Name: Wysokoprzepustowe badania przesiewowe dla małocząsteczkowych modulatorów kanałów potasowych wewnętrznego prostownika (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Poznaj metodę wysokoprzepustowego badania przesiewowego małocząsteczkowych modulatorów kanałów potasowych Kir przy użyciu fluorescencyjnego testu z taliem. Ta technika umożliwia szybkie odkrywanie nowych związków terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana ze środków z grantów National Institutes of Health 1R21NS073097-01 i 1R01DK082884 (J.S.D.) oraz grantu Foundation for the National Institutes PIER11VCTR.

<ol><li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129(2008).</li>
<li>Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+K%2B+channels%3A+recent+advances+and+future+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities.</a> Future Med. Chem. 2 (5), 757(2010).</li>
<li>Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tarantula+toxins+interacting+with+voltage+sensors+in+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Tarantula toxins interacting with voltage sensors in potassium channels.</a> Toxicon. 49 (2), 213(2007).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 37 (38), 13291(1998).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin%3A+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286(1999).</li>
<li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain%3A+a+Mount+Everest+in+the+making%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764(2010).</li>
<li>Weaver, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thallium-sensitive%2C+fluorescence-based+assay+for+detecting+and+characterizing+potassium+channel+modulators+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells.</a> J. Biomol. Screen. 9 (8), 671(2004).</li>
<li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094(2009).</li>
<li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1%2C+the+renal+outer+medullary+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42(2011).</li>
<li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+%28Kir%29+channels+with+preference+for+Kir2.3%2C+Kir3.x%2C+and+Kir7.1%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75(2012).</li>
<li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+of+Gi%2Fo-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213(2008).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Obróbka danych: Po zebraniu danych powszechnym krokiem w analizie jest normalizacja odpowiedzi fluorescencyjnej każdego dołka, F, do jego wartości początkowej na początku eksperymentu, F0. Jest to powszechnie określane jako „stosunek statyczny” i symbolizowane jako „F/F0". W przypadkach, gdy w F0 dominuje barwnik wskaźnikowy, operacja obliczenia stosunku statycznego w znacznym stopniu skoryguje wiele czynników, takich jak nierównomierność oświetlenia...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table><tbody><tr><td>pcDNA5/TO</td><td>Invitrogen</td><td>V1033-20</td><td>Wektor ekspresyjny indukowany tetracykliną</td></tr><tr><td>komórki T-REx-HEK293</td><td>Invitrogen</td><td>R71007</td><td>Linia komórkowa indukowalna tetracykliną</td></tr><tr><td>Odczynnik Lipofectamine LTX/Plus</td><td>Invitrogen</td><td>15338100</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>FBS</td><td>ATLANTA Biologicals</td><td>S11550</td><td>Pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td>Pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Higromycyna B</td><td>Invitrogen</td><td>10687-010</td><td>Pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Blasticydyna S</td><td>Invitrogen</td><td>R210-01</td><td>Pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td>Pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>HBSS bez jonów dwuwartościowych</td><td>Mediatech</td><td>21022CV</td><td>Przemywanie komórek</td></tr><tr><td>Trypsyna-0,25%</td><td>Mediatech</td><td>25053CI</td><td>Dysocjacja komórek</td></tr><tr><td>Tetracyklina-HCl</td><td>Sigma</td><td>T9823</td><td>Odczynnik indukujący</td></tr><tr><td>Dializowana FBS</td><td>ATLANTA Biologicals</td><td>S12650</td><td>Pożywki do wysiewu</td></tr><tr><td>FluoZin-2</td><td>Invitrogen</td><td>F24189</td><td>Barwnik fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td>Ładowanie barwnika</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>Bufor do analizy</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td>Bufor do analizy</td></tr><tr><td>NaHCO3&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td>Tl&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; bufor stymulujący</td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td>Tl&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; bufor stymulujący</td></tr><tr><td>CaSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8729;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>C3771</td><td>Tl&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; bufor stymulujący</td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td>Tl&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; bufor stymulujący</td></tr><tr><td>Siarczan talu(I)</td><td>Aldrich</td><td>204625</td><td>Tl&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; bufor stymulujący</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Tl&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; bufor stymulujący</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D4540</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Ośmiokanałowa pipeta elektroniczna</td><td>Biohit</td><td>E300</td><td>Wysiew komórek na płytki 384-dołkowe</td></tr><tr><td>płytki 384-dołkowe BD PureCoat pokryte aminami</td><td>BD Biosciences</td><td>356719</td><td>Mikropłytki analityczne</td></tr><tr><td>Certyfikowana do systemu Echo polipropylenowa mikropłytka 384-dołkowa (384PP)</td><td>Labcyte</td><td>P-05525</td><td>Złożone mikropłytki źródłowe</td></tr><tr><td>polipropylenowe mikropłytki 384-dołkowe</td><td>Greiner Bio-One</td><td>781280</td><td></td></tr><tr><td>Dozownik odczynników Multidrop Combi</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>myjka do mikropłytek ELx405</td><td>BioTek</td><td>ELx405HT</td><td>Zautomatyzowane przemywanie komórek</td></tr><tr><td>Automatyczny system dozujący Echo</td><td>Labcyte</td><td>Labcyte Echo 550</td><td></td></tr><tr><td>zautomatyzowana platforma do pipetowania Bravo</td><td>Agilent Technologies</td><td>Model standardowy</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu FDSS 6000</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td>Kinetyczny czytnik płytek obrazowych</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Tabela 1&lt;/strong&gt;Lista materiałów i odczynników.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowe badanie przesiewowe w celu poszukiwania małocząsteczkowych modulatorów potasowych kanałów prostujących do wewnątrz

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Zakłada się, że określone członowie rodziny kanałów potasowych wewnątrzprostujących (Kir) są celami terapeutycznymi w leczeniu wielu schorzeń, w tym nadciśnienia tętniczego, migotania przedsionków oraz bólu1,2. Jednak w większości przypadków postępy w rozumieniu ich potencjału terapeutycznego, a nawet podstawowych funkcji fizjologicznych, były spowolnione przez brak odpowiednich narzędzi farmakologicznych. W rzeczywistości farmakologia molekularna rodziny kanałów wewnątrzprostujących pozostaje daleko w tyle za superrodziną kanałów potasowych sterowanych napięciem (Kv) z domeną S4, dla których odkryto szereg modulatorów w postaci toksyn peptydowych o wysokiej selektywności i powinowactwie nanomolarnym3. Toksyna z jadu pszczół tertiapina oraz jej pochodne są silnymi inhibitorami kanałów Kir1.1 i Kir34,5, jednak peptydy mają ograniczone zastosowanie terapeutyczne i eksperymentalne ze względu na ich właściwości antygenowe oraz słabą biodostępność, stabilność metaboliczną i przenikanie do tkanek. Opracowanie silnych i selektywnych sond małocząsteczkowych o poprawionych właściwościach farmakologicznych będzie kluczem do pełnego zrozumienia fizjologii i potencjału terapeutycznego kanałów Kir.
Sieć Centrów Produkcji Sond Bibliotek Molekularnych (Molecular Libraries Probes Production Center Network, MLPCN), wspierana przez Common Fund Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH), stworzyła możliwości dla naukowców akademickich w celu zainicjowania kampanii odkrywania sond dla celów molekularnych i szlaków sygnalizacyjnych wymagających lepszej farmakologii6. MLPCN zapewnia badaczom dostęp do przemysłowych centrów przesiewowych oraz wsparcie w zakresie chemii medycznej i informatyki w celu opracowania sond małocząsteczkowych służących do wyjaśnienia funkcji genów i sieci genowych. Kluczowym krokiem w celu uzyskania dostępu do MLPCN jest opracowanie solidnego testu specyficznego dla danego celu lub szlaku, który nadaje się do wysokoprzepustowych przesiewów (HTS).
W niniejszej pracy opisujemy sposób opracowania fluorescencyjnego testu przepływu talu (Tl+) do badania funkcji kanałów Kir w celu wysokoprzepustowego przesiewania związków7,8,9,10. Test opiera się na przepuszczalności poru kanału K+ dla Tl+, będącego kongenerem K+. Do wykrywania transmembranowego przepływu Tl+ przez por wykorzystuje się komercyjnie dostępny fluorescencyjny barwnik reporterowy na Tl+. Istnieją co najmniej trzy komercyjnie dostępne barwniki odpowiednie do testów przepływu Tl+: BTC, FluoZin-2 oraz FluxOR7,8. Niniejszy protokół opisuje opracowanie testu z wykorzystaniem FluoZin-2. Chociaż FluoZin-2 został pierwotnie opracowany i wprowadzony na rynek jako wskaźnik cynku, wykazuje on silny i zależny od dawki wzrost emisji fluorescencji po związaniu Tl+. Rozpoczęliśmy pracę z FluoZin-2 przed wprowadzeniem na rynek FluxOR7,8 i nadal z niego korzystamy9,10. Jednak etapy opracowywania testu są zasadniczo identyczne dla wszystkich trzech barwników, a użytkownicy powinni sami określić, który z nich jest najbardziej odpowiedni dla ich konkretnych potrzeb. Omówiono również wskaźniki wydajności testu, które muszą zostać osiągnięte, aby mógł on zostać rozważony do włączenia do MLPCN. Ponieważ Tl+ łatwo przenika przez większość kanałów K+, test ten powinien być możliwy do zaadaptowania do większości celów w postaci kanałów K+.

Zastosowanie systemu ekspresji indukowalnej tetracykliną zapewnia wygodną kontrolę wewnętrzną pozwalającą odróżnić strumień Tl+ przez szlaki endogenne od strumienia przez analizowany kanał Kir. Rysunek 1 przedstawia przykłady map wysiewu komórek stosowanych w różnych typach eksperymentów. Pozycje studzienek zawierających komórki nieindukowane lub indukowane tetracykliną są oznaczone różnymi kolorami. Rysunek 2A przedstawia mapę płyty źródłowej użytej do wyznaczenia optymalnego...

Przedstawiono metody opracowania i walidacji ilościowego testu fluorescencyjnego do pomiaru aktywności kanałów potasowych prostujących do wewnątrz (Kir) w celu wysokoprzepustowego przesiewu związków.

Wysokoprzepustowe badanie przesiewowe w celu poszukiwania małocząsteczkowych modulatorów potasowych kanałów prostujących do wewnątrz

Zakłada się, że określone członkowie rodziny kanałów potasowych prostujących do wewnątrz (Kir) stanowią cele terapeutyczne w leczeniu wielu schorzeń, w tym nadciśnienia tętniczego, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest odkrycie nowych związków modulujących aktywność potasowych kanałów prostujących do wnętrza komórki. Jest to realizowane poprzez najpierw wysianie na płytkę 384-dołkową komórek HEK 293 z indukowaną tetracykliną ekspresją interesującego kanału KIR. Drugim krokiem jest załadowanie komórek fluorescencyjnym barwnikiem reporterowym talu o nazwie fluo-in-2.Następnie nieprzywiązanym barwnikiem wypłukuje się komórki, a następnie zastępuje go buforem do analizy zawierającym kontrolę nośnika lub badane związki. Ostatnim krokiem jest dodanie do studniek buforu stymulującego w celu zainicjowania przepływu talu. Na koniec wykorzystuje się czytnik płytek fluorescencyjnych do zidentyfikowania związków, które zmieniają ruch jonów talu przez kanał KIR.Słaba.Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi technikami, takimi jak ręczna elektrofizjologia patch-clamp, jest to, że umożliwia ona badaczowi przeprowadzenie setek eksperymentów jednocześnie i tysięcy eksperymentów dziennie. Metoda ta pozwala badaczowi na przesiewanie bibliotek tysięcy małych cząsteczek w celu odkrycia modulatorów wewnątrzstymulowanych kanałów potasowych. Na dzień przed eksperymentem z przepływem talu należy zdysocjować komórki i wyznaczyć gęstość zawiesiny komórkowej zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie. Następnie, używając podłoża BH zawierającego 10% dializowanego FBS, należy wysiać 20 000 monoklonalnych komórek stabilnie transfektowanych genem interesującego kanału KIR do każdej studni płytki BD pure coat Amin coated z 384 studniami, wykorzystując Thermo MultiDrop Combi lub pipetę wielokanałową. Następnego dnia należy sprawdzić płytkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki przylegają i są równomiernie rozłożone na dnie studni.Następnie użyj myjki do mikropłytek ELX 4 0 5, aby zastąpić pożywkę do hodowli komórek buforem HBSS w ilości 20 µL na dołek. Po tym kroku przygotuj roztwór ładujący flus w 2:00 AM D, krótko wirując probówkę, aby rozpuścić 50 µg proszku flus w 100 µL bezwodnego DMSO.Następnie dodaj 50 µL 20% (m/v) roztworu onic F1 27 w DMSO do barwnika. Wymieszaj je, delikatnie pipetując. Następnie dodaj 150 µL flus in 2:00 AM onic F1 27 do 35 ml buforu assay HBSS i delikatnie wymieszaj.Następnie do każdej studni zawierającej 20 µL buforu do testu HBSS należy dodać 20 µL buforu do ładowania barwnika. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez około jedną godzinę, aby umożliwić ich obarwienie. Przygotować płytkę ze stymulacją talem, rozpuszczając na świeżo 0,5 g wodorowęglanu sodu w 50 mL pięciokrotnego stężenia buforu do stymulacji talem.Następnie dodaj 50 µL roztworu do każdej studzienki polipropylowej płytki 384-studzienkowej. Po załadowaniu komórek fluroforem przez 2:00 AM, przemyj płytkę za pomocą myjki do mikropłytek ELX 4 0 5. Następnie do każdej studzienki dodaj 20 µL lub 40 µL buforu do analizy HBSS; płytka jest teraz gotowa do przeprowadzenia doświadczeń.Wprowadź płytki z talem oraz płytki z komórkami do systemu funkcjonalnego przesiewania leków Hema Matsu lub równoważnego czytnika płytek do obrazowania kinetycznego z zintegrowaną funkcją dozowania cieczy, stosując odpowiednie filtry dla barwników opartych na fluoresceinie, takich jak flu oh four. Następnie skonfiguruj protokół pojedynczego dodawania, aby dodać 10 µL serii 5X Thallium do odpowiednich dołków płytki z komórkami zawierających 40 µL buforu do analizy HBSS. Następnie zarejestruj fluorescencję bazową przy częstotliwości próbkowania 1 Hz przez co najmniej 10 sekund.Po ustaleniu optymalnych warunków siania komórek, płukania i ładowania, fluorescencja między poszczególnymi studniami powinna być jednolita i stabilna w obrębie całej płytki. W tym czasie należy użyć zintegrowanego pipetora 384-kanałowego, aby jednocześnie dodać bufor stymulujący talem do każdej studni, i kontynuować rejestrację przez co najmniej dwie minuty, aby uchwycić tempo oraz szczyt wzrostu fluorescencji indukowanego talem do późniejszej analizy offline. W następnej serii doświadczeń należy ocenić jednolitość i powtarzalność testu, siejąc inhibitor kontrolny w co drugiej studni każdego rzędu i kolumny płytki 384-dołkowej oraz dodając DMSO do pozostałych studni jako kontrolę nośnika.Użyj pipety wielokanałowej. Przygotuj płytkę z DMSO i związkiem, pipetując inhibitor docelowego kanału KIR w wcześniej określonym stężeniu w ilości 80 µL na studzienkę oraz nośnik 0,1% DMSO do polipropylenowej płytki 384-dołkowej. Procedurę tę wykonuje się poprzez dodawanie znanego inhibitora, zaczynając od studzienki A1 i naprzemiennie do studzienki B2 i tak dalej, aż do studzienki B24.Powtórz tę procedurę z DMSO, zaczynając od dołka B1 i tak dalej, aż do dołka A24. Następnie umieść płytkę z komórkami, płytkę z związkami oraz płytkę ze stymulatorem talem w czytniku płytek. Następnie skonfiguruj protokół dodawania, aby dodać 20 µL serii związków o stężeniu 2X do odpowiednich dołków płytki z komórkami zawierającej 20 µL buforu do testów HBSS.Dodaj związki do płytki z komórkami i inkubuj je przez maksymalnie 20 minut w temperaturze pokojowej. Zarejestruj bazową fluorescencję dla dwóch kanałów fluorescencyjnych przez co najmniej 10 sekund. Następnie dodaj 10 µL pięciokrotnego buforu talowego do każdej studzienki płytki z komórkami.Powtórz eksperyment w ciągu trzech kolejnych dni, aby ustalić powtarzalność wyników. Wykorzystaj strumień talu w DMSO oraz komórki traktowane lekiem do obliczenia wartości Z prime. Jako statystyczną miarę zmienności między poszczególnymi studzienkami w dwóch populacjach studzienek oblicz Z prime, korzystając z następującego wzoru opartego na średnich i odchyleniach standardowych P oraz N, gdzie P to wartość strumienia nieinhibowanego, a N to wartość strumienia całkowicie inhibowanego.Test z wartościami ZPrime większymi lub równymi 0,5 w trzy oddzielne dni jest uznawany za odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Te rysunki przedstawiają kilka przykładów map wysiewu komórek stosowanych w różnych rodzajach eksperymentów. Pozycje studzienek zawierających komórki nieindukowane lub indukowane tetracykliną są zaznaczone różnymi kolorami.Rysunek ten przedstawia mapę płyty źródłowej użytej do wyznaczenia optymalnego stężenia talu dla opracowania testu i screeningu związków. Gradient kolorów reprezentuje trzykrotny szereg rozcieńczeń w zakresie od 100% do 0,002% talu, a tutaj przedstawiona jest reprezentatywna mapa intensywności fluorescencji z kolorami od zimnych do gorących, wskazująca niskie i wysokie wartości strumienia talu. Przedstawiona tutaj mapa wysiewu komórek z dopasowaniem czteroparametrowej funkcji logistycznej do krzywej odpowiedzi koncentracyjnej (CRC) talu służy do wyznaczenia wartości EEC 80 wynoszącej 15% talu.Rysunek ten przedstawia mapę płytki źródłowej wykorzystanej do określenia tolerancji DMSO w teście. Kolumny 1 i 24 zawierają wyłącznie bufor testowy, natomiast gradient kolorów wskazuje dwukrotną serię rozcieńczeń w zakresie od 10% do 0,01% DMSO; przedstawiono tutaj reprezentatywną mapę intensywności fluorescencji, w której niskie wartości strumienia talu są oznaczone ciemniejszym odcieniem niebieskiego. Tutaj zestawiono średnie wartości strumienia talu zarejestrowane w studzienkach zawierających wskazane stężenia DMSO.Na niniejszej ilustracji przedstawiono mapę płytki źródłowej wykorzystanej do wyznaczenia krzywych zależności odpowiedzi od stężenia dla znanych inhibitorów kanału KIR. Każdy związek jest oznaczony innym kolorem i zazwyczaj nanoszony na płytkę w formie serii rozcieńczeń trzykrotnych. Przedstawiono tutaj reprezentatywną mapę intensywności fluorescencji, a rycina ta ukazuje zależne od dawki hamowanie strumienia talu przez inhibitor po jego opracowaniu i optymalizacji.Test przepływu talu może być również wykorzystywany do przeprowadzania różnych rutynowych analiz farmakologicznych. Metoda ta została wcześniej zaadoptowana do badań nad bramkowanymi napięciowo i ligandowo kanałami potasowymi, nieselektywnymi kanałami kationowymi, a nawet transporterami potasu. Należy pamiętać, że praca z talem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak stosowanie rękawiczek i odpowiednia utylizacja odpadów.

high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przesiewowe badanie wysokowydajnościowe małych cząsteczek modulujących kanały potasowe prostych prądów

Opisano procedurę przesiewową w czasie rzeczywistym służącą do identyfikacji leków oddziałujących z kanałami K+ wewnątrzstymulowanymi, bramkowanymi przez białka G (GIRK). Test wykorzystuje fluorescencyjne barwniki czułe na potencjał błonowy do pomiaru aktywności kanałów GIRK. Technika ta może być dostosowana do zastosowania w wielu liniach komórkowych.

Fluorescencyjny test przesiewowy do identyfikacji modulatorów kanałów GIRK

Techniki biosensorów optycznych mogą wykrywać zmiany w masie w pobliżu błony plazmatycznej w żywych komórkach i pozwalają śledzić reakcje komórkowe zarówno w pojedynczych komórkach, jak i populacjach komórek. Protokół ten będzie opisywał wykrywanie modulacji kanałów potasowych przez receptory sprzężone z białkiem G w nienaruszonych komórkach przy użyciu tego podejścia.

Zastosowanie bezznacznikowych biosensorów optycznych do wykrywania modulacji kanałów potasowych przez receptory sprzężone z białkiem G

Tutaj opisujemy komórkowy test genu reporterowego jako cenne narzędzie do badania bibliotek chemicznych pod kątem związków modulujących mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej wywieranej przez 3' UTR.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

Interakcja między kanałami HCN a ich podjednostką pomocniczą została zidentyfikowana jako cel terapeutyczny w dużym zaburzeniu depresyjnym. W tym artykule przedstawiono opartą na polaryzacji fluorescencyjnej metodę identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów tej interakcji białko-białko.

Metoda identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów oddziaływania białko-białko między HCN1 i TRIP8b

Badanie kanałów jonowych za pomocą heterologicznie wyrażającego systemu stało się podstawową techniką w badaniach biomedycznych. W tym manuskrypcie przedstawiamy efektywną czasowo metodę osiągania ściśle kontrolowanej ekspresji kanału jonowego poprzez przeprowadzanie transfekcji przejściowej pod kontrolą indukowalnego promotora.

Kontrolowana ekspresja kanału jonowego poprzez indukowalną transfekcję przejściową

Tutaj prezentujemy ilościowy i skalowalny protokół do przeprowadzania ukierunkowanych badań przesiewowych małych cząsteczek dla regulatorów kinaz naiwnie zaszczepionego przejścia pluripotencjalnego.

Prosta metoda identyfikacji kinaz, które regulują pluripotencję embrionalnych komórek macierzystych za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych inhibitorów

Test ATPazy sprzężony z dinukleotydem nikotynamidoadeninowym (NADH) został dostosowany do półwysokoprzepustowych badań przesiewowych małocząsteczkowych inhibitorów miozyny. Ten test kinetyczny jest przeprowadzany w 384-dołkowym formacie mikropłytki, przy całkowitej objętości reakcji wynoszącej zaledwie 20 μl na dołek. Platforma powinna mieć zastosowanie do praktycznie każdego enzymu wytwarzającego ADP.

Adaptacja półwysokoprzepustowa testu ATPazy sprzężonej z NADH do badań przesiewowych inhibitorów małocząsteczkowych

Ten protokół opisuje metodę badania elektrogenicznych białek błonowych poprzez pomiar zmian potencjału błonowego. Test ten stanowi platformę do funkcjonalnego odczytu wielu kanałów jonowych ulegających endogenicznej ekspresji w liniach komórkowych nabłonka.

Oparty na fluorescencji test potencjału błonowego do wysokoprzepustowego badania funkcjonalnego dwóch endogennych kanałów jonowych w dwóch nabłonkowych liniach komórkowych

Obecny protokół podkreśla zastosowanie techniki western blotting do badania funkcji i aktywności kotransportera neuronalnego K-Cl KCC2. Protokół opisuje badanie fosforylacji KCC2 w miejscach regulatora kinazy Thr906/1007 poprzez western blot. W tym tekście pokrótce omówiono również dodatkowe metody potwierdzania aktywności KCC2.

Badanie funkcji i aktywności neuronalnego kotransportera K-Cl KCC2 z wykorzystaniem Western Blotting

Ten protokół opisuje opartą na cytometrii przepływowej, wysokoprzepustową metodę przesiewową w celu identyfikacji małocząsteczkowych leków, które hamują aktywację integryny β2 na ludzkich neutrofilach.

Wysokoprzepustowa technika oparta na cytometrii przepływowej do badań przesiewowych leków hamujących integryny

Farmakologiczne celowanie w kanały jonowe jest obiecującym podejściem do leczenia guzów litych. Podano szczegółowe protokoły charakteryzujące funkcję kanałów jonowych w komórkach nowotworowych i oznaczające wpływ modulatorów kanałów jonowych na żywotność raka.

Badania przesiewowe kanałów jonowych w komórkach nowotworowych

Poznaj metodę wysokoprzepustowego badania przesiewowego małocząsteczkowych modulatorów kanałów potasowych Kir przy użyciu fluorescencyjnego testu z taliem. Ta technika umożliwia szybkie odkrywanie nowych związków terapeutycznych.

Wysokoprzepustowe badanie przesiewowe w celu poszukiwania małocząsteczkowych modulatorów potasowych kanałów prostujących do wewnątrz

Przeglądaj więcej filmów