Name: Regularna pielęgnacja i konserwacja laboratorium danio pręgowanego (Danio rerio): wprowadzenie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Poznaj kompleksowe metody hodowli Danio rerio, obejmujące konserwację systemu, karmienie, rozmnażanie i wychów larw. Ten protokół wspiera badaczy w utrzymaniu zdrowych kolonii ryb do badań genetycznych i farmakologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Tammy Esmaili za pomoc w zarządzaniu materiałami eksploatacyjnymi do laboratorium. AA jest stypendystą doktoratu w Centre of Excellence for Alzheimer's Disease Research and Care, School of Medical Sciences na Edith Cowan University. MC otrzymuje wsparcie finansowe na studia doktoranckie z Rotary Club w Perth. AM, GV, KT oraz RNM są finansowani przez McCusker Alzheimer's Research foundation.

1. Konserwacja systemu
<ol>
 <li>Danio pręgowane są utrzymywane w systemie cyrkulacyjnym, który stale filtruje i napowietrza wodę w systemie, aby zachować jakość wody niezbędną dla zdrowego środowiska wodnego. System cyrkulacyjny pomaga również filtrować nadmiar pokarmu i odchody ryb. Różne firmy oferują systemy dla danio pręgowanych, lecz w naszym laboratorium korzystamy z systemów firmy Aquatic Habitats, USA. Temperatura w pomieszczeniu lub w zbiornikach jest zazwyczaj utrzymywana w zakresie 26-28.5 °C, a warunki oświetleniowe wynoszą 14:10 h (światło: ciemność). System dla danio pręgowanych od Aquatic Habitats (np. system nablatowy) kosztuje ok. 9 000 USD. Ten system nablatowy z dwiema półkami może pomieścić na każdej półce sześć zbiorników o pojemności 10 litrów, dwanaście zbiorników o pojemności 3 litrów lub dwadzieścia zbiorników o pojemności 1.5 litra. W tym samym systemie mogą być również utrzymywane wiele linii ryb (np. transgeniczne, mutanty, typ dziki).</li>
 <li>W systemie stosowany jest zestaw różnych rodzajów filtrów. W naszym systemie woda ze wszystkich zbiorników przechodzi przez wkład filtrujący 120 µm, filtr kanistrowy 50 µm, filtr biologiczny, filtr absorpcyjny z węglem aktywnym oraz filtr do dezynfekcji UV, zanim zostanie ponownie wpompowana do zbiornika. W systemie dla danio pręgowanych stosuje się wodę odchlorowaną/odstaną. Wodę można odchlorować poprzez odstawienie jej na co najmniej 48 h. W idealnych warunkach woda powinna być przechowywana w zbiorniku z pompą cyrkulacyjną, aby utrzymać jej ciepłotę i przyspieszyć proces odchlorowania.</li>
 <li>Wartość pH wody w systemie należy sprawdzać codziennie i utrzymywać w zakresie od 6.8 do 7.5. W razie potrzeby do podniesienia pH należy użyć wodorowęglanu sodu.</li>
 <li>Zbiorniki z rybami należy regularnie czyścić. Aby wyczyścić zbiornik, należy zamknąć dopływ wody do tego zbiornika, spuścić nadmiar wody poprzez przechylenie zbiornika do tyłu i ostrożnie wyjąć go z systemu. Brud i narosty glonów będą widoczne na dnie i ściankach zbiornika.</li>
 <li>Należy umieścić przegrodę w czystym zbiorniku i napełnić go wodą odchlorowaną (zwaną wodą systemową). Ryby należy ostrożnie przenieść do tego zbiornika za pomocą siatki. Następnie należy zamknąć pokrywę i przenieść etykietę z nazwą zbiornika. Czysty zbiornik należy ostrożnie umieścić w systemie i włączyć dopływ wody.</li>
 <li>Aby zdekontaminować siatkę, należy spryskać ją 70% etanolem, wypłukać wodą i pozostawić do wyschnięcia przed ponownym użyciem. Należy wyjąć przegrodę z brudnego zbiornika i spryskać obie części 70% etanolem. Następnie należy je dokładnie wypłukać wodą z kranu i pozwolić zbiornikowi oraz przegrodzie całkowicie wyschnąć przed ponownym użyciem.</li>
 <li>Filtry w systemie cyrkulacyjnym muszą być regularnie sprawdzane i wymieniane, aby zapewnić ich prawidłowe działanie. Filtry te należy wymieniać systematycznie, aby zapewnić odpowiednią i czystą dostawę wody do wszystkich zbiorników z rybami.</li>
 <li>Wkład filtrujący 120 µm jest zazwyczaj codziennie przepozycjonowany lub wymieniany; należy go przesuwać zgodnie z kierunkiem przepływu wody, aby wykorzystać go w pełni przed wymianą na nowy.</li>
 <li>Filtr kanistrowy należy wymieniać co tydzień. Aby wymienić filtr kanistrowy, należy wyjąć moduł filtra, obracając go przeciwnie do ruchu wskazówek zegara za pomocą klucza lub dłoni. Pod spodem należy położyć arkusz plastiku lub ręcznik, aby zapobiec lub wchłonąć wyciek wody. Należy zastąpić filtr kanistrowy nowym i zamontować moduł filtra z powrotem w systemie, ostrożnie dokręcając go dłońmi, a w razie potrzeby kluczem.</li>
 <li>Filtr węglowy należy wymieniać co dwa tygodnie. Aby wymienić filtr węglowy, należy ostrożnie wykręcić moduł filtra węglowego kluczem. Zużyty węgiel aktywny należy usunąć i zastąpić nowym węglem aktywnym. Należy ponownie zamontować uchwyt węglowy i umieścić go w module filtra. Moduł filtra należy zamontować z powrotem w systemie. Należy włączyć system i sprawdzić, czy woda przepływa do filtra. W razie potrzeby należy przepłukać rury wodą, aby usunąć z nich zanieczyszczenia przed zamontowaniem filtra w systemie.</li>
 <li>Filtr biologiczny należy czyścić co sześć miesięcy. Filtr biologiczny znajduje się zazwyczaj między filtrem kanistrowym a węglowym w systemie cyrkulacyjnym. Aby wymienić filtr biologiczny, należy wyjąć moduł filtra z systemu. Należy zwolnić ciśnienie z filtra, naciskając przycisk spustowy. Filtr należy odkręcić kluczem. Na tym etapie zazwyczaj potrzebne są dwie osoby. Należy zdjąć pokrywę modułu filtra. Zawartość filtra należy opróżnić do naczynia z sitem, aby oddzielić siporax od wody. Uwaga: Siporax to materiał do biofiltracji o drobnych porach, który posiada zdolność do przeprowadzania zarówno nitryfikacji, jak i denitryfikacji.</li>
 <li>Jeśli siporax jest bardzo brudny, należy go wymienić na nowy. Moduł filtra należy napełnić wodą systemową (wodą odchlorowaną), zamknąć pokrywę, zwrócić moduł filtra do systemu i włączyć dopływ wody. 
 Uwaga: W aklimatyzowanym akwarium siporax będzie siedliskiem dla wielu bakterii nitryfikacyjnych. Mikroorganizmy te są kluczowe dla utrzymania cyklu azotowego w akwarium, a usunięcie głównego nośnika filtra biologicznego (brudnego siporaxu) może doprowadzić do gwałtownego wzrostu poziomu amoniaku, a następnie azotynów, podczas gdy nowy filtr biologiczny (z nowym siporaxem) będzie się ponownie zasiedlać. Oba te stany pośrednie cyklu azotowego mogą być toksyczne dla organizmów wodnych i mogą zabić danio pręgowane, jeśli nie zostaną odpowiednio zniwelowane. Dlatego ważne jest posiadanie wtórnego filtra biologicznego w innym miejscu systemu utrzymania danio pręgowanych (np. w zbiorniku zbiorczym w systemie Aquatic Habitats), aby umożliwić szybką repopulację tych ważnych mikroorganizmów na nowym siporaxie.</li>
 <li>Filtry UV są stosowane do kontrolowania biologicznych zanieczyszczeń systemu (takich jak bakterie) i powinny być wymieniane co dziewięć-dziesięć miesięcy. Należy zauważyć, że dawka dezynfekcyjna filtra UV wynosi ~110 mJ/cm2 na początku życia lampy, a dawka ta zmniejsza się z upływem czasu, dlatego konieczna jest wymiana żarówki, nawet jeśli wydaje się ona nadal funkcjonalna.</li>
</ol>
2. Karmienie
<ol>
 <li>Danio pręgowane mogą być karmione pokarmem suchym (rozmiar pokarmu od 100 µm dla larw do 300/400 µm dla dorosłych ryb) lub pokarmem żywym (solniczkami). Jaja solniczek (Artemia sp.) są dostępne w lokalnych sklepach zoologicznych i mogą być wylęgane w laboratorium zgodnie z prostymi krokami opisanymi poniżej. 
 <ol class="lalpha">
 <li> Rozpuścić czerwoną sól morską w odstanej wodzie, umieszczając zlewkę z solą na mieszadle magnetycznym w celu lepszego rozpuszczenia. Alternatywnie sól można rozpuścić w wodzie poprzez napowietrzanie rurką napowietrzającą. Jeśli czerwona sól morska jest niedostępna, jako roztwór do wylęgu można zastosować sól Instant Ocean. Solniczki tolerują szeroki zakres zasolenia; jednak nasze solniczki (10-15 g) wylęgamy w wodzie z czerwonej soli morskiej o stężeniu 30-35 g/L. Uwaga: W przypadku braku łatwo dostępnych jaj solniczek w lokalnych sklepach zoologicznych można użyć solniczków kapsułkowanych po ich uprzednim „odkapsułkowaniu” partiami przed dodaniem do inkubatora. Może to również pozwolić uniknąć częstych wizyt w sklepie zoologicznym.</li>
 <li> Napełnić inkubator solniczek wodą zasoloną i dodać jaja solniczek w stężeniu 1,2 łyżki stołowej/litr. Intensywnie napowietrzać inkubator za pomocą pompy powietrznej i pozostawić jaja solniczek do wylęgu na ok. 48 hr. 
 Uwaga: Należy zauważyć, że niewzbogacone solniczki tracą wartość odżywczą z każdą godziną po wylęgu. Dlatego w celu uzyskania maksymalnej wartości odżywczej z solniczek może być odpowiednie wylęganie przez 24 hr lub wzbogacanie przez 48 hr.</li>
 <li> Woda odpadowa z systemu wylęgu jest dodawana do odpadów z kwarantanny, aby zostać zdezynfekowana wybielaczem i później zutylizowana. </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Aby zebrać solniczki, należy odłączyć rurkę powietrzną i pozwolić kulturze opaść przez 4-5 min, ale nie dłużej niż 10 min. Wylęgłe solniczki gromadzą się na dnie inkubatora.
 <ol class="lalpha">
 <li> Zebrać solniczki za pomocą kranu na dnie inkubatora. Odrzucić początkowy przepływ, który składa się z niewylęgłych jaj solniczek. </li>
 <li> Po odrzuceniu niewylęgłych solniczek, zebrać wylęgłe solniczki, które posłużą jako pokarm dla danio pręgowanych. </li>
 <li> Oddzielić solniczki od słonej wody, używając sieci do zbierania solniczek (nylonowa siatka o oczkach ok. 350 µm). Wypłukać solniczki z sieci do pojemnika, używając wody systemowej. </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Zebrane solniczki występują zazwyczaj w wysokim stężeniu na dnie pojemnika, co nadaje mu pomarańczowy kolor. </li>
 <li>Podawać solniczki danio pręgowanym za pomocą pipety lub zakraplacza/butelki wyciskanej. Ilość podawanego pokarmu zależy od liczebności populacji w poszczególnych zbiornikach. Powszechnie przyjęta dawka dla danio pręgowanych to 4% masy ciała w pokarmie na dobę. Nie należy przekarmiać danio pręgowanych, ponieważ może to zwiększyć poziom azotanów w wodzie, co potencjalnie wpływa na ich rozród lub żywotność, a niektóre ryby mogą paść w wyniku przejedzenia.
 <ol class="lalpha">
 <li>Po wstrzyknięciu pokarmu do wody, głodne ryby podpływają, aby schwytać solniczki. </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Karmienie suchym pokarmem może być wykonywane przy użyciu prostego dozownika pokarmu dla ryb na sprężynę firmy Aquatic Eco-System/Aquatic Habitats. Alternatywnie, karmienie suche można przeprowadzić za pomocą zwykłej łyżeczki lub przecinając plastikowy zakraplacz przekątnie nożyczkami, aby nadać mu kształt małej łyżeczki. </li>
</ol>
3. Rozmnażanie
<ol>
 <li>Danio prążkowane rozpoczynają tarło wraz z pojawieniem się światła. Zapłodnione jaja można pozyskać albo poprzez tarło w zbiorniku, albo poprzez dobieranie par. Choć tarło w zbiorniku jest bardziej wydajne pod względem pracy i jest stosowane do regularnego zbierania embrionów w naszym laboratorium, dobieranie par jest preferowane w przypadku konieczności przesiewania genów lub mutacji u poszczególnych ryb. </li>
 <li>W przypadku tarła w zbiorniku, należy złożyć urządzenie do tarła i powoli opuścić je do akwarium po pojawieniu się światła. Alternatywnie, zestaw do tarła można pozostawić w akwarium na noc. </li>
 <li>Urządzenie do tarła pozostawia się przez około 15 min, aby umożliwić rybom kopulację, przed wyjęciem urządzenia ze zbiornika i zebraniem jaj. </li>
 <li>Dobieranie par zazwyczaj przygotowuje się późnym popołudniem, po karmieniu.</li>
 <li>Złożyć zbiornik do tarła i napełnić go odstaną wodą systemową. </li>
 <li>Przenieść jedną samicę i jednego samca na przeciwległe strony zbiornika do tarła. Samice można odróżnić od samców po większym brzuchu. Samce można również odróżnić od samic tym, że są szczuplejsze i mają ciemniejszy kolor. Ponadto samce wykazują silniejsze żółte zabarwienie płetwy odbytowej w porównaniu do samic (patrz Rysunek 1). W razie wątpliwości należy szukać znadmienia u samic danio prążkowanych (patrz Rysunek 4).</li>
 <li>Usunąć przegrodę następnego ranka, krótko po pojawieniu się światła. Pozwolić na niezakłóconą kopulację przez 20 min lub do momentu, aż na dnie zbiornika zostanie złożona wystarczająca liczba embrionów. </li>
 <li>Po tarle ryby należy zwrócić do ich zbiorników. Jaja zbiera się za pomocą sitka. </li>
 <li>Embriony należy dokładnie wypłukać wodą systemową. </li>
 <li>Przenieść embriony do szalki Petriego, płucząc sitko pożywką do embrionów, znaną jako EM3 (NaCl, 13.7 mM; KCl, 0.54 mM; MgSO4, 1.0 mM; CaCl2, 1.3 mM; Na2HPO4, 0.025 mM; KH2PO4, 0.044 mM; NaHCO3, 4.2 mM). </li>
 <li>Embriony można obserwować pod mikroskopem. Następnie jaja zapłodnione oddziela się od niezapłodnionych za pomocą igły i pipety (patrz Rysunek 3). </li>
</ol>
4. Hodowla larw
<ol>
 <li>Zapłodnione jaja utrzymuje się w inkubatorze (~28.5 °C) przez 72 hr aż do wyklucia się larw.</li>
 <li>Gdy larwy opuszczą chorion i zaczną swobodnie pływać, są gotowe do przeniesienia do głównego zbiornika z rybami. Larwy wymagają karmienia od 5 dni po zapłodnieniu (dpf) i są utrzymywane w medium embrionalnym (skład opisany w części 3, 10) lub wodzie systemowej. Larwy można trzymać w okrągłych naczyniach, wymieniając codziennie ~50% lub więcej zawartej w nich wody. Wymiana wody powinna obejmować usuwanie martwych lub chorych larw oraz wszelkich innych zanieczyszczeń.</li>
 <li>Przenieś delikatnie larwy do zbiornika zawierającego niewielki sitkowy filtr (o rozmiarze około 300-400 µm). Martwe i chore larwy należy usuwać, a codziennie powoli dolewać kilka mililitrów wody.</li>
 <li>Po 14 dniach zbiorniki z larwami można umieścić w systemie i zasilić niewielkim strumieniem wody cyrkulującej (1-2 krople na sekundę). Wraz ze wzrostem larw można zwiększać przepływ wody. W zależności od wielkości larw można stosować filtry o różnych rozmiarach oczek (np. 300-400, 500, 700-750 i 1000 µm), a dla dorosłych ryb należy stosować standardowy plastikowy filtr.</li>
 <li>Rozwój embrionów do stadium płciowo dojrzałych osobników trwa zazwyczaj 3 miesiące.</li>
</ol>

<ol><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+color+preference+in+zebrafish+for+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of color preference in zebrafish for learning and memory.</a> J. Alzheimers Dis. 28, 459-469 (2012).</li>
<li>Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+behaviour+and+ecology+of+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Rev.+Camb.+Philos.+Soc%22%5BJournal%5D)">The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio.</a> Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 83, 13-34 (2008).</li>
<li>Best, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-associative+learning+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Non-associative learning in larval zebrafish.</a> Neuropsychopharmacology. 33, 1206-1215 (2008).</li>
<li>Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modulation+of+memory+formation+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15468-15473 (2011).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebra+fish%3A+an+uncharted+behavior+genetic+model%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Genet%22%5BJournal%5D)">Zebra fish: an uncharted behavior genetic model.</a> Behav. Genet. 33, 461-468 (2003).</li>
<li>Eddins, D., Petro, A., Williams, P., Cerutti, D. T., Levin, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+effects+on+learning+in+zebrafish%3A+the+role+of+dopaminergic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Nicotine effects on learning in zebrafish: the role of dopaminergic systems.</a> Psychopharmacology. (Berl). 202, 103-109 (2009).</li>
<li>Colwill, R. M., Raymond, M. P., Ferreira, L., Escudero, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+discrimination+learning+in+zebrafish+%28Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Processes%22%5BJournal%5D)">Visual discrimination learning in zebrafish (Danio rerio.</a> Behav. Processes. 70, 19-31 (2005).</li>
<li>Blaser, R. E., Chadwick, L., McGinnis, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+measures+of+anxiety+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio).</a> Behav. Brain Res. 208, 56-62 (2010).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%22%5BJournal%5D)">A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> THE ZEBRAFISH BOOK. , 5th, University of Oregon Press. Eugene. (2007).</li>
<li>Delaney, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+interaction+and+distribution+of+female+zebrafish+%28Danio+rerio%29+in+a+large+aquarium%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Social interaction and distribution of female zebrafish (Danio rerio) in a large aquarium.</a> Biol. Bull. 203, 240-241 (2002).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Danio pręgowany pochodzi z rzeki Ganges w północnych Indiach i staje się popularnym obiektem badań zarówno w stadium dorosłym, jak i larwalnym2, co omówiono w przeglądzie Spence et al.3. Danio pręgowany posiada szereg zalet w porównaniu z innymi modelami zwierzęcymi, takich jak wysoka płodność, łatwość utrzymania, przejrzystość optyczna embrionów, szybki rozwój embrionalny oraz niskie koszty utrzymania. Są one podatne na manipulacje genetyczne6 i odpowiednie do wysokoprzepustowego screeningu leków4,5. Zapłodnienie u tych ryb odbywa się zewnętrznie, co jest korzystne z punktu widzenia biologów rozwoju. Ze względu na te sprzyjające cechy, danio pręgowany zyskuje na popularności w badaniach genetycznych7, farmakologicznych8 i behawioralnych9,10. Utrzymanie zaplecza dla danio pręgowanego oraz hodowla w celu pozyskania embrionów wiążą się z wieloma wyzwaniami. W niniejszej pracy opisujemy nasze doświadczenia i zalecenia w rozwiązywaniu tych problemów oraz przedstawiamy protokół konserwacji systemu, karmienia, rozrodu i hodowli larw.
Konserwacja systemu
Aby utrzymać rybki danio w dobrym stanie zdrowotnym, ważne jest zapewnienie im czystego środowiska w prawidłowo funkcjonującym systemie akwariowym. Istotną częścią tych działań jest regularna wymiana filtrów systemowych, aby wszystkie zbiorniki otrzymywały odpowiedni przepływ i czystą wodę. Niezbędne jest uniknięcie awarii obiegu wody do każdego zbiornika spowodowanej zablokowaniem rur systemowych. W przypadku wystąpienia zatoru rury można wyczyścić, stosując wyższe niż zwykle ciśnienie i przepływ wody. Idealnie około 10% wody w systemie powinno być wymieniane codziennie w celu utrzymania dobrej jakości wody. Alternatywnie wodę można wymieniać podczas wymiany filtra kubełkowego lub filtra węglowego. Zapewnia to usunięcie zanieczyszczeń osadzonych w rurach łączących te filtry. Jakość wody należy sprawdzać regularnie. Parametry takie jak zasadowość, pH, temperatura, twardość, zawartość amoniaku, tlen rozpuszczony, zasolenie i przewodność powinny być traktowane jako istotne czynniki odzwierciedlające jakość wody w systemie (szczegóły w Tabeli 2). Przynajmniej poziom azotanów, pH i temperatura powinny być monitorowane regularnie, aby zapewnić dobrą jakość wody do hodowli rybek danio. Idealne poziomy azotanów (NO3-) wynoszą &lt;50 mg/L11; w przypadku wysokich wartości poziomy te można obniżyć, zastępując wodę w obiegu świeżą wodą systemową. Czasami filtry nie przylegają szczelnie i przeciekają, dlatego zaleca się sprawdzenie szczelności po każdej wymianie filtra. Jeśli przepływ wody z głównego zbiornika zostanie zablokowany po wymianie pompy wodnej lub wymianie filtra, przepływ można przywrócić, poluzowując lub wyjmując filtr na kilka sekund, aby rozproszyć podciśnienie powstające w rurach. Czas wymagany na wymianę filtrów może się różnić w zależności od wielu czynników, takich jak całkowite obciążenie biologiczne systemu, czystość innych filtrów oraz ilość zanieczyszczeń osadzonych w rurach. W związku z tym filtry należy wymienić natychmiast, jeśli wydają się brudne lub jeśli wszystkie zbiorniki nie otrzymują prawidłowej dostawy wody. Zaleca się również, aby siatkę do ryb czyścić 70% etanolem, płukać w wodzie w celu dekontaminacji i pozostawić do wyschnięcia przed ponownym użyciem. Suszenie zapewnia odparowanie etanolu, który w przeciwnym razie jest toksyczny dla ryb.
Większość systemów dla danio pręgowanych wykorzystuje odchlorowaną wodę z kranu, jednak niektóre systemy wykorzystują wodę dejonizowaną. Ważne jest, aby utrzymywać przewodność wody w systemie w przedziale od 300 do ~1,500 μS, ponieważ zmniejsza to nakład energii potrzebny rybom do utrzymania równowagi soli w organizmie. W związku z tym danio pręgowanych nie można utrzymywać w wodzie dejonizowanej, chyba że dodano do niej sole w celu utrzymania optymalnego poziomu przewodności. W przypadku stosowania wody z kranu istnieje ryzyko wystąpienia wysokich stężeń miedzi w wodzie systemowej, ponieważ filtr węglowy nie usuwa miedzi. Dlatego użytkownicy powinni kontrolować stężenia miedzi i w miarę możliwości unikać stosowania miedzianych rur.
Karmienie
Danio pręgowanych nie należy przekarmiać, ponieważ może to zwiększyć poziom azotanów w wodzie, co potencjalnie wpływa na ich rozród11 lub żywotność, gdyż niektóre ryby mogą zginąć z powodu przejedzenia. Zaleca się podawanie podczas jednego karmienia takiej ilości pokarmu, jaką grupa ryb w zbiorniku jest w stanie spożyć w ciągu 10 min. Bardzo ważne jest usunięcie soli z artemii przed podaniem ich danio pręgowanym, ponieważ nadmierne stężenie soli prowadzi do śmierci. Jeśli wymagana jest większa liczba ikry, ryby można karmić trzy razy dziennie. Codzienne czyszczenie zbiorników z ryb hodowlanych zwiększa również poziom produkcji ikry.
Podczas karmienia ryb w systemach siedlisk wodnych zazwyczaj wyłączamy pompę wody i pompę powietrza na 10 min, aby umożliwić rybom zjedzenie pokarmu. Zmniejsza to ilość pokarmu wypłukiwanego do filtrów. Użytkownicy muszą jednak pamiętać o ponownym włączeniu tych pomp po zakończeniu karmienia.
Hodowla
Danio pręgowane zazwyczaj znajdują się w optymalnej kondycji rozrodczej między 3. a 18. miesiącem życia. Rozrodu par nie należy przeprowadzać przez dwa kolejne dni11; jednak rozród w zbiorniku może być wykonywany codziennie, ponieważ zbiornik może pomieścić wiele ryb, co zmniejsza prawdopodobieństwo rozrodu tej samej pary przez dwa dni z rzędu. Rozród powinien być przeprowadzany w regularnych odstępach czasu, nawet jeśli jaja nie są potrzebne. Proces ten zapewni utrzymanie cyklu rozrodczego ryb. W układzie rozrodczym zaleca się stosowanie większej liczby samic niż samców. Samce danio pręgowanych zmieniają partnerki każdego dnia12, co dodatkowo uzasadnia tę rekomendację. Co więcej, w naszym laboratorium początkowo wystąpiły problemy z rozmnażaniem, jednak zastosowanie większej liczby samic niż samców w układzie rozrodczym pomogło rozwiązać ten problem. Ponadto produkcję jaj dodatkowo poprawiło: karmienie dietą o wysokiej zawartości białka oraz artemią dwa-trzy razy dziennie, mieszanie ryb z różnych zbiorników (od różnych rodziców), utrzymywanie temperatury w układzie rozrodczym między 27 a 28 °C oraz delikatny masaż brzuchów samic z zablokowanymi jajowodami. Zalecamy prowadzenie rejestru linii/pochodzenia ryb, aby uniknąć chowu wsobnego między rodzeństwem. Pozwala to na dalszą poprawę produkcji embrionów. Zaleca się również prowadzenie ewidencji liczby embrionów złożonych przez ryby z każdego zbiornika. Pomaga to w monitorowaniu zbiorników z najlepszymi rybami hodowlanymi oraz w podejmowaniu działań mających na celu poprawę rozrodu u ryb, które nie składają jaj.
Hodowla larw
Karmienie larw należy rozpocząć od 5 dpf (dni po zapłodnieniu). Młode larwy można karmić pokarmem suchym o rozmiarze ~100 mikronów (np. ZM100) lub pokarmem żywym, takim jak paramecja i wrotki (co stymuluje wzrost). Rozmiar pokarmu można stopniowo zwiększać do 200 mikronów (np. ZM200) lub 300/400 mikronów (np. ZM300). Populacja dorosłych ryb powinna wynosić około 6-7 ryb na litr wody. Praktyka ta jest zalecana w celu lepszego utrzymania BZT (biochemicznego zapotrzebowania na tlen) w zbiornikach.

<table><tbody><tr><td>System cyrkulacyjny dla danio-ostrobramowych</td><td>Aquatic Habitats, USA</td><td>samodzielne, niskoprofilowe systemy AHAB</td><td></td></tr><tr><td>Węglan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Dozownik karmy dla ryb/Podajnik karmy suchej</td><td>Aquatic Habitats, USA</td><td>AH19</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop </td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Pokarm suchy </td><td>Karmidła dla ryb ZM, UK</td><td>ZM100, ZM200, ZM300</td><td></td></tr><tr><td>Jaja solankowca</td><td>Salt Creek, Inc., USA</td><td>Klasa Premium</td><td></td></tr><tr><td>Hodowle w zbiornikach</td><td>Aquatic Habitats, USA</td><td>ITSTS-A</td><td></td></tr><tr><td>Węgiel aktywny</td><td>Penn-Plax Pro-crab, USA</td><td>PBC3MF</td><td></td></tr><tr><td>Zbiorniki do rozmnażania</td><td>Aquatic Habitats, USA</td><td>SBTANK (1L)&lt;br/&gt; Zbiornik dla osobników hodowlanych 2 (2 l)</td><td></td></tr><tr><td>Sól morska Red Sea</td><td>Sól morska Red Sea, USA</td><td>Lokalny sklep zoologiczny/&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.redseafish.com&quot; Niniejszy protokół opisuje regularną pielęgnację i konserwację laboratorium rybek danio (zebrafish). Rybki danio zyskują obecnie popularność w badaniach genetycznych, farmakologicznych i behawioralnych. Jako kręgowce, rybki danio wykazują znaczne podobieństwo sekwencji genetycznych do ludzi i są wykorzystywane jako model zwierzęcy w badaniach nad różnymi schorzeniami ludzkimi. Przewagą rybek danio w porównaniu z innymi popularnymi modelami kręgowców jest wysoka płodność, niskie koszty utrzymania, przezroczyste zarodki oraz szybki rozwój. W związku ze wzrostem zainteresowania badaniami nad rybkami danio rośnie zapotrzebowanie na tworzenie i utrzymywanie wydajnych zapleć dla tych zwierząt. Mimo dostępności literatury dotyczącej prowadzenia laboratorium rybek danio, brakuje zwięzłego protokołu w formie wideo. Film ten przedstawia protokół regularnego utrzymania, karmienia, rozmnażania i hodowli larw rybek danio. Proces ten pomoże badaczom zrozumieć naturalne zachowanie i optymalne warunki hodowli rybek danio, a tym samym rozwiązywać problemy eksperymentalne wynikające z warunków utrzymania ryb. Protokół ten będzie niezwykle pomocny dla badaczy planujących założenie laboratorium rybek danio, a także dla studentów studiów wyższych zamierzających wykorzystać rybki danio jako model zwierzęcy.&quot;_puste&quot;&gt;www.redseafish.com&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Filtry (zewnętrzne, wkłady filtracyjne i UV) </td><td>Aquatic Habitats, USA</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.aquatichabitats.com&quot; Niniejszy protokół opisuje bieżącą opiekę i konserwację laboratorium rybek danio. Rybki danio zyskują obecnie na popularności w badaniach genetycznych, farmakologicznych i behawioralnych. Jako kręgowce, rybki danio wykazują znaczne podobieństwo sekwencji genetycznych do ludzi i są wykorzystywane jako model zwierzęcy w badaniach nad różnymi jednostkami chorobowymi człowieka. Zalety rybek danio w porównaniu z innymi powszechnymi modelami kręgowców obejmują wysoką płodność, niskie koszty utrzymania, przezroczyste zarodki oraz szybki rozwój. W związku ze wzrostem zainteresowania badaniami nad rybkami danio rośnie również zapotrzebowanie na tworzenie i utrzymanie wydajnych zaplecz do ich hodowli. Mimo dostępności literatury dotyczącej prowadzenia laboratorium rybek danio, brakuje zwięzłego protokołu w formie wideo. Niniejszy materiał wideo przedstawia protokół regularnego utrzymania, karmienia, rozmnażania i hodowli larw rybek danio. Proces ten pomoże badaczom zrozumieć naturalne zachowania i optymalne warunki hodowli rybek danio, a tym samym rozwiązywać problemy eksperymentalne wynikające z warunków utrzymania ryb. Protokół ten będzie ogromną pomocą dla badaczy planujących utworzenie laboratorium rybek danio, a także dla studentów studiów magisterskich i doktoranckich zamierzających wykorzystać rybki danio jako model zwierzęcy.&quot;_blank&quot;&gt;aquatichabitats.com&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże Siporax</td><td>Aquatic Habitats, USA</td><td>BF 820</td><td></td></tr><tr><td>Siatka do solnych krewetek </td><td>Aquatic Habitats, USA</td><td>BSN 1</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do wylęgu solankowców</td><td>Aquatic Habitats, USA</td><td>BS252</td><td></td></tr><tr><td>Przegrody</td><td>Aquatic Habitats, USA</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.aquatichabitats.com&quot; Niniejszy protokół opisuje regularną opiekę i konserwację laboratorium rybek danio (zebrafish). Rybki danio zyskują obecnie na popularności w badaniach genetycznych, farmakologicznych i behawioralnych. Jako kręgowce, rybki danio wykazują znaczną zgodność sekwencji genetycznych z ludźmi i są wykorzystywane jako model zwierzęcy w badaniach nad różnymi schorzeniami ludzkimi. Przewagą rybek danio w porównaniu z innymi powszechnymi modelami kręgowców jest wysoka płodność, niskie koszty utrzymania, przezroczyste zarodki oraz szybki rozwój. W związku z gwałtownym wzrostem zainteresowania badaniami nad tym gatunkiem rośnie zapotrzebowanie na tworzenie i utrzymywanie wydajnych zapleczy hodowlanych. Mimo dostępności literatury dotyczącej prowadzenia laboratorium rybek danio, brakuje zwięzłego protokołu w formie wideo. Niniejszy materiał wideo ilustruje protokół regularnego utrzymania, karmienia, rozrodu oraz hodowli larw rybek danio. Proces ten pomoże badaczom zrozumieć naturalne zachowanie oraz optymalne warunki hodowli rybek danio, a tym samym rozwiązywać problemy eksperymentalne wynikające z warunków utrzymania zwierząt. Protokół ten będzie niezwykle pomocny dla badaczy planujących utworzenie laboratorium rybek danio, a także dla studentów studiów magisterskich i doktoranckich zamierzających wykorzystać rybki danio jako model zwierzęcy.&quot;Niniejszy protokół opisuje regularną opiekę i konserwację laboratorium danio pręgowanych. Danio pręgowane zyskują obecnie na popularności w badaniach genetycznych, farmakologicznych i behawioralnych. Jako kręgowce, danio pręgowane wykazują znaczne podobieństwo sekwencji genetycznych do ludzi i są wykorzystywane jako model zwierzęcy w badaniach nad różnymi jednostkami chorobowymi u ludzi. Przewagą danio pręgowanych w porównaniu z innymi popularnymi modelami kręgowców jest wysoka płodność, niskie koszty utrzymania, przezroczyste embriony oraz szybki rozwój. W związku ze wzrostem zainteresowania badaniami nad tym gatunkiem, rośnie również zapotrzebowanie na zakładanie i utrzymywanie wydajnych zapleczy do ich hodowli. Choć w literaturze dostępne są informacje na temat prowadzenia laboratorium danio pręgowanych, brakuje zwięzłego protokołu w formie wideo. Niniejszy film ilustruje protokół regularnego utrzymania, karmienia, rozrodu oraz hodowli larw danio pręgowanych. Proces ten pomoże badaczom zrozumieć naturalne zachowanie i optymalne warunki chowu tych ryb, a tym samym rozwiązywać problemy eksperymentalne wynikające z warunków ich utrzymania. Protokół ten będzie ogromną pomocą dla badaczy planujących założenie laboratorium danio pręgowanych, a także dla studentów studiów magisterskich i doktoranckich zamierzających wykorzystać ten gatunek jako model zwierzęcy.&quot;&gt;aquatichabitats.com&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;span class=&quot;Niniejszy protokół opisuje regularną opiekę i konserwację laboratorium ryb danio pręgowanych. Ryby danio pręgowane zyskują obecnie na popularności w badaniach genetycznych, farmakologicznych i behawioralnych. Jako kręgowce, ryby danio pręgowane wykazują znaczną podobieństwo sekwencji genetycznych do ludzi i są wykorzystywane jako model zwierzęcy dla różnych stanów chorobowych człowieka. Zalety ryb danio pręgowanych w porównaniu z innymi powszechnymi modelami kręgowców obejmują wysoką płodność, niskie koszty utrzymania, przezroczyste embriony oraz szybki rozwój. W związku ze wzrostem zainteresowania badaniami nad tymi rybami rośnie również zapotrzebowanie na tworzenie i utrzymywanie wydajnych zaplecz ich chowu. Mimo dostępności literatury dotyczącej prowadzenia laboratorium ryb danio pręgowanych, brakuje zwięzłego protokołu wideo. Niniejszy film ilustruje protokół regularnego utrzymania, karmienia, rozrodu i hodowli larw ryb danio pręgowanych. Proces ten pomoże badaczom zrozumieć naturalne zachowanie i optymalne warunki chowu ryb danio pręgowanych, a tym samym rozwiązywać problemy eksperymentalne wynikające z warunków ich utrzymania. Protokół ten będzie ogromną pomocą dla badaczy planujących utworzenie laboratorium ryb danio pręgowanych, a także dla studentów studiów magisterskich i doktoranckich zamierzających wykorzystać te ryby jako model zwierzęcy.&quot;&gt;&lt;strong&gt;Tabela 1. &lt;/strong&gt;Tabela specyficznych odczynników i sprzętu użytych w tym protokole.&lt;/span&gt;</td></tr></tbody></table>

regularna pielęgnacja i konserwacja laboratorium rybek danio (danio rerio): wprowadzenie

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

Niniejszy protokół opisuje regularną opiekę i konserwację laboratorium danio pręgowanych. Danio pręgowane zyskują obecnie na popularności w badaniach genetycznych, farmakologicznych i behawioralnych. Jako kręgowce, danio pręgowane wykazują znaczne podobieństwo sekwencji genetycznych do ludzi i są wykorzystywane jako model zwierzęcy dla różnych stanów chorobowych człowieka. Przewagi danio pręgowanych w porównaniu z innymi powszechnymi modelami kręgowców obejmują wysoką płodność, niskie koszty utrzymania, przezroczyste embriony oraz szybki rozwój. W związku ze wzrostem zainteresowania badaniami nad tym gatunkiem, rośnie również potrzeba tworzenia i utrzymywania wydajnych zapleczy do ich hodowli. Mimo dostępności literatury dotyczącej prowadzenia laboratorium danio pręgowanych, brakuje zwięzłego protokołu w formie wideo. Niniejszy film ilustruje protokół regularnego utrzymania, karmienia, rozrodu i hodowli larw danio pręgowanych. Proces ten pomoże badaczom zrozumieć naturalne zachowanie i optymalne warunki hodowli danio pręgowanych, a tym samym rozwiązywać problemy eksperymentalne wynikające z warunków utrzymania ryb. Protokół ten będzie niezwykle pomocny dla badaczy planujących założenie laboratorium danio pręgowanych, a także dla studentów studiów drugiego stopnia zamierzających wykorzystać danio pręgowane jako model zwierzęcy.

Utrzymanie i hodowla danio pręgowanych jest łatwiejsze i tańsze niż w przypadku tradycyjnych modeli gryzoni. W niewielnym laboratorium można zmieścić kilka tysięcy osobników danio pręgowanych. Dzięki temu protokołowi badacze będą w stanie zarządzać zapleczem hodowlanym, zapewniając danio pręgowanym zdrowe warunki bytowania. Ponadto poniższe ilustracje pomogą w identyfikacji zapłodnionych jaj, dorosłych osobników oraz ich pokarmu. Przedstawiono ilustrację samca (Rysunek 1A) oraz samicy (Rysunek 1B i 1C) danio pręgowanych, aby pomóc badaczom w rozróżnianiu płci w celach hodowlanych. Rysunek 2 przedstawia widok mikroskopowy: artemii przy powiększeniu 12X (Rysunek 2A), pojedynczej artemii przy powiększeniu 90X (Rysunek 2B) oraz niezapłodnionego jaja artemii przy powiększeniu 90X (Rysunek 2C). Pomoże to w zrozumieniu różnicy między niezapłodnionymi a zapłodnionymi artemiami w celu zapewnienia prawidłowego karmienia. Jaja zapłodnione i niezapłodnione pokazano na Rysunku 3. Rysunek 3A ilustruje mikroskopowy widok zapłodnionych i niezapłodnionych embrionów. Embriony niezapłodnione są zazwyczaj nieprzezroczyste i/lub mają pęknięte komórki wewnątrz chorionu (czarna strzałka), podczas gdy embriony zapłodnione wydają się nienaruszone i rozwijają się do kolejnego etapu podziału komórkowego (szczegółowe informacje na temat różnych stadiów embrionów danio pręgowanych znajdują się w materiale 1). Widok przy większym powiększeniu jaja zapłodnionego i niezapłodnionego pokazano odpowiednio na Rysunku 3B i 3C. Rysunek 4 ilustruje ovipozytor samicy danio pręgowanych, co ma pomóc badaczom w rozróżnieniu samca od samicy.
Do kilku krytycznych problemów, które mogą wystąpić w laboratorium rybek danio-zebry, należą: zablokowanie dopływu wody do poszczególnych lub wszystkich zbiorników w systemie hodowlanym, słaba jakość wody oraz wycieki w rurach lub zbiorniku systemu cyrkulacyjnego. Ponadto problemem może być trudność w pozyskiwaniu zarodków z hodowli. Rozwiązywanie tych problemów omówiono poniżej.
<img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig1.jpg" alt="Porównanie fenotypu danio pręgowanego; typ dziki vs mutant; badanie zmienności genetycznej; obraz 3-panelowy." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Ilustracja samca danio pręgowanego (A) oraz samicy danio pręgowanego (B, C).
<img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig2.jpg" alt="Analiza mikroskopowa organizmów wodnych; obejmuje identyfikację gatunków i badanie próbek." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Widok mikroskopowy solniczków przy powiększeniu 12X (A), pojedynczy solniczek przy powiększeniu 90X (B) oraz niezapłodnione jajo solniczka przy powiększeniu 90X (C). 
<img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig3.jpg" alt="Rozwój embrionu: obrazy mikroskopowe; stadia A-C; analiza podziału i wzrostu komórek." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Widok mikroskopowy (16X) zapłodnionych i niezapłodnionych jaj, z których tylko dwa są niezapłodnione; jaja niezapłodnione zaznaczono czarnymi strzałkami (A). Widok przy większym powiększeniu (90X) jaja zapłodnionego (B) oraz jaja niezapłodnionego (C). 
<img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig4.jpg" alt="Schemat anatomii rybki zebrafish przedstawiający wykluwacz do badań nad rozmnażaniem." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Ilustracja wykluwacza samicy rybki zebrafish (wskazanego czarną strzałką). 
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td fo:width="2in">Parametr</td>
 <td fo:width="3in">Zakres optymalny</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alkaliczność</td>
 <td>50-150 mg/L CaCO33</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH</td>
 <td>6,8-7,5 
(tolerancja 6,0-8,5)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Temperatura</td>
 <td>26-28.5 °C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Twardość</td>
 <td>50–100 mg/L CaCO₃3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amoniak niezjonizowany</td>
 <td>&lt;0,02 mg/L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Azotan (NO₃⁻)3-)</td>
 <td>&lt;50 mg/L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Azotyny (NO2-)2-)</td>
 <td>&lt;0,1 mg/L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tlen rozpuszczony</td>
 <td>&gt;6,0 mg/L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Zasolenie</td>
 <td>0,5-1 g/L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Przewodność</td>
 <td>300 -1,500 μS</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Tabela 2. Parametry jakości wody. Parametry jakości wody. Optymalny zakres parametrów środowiskowych w akwarium dla danio pręgowanego11.

Niniejszy protokół opisuje regularną konserwację i pielęgnację w celu utrzymania optymalnych warunków chowu danio pręgowanych. Film przedstawia procedurę konserwacji systemu, bieżącego utrzymania, karmienia, rozrodu oraz hodowli larw danio pręgowanych.

Regularna pielęgnacja i konserwacja laboratorium rybek danio (Danio rerio): wprowadzenie

Niniejszy protokół opisuje regularną pielęgnację i konserwację laboratorium rybek danio (zebrafish). Rybki danio zyskują obecnie popularność w genetyce, farmakologii oraz...

Niniejszy protokół opisuje regularną opiekę i konserwację laboratorium rybek danio. Ze względu na rosnące zainteresowanie badaniami nad rybkami danio, wzrasta również potrzeba tworzenia i utrzymywania placówek przeznaczonych do ich hodowli. Mimo że dostępna jest literatura dotycząca prowadzenia laboratorium rybek danio, brakuje zwięzłego protokołu w formie wideo.W tym filmie wyjaśniono zasady konserwacji systemu, karmienia, rozrodu oraz hodowli larw danio pręgowanego. Witam, jestem ABH ze School of Medical Sciences na University. Witam, jestem Manchi z Thee Institution.Dzisiaj zaprezentujemy standardową pielęgnację i konserwację laboratorium rybek danio. Rybki danio stają się popularne w badaniach genetycznych, farmakologicznych i behawioralnych. Ze względu na łatwość utrzymania i szybki rozwój, są one wysoce podatne na modulacje genetyczne i odpowiednie do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków.Niniejszy materiał przedstawia zasady hodowli danio pręgowanego dla użytkowników oraz badaczy rozważających utworzenie nowej pracowni ichtiologicznej. Przejdźmy zatem do szczegółów. Istnieje kilka firm oferujących systemy dla ryb, jednak w naszym przypadku korzystamy z systemów firmy Aquatic Habitats.W naszym laboratorium rybki danio są utrzymywane w temperaturze od 26 do 28.5 °C przy cyklu światło-ciemność wynoszącym od 14 do 10 godzin. Rybki danio są hodowane w systemie cyrkulacyjnym, który stale filtruje i napowietrza wodę w układzie. Aby utrzymać jakość wody niezbędną dla zdrowego środowiska wodnego, w naszym systemie wykorzystuje się zestaw filtrów różnych typów.Woda ze zbiorników przechodzi przez wkład filtrujący, filtr kubełkowy, filtr biologiczny, filtr z węglem aktywnym oraz filtr UV, zanim zostanie ponownie wpompowana do zbiornika. W systemie dla danio pręgowanych stosuje się wodę dechlorowaną lub odstaną. Dechlorację wody można przeprowadzić poprzez jej odstawienie na co najmniej 48 h.Codziennie sprawdzaj pH wody w systemie i utrzymuj je w zakresie od 6.8 do 7.5. Akwaria należy regularnie czyścić, używając wodorowęglanu sodu. Aby wyczyścić akwarium, zamknij dopływ wody do tego zbiornika, odlej nadmiar wody, przechylając akwarium do tyłu, a następnie ostrożnie wyjmij je z systemu.Przygotuj czysty zbiornik i napełnij go wodą systemową. Ostrożnie przenieś ryby do tego zbiornika za pomocą siatki. Zamknij pokrywę i ostrożnie przytwierdź etykietę z nazwą zbiornika.Umieść zbiornik w systemie. Włóż rurkę z powrotem do zbiornika i włącz dopływ wody. Zdezynfekuj siatkę do ryb oraz zbiornik 70% etanolem.Opłukać w wodzie i pozostawić do wyschnięcia przed ponownym użyciem. Filtry układu obiegowego należy regularnie sprawdzać i wymieniać, aby zapewnić ich prawidłowe funkcjonowanie.Wkład filtra o wielkości oczek 120 mikronów jest codziennie sprawdzany i ustawiany zgodnie z kierunkiem przepływu wody przed jego wymianą. Filtr kanistrowy należy wymieniać co tydzień. Aby wymienić filtr kanistrowy, należy go wykręcić za pomocą klucza lub ręką.Pod spodem należy umieścić plastikową folię lub ręcznik, aby zapobiec rozlaniu wody. Włóż nowy kanister oraz filtr, a następnie zamontuj jednostkę z powrotem w systemie. Dokręć ostrożnie najpierw ręką, a następnie kluczem.W razie potrzeby filtr węglowy należy wymieniać co dwa tygodnie. Aby wymienić filtr węglowy, należy go ostrożnie zdemontować. Za pomocą klucza usunąć węgiel aktywny z filtra i zastąpić go nowym węglem aktywnym.Ponownie zamontuj uchwyt węglowy i umieść go z powrotem w jednostce filtrującej. Zamontuj jednostkę filtrującą z powrotem w systemie. Włącz system i sprawdź, czy woda przepływa do filtra.Filtr biologiczny należy czyścić co sześć miesięcy. Aby wymienić filtr biologiczny, należy wyjąć go z systemu. Następnie należy zwolnić ciśnienie w filtrze, naciskając przycisk spustowy ciśnienia.Odkręć filtr i zdejmij pokrywę. Przesyp zawartość do sita, aby oddzielić Cy Oex od wody. Jeśli Cy Oex jest bardzo zanieczyszczony, należy go wymienić.Napełnij filtr nowym cy ax. Napełnij jednostkę wodą systemową. Zamknij pokrywę filtra, zamontuj ponownie jednostkę i włącz urządzenie.Filtry UV są stosowane do kontroli zanieczyszczeń biologicznych i powinny być wymieniane co dziewięć do 10 miesięcy. Danio pręgowane można karmić pokarmem suchym lub żywym, takim jak artemia; jaja artemii są dostępne w lokalnych sklepach zoologicznych i mogą być wylęgane w laboratorium zgodnie z prostymi krokami opisanymi tutaj. Rozpuścić sól morską w wodzie systemowej, aby przygotować roztwór o stężeniu od 30 do 35 g/L.Napełnij inkubator do wylęgu artemii wodą zasoloną i dodaj jaja artemii w stężeniu 1,2 łyżki stołowej na litr. Intensywnie napowietrzaj inkubator za pomocą pompy powietrznej i pozostaw jaja artemii do wylęgu na około 48 godzin. Wyjmij rurkę doprowadzającą powietrze i pozwól kulturze osiąść przez cztery do pięciu minut.Zapłodnione artemie gromadzą się na dnie inkubatora. Korzystając z kranika znajdującego się na dole inkubatora, należy spuścić pierwszą partię cieczy, która zawiera niezapłodnione jaja. Następnie należy zebrać zapłodnione artemie i oddzielić je od słonej wody.Użyj siatki do odławiania solankowców. Przepłucz solankowce do pojemnika. Przy użyciu wody systemowej solankowce gromadzą się w wysokim stężeniu na dnie pojemnika i są teraz gotowe do podania daniorkom zebra. Podaj solankowce rybom za pomocą pipety lub zakraplacza.Ilość podawanego pokarmu zależy od liczebności populacji w poszczególnych zbiornikach. Po wprowadzeniu pokarmu do wody głodne ryby pływają, aby chwytać solniczki, co jest istotne dla ich regularnej aktywności fizycznej. Karmienie suchym pokarmem można przeprowadzić za pomocą dozownika pokarmu do środowisk wodnych lub zwykłej łyżki.Danio pręgowane rozpoczynają tarło wraz z pojawieniem się światła. Ikrę można pozyskać poprzez hodowlę zbiorową lub parową. O ile hodowla zbiorowa jest bardziej wydajna pod względem nakładu pracy i stosuje się ją podczas rutynowego zbierania embrionów, o tyle hodowla parowa jest preferowana w przypadku konieczności przesiewania genów lub mutacji. Zmontuj urządzenie do tarła w akwarium i powoli zanurz je w zbiorniku.Po włączeniu światła pozostaw zestaw do rozrodu w zbiorniku przez około 15 minut, aby ryby mogły się odbyć, a następnie wyjmij zestaw ze zbiornika i zbierz ikrę. Rozród w parach przygotowuje się późnym popołudniem poprzez złożenie zbiornika do rozrodu i napełnienie go wodą systemową. Przenieś jedną samicę i jednego samca na przeciwległe strony zbiornika.Samice można odróżnić od samców po większym brzuchu. Następnego ranka należy usunąć przegrodę. Wkrótce po zapaleniu światła należy pozostawić ryby do rozrodu bez zakłóceń na 20 minut lub do momentu, aż na dnie zbiornika zostanie złożona odpowiednia liczba embrionów.Po rozrodzie należy przenieść ryby z powrotem do zbiorników. Jaja należy zebrać za pomocą sitka. Następnie należy dokładnie wypłukać embriony.Z wodą systemową. Przenieść zarodki do szalki Petriego, wypłukując sitko z medium do zarodków. Zarodki można obserwować pod mikroskopem.Zarodki niezapłodnione należy oddzielić od zapłodnionych za pomocą igły i pipety. Po oddzieleniu jaj zapłodnionych od niezapłodnionych, przechowuje się je w inkubatorze w temperaturze około 28,5 °C przez 72 godziny, aż do wyklucia się larw. W tym momencie larwy opuszczają choriony i swobodnie pływają.Larwy należy karmić od piątego dnia po zapłodnieniu i utrzymywać w wodzie stojącej przez kilka dni przed przeniesieniem ich do systemu. Ostrożnie przenieś larwy do zbiornika zawierającego sito o małej oczkowości, około 300 do 400 mikronów. Po 14 dniach zbiorniki z larwami można umieścić w systemie i zasilić niewielkim strumieniem wody w obiegu.W zależności od wielkości larw i dorosłych ryb należy stosować przegrody o różnych rozmiarach. Zazwyczaj rozwój embrionów do stadium dojrzałych płciowo osobników trwa trzy miesiące. Dziękujemy za zapoznanie się z materiałem i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.

regular-care-maintenance-zebrafish-danio-rerio-laboratory-an

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Regularna Pielęgnacja i Konserwacja Laboratorium Rybki Zebro (Danio rerio): Wprowadzenie

Wąsik szczękowy danio pręgowanego jest integumentarnym organem zmysłowym zawierającym pochodne ektodermy, mezodermy i grzebienia nerwowego. Co istotne, u osobników dorosłych wąsik ten potrafi zregenerować się po amputacji proksymalnej. Niniejszy film przedstawia rozwój wąsika szczękowego oraz prezentuje protokół chirurgiczny indukcji regeneracji, a następnie proces pobierania, zatapiania i obrazowania preparatów wąsików.

Metody badania wąsika szczękowego danio pręgowanego

Zarodek danio pręgowanego jest doskonałym modelem do badań nad biologią rozwojową. Podczas embriogenezy danio pręgowany rozwija się z masą żółtka, co stanowi trójwymiarowe wyzwanie dla obserwacji i analizy próbek. Protokół ten opisuje, w jaki sposób tworzyć dwuwymiarowe preparaty do montażu płaskiego całych próbek zarodków danio pręgowanego barwionych metodą montażu in situ (WISH).

Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca

Obiekt dla danio pręgowanego nadający się do hodowli i badań in vivo jest zbudowany w łatwy i niedrogi sposób. Konserwacja jest minimalna. To miejsce jest idealne do angażowania studentów i niezależnych badań.

Budowa niedrogiego i łatwego w budowie obiektu do połowu danio pręgowanego

Larwy danio pręgowanego są przystosowane do żywienia się zooplanktonem. Możliwe jest wykorzystanie tej naturalnej cechy w laboratorium, hodując najpierw ryby karmione razem w tym samym systemie z żywymi wrotkami słonowodnymi.  Ta strategia "polikultury" sprzyja wysokiemu wzrostowi i przetrwaniu przy minimalnym nakładzie pracy i zakłóceniach dla larw.

Kompletna i zaktualizowana "metoda polikultury wrotka" do hodowli danio pręgowanego po raz pierwszy

Ten protokół przedstawia podstawowe kroki do uzyskania wolnych od zarazków (GF) zarodków ryb i utrzymania ich od larw do stadium młodocianego, w tym pobieranie próbek i wykrywanie ich sterylnego statusu. Zastosowanie modeli GF w przypadku infekcji jest ważne dla zrozumienia roli drobnoustrojów w zdrowiu gospodarza.

Generowanie, utrzymanie i identyfikacja wolnych od zarazków modeli danio pręgowanego od larw do stadiów młodocianych

Protokół ten opisuje tanią metodę mikroskopii świetlnej do oceny morfologii i funkcji serca w embrionach danio pręgowanych, umożliwiającą powtarzalną ocenę rozwojowej kardiotoksyczności bez potrzeby stosowania zaawansowanych systemów obrazowania.

Funkcjonalne obrazowanie serca w zarodkach danio dano za pomocą standardowej mikroskopii i analizy wideo: zastosowania w badaniach środowiskowych i biomedycznych

Przedstawiamy tutaj nowy, łatwy w budowie i nisko kosztowy protokół dotyczący obiegowego hodowania rybki labiryntowej.

System do hodowania ryb cebra z recyrkulacją wody

Utrzymanie czystości optyki mikroskopu jest kluczowe dla uzyskania obrazowania wysokiej jakości. Kurz, odciski palców, nadmiar olejku imersyjnego lub medium montażowego na powierzchni lub wewnątrz mikroskopu powodują spadek kontrastu i rozdzielczości. Metoda DIC jest szczególnie wrażliwa na zanieczyszczenia i zarysowania powierzchni soczewek. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje procedurę czyszczenia mikroskopu.

Właściwa pielęgnacja i czyszczenie mikroskopu

W niniejszym opracowaniu opisujemy technikę przygotowywania i utrzymywania komór przedzielonych do hodowli neuronów sensorycznych z zwojów korzeni grzbietowych.

Przygotowanie i utrzymanie neuronów z zwojów korzeni grzbietowych w hodowlach przedzielonych

Nabłonek sensoryczny ucha wewnętrznego dorosłych danio przebraniego stanowi dobry model badawczy do zrozumienia mechanizmów regeneracji komórek rzęskowych u dorosłych kręgowców. Niniejszy protokół prezentuje precyzyjną dyssekcję nabłonków, która pozwala na pobranie próbek tkanek do badania procesów regeneracyjnych na poziomie komórkowym i subkomórkowym.

Makro- i mikrosekcja nabłonków sensorycznych ucha wewnętrznego u dorosłych danio pręgowanych (Danio rerio)

Poznaj kompleksowe metody hodowli Danio rerio, obejmujące konserwację systemu, karmienie, rozmnażanie i wychów larw. Ten protokół wspiera badaczy w utrzymaniu zdrowych kolonii ryb do badań genetycznych i farmakologicznych.

Regularna pielęgnacja i konserwacja laboratorium rybek danio (Danio rerio): wprowadzenie

Przeglądaj więcej filmów