka bez konieczności dodatkowego barwienia immunologicznego. Rozpocząć od uwolnienia białka przygotowanego w sposób opisany w dokumencie towarzyszącym z merkaptoetanolu wiązkowego, dializując go trzykrotnie w dwóch litrach PBS w rozcieńczeniu od jednego do 2000.

Następnie oznaczyć jeden krążek miligramowy, jeden z DITE 5, 94 IDE, rozpuścić jeden miligram na mililitr białka w PBS i dodać pięć milimolowych TCEP w celu odzyskania wolnych grup TH, dodać 20 mikrolitrów rozpuszczonego barwnika DMF do reakcji i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej przy użyciu kasety do dializy SLI o masie cząsteczkowej odcięcia 10, 000. Daltonowie dializują białko trzy razy w PBS w stosunku jeden do 2000 przez dwie godziny za każdym razem. Następnie, aby jeszcze bardziej zwiększyć czystość znakowanego białka.

Wykonywane jest oczyszczanie powinowactwa oparte na znaczniku syczącym w kolumnie NI NTA. Umyj jeden mililitr matrycy NI NTA 10 mililitrami. PBS następnie nakłada znakowane białko dializujące do kolumny i pozostawia je na przepłynięcie przez kolumnę.

Powoli roztwór straci część swojego niebieskiego koloru z powodu wiązania białka z matrycą NTA, nieznakowany wolny barwnik pozostanie w przepływie. Po wprowadzeniu roztworu białkowego. Kolumnę, przemyj kolumnę trzykrotnie 20 mililitrami PBS w celu wymycia białka, dodaj dwa mililitry PBS zawierające 500 milimolowych ole do kolumny.

Ustaw zawór na niską prędkość i elucję kroplami, jednocześnie monitorując kolorowy pasek na kolumnie N NI NTA. Aby wspomnieć, ta kolorowa frakcja eluatu zawiera znakowane rekombinowane białko, przenosi EIT do kasety dializacyjnej SLI i dializuje EIT trzy razy do 10 milimolowych NAPI w rozcieńczeniu od 1 do 2000 przez dwie godziny każdy w dwóch litrach po dializie. Przepchnąć EIT przez sterylny filtr strzykawkowy o średnicy 0,45 mikrometra, a następnie poddzielić pięć razy po 100 mikrolitrów próbek i zamknąć w ciekłym azocie.

Całkowita ilość białka powinna wynosić od 0,5 do jednego mikrograma na mililitr na każde 100 mikrolitrów podwielokrotności. Aby ocenić inwazyjność białka, dodaj pożywkę zawierającą od pięciu do 10 mikrogramów na mililitr, znakowany rekombinowany krążek, jedno białko do każdej studzienki 24-dołkowej płytki zawierającej biorcę SH SY pięć Y ludzkich komórek nerwiaka zarodkowego. Składnik wyrażający rozpuszczalny krążek znaczników GFP jeden koniec C na sterylnych szkiełkach nakrywkowych inkubować przez 48 do 72 godzin.

Ugasić fluorescencję zewnątrzkomórkową, utrwalić i zamontować komórki, tak jak to zrobiono w przypadku komórek traktowanych w strefie rolniczej, potwierdzając inwazję egzogennie zastosowanego białka rekombinowanego przez Zack Imaging. Kiedy znakowane białko jest pobierane, jest wykrywane w obwodzie komórek biorczych na obrazach generowanych przez mikroskopię konfokalną. Ten Zack obejmuje około pięciu mikrometrów głębokości w 24 krokach po 220 nanometrów.

Tutaj rekombinowany krążek jeden fragment 5, 98 do 7, 85 pokazany na czerwono, jest pobierany przez komórki biorcze, wyrażające rozpuszczalny dysk oznaczony końcówką C oznaczoną GFP, jeden pokazany na zielono, w celu określenia inwazyjności dysku. Strefy agro jednego agregatu białkowego, składające się z oznaczonego MRFP dysku o pełnej długości, oczyszczono z komórek NLF i nałożono na biorcę SH SY pięć komórek Y, jak opisano na tym zdjęciu, jak pokazano tutaj. Oznaczony A-M-R-F-P dysk jeden akrosom zaatakował ludzki neuroblastoma SH SY pięć komórek Y wyrażających rozpuszczalny GFP oznaczony C, końcowy dysk jeden.

Co więcej, oznaczony MRFP dysk jeden asome był w stanie zrekrutować rozpuszczalny dysk oznaczony GFP w nierozpuszczalne agregaty w celu określenia inwazyjności rekombinowanego dysku znakowanego światłem DIA, który zastosowano do komórek nerwiaka zarodkowego SH SY pięciu Y wykazujących ekspresję rozpuszczalnego dysku GFP jeden, jak pokazano tutaj. Rekombinowany krążek jeden słodownik białkowy pokazany na czerwono zaatakował komórkę biorcy, żółte kropki wskazują na rekrutację rozpuszczalnego dysku końcowego C oznaczonego GFP do agregatów oznaczonych rekombinowanym dyskiem jeden, wyrażonym i oczyszczonym z E. coli, był również inwazyjny dla neuronów in vivo, gdy białko multimeryczne zostało stereotaktycznie wstrzyknięte do przyśrodkowej kory przedczołowej szczura. Obrazowanie Zacka potwierdza obecność rekombinowanego białka krążka jednego w neuronach korowych szczura barwionych przeciwciałem przeciwko jądrom neuronalnym

Właśnie pokazaliśmy dwie metody generowania agregatów dysku pierwszego do badania inwazji komórek. Korzystając z każdej z tych metod, możemy zbadać efekty komórkowe wychwytu agregatów z dysku pierwszego bez potencjalnie mylących zmiennych ekspresji genów rekombinowanych przez transfekcję obcego DNA. Techniki te mogą być stosowane do badania biologicznych skutków patologii białka krążka międzykręgowego in vitro w komórkach oraz in vivo poprzez inokulację domózgową lub inne podawanie w modelach zwierzęcych.

Jesteśmy przekonani, że techniki te mogą być również przeniesione na inne agregaty białkowe, ostatecznie z niewielkimi modyfikacjami protokołu przyjętego dla każdego konkretnego białka. Wykonując tę procedurę, należy poświęcić czas na staranną analizę obrazów z mikroskopii konfokalnej.