Name: Wytwarzanie, oczyszczanie i charakterystyka inwazyjnych dla komórek form białka DISC1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: Poznaj metody wytwarzania i oczyszczania agregatów białka DISC1 oraz ich inwazyjność komórkową. Techniki te umożliwiają badanie mechanizmów zaburzeń konformacyjnych białek w kontekście chorób psychicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca została sfinansowana przez NEURON-ERANET DISCover (BMBF 01EW1003) dla C.K. i J. P. H. oraz DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033) dla C.K. V.B. jest wspierana grantem Forschungskommission Wydziału Medycznego Uniwersytetu w Düsseldorfie.

1. Przygotowanie komórek donora aggresomów: transfekcja monomerycznej czerwonej białka fluorescencyjnego (mRFP) lub ulepszonego zielonego białka fluorescencyjnego (eGFP) z tagiem pełnej długości (FL) ludzkiego białka DISC1
<ol>
 <li>Wysiać 1,5 x 106 komórek ludzkiego neuroblastoma NLF (NLF; Children's Hospital of Philadelphia, Philadelphia, PA) na każdą z dziesięciu szalek o średnicy 10 cm i inkubować przez noc. Komórki NLF hodować w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej o 10% FBS, penicylinę/streptomycynę oraz L-glutaminę. Następnego dnia komórki powinny osiągnąć 70-80% konfluencji.</li>
 <li>Przeprowadzić transfekcję przejściową komórek na każdej szalce 10 cm za pomocą 15 μg plazmidowego DNA i odczynnika do transfekcji Metafectene (Biontex, Martinsried, Niemcy). W skrócie: dla szalki 10 cm, 15 μg plazmidowego DNA oraz 30 μl Metafectene dodano do 750 μl Opti-MEM, wymieszano i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 20 min. 5 szalek transfekowano plazmidem pcDNA3.1 z ludzkim (FL) DISC1 oznaczonym mRFP/eGFP, a 5 szalek samym plazmidem eGFP.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie aggresomów z transfektowanych komórek dawcy
Opisany tutaj protokół stanowi połączenie metody oczyszczania ciał Lewy z tkanki mózgowej13 oraz protokołu izolacji dużych agregatów i aggresomów14. Ponieważ istniejące już metody opierają się na zastosowaniu detergentów, kluczowe jest wyizolowanie białka wolnego od detergentów do zastosowania w testach inwazyjności komórkowej.
<ol>
 <li>48 h po transfekcji monitoruj ekspresję eGFP i mRFP/eGFP-DISC1 oraz potwierdź tworzenie się aggresomów pod mikroskopem fluorescencyjnym (Rycina 1). </li>
 <li>Przemyj komórki PBS pH 7.4, zeskrob każdą z nich w 400 μl PBS, dodaj 1X koktajl inhibitorów proteaz (Roche, Indianapolis, IN) i rozbij komórki za pomocą homogenizatora Precellys24 (Bertin technologies, Francja). W skrócie: dodaj 1 ml zawiesiny komórkowej do 2 ml probówki do lizy i dodaj 10 kulek ceramicznych. Lizuj komórki za pomocą 3 impulsów po 60 s. Siła mechaniczna tego procesu może podnieść temperaturę w próbce powyżej 37 °C, dlatego należy zadbać o schłodzenie próbki na lodzie po procedurze lizy.</li>
 <li>Schłodź komórki na lodzie, dodaj 10 mM MgCl2, 40 U/ml DNazy A i inkubuj przez 60 min w 37 °C.</li>
 <li>Przygotuj roztwory sacharozy (w/v) o stężeniach 80%, 50% i 20% w PBS pH 7.4 (po 10 ml każdego).</li>
 <li>Przygotuj gradient sacharozy w 15 ml probówce typu Falcon, zaczynając od 2 ml 80% sacharozy, a następnie dodając 50% i 20%. Wlewaj gradient powoli, uważając, aby nie zmącić już wlanych warstw. Nałóż strawiony lizat na wierzch gradientu i wiruj przez 15 min przy 1000 x g w 4 °C.</li>
 <li>Ostrożnie pobierz pipetą interfazę między warstwami 50% a 80% sacharozy i zmieszaj z 5 objętościami PBS pH 7.4. Wiruj przez 15 min przy 1000 x g w 4 °C. Powtórz przemywanie jeszcze dwukrotnie. W tej interfazie aggresomy wykazują fluorescencję i można je wizualizować pod mikroskopem w świetle UV.</li>
 <li>Odlej nadsącz i resuspenduj osad w 250-500 μl PBS pH 7.4. Osad ten zawiera oczyszczone aggresomy (Rycina 2).</li>
</ol>
3. Traktowanie komórek biorcy SH-SY5Y aggresomami mRFP/eGFP-DISC1
<ol>
 <li>Wysiać 5 x 104 komórek neuroblastoma człowieka SH-SY5Y (komórki biorcy), konstytutywnie eksprymujących GFP-DISC1(598-854), na sterylne szkiełka nakrywkowe w każdym dołku płytki 24-dołkowej. Komórki SH-SY5Y hodować w pożywce DMEM/F-12 uzupełnionej o penicylinę/streptomycynę, niezasadnicze aminokwasy (NEAA) oraz 10% FBS. </li>
 <li>Po 24 h dodać 10 μl do każdego dołka i inkubować przez 48-72 h. </li>
 <li>Przemyć komórki 3 x PBS pH 7.4 i wygasić fluorescencję zewnątrzkomórkową za pomocą 0,04% Trypan Blue przez 5 min. </li>
 <li>Utrwalić komórki w 4% PFA w PBS pH 7.4 przez 10 min na lodzie, przemyć raz sterylną H2O i zamontować szkiełka nakrywkowe na szkiełkach przedmiotowych przy użyciu medium montażowego ProLong Gold z DAPI (Invitrogen, USA). </li>
 <li>Potwierdzić pobranie/inwazję egzogennie wprowadzonych aggresomów poprzez kolokalizację z rekrutowanymi białkami eksprymowanymi przez komórki biorcy na obrazach Z-stack. </li>
</ol>
Jednakże pobieranie/inwazja białek egzogennych może nie być wykrywalne równolegle z rekrutacją białek komórki gospodarza. W naszym przykładzie aggresomy z DISC1 znakowane mRFP rekrutują rozpuszczalne białko DISC1(598-854) znakowane GFP, ekspresjonowane przez komórkę gospodarza (patrz Rycina 3). Zdjęcia wykonano za pomocą konfokalnego mikroskopu Zeiss LSM 510 lub mikroskopu Zeiss Axiovision Apotome2.
4. Generowanie rekombinowanego DISC1(598-785)
W poprzedniej publikacji przeanalizowaliśmy zdolność różnych fragmentów białka DISC1 do autinterakcji na podstawie obecności domen samoprzylegania. spośród wszystkich przetestowanych fragmentów białek ludzkie DISC1(598-785) wykazało najsilniejszą tendencję do multimeryzacji4 (Rycina 4). W związku z tym ludzkie DISC1(598-785) sklonowano do wektora pET15b (Novagen, Madison, Wisconsin) zawierającego N-terminalny znacznik 6-histydynowy, wyekspresowano w E. coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, US) i oczyszczono w warunkach denaturujących w 8 mol/l mocznika zgodnie z opisem4. Poniżej przedstawiono skrócony opis protokołu.
<ol>
 <li>Bakterie BL21-(IDE3) Rosetta E. coli hodowano w 2 x 500 ml pożywki 2YT zawierającej 5 mM-argininę-HCl, 5mM MGSO4, 100 μg/ml karbenicyliny i 35 μg/ml chloramfenikolu do osiągnięcia OD600: 0,6-0,8, a następnie indukowano ekspresję DISC1(598-785) za pomocą 1 mM IPTG. </li>
 <li>Ekspresję DISC1(598-785) prowadzono przez 4 hr w 37 °C, a następnie przerwano ją poprzez zebranie bakterii metodą wirowania. </li>
 <li>Osad bakteryjny resuspendowano w 50 ml buforu TE (50 mM TRIS-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA) z dodatkiem 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 μg/ml lizozymu, 20 mM MgCl2 oraz 400 U/50 ml DNazy I. Aby zapewnić całkowitą lizę, mieszaninę inkubowano przez 30 min w RT przy łagodnym mieszaniu.</li>
 <li>Dodano 10 mM β-merkaptoetanolu (ME) oraz 500 mM NaCl i inkubowano przez kolejne 30 min. </li>
 <li>Ciałka inkluzyjne bakterii osadzono przez wirowanie przy 20.000 g przez 30 min w 4 °C. </li>
 <li>Osad resuspendowano w 50 ml buforu ekstrakcyjnego zawierającego 50mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazolu, 500 mM NaCl, 8 M mocznika oraz 10 mM β-ME, a następnie usunięto zanieczyszczenia przez wirowanie przy 20.000 g przez 30 min w 4 °C. </li>
 <li>Matrycę agarozową Ni-NTA przemyto buforem ekstrakcyjnym. Resuspendowany, uprzednio oczyszczony ekstrakt białkowy inkubowano z matrycą Ni-NTA przez 2 hr w RT. </li>
 <li>Matrycę Ni-NTA przemyto buforem ekstrakcyjnym zawierającym 12 mM imidazolu. </li>
 <li>Białko elukowano powoli za pomocą 15 ml buforu elucyjnego zawierającego 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazolu, 8 M mocznika, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA oraz 10 mM β-ME. </li>
 <li>Białko dializowano etapowo przeciwko PBS pH 7,4 zawierającemu 10 mM β-ME. </li>
</ol>
Z 1 L kultury startowej bakterii można wyizolować do 50 mg rekombinowanego białka DISC1(598-785).
Renaturacja α-synucleiny
Do eksperymentów z α-synukleiną wykorzystano 500 μg rekombinowanego białka (Sigma-Aldrich, USA), które rozpuszczono w PBS do stężenia 1 mg/ml. W celu otrzymania oligomerów przeprowadzono refolding przez noc w temperaturze 37 °C, zgodnie z opisem w poprzedniej publikacji10.
5. Znakowanie rekombinowanego białka DISC1(598-785) barwnikiem DyLight594
<ol>
 <li>Przed kolejnym etapem znakowania białko DISC1(598-785) musi zostać uwolnione z β-ME. W związku z tym białko poddaje się dializie 3-krotnie przeciwko PBS pH 7.4 w rozcieńczeniu 1:2,000.</li>
 <li>Znakuj 1 mg białka DISC1(598-785) przy użyciu DyLight 594 maleimide (Thermo Scientific, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie: rozpuść 1 mg/ml białka w PBS pH 7.4 i dodaj 5 mM TCEP, aby przywrócić wolne grupy tiolowe. Dodaj 20 μl barwnika rozpuszczonego w DMF do mieszaniny reakcyjnej i inkubuj przez 2 hr w RT.</li>
 <li>Dializuj białko 3 x przeciwko PBS pH 7.4 w stosunku 1:2000 przez 2 hr w każdej sesji.</li>
</ol>
Aby dodatkowo zwiększyć czystość znakowanego białka, przeprowadza się oczyszczanie powinowactwa oparte na znaczniku His6 na kolumnie Ni-NTA.
<ol start="4">
 <li>Przemyć 1 ml macierzy Ni-NTA (Qiagen, Niemcy) za pomocą 10 ml PBS pH 7.4. </li>
 <li>Nanieść znakowane, dializowane białko na kolumnę i pozwolić mu powoli przez nią spłynąć. </li>
 <li>Przemyć białko 3 x 20 ml PBS pH 7.4. </li>
 <li>Eluować białko, dodając kroplami PBS pH 7.4 z 500 mM imidazolem, monitorując jednocześnie kolorowy prążek na kolumnie Ni-NTA, aby zminimalizować objętość eluatu. </li>
 <li>Przedializować eluat 3 razy przeciwko 10 mM NaPi pH 7.4 przy rozcieńczeniu 1:2000 przez 2 h w każdym cyklu. </li>
 <li>Przefiltrować eluat za pomocą sterylnego filtra strzykawkowego 0.45 μm, rozdzielić na 5 x 100 μl próbek i zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie. Całkowita ilość białka w każdej 100 μl porcji powinna wynosić 0.5 - 1 μg/ml. </li>
</ol>
opcjonalny etap zagęszczania
<ol start="10">
 <li>W celu wykonania stereotaktycznych iniekcji u szczurów, białko zagęszczono 10-krotnie w wirówce próżniowej (Eppendorf Concentrator 5301). Końcowy skład buforu wynosił 100 mM NaPi. 
 </li>
</ol>
Znakowanie α-synukleiny
 Oznakowanie i oczyszczanie (kolumna Ni-NTA) rekombinowanej α-synukleiny przeprowadzono równolegle do DISC1(598-785). Całkowita ilość materiału wyjściowego wynosiła 500 μg zamiast 1 mg w przypadku DISC1(598-785). 
6. Inkubacja komórek biorców SH-SY5Y z znakowanym rekombinowanym białkiem DISC1 (598-785)
<ol>
 <li>Wysiać 5x104 komórek biorcy – ludzkich komórek neuroblastoma SH-SY5Y konstytutywnie eksponujących GFP-DISC1(598-854) – na sterylnych szkiełkach podstawkowych w każdym dołku płytki 24-dołkowej. </li>
 <li>Dodać znakowane białko do pożywki hodowlanej w stężeniu 5-10 μg/ml i inkubować przez 48-72 hr. </li>
 <li>Przemyć komórki 3 x w PBS pH 7.4 i wygasić fluorescencję zewnątrzkomórkową przy użyciu 0,04% błękitu trypanu przez 5 min. </li>
 <li>Utrwalić komórki w 4% PFA w PBS pH 7.4 przez 10 min na lodzie, przemyć raz sterylną H2O i zamontować szkiełka podstawkowe na szkiełkach przedmiotowych, stosując medium montażowe ProLong Gold z DAPI (Invitrogen, USA). </li>
 <li>Potwierdzić pobranie/inwazję egzogennie podanego białka rekombinowanego poprzez kolokalizację z białkami rekrutowanymi, eksponowanymi przez komórki biorcy, na obrazach Z-stack uzyskanych za pomocą konfokalnej mikroskopii skaningowej. Nawet jeśli rekrutacja białka endogennego nie zostanie wyraźnie wykryta równolegle z inwazją białka komórki gospodarza, obrazy Z-stack mogą nadal potwierdzić inwazyjny charakter białka. </li>
</ol>
W naszym przykładzie rekombinowany DISC1(598-785)* przynajmniej częściowo rekrutuje rozpuszczalne białko DISC1(598-854) z tagiem GFP ekspresjonowane przez komórkę gospodarza (patrz Rysunek 5A). W przypadku rekombinowanej α-synukleiny wykazano inwazję, ale brak rekrutacji (Rysunek 5B). Zdjęcia wykonano za pomocą konfokalnego mikroskopu Zeiss LSM 510 lub mikroskopu Zeiss Axiovision Apotome2.
Wstrzyknięcie stężonego (ok. 4 μl w stężeniu 2,5 μg/μl), znakowanego DISC1(598-785)* do mPFC skutkuje rozprzestrzenieniem się białka wokół miejsca wstrzyknięcia, co można wykryć nawet po perfuzji zwierzęcia 4% PFA w PBS pH 7,4 przy użyciu zestawu filtrów do rodaminy. W naszym przykładzie DISC1(598-785) jest pobierany przez określoną liczbę neuronów i może być monitorowany za pomocą obrazowania Z-stack (Rysunek 6). 
Ogólnie rzecz biorąc, wstrzykiwanie białek innych niż te zastosowane w niniejszej pracy nie musi prowadzić do inwazji komórkowej. Zjawisko inwazji zależy w zasadzie od natury białka, niemniej jednak czyste oczyszczenie jest warunkiem wstępnym do dalszej analizy.
7. Reprezentatywne wyniki
Aggresomy składające się z rekombinowanego FL DISC1-eGFP oczyszczonego z komórek NLF wnikały do komórek biorcy SH-SY5Y z niską wydajnością (około 0,3% 5), co wykazano poprzez kolokalizację w mikroskopii konfokalnej (Rysunek 3). Jak zgłoszono wcześniej, DISC1(598-785) ekspresowany i oczyszczony z E. coli, który tworzył multimery 4, wykazywał podobną zdolność do wnikania do komórek przy wydajności około 20% 5 (Rysunek 5A), co było zbliżone do wyników dla α-synukleiny, użytej równolegle jako kontrola pozytywna (Rysunek 5B). Znakowany rekombinowany DISC1(598-785) ekspresowany i oczyszczony z E. coli był również zdolny do wnikania do neuronów in vivo po stereotaktycznym wstrzyknięciu multimerycznego białka do przyśrodkowej kory przedczołowej szczura (Rysunek 6; Pum, Bader, Huston, Korth, niepublikowane).
<img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig1.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej komórek przy wzbudzeniu czerwonym, pokazujący lokalizację białka w skali 20µm." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Komórki neuroblastoma NLF przejściowo eksponujące FP-DISC1 (czerwony). Wewnątrz komórek można wykryć czerwone fluorescencyjne aggresomy.
 <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig2.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiający cząsteczki zabarwione na czerwono, pasek skali 50 micrometers." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Oczyszczone aggresomy DISC1 znakowane mRFP po oczyszczaniu w gradiencie sacharozy. 
 <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig3.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej, lokalizacja DISC1: białka fuzyjne GFP, mRFP; obrazowanie komórkowe." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Obraz fluorescencyjny zainwadowanych aggresomów. Oczyszczone aggresomy flDISC1 znakowane mRFP inkubowano z komórkami neuroblastoma SH-SY5Y nadekspresującymi rozpuszczalne DISC1(598-854) znakowane GFP. Pobieranie znakowanych aggresomów monitorowano za pomocą obrazowania Z-stack na mikroskopie skaningowym laserem (Zeiss LSM 510).
<img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig4.jpg" alt="Wykres chromatografii wykluczania cząsteczkowego przedstawiający piki multimerów białek i analizę objętości elucji." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Profil SEC rekombinowanego białka DISC1(598-785) zawierającego polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP) S704 i C704. Oba warianty wykazują zaburzenie uporządkowanej oligomeryzacji i tworzenie multimerów o wysokiej masie cząsteczkowej (czerwona strzałka). Rycina zmodyfikowana na podstawie publikacji Leliveld et al., Biochemistry 2009.
<img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig5.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna komórek; barwienie GFP-DISC1, DyLight594 i DAPI; analiza lokalizacji białek." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Obraz Z-stack z mikroskopii fluorescencyjnej inwazyjnego, znakowanego DyLight rekombinowanego białka DISC1(598-785). Komórki neuroblastoma SH-SY5Y wykazujące ekspresję rozpuszczalnego GFP-DISC1(598-854) inkubowano z znakowanym białkiem rekombinowanym w stężeniu 5 μg/ml. (A) Czerwone agregaty obrazują inwazję rekombinowanego białka DISC1(598-785), a żółte kropki wskazują rekrutację rozpuszczalnego GFP-DISC1(598-854) do agregatów. (B) Rekombinowana α-synukleina (czerwona) wnika do komórek bez rekrutacji z częstotliwością około 20%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4132/4132fig5large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.
<img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig6.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii immunofluorescencyjnej; barwienie α-NeuN i DAPI w neuronach; obraz scalony; lokalizacja białka." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Obraz immunofluorescencyjny wstrzykniętego, znakowanego rekombinowanego białka DISC1(598-785). Obrazowanie Z-stack potwierdza obecność białka rec. DISC1(598-785) w neuronach kory szczura zabarwionych przeciwciałem przeciwko jądrom neuronalnym (NeuN, zielony).

<ol><li>Millar, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+two+novel+genes+by+a+translocation+co-segregating+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia.</a> Hum. Mol. Genet. 9, 1415-1423 (2000).</li>
<li>St Clair, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+within+a+family+of+a+balanced+autosomal+translocation+with+major+mental+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Association within a family of a balanced autosomal translocation with major mental illness.</a> Lancet. 336, 13-16 (1990).</li>
<li>Leliveld, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insolubility+of+disrupted-in-schizophrenia+1+disrupts+oligomer-dependent+interactions+with+nuclear+distribution+element+1+and+is+associated+with+sporadic+mental+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Insolubility of disrupted-in-schizophrenia 1 disrupts oligomer-dependent interactions with nuclear distribution element 1 and is associated with sporadic mental disease.</a> J. Neurosci. 28, 3839-3845 (2008).</li>
<li>Leliveld, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomer+assembly+of+the+C-terminal+DISC1+domain+%28640-854%29+is+controlled+by+self-association+motifs+and+disease-associated+polymorphism+S704C%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Oligomer assembly of the C-terminal DISC1 domain (640-854) is controlled by self-association motifs and disease-associated polymorphism S704C.</a> Biochemistry. 48, 7746-7755 (2009).</li>
<li>Ottis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+two+independent+mental+disease+genes+on+the+protein+level%3A+recruitment+of+dysbindin+to+cell-invasive+disrupted-in-schizophrenia+1+aggresomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Convergence of two independent mental disease genes on the protein level: recruitment of dysbindin to cell-invasive disrupted-in-schizophrenia 1 aggresomes.</a> Biol. Psychiatry. 70, 604-610 (2011).</li>
<li>Meyer-Luehmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+induction+of+cerebral+beta-amyloidogenesis+is+governed+by+agent+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host.</a> Science. 313, 1781-1784 (2006).</li>
<li>Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+tau+misfolding+from+the+outside+to+the+inside+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell.</a> J. Biol. Chem. 284, 12845-12852 (2009).</li>
<li>Frost, B., Ollesch, J., Wille, H., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+diversity+of+wild-type+Tau+fibrils+specified+by+templated+conformation+change%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Conformational diversity of wild-type Tau fibrils specified by templated conformation change.</a> J. Biol. Chem. 284, 3546-3551 (2009).</li>
<li>Clavaguera, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+and+spreading+of+tauopathy+in+transgenic+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain.</a> Nat. Cell Biol. 11, 909-913 (2009).</li>
<li>Desplats, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+formation+and+neuronal+cell+death+through+neuron-to-neuron+transmission+of+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13010-13015 (2009).</li>
<li>Ren, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+penetration+and+persistent+infection+of+mammalian+cells+by+polyglutamine+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates.</a> Nat. Cell Biol. 11, 219-225 (2009).</li>
<li>Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+propagation+of+mutant+superoxide+dismutase-1+misfolding+in+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 3548-3553 (2011).</li>
<li>Iwatsubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+Lewy+bodies+from+the+brains+of+patients+with+diffuse+Lewy+body+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of Lewy bodies from the brains of patients with diffuse Lewy body disease.</a> Am. J. Pathol. 148, 1517-1529 (1996).</li>
<li>Meriin, A. B., Wang, Y., Sherman, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+aggresomes+and+other+large+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of aggresomes and other large aggregates.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, 1-9 (2010).</li>
<li>Korth, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DISCopathies%3A+brain+disorders+related+to+dysfunctional+DISC1%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">DISCopathies: brain disorders related to dysfunctional DISC1.</a> Rev. Neurosci. 20, 321-330 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

W niniejszym badaniu opisujemy oczyszczanie aggresomów mRFP/eGFP-DISC1 z transfekowanej linii komórek neuroblastoma, przygotowanie i znakowanie rekombinowanego białka DISC1 oraz ich zastosowanie w eksperymentach dotyczących inwazyjności komórkowej w komórkach biorców in vitro oraz in vivo.
Oczyszczanie natywnych aggresomów mRFP/eGFP-DISC1 opracowano na podstawie protokołów izolacji struktur przypominających ciałka Lewy'ego oraz większych agregatów13, 14, jednak zmodyfikowano je, aby uniknąć stosowania detergentów i zminimalizować ryzyko fałszywie dodatniego wyniku inwazji komórkowej, która mogłaby wystąpić wskutek ułatwionej przez detergenty penetracji błon.
Jedną z możliwych przyszłych ulepszeń mogłoby być dalsze zwiększenie czystości aggresomów poprzez sonikację, aby całkowicie oddzielić pozostałe membrany i cytoszkielet od aggresomów. Poprzez zwiększenie ogólnej czystości, liczba zarejestrowanych całkowitych zdarzeń inwazji dla dużych aggresomów może ulec zwiększeniu5. To, czy ograniczona definicja sugerowanego przez nas 3-fazowego gradientu sacharozy jest wystarczająca dla aggresomów innych gatunków białek, wymaga przetestowania; w tym sensie opisany tutaj protokół należy traktować jako punkt wyjścia do indywidualnej optymalizacji. Oczyszczone aggresomy okazały się w naszych badaniach dość stabilne; dodatkowe etapy przemywania (bez detergentu) w celu usunięcia śladów sacharozy nie zmniejszyły znacząco całkowitej wydajności. 
W poprzedniej publikacji opisaliśmy, że montaż oligomerów DISC1 zależy od odrębnych domen multimeryzacji w C-końcu4 (Rysunek 4). Fragment ten wybraliśmy do rekombinacyjnej ekspresji rozpuszczalnej w E. coli i późniejszego oczyszczania za pomocą Ni-NTA. Aby monitorować jego multimeryzację i porównać jego inwazyjność komórkową z opisanym białkiem inwazyjnym, takim jak α-synuclein, oznakowaliśmy DISC1(598-785) fluorescencyjnym barwnikiem DyLight594 i porównaliśmy jego inwazyjność komórkową z inwazyjnością analogicznie oznakowanej α-synuclein. Inwazyjność komórkowa rekombinowanego fragmentu DISC1 była znacznie większa w porównaniu z natywnymi, pełnowymiarowymi aggresomami DISC1, co prawdopodobnie wynika z jego mniejszego rozmiaru i znacznie wyższej czystości. Ponownie wydaje się, że czystość odgrywa decydującą rolę w inwazyjności komórkowej.
W naszym przykładzie inwazyjne aggresomy rekrutowały rozpuszczalne białko homologiczne z linii komórkowej docelowej, które zostało wyrażone rekombinacyjnie w formie rozpuszczalnej, t.j. rozproszonej w komórce. Ekspresja białka fluorescencyjnego (np. GFP lub RFP) w linii komórkowej biorcy jest korzystna, ponieważ pozwala na kolokalizację inwazyjnych aggresomów i białek rekombinowanych w obrębie granic komórki biorcy za pomocą obrazowania Z-stack.
Inwazyjne komórkowo aggresomy DISC1 oraz fragmenty multimeryczne ekspresowane i oczyszczane z E. coli mogą stanowić cechę definiującą białkowe choroby konformacyjne związane z DISC1, czyli DISC1opatie 15.
Rozwiązywanie problemów:
Niska wydajność aggresomów po oczyszczaniu w gradiencie sacharozy:
Gradient sacharozy wprowadzony w tym protokole działa skutecznie w przypadku aggresomów eGFP/mRFP-DISC1(FL). Aggresomy składające się z innych białek mogą mieć różne rozmiary, dlatego stężenia sacharozy powinny zostać zoptymalizowane przez innych użytkowników.
Niewystarczające oczyszczanie białka rekombinowanego:
Wszelkie zanieczyszczenia bakteryjne w procesie oczyszczania białka rekombinowanego zostaną również znakowane w późniejszych etapach protokołu. Aby uniknąć zanieczyszczeń, należy poddać białko elektroforezie SDS-PAGE i potwierdzić, że białko rekombinowane jest czyste w co najmniej 95% poprzez barwienie Coomassie-Blue. W celu zapewnienia najwyższej jakości i wydajności, protokół musi zostać zoptymalizowany dla każdego konkretnego białka.
Niska wydajność znakowania białek rekombinowanych:
Wszelkie zanieczyszczenia zawierające wolne grupy SH zmniejszą wydajność znakowania białka. Dlatego niezbędne jest przeprowadzenie dokładnej dializy oraz oczyszczania z wykorzystaniem Ni-NTA.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td>Medium zależy od linii komórek gospodarza. Optymalna linia komórek biorcy powinna zostać określona przez użytkownika.</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11320-033</td><td>Medium zależy od linii komórek biorcy. Optymalną linię komórek biorcy powinien określić użytkownik.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Metafectene</td><td>Biontex</td><td>T020-1.0</td><td>Inne odczynniki do transfekcji mogą również być skuteczne, jednak nie zostały one przetestowane w ramach naszego protokołu.</td></tr><tr><td>agaroza Ni-NTA</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>Eksperymenty przeprowadzono z użyciem agarozy Ni_NTA firmy Qiagen, jednak produkty innych dostawców powinny również być odpowiednie.</td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Roche</td><td>04716728001</td><td>W procesie oczyszczania aggresomów nie ma potrzeby stosowania DNazy wolnej od RNazy.</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985-062</td><td>Pożywka bezsurowicza sprawdza się równie dobrze</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>Suplement do pożywki dla komórek SH-SY5Y i NLF</td></tr><tr><td>Niezbędne aminokwasy (NEAA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7145</td><td>Suplement do pożywki dla komórek SH-SY5Y</td></tr><tr><td>Błękit trypanu 0,4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>Toksyczny odczynnik</td></tr><tr><td>DyLight 594 Maleimide</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>46608</td><td>Zredukowany barwnik reaktywny z cysteiną w celu utworzenia stabilnych grup tio&amp;#8211;więzi. Dostępne również w innych kolorach.</td></tr><tr><td>ProLong Gold z DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>Ten medium montażowe zapobiegające blaknięciu (antifade) zapewnił w naszych badaniach lepsze rezultaty.</td></tr><tr><td>koktajl inhibitorów proteaz</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Rozpuścić 1 tabletkę w 500 &amp;mu;l H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O dla roztworu 100X.</td></tr><tr><td>Syntetyczna α-synukleina</td><td>Sigma</td><td>S7820</td><td>Przeprowadzić refolding zgodnie z opisem w tekście.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;span class=&quot;Agregacja białek jest uznawana za ogólną cechę charakterystyczną przewlekłych, degeneracyjnych schorzeń mózgu, takich jak na przykład neurodegeneracyjne choroby Alzheimera (Aβ, tau), Parkinsona (α-synukleina), Huntingtona (poliglutamina, huntingtyna) i inne. Uważa się, że agregacja białek zachodzi w wyniku zaburzeń proteostazy, tzn. braku równowagi między powstawaniem a degradacją błędnie sfałdowanych białek. Warto zauważyć, że te same białka występują w formie agregatów w sporadycznych postaciach tych chorób, jak i w rzadkich wariantach postaci rodzinnych wywołanych mutacjami. Schizofrenia jest przewlekłym, postępującym schorzeniem mózgu, któremu w wielu przypadkach towarzyszy trwały i nieodwracalny deficyt poznawczy. W ramach podejścia opartego na genach kandydackich zbadaliśmy, czy białko DISC1 (Disrupted-in-schizophrenia 1) – gen sklonowany w szkockiej rodzinie z powiązaniami z przewlekłymi chorobami psychicznymi1, 2 – może występować w formie nierozpuszczalnych agregatów w mózgach osób ze sporadyczną schizofrenią3. Wykorzystując SMRI CC, zidentyfikowaliśmy w około 20% przypadków z przewlekłymi chorobami psychicznymi (CMD), ale nie w grupie kontrolnej osób zdrowych ani u pacjentów z chorobami neurodegeneracyjnymi, immunoreaktywność DISC1 nierozpuszczalną w sarkozylu po frakcjonowaniu biochemicznym. Kolejne badania in vitro wykazały, że na skłonność DISC1 do agregacji wpływa polimorfizm S704C związane z chorobą4 oraz że aggresomy DISC1 generowane in vitro wykazują inwazyjność komórkową5, podobnie jak wykazano w przypadku agregatów Aβ6, tau7-9, α-synukleiny10, poliglutaminy11 lub SOD112. Wyniki te skłoniły nas do postawienia tezy, że co najmniej podgrupa przypadków CMD – mianowicie te z zagregowanym DISC1 – może stanowić zaburzenia konformacyjne białek. W niniejszej pracy opisujemy sposób generowania aggresomów DISC1 w komórkach ssaków, ich oczyszczania na gradiencie sacharozy oraz wykorzystywania ich w badaniach nad inwazyjnością komórkową. Podobnie opisujemy sposób generowania wyłącznie multimerycznego fragmentu C-końcowego DISC1, jego znakowania i oczyszczania do badań nad inwazyjnością komórkową. Używając rekombinowanych multimerów DISC1, osiągnęliśmy podobną inwazyjność komórkową, co w przypadku analogicznie znakowanego syntetycznego fragmentu α-synukleiny. Wykazujemy również, że fragment ten jest pobierany in vivo po stereotaktycznym wstrzyknięciu do mózgu zwierząt biorców.&quot;&gt;&lt;strong&gt;Tabela specyficznych odczynników.&lt;/strong&gt;&lt;/span&gt;</td></tr><tr><td>Precellys 24</td><td>Bertin Technologies</td><td>03119.200.RD000</td><td>Nie testowaliśmy innych homogenizatorów mechanicznych niż ten. Inne metody homogenizacji bez użycia detergentów również mogą być skuteczne, jednak nie zostały one sprawdzone w ramach niniejszego protokołu.</td></tr><tr><td>Koncentrator 5301 (speedvac)</td><td>Eppendorf</td><td>5301 000.210</td><td>Konieczne tylko w przypadku konieczności zagęszczenia białka.</td></tr><tr><td>LSM 510 oraz Axiovision Apotome2 </td><td>Zeiss</td><td>Patrz w katalogu producenta</td><td>Oba mikroskopy posiadają funkcję obrazowania w stosie Z (Z-stack). Jest to warunek niezbędny do rzetelnej i wiarygodnej oceny zdarzeń inwazyjnych.</td></tr><tr><td>Plastikowy materiał do hodowli komórkowych</td><td>Nunc</td><td>szalki 10 cm #172958, płytki 24-dołkowe #142475</td><td>Zastosowanie różnych materiałów z tworzyw sztucznych może wpływać na oddziaływanie białek rekombinowanych lub aggresomów z powierzchniami plastikowymi. Nie testowaliśmy materiałów innych niż opisane w niniejszym opracowaniu.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;span class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;Tabela konkretnych materiałów i sprzętu.&lt;/strong&gt;&lt;/span&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;tabela obramowanie=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Numer&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Nazwa buforu&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Agregacja białek jest uważana za ogólną cechę charakterystyczną przewlekłych, degeneracyjnych schorzeń mózgu, takich jak na przykład neurodegeneracyjne choroby Alzheimera (Aβ, tau), Parkinsona (α-synukleina), Huntingtona (poliglutamina, huntingtyna) i inne. Uważa się, że agregacja białek zachodzi w wyniku zaburzeń proteostazy, czyli braku równowagi między powstawaniem a degradacją źle sfałdowanych białek. Warto zauważyć, że te same białka występują w formie zagregowanej w sporadycznych postaciach tych chorób, jak i w rzadkich wariantach postaci rodzinnych, w których są one zmutowane. Schizofrenia jest przewlekłym, postępującym schorzeniem mózgu, któremu w wielu przypadkach towarzyszy trwały i nieodwracalny deficyt poznawczy. W podejściu opartym na genie kandydującym zbadaliśmy, czy białko DISC1 (Disrupted-in-schizophrenia 1) – gen sklonowany w szkockiej rodzinie z powiązaniem z przewlekłą chorobą psychiczną (CMD) – może występować w formie nierozpuszczalnych agregatów w mózgach osób ze sporadyczną schizofrenią. Wykorzystując SMRI CC, zidentyfikowaliśmy w około 20% przypadków CMD, ale nie w grupach kontrolnych ani u pacjentów z chorobami neurodegeneracyjnymi, immunoreaktywność DISC1 nierozpuszczalną w sarkosylu po frakcjonowaniu biochemicznym. Kolejne badania in vitro wykazały, że na skłonność DISC1 do agregacji wpływa związany z chorobą polimorfizm S704C, a agresomy DISC1 generowane in vitro wykazują inwazyjność komórkową, podobnie jak wykazano w przypadku agregatów Aβ, tau, α-synukleiny, poliglutaminy lub SOD1. Wyniki te skłoniły nas do postawienia hipotezy, że co najmniej podgrupa przypadków CMD – a konkretnie pacjenci z zagregowanym białkiem DISC1 – może należeć do zaburzeń konformacyjnych białek. W niniejszym opracowaniu opisujemy sposób generowania agresomów DISC1 w komórkach ssaków, ich oczyszczania na gradiencie sacharozy oraz wykorzystania ich do badań nad inwazyjnością komórkową. Podobnie opisujemy sposób generowania wyłącznie multimerycznego fragmentu C-końcowego DISC1, jego znakowania i oczyszczania na potrzeby badań nad inwazyjnością komórkową. Używając rekombinowanych multimerów DISC1, osiągnęliśmy podobną inwazyjność komórkową, co w przypadku analogicznie znakowanego syntetycznego fragmentu α-synukleiny. Wykazujemy również, że fragment ten jest pobierany in vivo po stereotaktycznym wstrzyknięciu do mózgu zwierząt biorców.&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Komentarze&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;1.&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Pożywka do wzrostu bakterii&lt;/td&gt; &lt;td&gt;16 g/l Bacto Tryptone, 10 g/l Bacto Yeast extract, 5 g/l NaCl, 5 mM argininy-HCl, 5 mM MGSO4, 100 &amp;mu;g/ml karbenicyliny, 35 &amp;mu;g/ml chloramphenikolu&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Hodować bakterie do OD&lt;sub&gt;600&lt;/sub&gt;: 0,6-0,8 indukować ekspresję przy użyciu 1 mM IPTG.&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;2.&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Bufor do resuspensji bakterii&lt;/td&gt; &lt;td&gt;50 mM TRIS-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 &amp;mu;g/ml lizozymu, 20 mM MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; oraz 400 U/50 ml DNazy I&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Osad bakteryjny z 1 l hodowli nocnej zawiesić ponownie w 50 ml buforu do resuspensji.&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;3.&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Bufor do ekstrakcji białek&lt;/td&gt; &lt;td&gt;50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCl, 8 M mocznik i 10 mM b-ME&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;4.&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Bufor do płukania kolumny Ni-NTA&lt;/td&gt; &lt;td&gt;50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCl, 8 M mocznik i 10 mM b-ME, 12 mM imidazol&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Zmodyfikowany bufor ekstrakcyjny z dodatkiem 12 mM imidazolu.&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;5.&lt;/td&gt; &lt;td&gt;bufor elucyjny do kolumny Ni-NTA&lt;/td&gt; &lt;td&gt;50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazol, 8 M mocznik, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA i 10 mM b-ME &lt;/td&gt; &lt;td&gt;Bufor elucyjny zawiera 10 mM β-ME, który jest później dializowany. &lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;6.&lt;/td&gt; &lt;td&gt;PBS&lt;/td&gt; &lt;td&gt;8 g/l NaCl, 0,2 g/l KCl, 1,44 g/l Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0,24 g/l KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, doprowadzić do pH 7,4&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;7.&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Bufor do znakowania&lt;/td&gt; &lt;td&gt;PBS zawierający 5 mM TCEP&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td colspan=&quot;4&quot;&gt;&lt;span class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;Tabela z recepturami.&lt;/strong&gt;&lt;/span&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt; &lt;/table&gt; </td></tr></tbody></table>

generowanie, oczyszczanie i charakterystyka inwazyjnych komórkowo form białka disc1

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Agregacja białek jest uznawana za ogólną cechę charakterystyczną przewlekłych, degeneracyjnych schorzeń mózgu, na przykład w chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera (Aβ, tau), choroba Parkinsona (α-synuclein), choroba Huntingtona (polyglutamine, huntingtin) i inne. Przyjmuje się, że agregacja białek zachodzi w wyniku zaburzonej proteostazy, tzn. braku równowagi między powstawaniem a degradacją błędnie sfałdowanych białek. Warto zauważyć, że te same białka występują w formie zagregowanej w sporadycznych postaciach tych chorób, podczas gdy w rzadkich wariantach postaci rodzinnych są one zmutowane.
Schizofrenia jest chronicznym, postępującym schorzeniem mózgu, któremu w wielu przypadkach towarzyszy trwały i nieodwracalny deficyt poznawczy. W podejściu opartym na genach kandydackich zbadaliśmy, czy białko Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), gen sklonowany w szkockiej rodzinie z powiązaniem z chronicznymi chorobami psychicznymi1, 2, może występować w formie nierozpuszczalnych agregatów w mózgach osób z przypadkami sporadycznymi schizofrenii3. Korzystając z SMRI CC, zidentyfikowaliśmy u około 20% pacjentów z CMD, ale nie w grupach kontrolnych ani u pacjentów z chorobami neurodegeneracyjnymi, immunoreaktywność DISC1 nierozpuszczalną w sarkosylu po frakcjonowaniu biochemicznym. Dalsze badania in vitro wykazały, że na skłonność DISC1 do agregacji wpływa związany z chorobą polimorfizm S704C4 oraz że aggresomy DISC1 generowane in vitro wykazują inwazyjność komórkową5, podobnie jak wykazano w przypadku agregatów Aβ6, tau7-9, α-synuclein10, poliglutaminy11 lub SOD112. Wyniki te skłoniły nas do postawienia hipotezy, że co najmniej podgrupa przypadków CMD, a mianowicie te z zagregowanym DISC1, mogą być zaburzeniami konformacyjnymi białek.
W niniejszej pracy opisujemy sposób generowania aggresomów DISC1 w komórkach ssaków, ich oczyszczanie na gradiencie sacharozowym oraz wykorzystanie ich w badaniach nad inwazyjnością komórkową. Analogicznie opisujemy sposób generowania wyłącznie multimerycznego fragmentu C-końcowego DISC1, jego znakowanie i oczyszczanie na potrzeby badań nad inwazyjnością komórkową. Wykorzystując rekombinowane multimery DISC1, osiągamy podobną inwazyjność komórkową, jak w przypadku analogicznie znakowanego syntetycznego fragmentu α-synucleiny. Wykazujemy również, że fragment ten jest pobierany in vivo po stereotaktycznym wstrzyknięciu do mózgu zwierząt biorców.

Opisano generowanie, oczyszczanie oraz inwazję komórkową wewnątrzkomórkowych, cytoplazmatycznych aggresomów pełnowymiarowego białka DISC1 z kultur komórkowych, a także znakowanego, multimerycznego rekombinowanego fragmentu białka DISC1 w E. coli. Inwazyjność komórkową wykazano dla komórek biorców w kulturze komórkowej oraz dla neuronów in vivo po stereotaktycznej inokulacji mózgu.

Generowanie, oczyszczanie i charakterystyka inwazyjnych komórkowo form białka DISC1

Agregacja białek jest uznawana za ogólną cechę charakterystyczną przewlekłych, degeneracyjnych schorzeń mózgu, takich jak na przykład neurodegeneracyjne choroby Alzheimera (Aβ, tau), Parkinsona (α-synukleina), Huntingtona (poliglutamina, huntingtyna) i inne. Uważa się, że agregacja białek zachodzi w wyniku zaburzenia proteostazy, tzn. nierównowagi między powstawaniem a degradacją błędnie sfałdowanych białek. Należy zauważyć, że te same białka występują w formie zagregowanej w sporadycznych postaciach tych chorób, a w rzadkich wariantach postaci rodzinnych są one zmutowane. Schizofrenia jest przewlekłym, postępującym schorzeniem mózgu, któremu w wielu przypadkach towarzyszy trwały i nieodwracalny deficyt poznawczy. Stosując podejście oparte na genach kandydackich, zbadaliśmy, czy białko DISC1 (Disrupted-in-schizophrenia 1), zakodowane przez gen sklonowany w szkockiej rodzinie z powiązaniem z przewlekłymi chorobami psychicznymi, może występować w formie nierozpuszczalnych agregatów w mózgach osób ze sporadyczną postacią schizofrenii. Wykorzystując SMRI CC, zidentyfikowaliśmy w około 20% przypadków z przewlekłymi chorobami psychicznymi (ale nie w grupie kontrolnej osób zdrowych ani u pacjentów z chorobami neurodegeneracyjnymi) immunoreaktywność DISC1 nierozpuszczalną w sarkosylu po frakcjonowaniu biochemicznym. Następne badania in vitro wykazały, że na skłonność DISC1 do agregacji wpływa polimorfizm S704C związany z chorobą oraz że aggresomy DISC1 generowane in vitro wykazują inwazyjność komórkową, podobnie jak wykazano w przypadku agregatów Aβ, tau, α-synukleiny, poliglutaminy lub SOD1. Wyniki te skłoniły nas do postawienia hipotezy, że co najmniej podgrupa przypadków z przewlekłymi chorobami psychicznymi – a konkretnie osoby z zagregowanym DISC1 – może stanowić zaburzenia konformacyjne białek. W niniejszej pracy opisujemy sposób generowania aggresomów DISC1 w komórkach ssaków, ich oczyszczania na gradiencie sacharozy oraz wykorzystywania ich w badaniach nad inwazyjnością komórkową. Analogicznie opisujemy sposób generowania wyłącznie multimerycznego fragmentu C-końcowego DISC1, jego znakowania i oczyszczania do badań nad inwazyjnością komórkową. Wykorzystując rekombinowane multimery DISC1, osiągnęliśmy podobną inwazyjność komórkową, co w przypadku analogicznie znakowanego syntetycznego fragmentu α-synukleiny. Wykazujemy również, że fragment ten jest pobierany in vivo po stereotaktycznym wstrzyknięciu do mózgu zwierząt biorców.

Ogólnym celem następujących procedur jest uzyskanie oczyszczonych dysków. Po pierwsze, należy uzyskać agregaty zdolne do inwazji w komórki biorcy. Pierwsza metoda zaprezentuje dwa różne sposoby osiągnięcia tego celu.Fuzja białka fluorescencyjnego tworzącego somy disc one jest nadekspresyjna w ludzkich komórkach neuroblastoma donorowych NLF. Następnie komórki są przemywane PBS, zbierane i lizowane bez użycia detergentów. DNA jest trawione, a agrozony są oczyszczane przy użyciu systemu gradientu sacharozy.Agrios oczyszczone tą metodą wykazują niską wydajność inwazji komórkowej. Alternatywnym podejściem jest nadekspresja aminokwasów 5 98 do 7 85 rekombinowanego białka disc one w e coli. Fragment białka jest następnie znakowany DITE 5 94, dializowany i oczyszczany przy użyciu macierzy NI NTA, która usuwa wszelkie pozostałe niezwiązane barwniki oraz multimery disc.Fragmenty otrzymane tą metodą wykazują wysoką wydajność inwazji komórkowej, co pozwala na ocenę inwazji komórek gospodarza. Można wykorzystać oczyszczony fluorescencyjny dysk białkowy, rybosomy lub znakowany dysk rekombinowany. Fragmenty inkubuje się z wybranymi komórkami biorczymi.Następnie dodaje się błękit Trian, aby wygasić fluorescencję zewnątrzkomórkową, a inwazję wizualizuje się za pomocą mikroskopii konfokalnej. Do tej pory agregacja białek nie była uznawana za cechę przewlekłych chorób psychicznych, takich jak schizofrenia. W przypadku zaburzeń w schizofrenii, gdzie jednym z kandydatów jest określone białko, inwazyjność komórkowa agregatów białkowych stanowi charakterystyczną cechę chorób konformacyjnych białek.W niniejszej pracy wykazujemy za pomocą dwóch metod, że agregaty białka disc one są inwazyjne dla komórek, a co za tym idzie, że zaburzenia związane z disc one lub neuropatie disc one są zaburzeniami konformacyjnymi białek. Dwie zastosowane metody to po pierwsze oczyszczanie pełnowymiarowego białka disc one ASOS z linii komórkowych neuroblastomy, a po drugie ekspresja C-terminalnego multimerycznego fragmentu białka disc one w e coli, a następnie jego oczyszczanie i znakowanie barwnikiem fluorescencyjnym.Podczas gdy pierwsza metoda prowadzi jedynie do niskiej wydajności inwazji komórkowej, w której tylko około 0,3% komórek pobiera oczyszczone mikrosomy, czysty fragment białka rekombinowanego infekuje do 20% wystawionych komórek. Opisane tutaj metody powinny być możliwe do przeniesienia na inne białka, w przypadku których przekonująco wykazano formowanie akrosomu lub montaż multimeryczny. W każdej z szalek o średnicy 10 cm.Wysiej 1,5 × 10⁶ komórek neuroblastoma człowieka oraz komórek LF w uzupełnionej pożywce RPMI 1640 i inkubuj przez noc. Następnego dnia komórki powinny osiągnąć 70–80% konfluencji. Oznacz pięć naczyń do transfekcji plazmidem PC DNA 3.1 MRFP oraz ludzkim pełnowymiarowym DISC1 z etykietą EGFP i pięć naczyń do transfekcji samym plazmidem EGFP. Dla każdego naczynia o średnicy 10 cm połącz 15 µg DNA plazmidowego, 30 µl Metfectiny oraz 750 µl.Opti MEM w probówce do mikrowirówki wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie w celu transfekcji komórek, dodać kroplami do komórek roztwór odczynnika do transfekcji DNA i inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO 2. 48 godzin po transfekcji monitorowano ekspresję pełnowymiarowego mRFP disc 1 i potwierdzono tworzenie się aggresomów pod mikroskopem fluorescencyjnym. Niektóre komórki zawierają masywne inkluzje białek fluorescencyjnych, jak pokazano tutaj.Niniejszy protokół łączy metodę oczyszczania ciał Lewy z tkanki mózgowej z protokołem izolacji większych agregatów lub stref agro; ponieważ istniejące metody opierają się na zastosowaniu detergentów, izolacja białek wolnych od detergentów jest kluczowa dla zastosowań w testach inwazyjności komórkowej. Następnie należy odessać medium, przemyć PBS i dodać 400 µL PBS zawierającego koktajl inhibitorów proteaz. Następnie należy zebrać komórki za pomocą skrobaka i przenieść 1 mL zawiesiny komórkowej oraz 10 kulek ceramicznych do probówki do lizy o pojemności 2 mL.Przeprowadź lizę komórek, stosując trzy impulsy w homogenizatorze pre-cell lyse 24. Siła mechaniczna tego procesu może podnieść temperaturę próbki powyżej 37 °C, dlatego należy zadbać o chłodzenie próbki w lodzie. Po procedurze lizy i schłodzeniu komórek w lodzie, dodaj 10 mM chlorku magnezu oraz 40 j./ml DNAazy i inkubuj przez 60 minut w temperaturze 37 °C przy jednoczesnym wytrząsaniu.Przygotuj po 10 ml roztworów sacharozy w PBS o stężeniach 80%, 50% i 20% (masowych w objętości). Następnie w stożkowej probówce o pojemności 15 ml przygotuj gradient sacharozy, zaczynając od dwóch ml 80% sacharozy, a następnie dodając dwa ml 50% i dwa ml 20% sacharozy. Wlewaj gradient powoli, uważając, aby nie zmieszać już naniesionych warstw.Następnie nanieś strawiony lizat na wierzch gradientu i wiruj przez 15 minut przy 1000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zatrzymaniu wirowania ostrożnie pobierz pipetą interfejs między warstwą 50 a 80% sacharozy, przenieś do 15 ml stożkowej probówki i wymieszaj z pięciokrotnością objętości buforu, a następnie wiruj przez 15 minut przy 1000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie usuń nadsącz i zachowaj osad zawierający strefę agregacji.Powtórz płukanie jeszcze dwa razy w tym interfejsie. Strefy Agri są fluorescencyjne i można je zwizualizować pod mikroskopem w świetle UV po ostatnim płukaniu; odlej nadsącz i resuspenduj osad w 250 do 500 µL PBS. Osad ten zawiera oczyszczone strefy agro.Do każdej studzienki płytki 24-dołkowej zawierającej ludzkie komórki neuroblastoma SH-SY5Y, konstytutywnie wykazujące ekspresję rozpuszczalnego GFP-disc1 C-końca na sterylnych szkiełkach podstawkowych, dodać 10 µL zawiesiny MRFP-disc1-some. Inkubować przez 48 do 72 godzin. Po inkubacji komórki przemyć trzy razy PBS i wygasić fluorescencję zewnątrzkomórkową za pomocą 0,04% trypan błękitu przez pięć minut.Następnie przemyć próbkę roztworem PBS, aby usunąć błękit trypanowy. Następnie umieścić szalkę na lodzie i dodać 4% PFA oraz PBS na 10 minut w celu utrwalenia komórek. Potem przemyć raz sterylną wodą i zamontować szkiełka nakrywkowe na szkiełkach przedmiotowych, używając medium montażowego Prolong Gold z DPI.Potwierdź pobieranie w procesie inwazji egzogennych agregosomów poprzez kolokalizację z rekrutowanymi białkami ekspresjonowanymi przez komórki biorcy w obrazach Z-stack. Ten Z-stack obejmuje głębokość około 6 µm.24 obrazy wykonane w odstępach 200 nanometrów. Fluorescencja strefy agri białka mRFP disc one, pokazana na czerwono, rekrutuje cytozolowy terminalny dysk GFPC. Jeden fragment pokazany na zielono wykazuje kolokalizację w postaci koloru żółtego, co wskazuje, że strefy agri wniknęły do cytozolu biorcy i zrekrutowały wcześniej rozpuszczalne białko disc one.W tej części protokołu ludzki disc one zostanie znakowany DITE 5 94. Pozwala to na bezpośrednie monitorowanie białka rekombinowanego bez konieczności stosowania dodatkowego barwienia immunologicznego. Należy rozpocząć od usunięcia β-merkaptoetanolu z białka przygotowanego zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie poprzez trzykrotną dializę w dwóch litrach PBS przy rozcieńczeniu 1:2000.Następnie w jednej probówce z etykietą „1 mg” rozpuścić 1 mg/mL białka w PBS i dodać 5 mM TCEP, aby odzyskać wolne grupy SH. Do mieszaniny reakcyjnej dodać 20 µL barwnika rozpuszczonego w DMF i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Korzystając z kasety do dializy SLI o progu odcięcia masy cząsteczkowej 10 000 Da, dializować białko trzykrotnie w PBS w stosunku 1:2000 przez dwie godziny podczas każdego etapu, aby dalej zwiększyć czystość znakowanego białka.Przeprowadza się oczyszczanie powinowactwa z wykorzystaniem znacznika histydynowego na kolumnie Ni-NTA. Jeden mililitr matrycy Ni-NTA przemywa się 10 mililitrami PBS, a następnie nanosi na kolumnę dializowane białko z etykietą i pozwala mu spłynąć przez złoże.Roztwór będzie powoli tracić część niebieskiego zabarwienia w wyniku wiązania białka z macierzą NTA; niezwiązany wolny barwnik pozostanie w frakcji przepływowej. Po wprowadzeniu roztworu białka do kolumny, należy przemyć ją trzykrotnie 20 ml PBS. Aby eluować białko, należy dodać do kolumny 2 ml PBS zawierającego 500 mM imidazolu.Ustaw zawór na niską prędkość i eluuj kroplowo, monitorując kolorowy prążek na kolumnie Ni-NTA. Eluowana kolorowa frakcja zawiera znakowane białko rekombinowane. Przenieś eluat do kasety dializacyjnej typu SLI i przeprowadź dializę eluatu trzykrotnie przeciwko 10 mM NAPI przy rozcieńczeniu 1:2000, przez dwie godziny każdorazowo w 2 litrach. Po dializie przepuść eluat przez sterylny filtr strzykawkowy 0,45 µm, a następnie podziel go na pięć próbek po 100 µL i zamroź gwałtownie w ciekłym azocie.Całkowita ilość białka powinna wynosić od 0,5 do 1 µg/mL w każdej 100 µL alikwocie. Aby ocenić inwazyjność białka, należy dodać do każdej studni płytki 24-dołkowej zawierającej biorcze ludzkie komórki neuroblastoma SH SY 5Y podłoże zawierające od 5 do 10 µg/mL znakowanego rekombinowanego białka disc one. Komórki stale eksponujące rozpuszczalny znacznik GFP na C-końcu disc one na sterylnych szkiełkach podstawkowych należy inkubować przez 48 do 72 godzin.Wygaszamy fluorescencję zewnątrzkomórkową, utrwalamy i montujemy komórki w taki sam sposób, jak w przypadku komórek traktowanych strefą agri, a następnie potwierdzamy inwazję egzogennie zastosowanego białka rekombinowanego za pomocą obrazowania Z-stack. Gdy znakowane białko zostanie pobrane, jest ono wykrywane w obrębie obrysu komórek biorców na obrazach generowanych przez mikroskopię konfokalną. Ten Z-stack obejmuje głębokość około 5 µm przy 24 krokach co 220 nm.Tutaj rekombinowany fragment białka disc1 od aminokwasu 598 do 785, zaznaczony na czerwono, jest pobierany przez komórki biorcy wykazujące ekspresję rozpuszczalnego białka disc1 z tagiem GFP na C-końcu, zaznaczonego na zielono, w celu określenia inwazyjności agregatów białka disc1. Akrozomy składające się z pełnowymiarowego białka disc1 z tagiem mRFP zostały oczyszczone z komórek NLF i naniesione na komórki biorcy SH-SY5Y, zgodnie z opisem w tym materiale, jak pokazano tutaj. Akrozom disc1 z tagiem mRFP zainwadował ludzką komórkę neuroblastoma SH-SY5Y wykazującą ekspresję rozpuszczalnego białka disc1 z tagiem GFP na C-końcu.Ponadto, asome białka disc one znakowane MRFP było w stanie rekrutować rozpuszczalne białko disc one znakowane GFP do nierozpuszczalnych agregatów. Aby określić inwazyjność, rekombinowane białko disc one znakowane DIA light zastosowano do komórek neuroblastoma SH SY five Y wykazujących ekspresję rozpuszczalnego białka GFP disc one, jak pokazano tutaj. Rekombinowane białko disc one malters, zaznaczone na czerwono, wniknęło do komórki biorcy; żółte kropki wskazują rekrutację rozpuszczalnego białka disc one z końcem C-terminalnym znakowanego GFP do agregatów. Rekombinowane białko disc one, wyekspresowane i oczyszczone z E. coli, wykazało również inwazyjność komórkową w stosunku do neuronów in vivo, gdy białko multimeryczne zostało wstrzyknięte stereotaktycznie do przyśrodkowej kory przedczołowej szczura. Obrazowanie Z-stack potwierdza obecność rekombinowanego białka disc one w neuronach kory szczura, barwionych przeciwciałem przeciwko jądrom neuronalnym.Przedstawiliśmy właśnie dwie metody generowania agregatów białka disc one do badania inwazji komórkowej. Stosując dowolną z tych metod, możemy badać efekty komórkowe związane z pobieraniem agregatów disc one, eliminując potencjalnie zakłócające zmienne wynikające z ekspresji genów rekombinowanych poprzez transfekcję obcego DNA. Techniki te mogą zostać zastosowane do badania biologicznych efektów patologii białka disc one in vitro w komórkach oraz in vivo poprzez inokulację wewnątrzczaszkową lub inne formy podania w modelach zwierzęcych.Jesteśmy przekonani, że techniki te mogą zostać przeniesione na inne agregaty białkowe, po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji w protokole dostosowanym do każdego konkretnego białka. Przeprowadzając tę procedurę, należy poświęcić wystarczająco dużo czasu na rzetelną analizę obrazów z mikroskopii konfokalnej.

generation-purification-characterization-cell-invasive-disc1-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Generowanie, oczyszczanie i charakterystyka inwazyjnych na komórki gatunków białka DISC1

Modele inwazji komórek nowotworowych do trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej lepiej odzwierciedlają sytuację in vivo niż dwuwymiarowe testy motylości. Dzięki zastosowaniu testów inwazji do macierzy w połączeniu z obrazowaniem konfokalnym komórek znakowanych fluorescencyjnie można uzyskać szczegółowe informacje na temat trybów inwazji oraz odrębnego wkładu komórek prowadzących i podążających.

Modelowanie i obrazowanie trójwymiarowej zbiorowej inwazji komórek

Naczynia krwionośne w ludzkich mięśniach szkieletowych zawierają kilka wieloliniowych populacji prekursorów, które są idealne do zastosowań regeneracyjnych. Ta metoda izolacji pozwala na jednoczesne oczyszczanie trzech multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych odpowiednio z trzech warstw strukturalnych naczyń krwionośnych: miogennych komórek śródbłonka z błony wewnętrznej, perycytów z pożywki i komórek przybyszowych z przydanki.

Izolacja multipotencjalnych prekursorów pochodzących z naczyń krwionośnych z ludzkich mięśni szkieletowych

Ten artykuł zawiera szczegółowe metodologie wykorzystania testów trójwymiarowych (3D) do ilościowego określenia inwazji komórek raka piersi. W szczególności omawiamy procedury wymagane do skonfigurowania, takie jak testy, kwantyfikacja i analiza danych, a także metody badania utraty integralności błony, która ma miejsce podczas inwazji komórek.

Kwantyfikacja inwazyjności komórek raka piersi za pomocą modelu trójwymiarowego (3D)

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda izolacji i analizy metodą cytometrii przepływowej komórek jednojądrzastych krwi obwodowej naciekającej glejak, która dostarcza zależnych od czasu danych ilościowych na temat liczby i statusu aktywacji komórek odpornościowych wchodzących do wczesnego mikrośrodowiska guza mózgu.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa jednojądrzastych komórek krwi obwodowej naciekających glejaka

Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) pozwala nowotworom stać się inwazyjnymi. W celu zbadania EMT opisano model in vitro oparty na neuronalnych komórkach macierzystych (NSC) pozbawiony surowicy i enzymów. Ten ustandaryzowany system umożliwia ilościową i jakościową ocenę migracji komórek, ekspresji genów i białek. Model nadaje się do odkrywania leków.

Wolny od enzymów i surowicy model hodowli nerwowych komórek macierzystych do badań EMT, odpowiedni do odkrywania leków

Urazom wątroby towarzyszy ekspansja komórek progenitorowych, które reprezentują niejednorodną populację komórek. Nowatorska klasyfikacja tego przedziału komórkowego pozwala na rozróżnienie wielu podzbiorów. Opisana tutaj metoda ilustruje analizę cytometrii przepływowej i izolację różnych podzbiorów o wysokiej czystości, które można wykorzystać do dalszych testów.

Izolacja i wzbogacenie podzbiorów progenitorów wątroby zidentyfikowanych za pomocą nowej kombinacji markerów powierzchniowych

Procesy rządzące inwazją raka pęcherza moczowego stanowią okazję do rozwoju biomarkerów i terapii. Poniżej przedstawiamy model inwazji raka pęcherza moczowego, który obejmuje hodowlę 3D sferoid guza, obrazowanie poklatkowe i mikroskopię konfokalną. Technika ta jest przydatna do definiowania cech procesu inwazyjnego oraz do badań przesiewowych środków terapeutycznych.

System hodowli komórkowych 3D do badania inwazji i oceny terapii w raku pęcherza moczowego

Dictyostelium discoideum to popularny organizm modelowy do badania złożonych procesów komórkowych, takich jak migracja komórek, endocytoza i rozwój. Użyteczność organizmu zależy od wykonalności manipulacji genetycznej. W tym miejscu przedstawiamy metody transfekcji komórek Dictyostelium discoideum, które przezwyciężają istniejące ograniczenia hodowli komórek w płynnych pożywkach.

Inżynieria genetyczna komórek Dictyostelium discoideum oparta na selekcji i wzroście bakterii

Ten artykuł przedstawia protokół izolacji błony plazmatycznej na małą skalę w celu scharakteryzowania białka Cdr1 Candida albicans ABC (ATP-binding cassette), którego nadekspresja występuje w Saccharomyces cerevisiae. Podwójny znacznik c-końcowy mGFPHis z rozszczepialnym proteazą z łącznikiem 16 reszt między Cdr1 a znacznikiem został zaprojektowany w celu ułatwienia oczyszczania i przesiewania detergentem Cdr1.

Preparat błony plazmatycznej na małą skalę do analizy Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Opisujemy podejście do wykrywania i przechwytywania inwazyjnych subpopulacji komórek w czasie rzeczywistym. Projekt eksperymentalny wykorzystuje analizę komórkową w czasie rzeczywistym poprzez monitorowanie zmian impedancji elektrycznej komórek. Można wychwycić inwazyjne komórki nowotworowe, immunologiczne, śródbłonkowe lub zrębowe w złożonych tkankach i ocenić wpływ kokultur.

Wykrywanie i wychwytywanie w czasie rzeczywistym inwazyjnych subpopulacji komórek z kokultur

Poznaj metody wytwarzania i oczyszczania agregatów białka DISC1 oraz ich inwazyjność komórkową. Techniki te umożliwiają badanie mechanizmów zaburzeń konformacyjnych białek w kontekście chorób psychicznych.

Generowanie, oczyszczanie i charakterystyka inwazyjnych komórkowo form białka DISC1

Przeglądaj więcej filmów