Wysokoprzepustowe badania przesiewowe dla małocząsteczkowych modulatorów kanałów potasowych wewnętrznego prostownika

Ogólnym celem tej procedury jest odkrycie nowych związków, które modulują aktywność kanałów potasowych prostownika wewnętrznego. Osiąga się to poprzez pierwsze posiew indukowanych tetracykliną, HK 2 9 3 komórek, wyrażających interesujący kanał KIR w płytce 384-dołkowej. Drugim krokiem jest nałożenie na komórki fluorescencyjnego barwnika reporterowego talu o nazwie grypa w dwóch częściach.

Następnie niewłączony barwnik jest wypłukiwany z komórek i zastępowany buforem testowym zawierającym nośnik kontrolny lub badane związki. Ostatnim krokiem jest dodanie bufora stymulacyjnego do studzienek w celu zainicjowania strumienia talu. Docelowo czytnik płytek fluorescencyjnych służy do identyfikacji związków, które zmieniają ruch jonów talu przez kanał KIR. Biedny.

Główną przewagą tej metody nad istniejącymi technikami, takimi jak ręczna elektrofizjologia z użyciem zacisku krosowego, jest to, że umożliwia badaczowi wykonywanie setek eksperymentów jednocześnie i tysięcy eksperymentów dziennie. Metoda ta pozwala badaczowi na przesiewanie bibliotek tysięcy małych cząsteczek w celu odkrycia modulatorów wewnętrznych kanałów potasowych rektyfikujących Na dzień przed eksperymentem z strumieniem talu należy dysocjować komórki i określić ilościowo gęstość zawiesiny komórkowej, jak opisano w dołączonym manuskrypcie. Następnie następnego dnia należy użyć pożywki BH zawierającej 10% dializowaną płytkę FBS 20 000 komórek monoklonalnych stabilnie transfekowanych genem kanału KIR będącego przedmiotem zainteresowania w każdym dołku płytki 384-dołkowej pokrytej czystym płaszczem BD pokrytej Aminem za pomocą termo multi drop combi lub pipetera wielokanałowego, następnego dnia sprawdzić płytkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki przylegają i są równomiernie rozmieszczone na dnie studzienek.

Następnie użyj myjki do mikropłytek ELX 4 0 5, aby zastąpić pożywkę do hodowli komórkowych testem HBSS. Bufor w ilości 20 mikrolitrów na studzienkę. Następnie przygotuj grypę w roztworze ładującym 2:00 AM D, krótko odwirowując probówkę, aby rozpuścić 50 mikrogramów grypy w dwóch proszkach w 100 mikrolitrach bezwodnego DMSO.

Teraz dodaj 50 mikrolitrów roztworu F1 27 DMSO o masie 20% na objętość do barwnika. Wymieszaj je, delikatnie pipetując. Następnie dodaj 150 mikrolitrów grypy w 2:00 w nocy onic F1 27 do 35 mililitrów testu HBSS, buforuj i delikatnie wymieszaj.

Następnie dodaj 20 mikrolitrów buforu ładującego barwnik do każdej studzienki, która zawiera już 20 mikrolitrów testu HBSS. Bufor. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez około godzinę, podczas gdy komórki są ładowane barwnikiem. Przygotuj płytkę stymulacyjną talu, świeżo rozpuszczając 0,5 grama wodorowęglanu sodu w 50 mililitrach pięciokrotnego buforu stymulacyjnego talu.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów roztworu do każdej studzienki z polipropylenu 384 dołków Po załadowaniu komórek grypą o godzinie 2:00 w nocy. Umyj płytkę myjką do mikropłytek ELX 4 0 5. Następnie dodaj 20 mikrolitrów lub 40 mikrolitrów testu HBSS. Buforuj z powrotem do każdej studzienki, a płytka jest teraz gotowa do eksperymentów.

Załaduj tal i płytki komórkowe do funkcjonalnego systemu badań przesiewowych leków Hema Matsu lub równoważnego czytnika płytek do obrazowania kinetycznego ze zintegrowanymi możliwościami dozowania cieczy i użyj odpowiednich filtrów do barwników na bazie fluoresceiny, takich jak grypa oh four. Następnie ustaw pojedynczy protokół dodawania, aby dodać 10 mikrolitrów pięciu serii X Thallium do odpowiednich dołków płytki komórkowej zawierającej 40 mikrolitrów buforu testowego HBSS. Następnie rejestruj fluorescencję podstawową przy częstotliwości próbkowania jednego herca przez co najmniej 10 sekund.

Fluorescencja od studni do studni powinna być jednolita i stabilna na całej płytce po ustaleniu optymalnych warunków powlekania komórek, mycia i ładowania. W międzyczasie użyj zintegrowanego pipetera 384-kanałowego, aby dodać bufor stymulacyjny talu do każdej studzienki jednocześnie i kontynuować zapis przez co najmniej dwie minuty, tak aby szybkość i szczyt wzrostu fluorescencji wywołanego talem zostały uchwycone do analizy offline. W następnej serii eksperymentów oceń jednorodność i odtwarzalność testu, umieszczając inhibitor kontrolny w co drugiej studzience każdej kolumny i rzędu płytki 384-dołkowej i dodaj DMSO do innych studzienek jako kontrolę nośnika.

Użyj pipety wielokanałowej. Wykonać złożoną płytkę DMSO, pipetując inhibitor docelowego kanału KIR o stężeniu określonym wcześniej na 80 mikrolitrów na studzienkę i 0,1% nośniku DMSO do 384-dołkowej płytki polipropylenowej. Odbywa się to poprzez dodanie znanego inhibitora, zaczynając od studzienki A i naprzemiennie do studni B drugiej i tak dalej, aż do studni B 24.

Powtórz tę procedurę z DMSO, zaczynając w studzience, B jeden i tak dalej, aż do dołka A 24. Teraz załaduj ogniwo, płytki stymulujące związek i tal do czytnika płytek. Następnie ustaw protokół dwóch dodawania, aby dodać 20 mikrolitrów dwóch serii związków o stężeniu X do odpowiednich studzienek płytki komórkowej zawierającej 20 mikrolitrów buforu testowego HBSS.

Dodaj związki do płytki komórkowej i inkubuj je do 20 minut w temperaturze pokojowej. Rejestruj wyjściowe objawy grypy w dwóch fluorescencjach przez co najmniej 10 sekund. Następnie dodaj 10 mikrolitrów pięciu x buforu talowego do każdego dołka płytki komórkowej.

Powtórz eksperyment przez trzy kolejne dni, aby ustalić odtwarzalność wyników. Użyj strumienia talu w DMSO i komórkach traktowanych lekami, aby obliczyć wartość dla liczby pierwszej Z. Statystyczna miara zmienności między odwiertami między dwiema populacjami studni oblicza Z prime przy użyciu tego wzoru na podstawie średnich i odchyleń standardowych P i N, gdzie P jest wartością strumienia niehamowanego, a N jest wartością strumienia w pełni zahamowanego.

Test z wartościami ZPrime większymi lub równymi 0,5 w trzech oddzielnych dniach jest uważany za odpowiedni do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości. Rysunki te to tylko niektóre przykłady map posiewu komórek stosowanych w różnych typach eksperymentów. Pozycje studzienek zawierających komórki nieindukowane lub indukowane tetracykliną są oznaczone różnymi kolorami.

Rysunek ten przedstawia mapę płyty źródłowej używaną do określenia optymalnego stężenia talu do opracowania testu i badania przesiewowego związków. Gradient kolorów reprezentuje potrójne serie rozcieńczeń w zakresie od 100% do 0,002% talu, a oto reprezentatywna mapa intensywności fluorescencji z chłodnymi i gorącymi kolorami, wskazująca niskie do wysokich wartości strumienia talu. Przedstawiona tutaj mapa posiewu komórek z dopasowaniem czteroparametrowej funkcji logistycznej do talu CRC służy do określenia wartości EWG 80 wynoszącej 15% talu.

Rysunek ten przedstawia mapę płyty źródłowej używaną do określania tolerancji DMSO testu. Kolumny pierwsza i 24 zawierają tylko bufor testowy, podczas gdy gradient kolorów wskazuje podwójną serię rozcieńczeń w zakresie od 10% do 0,01% DMSO, a tutaj znajduje się reprezentatywna mapa intensywności fluorescencji z niskimi wartościami strumienia talu oznaczonymi ciemniejszym kolorem niebieskim. W tym miejscu podsumowano średnie wartości strumienia talu zarejestrowane ze studni zawierających wskazane stężenia DMSO.

Teraz ten rysunek przedstawia mapę płyty źródłowej używaną do wyznaczania krzywych stężenie-odpowiedź dla znanych inhibitorów kanału KIR. Każdy związek jest oznaczony innym kolorem i jest zwykle platerowany jako seria trzech rozcieńczeń. Reprezentatywna mapa intensywności fluorescencji jest pokazana tutaj, a rysunek ten pokazuje zależne od dawki hamowanie przepływu talu po jego opracowaniu i optymalizacji.

Test strumienia talu może być również stosowany do wykonywania różnych rutynowych testów farmakologicznych. Test strumienia talu został wcześniej przystosowany do stosowania z napięciowymi i ligowanymi kanałami potasowymi, nieselektywnymi kanałami kationowymi, a nawet transporterami potasu. Nie zapominaj, że praca z tellem może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak używanie rękawiczek i odpowiednia utylizacja odpadów.