Name: Obrazowanie inicjacji glejaka in vivo przez wypolerowane i wzmocnione okienko czaszkowe cienkoczaszkowe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Poznaj metodę obrazowania inicjacji glejaka in vivo przy użyciu wypolerowanego i wzmocnionego okienka czaszkowego cienkoczaszkowego. Technika ta umożliwia długoterminowe obserwacje rozwoju guza w żywych myszach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca jest finansowana z grantu pilotażowego The Jackson Laboratory Cancer Center oraz przez The Maine Cancer Foundation.

1. Protokół
<ol>
 <li>Mysz poddaje się anestezji ketaminą i ksylazyną w dawce 0,1 mg ketaminy i 0,01 mg ksylazyny na 1 g masy ciała. W celu zapewnienia analgezji przedoperacyjnie podaje się karprofen (0,005 mg na 1 g masy ciała).</li>
 <li>Wszystkie narzędzia chirurgiczne, w tym wiertło stomatologiczne, są sterylizowane parą w autoklawie. W przypadku przeprowadzania serii zabiegów, końcówki instrumentów chirurgicznych muszą być resterylizowane za pomocą sterylizatora koralikowego (Fine Science Tools FST 250) przed każdym kolejnym zabiegiem.</li>
 <li>Gdy mysz osiągnie chirurgiczną płaszczyznę anestezji, ocenianą na podstawie braku reakcji na uciśnięcie palca u stopy, umieszcza się ją na waciku bawełnianym, który następnie kładzie się na podgrzewanej podkładce w celu utrzymania temperatury ciała na poziomie ~37 °C. Głębokość anestezji jest często monitorowana podczas operacji.</li>
 <li>Sierść usuwa się z grzbietowej części głowy w obszarze o kształcie zbliżonym do trójkąta, ok. 3 mm za nozdrzami, rozszerzając go ku dołowi w stronę kręgów szyjnych. Na oczy nakłada się maść oftalmologiczną, aby chronić je przed odwodnieniem i podrażnieniem.</li>
 <li>Mysz ułożono w pozycji brzusznej, a skórę zdezynfekowano jodynem chirurgicznym, 70% etanolem i sterylnymi gazikami. Za pomocą precyzyjnych nożyczek usuwa się płat skóry o wymiarach 0,8 x 1,0 cm, pokrywający grzbietową stronę kości czołowych i ciemieniowych czaszki.</li>
 <li>Miejscowo na okostną oraz odsłonięte tkanki na obwodzie rany nakłada się środek przeciwbólowy, 0,5% lidokainę. Okostną usuwa się, delikatnie zeskrobując czaszkę ostrzem skalpela; ułatwi to przyleganie kleju cyjanoakrylowego do kości.</li>
 <li>Interesujący obszar kory zaznacza się markerem na czaszce. Obszar ten nie powinien znajdować się nad liniami szwów czaszkowych, aby uniknąć uszkodzenia leżących pod nimi dużych naczyń.</li>
 <li>Cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego nakłada się na brzegi rany, aby zapobiec przesiąkaniu wysięku surowiczo-krwistego, oraz na czaszkę, z wyjątkiem obszaru docelowego.</li>
 <li>W naszym protokole do uszczelniania czaszki stosowany jest utwardzany światłem cement stomatologiczny. Przed nałożeniem cementu cały odsłonięty obszar czaszki, poza miejscem przeznaczonym do pocienienia, traktuje się primerami, a następnie preparatem wiążącym z zestawu cementu stomatologicznego utwardzanego światłem. Po wyschnięciu preparatu wiążącego nanosi się cement stomatologiczny, aby pokryć czaszkę. W celu stabilizacji głowy myszy podczas kolejnych etapów operacji i obrazowania, w cemencie stomatologicznym, w pewnej odległości od obszaru do pocienienia, osadza się sterylną nakrętkę sześciokątną #00-90. Zastosowanie cementu stomatologicznego utwardzanego światłem pozwala nam przygotować czaszkę bez konieczności pośpiechu przy całym zabiegu. Po zakończeniu przygotowania cementu na czaszce, utwardza się go światłem widzialnym.</li>
 <li>Po utwardzeniu cementu stomatologicznego, uchwyt głowicy z urządzenia stereotaktycznego montuje się do nakrętki na głowie myszy za pomocą śruby #00-90.</li>
 <li>Na obszar czaszki przeznaczony do pocienienia nakłada się kroplę sterylnej soli fizjologicznej 0,9% w temperaturze pokojowej. Przy użyciu stereomikroskopu i szybkowirującego mikro-wiertła pocienia się okrągły obszar czaszki (zazwyczaj o średnicy ~4-5 mm) nad regionem zainteresowania. Wiercenie oraz aplikowanie soli fizjologicznej na wiercony obszar wykonuje się przerywanie, aby uniknąć termicznego uszkodzenia leżącej pod spodem tkanki mózgowej. Sól fizjologiczna pochłania ciepło i pomaga zmiękczyć kość.</li>
 <li>Czaszka myszy składa się z dwóch cienkich warstw kości zbitej, pomiędzy którymi znajduje się gruba warstwa kości gąbczastej. Zewnętrzna warstwa kości zbitej oraz większość kości gąbczastej są usuwane za pomocą wiertła.</li>
 <li>Po usunięciu większości kości gąbczastej, pozostałe w niej pustki są widoczne pod mikroskopem dissectingowym, co wskazuje, że wiercenie zbliża się do wewnętrznej warstwy kości zbitej. Na tym etapie grubość czaszki powinna nadal wynosić więcej niż 50 μm. Pocienianie czaszki należy kontynuować ostrożnie, aby uzyskać bardzo cienki (~20 μm) i gładki preparat.</li>
 <li>Po uzyskaniu pożądanej grubości czaszki (~20 μm), poleruje się ją najpierw za pomocą specjalnie wykonanego silikonowego wata z pastą diamentową (6-15 μm) przez około 10 min. Polerowanie pastą diamentową służy dwóm celom. Po pierwsze, dodatkowo pocienia czaszkę bez wywierania nacisku na jej cienką warstwę, unikając tym samym przypadkowego uszkodzenia tkanki mózgowej. Po drugie, stanowi wstępny etap polerowania przed użyciem drobnoziarnistego tlenku cyny do dalszego wygładzania.</li>
 <li>Po polerowaniu pastą diamentową, pocienioną czaszkę poleruje się tlenkiem cyny przez około 10 min. Po polerowaniu tlenek cyny wypłukuje się solą fizjologiczną, aż pocieniona czaszka będzie wyglądać na czystą.</li>
 <li>Na tym etapie, jeśli okno czaszkowe ma służyć do długoterminowego obrazowania in vivo, oczyszczony obszar cienkiej czaszki należy osuszyć. Nanoszona jest mała kropla przezroczystego kleju cyjanoakrylowego, aby uszczelnić okno czaszkowe. Warstwa kleju cyjanoakrylowego między pocienioną czaszką a szkiełkiem powinna być jak najcieńsza.</li>
 <li>Jeśli po stworzeniu okna czaszkowego PoRTS ma zostać wykonana iniekcja, na tym etapie używa się igły 26G do wykonania niewielkiego otworu po jednej stronie wypolerowanego okna z cienkiej czaszki. Otwór ten służy do iniekcji komórek GBM.</li>
 <li>Za pomocą wyciągacza do pipet przygotowuje się sterylną szklaną pipetę z otworem końcowym o średnicy około 50 μm. Pipeta ta zostanie użyta do iniekcji komórek GBM i zostaje zamontowana w mikromanipulatorze. Pipetę ustawia się pod kątem 30 stopni, aby miejsce iniekcji komórek GBM znajdowało się z dala od końcowego miejsca obrazowania. Końcówkę pipety usuwa się pod mikroskopem dissectingowym. Zawiesina komórek GBM jest wprowadzana do pipety od przodu poprzez zasysanie przy użyciu pompy strzykawkowej.</li>
 <li>Po napełnieniu pipety komórkami GBM, mysz zostaje ponownie umieszczona pod mikroskopem. Pipetę iniekcyjną opuszcza się w stronę niewielkiego otworu w oknie czaszkowym i ostatecznie wprowadza do mózgu przez otwór za pomocą mikromanipulatora. 1 μl zawiesiny komórek GBM wstrzykuje się do mózgu w odległości 100-200 μm od powierzchni mózgu (prędkość: 0,1 μl/min, czas trwania: 10 min).</li>
 <li>Czaszkę osusza się, nanosi małą kroplę przezroczystego kleju cyjanoakrylowego na osuszoną czaszkę, a do pocienionego i wypolerowanego obszaru przykleja się kawałek szkiełka kryjącego nr 1 o rozmiarze 3 mm. Przestrzeń między szkiełkiem a sąsiednim cementem stomatologicznym uszczelnia się klejem cyjanoakrylowym.</li>
 <li>Po operacji myszy wstrzykuje się podskórnie 1 ml ciepłej sterylnej soli fizjologicznej i zapewnia się im dodatkowe ogrzewanie w celu utrzymania temperatury ciała do czasu pełnego wybudzenia z anestezji.</li>
 <li>Do obrazowania myszy poddaje się anestezji ketaminą i ksylazyną w dawce 0,1 mg ketaminy i 0,01 mg ksylazyny na 1 g masy ciała. Myszy są unieruchamiane pod mikroskopem za pomocą specjalnej ramki stereotaktycznej. W przypadku codziennego, powtarzalnego obrazowania in vivo lepszą opcją będzie izofluran, ponieważ przy powtarzalnym stosowaniu ketaminy u myszy mogą pojawić się oznaki uzależnienia.</li>
</ol>
2. Reprezentatywne wyniki
Pomyślny zabieg chirurgiczny wszczepienia okna czaszkowego PoRTS pozwala na utrzymanie przejrzystości okna przez wiele tygodni lub miesięcy. Rysunek 1 przedstawia układ naczyniowy pod oknem czaszkowym PoRTS, wizualizowany za pomocą światła rozproszonego. Obrazy naczyń krwionośnych posłużyły jako punkty orientacyjne do lokalizacji tych samych obszarów mózgu podczas powtarzalnych badań obrazowych. Aby zwizualizować zarówno komórki śródbłonka naczyniowego, jak i komórki GBM, skrzyżowano myszy B6.Cg-Tg(Tek-cre)1Ywa/J, które znakują komórki śródbłonka naczyniowego, z myszami B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J, otrzymując myszy z komórkami śródbłonka naczyniowego znakowanymi czerwoną białkową fluorescencją tdTomato. Następnie przeprowadzono procedurę kraniotomii PoRTS u tych myszy i wstrzyknięto znakowane GFP komórki GBM do ich mózgów poprzez niewielki otwór z boku okna czaszkowego. W dalszej kolejności wykonano podłużne obrazowanie dwufotonowe in vivo u wstrzykniętych myszy. Długość fali wzbudzenia lasera ustawiono na 910 nm, co pozwoliło na wzbudzenie zarówno GFP, jak i tdTomato. Obrazowanie dwufotonowe przeprowadzono przy użyciu zbudowanego na zamówienie dwufotonowego mikroskopu skanującego z dwoma detektorami, umożliwiającymi jednoczesną detekcję fluorescencji zielonej i czerwonej. Rysunek 2 przedstawia przykład in vivo inicjacji glejaka z wstrzykniętych komórek GBM w pobliżu naczyń krwionośnych. Okno czaszkowe PoRTS jest również doskonałym wyborem do chronicznego obrazowania in vivo w trybie time-lapse. Rysunek 3 przedstawia barwienie GFAP przekrojów kory mózgowej myszy bez zabiegu PoRTS, myszy 7 dni po zabiegu PoRTS oraz myszy 7 dni po zabiegu PoRTS i wstrzyknięciu soli fizjologicznej. Z obrazów wynika, że u myszy bez zabiegu oraz u myszy po zabiegu PoRTS nie występuje gliuza, natomiast po wstrzyknięciu soli fizjologicznej w tkance mózgowej myszy obserwuje się gliozę, spowodowaną penetracją pipety i wstrzyknięciem soli fizjologicznej do mózgu. Wynik ten dowodzi, że pod oknem czaszkowym PoRTS nie dochodzi do gliozy, co stanowi niezależną walidację tezy, że opisane tutaj okno czaszkowe PoRTS nie prowadzi do gliozy typowo związanej z chronicznym oknem czaszkowym typu „open skull”. Rysunek 4 przedstawia obrazowanie o wysokiej rozdzielczości kolców dendrytycznych tej samej myszy w dniu operacji (Dzień 0) oraz 32 dni po utworzeniu okna PoRTS (Dzień 32), co dowodzi, że okno PoRTS jest również doskonałym wyborem do obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości.
<img alt="Time-lapse rozwoju naczyń krwionośnych po iniekcji, obrazy mikroskopowe pokazujące codzienny postęp przez 14 dni." src="/files/ftp_upload/4201/4201fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Wizualizacja naczyń krwionośnych pod wypolerowanym i wzmocnionym cienkim oknem czaszkowym z wykorzystaniem światła rozproszonego wstecznie. Dni oznaczają liczbę dni po zabiegu; obrazy były pobierane począwszy od dnia operacji bezpośrednio po zakończeniu iniekcji komórek GBM. Pasek skali: 0.5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig1large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinię</a>.
<img alt="Mikroskopia poklatkowa migracji komórek; obrazy fluorescencyjne dni 1-13; znaczniki czerwony/zielony." src="/files/ftp_upload/4201/4201fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Wizualizacja wstrzykniętych komórek GBM oraz naczyń krwionośnych in vivo. Do wstrzykiwania komórek GBM wykorzystano myszy niosące zarówno Tek-Cre, jak i ROSA26 CAG-tdTomato. Komórki śródbłonka naczyniowego znakowano tdTomato (czerwony), a komórki GBM znakowano GFP (zielony). Obrazy pozyskiwano począwszy od 24 hr po wstrzyknięciu komórek GBM. Wykonano łącznie 10-12 sąsiednich pól widzenia, które zestawiono obok siebie, umieszczając zidentyfikowane wstrzyknięte komórki GBM w centrum całkowitego pola, aby uzyskać końcowe obrazy. Dni oznaczają liczbę dni po operacji. Pasek skali: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig2large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię</a>.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna przekroju mózgu; modele mysie B6; po operacji, sól fizjologiczna; analiza struktury neuronalnej." src="/files/ftp_upload/4201/4201fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Gliosis nie występuje po operacji okna czaszkowego PoRTS. Panele górne: Przekrój koronalny mózgu myszy przy mniejszym powiększeniu. Panel lewy: mysz bez operacji okna czaszkowego; w tkance mózgowej nie obserwuje się aktywacji GFAP. Panel środkowy: mysz z oknem czaszkowym PoRTS wykonanym po prawej stronie mózgu; w tkance mózgowej nie obserwuje się aktywacji GFAP. Panel prawy: mysz z oknem czaszkowym PoRTS i wstrzyknięciem soli fizjologicznej po stronie okna PoRTS. Aktywacja GFAP jest widoczna po stronie okna PoRTS, ale nie po stronie nienaruszonej tkanki mózgowej. Pasek skali: 1 mm. Panel dolny: obrazy tkanek mózgowych przy większym powiększeniu w obszarach wskazanych białymi ramkami na obrazach z paneli górnych. Pasek skali: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig3large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.
<img alt="Schemat mikroskopowy pokazujący zmiany strukturalne w ciągu 32 dni; pasek skali 2 µm dla analizy." src="/files/ftp_upload/4201/4201fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości kolców dendrytycznych u myszy Thy-1 YFP. Obrazy pozyskano w dniu zabiegu PoRTS oraz 32 dni po zabiegu PoRTS. Z obrazów wynika, że większość kolców obecnych w dniu 0 jest wyraźnie widoczna 32 dni po zabiegu PoRTS. Pasek skali: 2 μm.

<ol><li>Paulino, A. C., Teh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of brain tumors.</a> N. Engl. J. Med. 352, 2350-2353 (2005).</li>
<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N. Engl. J. Med. 352, 987-996 (2005).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
<li>Cheng, L., Bao, S., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+therapeutic+implications+of+cancer+stem+cells+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Potential therapeutic implications of cancer stem cells in glioblastoma.</a> Biochem. Pharmacol. 80, 654-665 (2010).</li>
<li>Cheng, L., Ramesh, A. V., Flesken-Nikitin, A., Choi, J., Nikitin, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+cancer+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mouse models for cancer stem cell research.</a> Toxicol. Pathol. 38, 62-71 (2010).</li>
<li>Dirks, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+stem+cells%3A+the+cancer+stem+cell+hypothesis+writ+large%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Brain tumor stem cells: the cancer stem cell hypothesis writ large.</a> Mol. Oncol. 4, 420-430 (2010).</li>
<li>Ebben, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer+stem+cell+paradigm%3A+a+new+understanding+of+tumor+development+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Ther.+Targets%22%5BJournal%5D)">The cancer stem cell paradigm: a new understanding of tumor development and treatment.</a> Expert Opin. Ther. Targets. 14, 621-632 (2010).</li>
<li>Germano, I., Swiss, V., Casaccia, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+brain+tumors%2C+neural+stem+cell%2C+and+brain+tumor+cancer+cells%3A+where+is+the+link%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Primary brain tumors, neural stem cell, and brain tumor cancer cells: where is the link.</a> Neuropharmacology. 58, 903-910 (2010).</li>
<li>Park, D. M., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+glioma+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Biology of glioma cancer stem cells.</a> Mol. Cells. 28, 7-12 (2009).</li>
<li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-like+glioma+cells+promote+tumor+angiogenesis+through+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor.</a> Cancer Res. 66, 7843-7848 (2006).</li>
<li>Calabrese, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+niche+for+brain+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular niche for brain tumor stem cells.</a> Cancer Cell. 11, 69-82 (2007).</li>
<li>Barami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+neural+stem+cells+with+their+vascular+niche%3A+implications+in+the+malignant+progression+of+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Relationship of neural stem cells with their vascular niche: implications in the malignant progression of gliomas.</a> J. Clin. Neurosci. 15, 1193-1197 (2008).</li>
<li>Gilbertson, R. J., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+a+tumour%27s+bed%3A+glioblastoma+stem+cells+and+the+vascular+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Making a tumour's bed: glioblastoma stem cells and the vascular niche.</a> Nat. Rev. Cancer. 7, 733-736 (2007).</li>
<li>Cho, R. W., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Recent advances in cancer stem cells.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 18, 48-53 (2008).</li>
<li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nat. Methods. 7, 981-984 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Kluczem do sukcesu w wykonaniu okna czaszkowego metodą PoRTS jest odpowiednie ścieńczenie i polerowanie. Choć wstępne ścieńczenie może zostać wykonane szybko, należy zadbać o to, aby ścieńczenie czaszki na dużym obszarze było jednorodne. Zazwyczaj nakładamy na czaszkę cienką warstwę soli fizjologicznej, a następnie ścieńczamy czaszkę przejście po przejściu, tak aby roztwór soli fizjologicznej odparował krótko po każdym przejeździe mikrowiertła. Pozwala nam to na powolne, ale jednorodne dalsze ścieńczenie czaszki. Kluczow...

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12(1:1) z pirogronianem sodu</td><td>Thermo Sci Hyclone</td><td>SH3026101</td><td> </td></tr><tr><td>Suplement bezsurowiczy B-27 (50x)</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td> </td></tr><tr><td>Suplement GlutaMax-1</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td> </td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny i streptomycyny</td><td>Thermo Sci Hyclone</td><td>SV30010</td><td> </td></tr><tr><td>Accutase-enzymatyczne medium do odrywania komórek</td><td>eBioscience</td><td>00-4555-56</td><td> </td></tr><tr><td>Kolby T25-z zielonym nakrętką wentylacyjną</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>83.1810.502</td><td> </td></tr><tr><td>70% alkohol</td><td>JAX LAHS</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>10% miejscowy roztwór powidon-jodu</td><td>JAX LAHS</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Ketamina HCl</td><td>Butler Animal Health Supply</td><td>NDC# 11695-0550-1</td><td> </td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Akorn, Inc.</td><td>NADA# 139-236</td><td> </td></tr><tr><td>Karprofen</td><td>JAX LAHS</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Maść okulistyczna</td><td>Dechra Veterinary Products</td><td>17033-211-38</td><td> </td></tr><tr><td>0.5% Lidokaina HCl</td><td>REGENT, Inc.</td><td>NDC 0517-0625-25</td><td> </td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy</td><td>Henkel Corp</td><td>46551</td><td> </td></tr><tr><td>Sterylne wymazy</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-114</td><td> </td></tr><tr><td>Pasta diamentowa</td><td>Widget Supply</td><td>BBE60</td><td> </td></tr><tr><td>Tlenek cyny</td><td>LORTONE, Inc.</td><td>591-038</td><td> </td></tr><tr><td>Liner Bond 2V</td><td>KURARAY Medical Inc.</td><td>1921-KA</td><td> </td></tr><tr><td>Clearfil AP-X</td><td>KURARAY Medical Inc.</td><td>1721-KA</td><td> </td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna</td><td>JAX LAHS</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Szkiełko przykrywowe</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0720</td><td> </td></tr><tr><td>Nakrętka sześciokątna</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HNX-0090-C</td><td> </td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Syringepump.com</td><td>NE-1000</td><td> </td></tr><tr><td>System obrazowania dwufotonowego</td><td>Budowa własna (można zastosować dowolny system komercyjny)</td><td></td><td> </td></tr></tbody></table>

obrazowanie inicjacji glejaka in vivo poprzez wypolerowane i wzmocnione cienkie okno czaszkowe

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Glejaki są jedną z najbardziej śmiertelnych postaci nowotworów u ludzi. Do dziś najskuteczniejsza terapia glejaków – operacja, po której następuje radioterapia – oferuje pacjentom jedynie niewielkie korzyści, ponieważ większość z nich nie przeżywa więcej niż pięć lat od momentu diagnozy z powodu nawrotu nowotworu 1,2. Odkrycie nowotworowych komórek macierzystych w guzach mózgu u ludzi daje nadzieję na ogromny wpływ na opracowanie nowych strategii terapeutycznych w leczeniu glejaków 3. Nowotworowe komórki macierzyste definiuje ich zdolność zarówno do samoodnawiania, jak i do różnicowania się; uważa się, że są one jedynymi komórkami w guzie zdolnymi do inicjacji nowych nowotworów 4. Przypuszcza się, że nawrotu glejaka po radioterapii wynika z oporności komórek macierzystych glejaka (GSCs) na terapię 5-10. Wykazano, że in vivo GSCs bytują w niszy naczyniowej, która jest kluczowa dla utrzymania ich cech macierzystych 11-14. Centralnymi elementami organizacji niszy GSCs są komórki śródbłonka naczyniowego 12. Istniejące dowody sugerują, że GSCs oraz ich oddziaływanie z komórkami śródbłonka naczyniowego są istotne dla rozwoju guza, co wskazuje na GSCs i ich interakcje z komórkami śródbłonka jako ważne cele terapeutyczne w leczeniu glejaków. Obecność GSCs określa się eksperymentalnie na podstawie ich zdolności do inicjowania nowych guzów po transplantacji ortotopowej 15. Zazwyczaj osiąga się to poprzez wstrzyknięcie określonej liczby komórek GBM wyizolowanych z ludzkich guzów do mózgów myszy z ciężkim niedoborem odporności lub wstrzyknięcie mysich komórek GBM do mózgów myszy gospodarzy kongenicznych. Analizy wzrostu guza przeprowadza się po upływie czasu wystarczającego, aby GSCs spośród wstrzykniętych komórek GBM mogły doprowadzić do powstania nowych guzów – zazwyczaj po kilku tygodniach lub miesiącach. W związku z tym istniejące testy nie pozwalają na badanie istotnego procesu patologicznego, jakim jest inicjacja guza z pojedynczych GSCs in vivo. W rezultacie brakuje kluczowych informacji na temat specyficznych ról GSCs oraz ich oddziaływań z komórkami śródbłonka naczyniowego we wczesnych etapach inicjacji guza. Takie spostrzeżenia są krytyczne dla opracowania nowych strategii terapeutycznych w leczeniu glejaków i będą miały wielkie znaczenie dla zapobiegania nawrotom glejaków u pacjentów. W niniejszej pracy zaadaptowaliśmy procedurę okna czaszkowego PoRTS 16 oraz dwufotonową mikroskopię in vivo, aby umożliwić wizualizację inicjacji guza z wstrzykniętych komórek GBM w mózgu żywej myszy. Nasza technika utoruje drogę do przyszłych starań mających na celu wyjaśnienie kluczowych mechanizmów sygnalizacyjnych między GSCs a komórkami śródbłonka naczyniowego podczas inicjacji glejaka.

Łącząc zastosowanie polerowanego i wzmocnionego cienkiego okna czaszkowego (PoRTS) z wstrzykiwaniem komórek glejaka wielopostaciowego (GBM), możemy w sposób podłużny obserwować inicjację i wzrost glejaka z wstrzykniętych komórek GBM w mózgu żywej myszy.

Obrazowanie inicjacji glejaka in vivo poprzez wypolerowane i wzmocnione cienkie okno czaszkowe

Glejaki stanowią jedną z najbardziej śmiertelnych postaci nowotworów u ludzi. Do tej pory najskuteczniejsza terapia glejaków – operacja, po której następuje radioterapia – oferuje...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja wczesnych etapów inicjacji glejaka z pojedynczych wstrzykniętych komórek glejaka wielopostaciowego in vivo. Jest to realizowane poprzez uprzednie ścieńczenie obszaru czaszki myszy do grubości odpowiedniej dla celów obrazowania in vivo. Następnie ścieńczony obszar czaszki zostaje wypolerowany.Następnie komórki glejaka oznaczone GFP wstrzykuje się do mózgu myszy, a okno czaszkowe uszczelnia w celu przeprowadzenia obrazowania in vivo. Na koniec codziennie obrazuje się wstrzyknięte komórki glejaka, aby zwizualizować powstawanie glejaka z wstrzykniętych komórek in vivo. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące powstawanie glejaka in vivo po pojedynczym wstrzyknięciu komórek glejaka oraz jego relację z komórkami śródbłonka naczyniowego przy użyciu dwukolorowej dwufotonowej mikroskopii in vivo.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie rakowych komórek macierzystych, takie jak krytyczna rola interakcji między macierzystymi komórkami glejaka a naczyniowymi komórkami śródbłonka oraz inicjacja glejaka in vivo; procedura zostanie przeprowadzona pod nadzorem JAK Surgical Services i w moim laboratorium. W celu przyg

imaging-glioma-initiation-vivo-through-polished-reinforced-thin-skull

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Obrazowanie inicjacji gliomatu in vivo poprzez wypolerowane i wzmocnione okno czaszkowe o cienkiej czaszce

Dośródczaszkowa implantacja komórek GL261 u myszy C57BL/6 powoduje powstanie złośliwych glejaków, które odzwierciedlają wiele cech charakterystycznych dla ludzkiego wielopostaciowego glejakaa. Wykorzystaliśmy komórki GL261 stabilnie wykazujące ekspresję lucyferazy, co pozwoliło nam zastosować obrazowanie in vivo do śledzenia progresji guza. Przedstawiono procedurę chirurgiczną oraz trójwymiarowe obrazowanie in vivo.

Implantacja wewnątrzczaszkowa z następującym obrazowaniem bioluminescencyjnym 3D in vivo glejaków mysich

Przedstawiamy metodę tworzenia okna obrazującego w czaszce myszy, które obejmuje obszar o wielkości kilku milimetrów i pozostaje stabilne przez wiele miesięcy bez wywoływania stanu zapalnego mózgu. Metoda ta jest odpowiednia do podłużnych badań przepływu krwi, dynamiki komórkowej oraz struktury komórkowej i naczyniowej z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej.

Polerowane i wzmocnione okno z cienkiej czaszki do długoterminowego obrazowania mózgu myszy

Ten film przedstawia zabieg chirurgiczny polegający na wszczepieniu okna czaszkowego w modelu mysim w celu zapewnienia stabilnego dostępu optycznego do różnych obszarów mózgu.

Implantacja okienka obrazowania czaszki w modelu mysim: zabieg chirurgiczny polegający na wszczepieniu szkiełka nakrywkowego na bazie szkła w celu stabilnego dostępu optycznego do obszarów mózgu myszy

Prezentujemy metodę tworzenia okna korowego z cieńszą czaszką (TSCW) w modelu mysim do obrazowania in vivo OCT kory mózgowej.

Technika cienkiego okienka korowego czaszki do obrazowania w optycznej tomografii koherentnej in vivo

Opisujemy nowatorską technikę obrazowania in vivo, która łączy fluorescencyjne chimeryczne myszy z oknami wewnątrzczaszkowymi i mikroskopią 2-fotonową o wysokiej rozdzielczości. Ta platforma obrazowania wspomaga badania dynamicznych zmian w tkance mózgowej i mikrokrążeniu na poziomie pojedynczej komórki, po patologicznych urazach i jest przystosowana do oceny wewnątrzczaszkowego dostarczania i dystrybucji leków.

Nowatorska technika obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości do badania dynamicznej odpowiedzi struktur wewnątrzczaszkowych na wzrost guza i terapie

Ustaliliśmy korowy model glejaka ortotopowego u myszy do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej, który podsumowuje ograniczenia biofizyczne, które normalnie występują podczas wzrostu guza. Przewlekłe szklane okienko zastępujące czaszkę nad guzem umożliwia śledzenie postępu guza w czasie za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Ortotopowy mysi model glejaka wielopostaciowego utrzymujący fizyczne ograniczenia miąższu mózgu i nadający się do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej

Tutaj opisujemy metodę wielofotonowego obrazowania poklatkowego komórek mózgu w wysokiej rozdzielczości przed i po inwazyjnej interwencji chirurgicznej (np. biopsji) u tego samego żywego zwierzęcia. Metoda ta pozwala na badanie wpływu tych inwazyjnych zabiegów chirurgicznych na zachowanie migracyjne, inwazyjne i proliferacyjne komórek nowotworowych na poziomie pojedynczej komórki.

Podłużne obrazowanie przyżyciowe zachowania komórek guza mózgu w odpowiedzi na inwazyjną biopsję chirurgiczną

Ten protokół opisuje technikę przewlekłego wszczepiania okien czaszkowych, która może być używana do podłużnego obrazowania struktur nerwowo-glejowo-naczyniowych, interakcji i funkcji zarówno w zdrowych, jak i chorych warunkach. Służy jako alternatywa uzupełniająca dla metody obrazowania przezczaszkowego, która, choć często preferowana, ma pewne krytyczne ograniczenia.

Precyzyjne mapowanie mózgu w celu wykonywania powtarzalnych obrazowań in vivo dynamiki neuroimmunologicznej u myszy

Prezentowany tutaj jest protokół wszczepienia przewlekłego okna czaszkowego do podłużnego obrazowania komórek mózgowych u obudzonych, skrępowanych głową myszy.

Implantacja okna czaszkowego w celu powtórzenia obrazowania in vivo u obudzonych myszy

To badanie demonstruje dostarczanie powtarzających się urazowych uszkodzeń mózgu myszom i jednoczesne wszczepienie okna czaszkowego do późniejszego przyżyciowego obrazowania EGFP wyrażonego przez neuron za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Przyżyciowe obrazowanie ekspresji białek fluorescencyjnych u myszy z urazowym uszkodzeniem mózgu i okienkiem czaszkowym przy użyciu mikroskopu dwufotonowego

Prezentujemy nowatorskie podejście do dwufotonowej mikroskopii dostarczania przez nowotwór znakowanych fluorescencyjnie nanocząstek tlenku żelaza do glejaka w modelu mysim.

Dwufotonowa mikroskopia przyżyteczna glejaka w modelu mysim

Poznaj metodę obrazowania inicjacji glejaka in vivo przy użyciu wypolerowanego i wzmocnionego okienka czaszkowego cienkoczaszkowego. Technika ta umożliwia długoterminowe obserwacje rozwoju guza w żywych myszach.

Obrazowanie inicjacji glejaka in vivo poprzez wypolerowane i wzmocnione cienkie okno czaszkowe

Przeglądaj więcej filmów