Ludzkie linie komórkowe guzów neuroendokrynnych jako trójwymiarowy model do badania terapii ludzkich guzów neuroendokrynnych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest opracowanie łatwej i prostej metody wytwarzania jednolitych, trójwymiarowych steroidów neuroendokrynnych nowotworów oraz prostej metody przetwarzania osadzania HistoGel w celu zbadania histologii tych steroidów. Osiąga się to poprzez równomierne pokrycie 24-dołkowych płytek aerosami, na których wysiewane są ludzkie neuroendokrynne komórki nowotworowe w zawiesinie pojedynczej komórki. Płytka jest następnie inkubowana na wytrząsarce orbitalnej w inkubatorze przez noc z prędkością mniejszą niż 40 obr./min, a następnie przenoszona na stabilną półkę w inkubatorze.

Feroidy uformują się w trzecim lub czwartym dniu, a ich wzrost i integralność są monitorowane za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym w celu zbadania ich histologii. Sterydy 3D są osadzone w rozgrzanym HistoGel przed rutynowym przetwarzaniem parafiny uzyskuje się wyniki, które pokazują wzrost steroidów 3D guza neuroendokrynnego na podstawie obrazów wykonanych podczas mikroskopii z kontrastem fazowym. Histologia steroidu 3D jest analizowana przez h i e oraz barwienie immunohistochemiczne skrawków bloków parafinowych steroidów 3D.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącą metodą jest to, że jest prosta, łatwa, niezawodna i opłacalna. Metoda ta może ułatwić badania w dziedzinie odkrywania leków, pomagając w szybkiej identyfikacji leków terapeutycznych dla pacjentów z nowotworami neuroendokrynnymi. W ogóle, osoby nowe w tej metodzie będzie początkowo zmagać się przynajmniej do wzrostu jednolicie ukształtowane w rozmiarze sterydów 3D.

Kluczem do tego jest upewnienie się, że płytki 24-dołkowe są równomiernie pokryte agrosem, a także upewnienie się, że zawiesiny jednokomórkowe są dobrze rozproszone i dokładne. Aby zrozumieć histologię sterydów 3D, musimy przeprowadzić przetwarzanie paren i barwienie immunochemiczne. Osadzanie sterydów 3D jest kluczowym krokiem, który zostanie zademonstrowany późnym wieczorem dzisiaj Aby przygotować 1% wróżby do powlekania 24-dołkowych płytek, dodaj jeden gram aeros do 100 mililitrów wody dejonizowanej w butelce o pojemności od 250 do 500 mililitrów i autoklaw do sterylizacji aeros po sterylizacji.

Przenieś butelkę do łaźni wodnej o temperaturze 70 stopni Celsjusza na około godzinę. Aby aero ostygło do 70 stopni Celsjusza, aero musi być przez cały czas utrzymywane w sterylności. W komorze bezpieczeństwa biologicznego użyj pipety powtarzalnej, aby dozować 200 mikrolitrów aeros do każdej studzienki 2 24.

Cóż, płaskie płyty denne dla tego protokołu. Każdy rodzaj 24-dołkowych płyt z płaskim dnem będzie działał, o ile płytki można obrazować pod mikroskopem kontrastu fazowego, obracając aeros wokół studni, aby równomiernie pokryły studnię. 200 mikrolitrów aeros jest optymalne do formowania wklęsłej powierzchni, aby umożliwić sferoidom tworzenie spójnych kulistych kształtów.

Po około 10 minutach 24-dołkowe płytki pokryte aeros są gotowe do użycia. Komórki bon-one użyte w tym eksperymencie to ludzki guz neuroendokrynny trzustki lub komórki NET utrzymywane w D-M-E-M-F 12 z 10% pożywką FBS w sterylnym naczyniu do hodowli tkankowej w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Gdy jednowarstwowe wiązanie jednej komórki osiąga płynność od 70 do 80% Co, zawiesiny pojedynczych komórek są przygotowywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Usuń pożywkę i umyj komórki za pomocą PBS dwukrotnie, usuń komórki z naczynia, dodając jeden mililitr wycieczki i inkubując w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Sprawdź pod mikroskopem, czy wszystkie komórki są odłączone od naczynia, a następnie dodaj dziewięć mililitrów. Pożywka wzrostowa do trypsyny.

Komórki oka kilkakrotnie pipetują komórki w górę i w dół, aby zapewnić równomierne zawieszenie pojedynczej komórki. Użyj sitka do komórek o średnicy 70 mikronów, aby przefiltrować komórki. Zbierz przefiltrowane komórki po wykonaniu zliczania komórek, przygotuj zawiesinę 5 000 komórek na mililitr w D-M-E-M-F 12 z 10% wzrostem FBS. Średni.

Liczba komórek, które mają być płytkowane, powinna być określona empirycznie na podstawie wielkości kulek w szóstym dniu. Idealnie byłoby, gdybyś chciał mieć spirytus o rozmiarze od 300 do 400 nanomikrometrów i średnicy. Z tego powodu platerujemy tysiąc komórek na 200 mikrolitrów na studzienkę.

Aby rozpocząć tę procedurę, nałóż 200 mikrolitrów zawiesiny jednokomórkowej na każdą studzienkę pokrytą aeros wcześniej przygotowanych płytek 24-dołkowych, uszczelnij 24-dołkowe płytki sterylną taśmą sufitową, aby zapobiec parowaniu. Umieść powlekane aerodynamicznie 24-dołkowe płytki zawierające komórki bon one na wytrząsarce orbitalnej przy bardzo powolnym mieszaniu w inkubatorze nawilżanym o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla w powietrzu, inkubuj przez noc następnego ranka, przenieś płytki na stabilną platformę i utrzymuj wzrost kultur w inkubatorze. Co trzy dni.

Dodaj 200 mikrolitrów pożywki wzrostowej do każdej studzienki na płytkach. Aby uniknąć zakłócenia phe, należy przyłożyć końcówkę pipety do boku studzienki i pozwolić, aby medium spłynęło po ściance do studzienki, monitorując tworzenie się OID w 24-dołkowych płytkach pod mikroskopem. Leczenie farmakologiczne sterydami 3D rozpoczyna się w szóstym dniu hodowli.

Gdy sferoidy mają średnicę około 300 do 400 mikronów, jest to oznaczane jako dzień zerowy dla leczenia farmakologicznego w szóstym dniu. Każda studzienka na płytkach zawiera około 400 mikrolitrów pożywki, aby zapewnić, że leczenie farmakologiczne ma stężenie końcowe jeden x w każdym dołku dla każdej dawki leczniczej wykonać trzykrotnie pożądane stężenie, rozcieńczyć odpowiednią ilość leku w pięciu mililitrach pożywki wzrostowej w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów, co wystarcza na osiem powtórzeń, PHE w każdym rzędzie 24 płytek dołkowych są scharakteryzowane jako dawka nośnika 1, 2, 3, 4 i pięć. Na każdej 24-dołkowej płytce znajdują się cztery powtórzenia dla każdej dawki leku.

Zazwyczaj phe 3D są poddawane działaniu co najmniej 2 płytek 24-dołkowych, co daje co najmniej osiem powtórzeń na każdą dawkę leczenia. Przed dodaniem zabiegu do każdego z nich, dobrze odkręć płytki 24-dołkowe, aby upewnić się, że cała kondensacja na taśmie sufitowej trafia do studni ze względu na pływającą funkcję sterydu 3D. Pożywka w każdym dołku nie jest usuwana po odwirowaniu.

Aby uniknąć zakłócenia sphe, ostrożnie dodaj 200 mikrolitrów każdej dawki zabiegu do odpowiednich studzienek wzdłuż ściany każdego z nich. Dobrze uszczelnij 24-dołkowe płytki taśmą sufitową i inkubuj kultury w inkubatorze z wilgotnością 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla w powietrzu. Monitoruj hodowle steroidów 3D w każdym wybranym punkcie czasowym po leczeniu farmakologicznym za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym.

Obiektyw o powiększeniu 5x jest idealny, ponieważ PHE szybko wyprzedza pole obrazowania w przypadku obiektywu 10x. Uzyskaj obrazy sterydów w każdym dołku w każdym punkcie czasowym przed HistoGel. Osadzanie w siatce sterydy 3D są zbierane z 24 płytek dołkowych i utrwalane w 10% Formina.

Umieścić tubkę zimnego HistoGel w zlewce wypełnionej wodą. Podgrzewaj zlewkę w kuchence mikrofalowej przez jedną minutę lub do momentu, gdy żel całkowicie się upłynni. Probówkę należy przechowywać w tej samej zlewce wypełnionej wodą przez cały czas trwania zabiegu.

Za pomocą jednorazowej plastikowej pipety. Przenieś wszystkie sterydy do formy kriogenicznej do biopsji. Pozwól sterydowi usiąść na minutę, aby opaść na dno formy kriogenicznej do biopsji.

Spróbuj pozbyć się płynu z formy kriogenicznej do biopsji za pomocą chusteczek Kim. Bardzo delikatnie wepchnij steryd do środka na dole formy kriogenicznej do biopsji za pomocą wykałaczki. Następnie, używając pipety Pasteura, aby bardzo delikatnie utrzymać steryd w środku formy kriograficznej do biopsji.

Dodaj cienką warstwę podgrzanego HistoGel do formy kriogenicznej do biopsji. Nie dodawaj zbyt dużej ilości HistoGel. Tylko tyle, aby ustabilizować sterydy w centrum.

Pozwól sterydowi w HistoGel siedzieć przez jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej lub do momentu, gdy HistoGel zestali. Wypełnij pozostałą część formy kriogenicznej do biopsji podgrzanym HistoGel i pozwól mu zestalić się w temperaturze pokojowej przez około 10 minut. Tuż przed wystrzeleniem tego bloku HistoGel OIDs z formy kriogenicznej do biopsji.

Pozostaw krioformę na lodzie na minutę, a następnie wyjmij nienaruszony blok sterydowy HistoGel. Zawiń blok w kawałek bio wrappa i włóż go do kasety na chusteczki i biopsję. Przechowuj kasetę z tkankami i biopsją w pojemniku z 70% etanolem.

Następnie przeprowadza się rutynowe procedury przetwarzania tkanek w celu zatopienia parafiny, gdy są hodowane na 24-dołkowych płytkach oznaczonych kodem aerodynamicznym. Różne linie komórkowe sieci wykazują różne morfologie, jak widać tutaj. Ludzka linia komórkowa trzustki netto wiąże się raz i ludzka linia komórkowa płuc H 7 27 utworzyła sterydy 3D.

Natomiast qgp jeden. Ludzkie komórki siatki trzustki wykazują duże porowate masy przypominające winogrona, które nie są uważane za sterydy. Po zawiązaniu wysiewu, jedna komórka na 24-dołkowej płytce pokrytej agros wielokomórkowa formacja steroidów zwykle występuje w trzecim lub czwartym dniu, a steryd staje się bardziej okrągły w szóstym dniu.

Ze względu na ograniczenie składników odżywczych i tlenu. Komórki w gęstym rdzeniu sterydu zaczynają umierać około 10 dnia, a do 17 dnia, sterydy zaczynają się rozpadać. Ze względu na duży rozmiar lub w niektórych przypadkach wyrzucenie martwiczego sznura, steryd zazwyczaj może rosnąć do 1000 mikronów średnicy.

W tym eksperymencie, sterydy 3D dnia szóstego zostały wybrane jako punkt wyjścia do leczenia inhibitorem histonów trikes statyny A lub TSA. Wcześniej donoszono, że inhibitory deacetylazy histonowej wykazują działanie antyproliferacyjne i proproliferacyjne na komórki sieciowe. Obrazy te śledzą morfologię sterydów 3D na początku leczenia i po 24, 48, 72 i 96 godzinach.

V oznacza leczenie z nośnikiem, którym w tym przypadku jest DMSO. D jeden do D pięć reprezentuje leczenie z rosnącymi dawkami TSA wielkości każdej osoby. OID został oszacowany automatycznie przez specjalnie opracowany program komputerowy MATLAB.

Zmierzono co najmniej osiem sph na dawkę TSA w każdym punkcie czasowym, a wyniki są wykreślone na tym wykresie w odniesieniu do nośnika. Wszystkie dawki TSA wykazały pewien stopień zahamowania wzrostu na 3D OIDs. Przy stężeniach TSA 125 nano molowych i 250 nano molowych wzrost sterydów 3D został silnie stłumiony, aby zrozumieć histologię netto sterydów 3D.

Barwienie H i e oraz barwienie immunohistochemiczne przeprowadzono na sterydach 3D, które były hodowane przez 17 dni. KI 67 jest markerem proliferujących komórek, podczas gdy rozszczepiona kaspaza trzy jest markerem komórek apoptotycznych. Wyniki wskazują, że komórki zewnętrznej warstwy sterydu 3D aktywnie się proliferują, ale komórki w rdzeniu są głównie nekrotyczne lub apoptotyczne.

Po tej procedurze można wykonać dodatkowe testy, takie jak test blasku miana komórek, w celu określenia żywotności komórek tych steroidów 3D. Po opracowaniu technika ta może zostać rozszerzona na 96 płyt ściennych w celu wykonywania badań przesiewowych o wysokiej przepustowości, co ułatwi odkrywanie leków terapeutycznych w badaniach nad rakiem.