Linie komórkowe ludzkich guzów neuroendokrynnych jako trójwymiarowy model do badania terapii ludzkich guzów neuroendokrynnych

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest opracowanie łatwej i prostej metody wytwarzania jednolitych, trójwymiarowych sferoidów nowotworu neuroendokrynnego oraz prostej metody przetwarzania otoczkującego HistoGelu w celu badania histologii tych sferoidów. Osiąga się to poprzez równomierne pokrycie płytek 24-dołkowych aerozolem, na których wysiewa się ludzkie komórki nowotworu neuroendokrynnego w formie zawiesiny pojedynczych komórek. Następnie płytkę inkubuje się przez noc w inkubatorze na wytrząsarce orbitalnej przy prędkości poniżej 40 RPM, a następnie przenosi na stabilną półkę w inkubatorze.

Sferoidy uformują się w trzecim lub czwartym dniu, a ich wzrost i integralność są monitorowane za pomocą mikroskopii w kontraście fazowym w celu zbadania ich histologii. Trójwymiarowe sferoidy są zatapiane w ogrzanym HistoGel przed rutynowym opracowaniem w parafinie; wyniki uzyskane na podstawie obrazów wykonanych podczas mikroskopii w kontraście fazowym wykazują wzrost trójwymiarowych sferoidów guza neuroendokrynnego. Histologię sferoidów 3D analizuje się za pomocą barwienia H&E oraz barwienia immunohistochemicznego przekrojów bloków parafinowych sferoidów 3D.

Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejącej metody jest jej prostota, łatwość wykonania, niezawodność oraz efektywność kosztowa. Metoda ta może usprawnić badania w dziedzinie poszukiwania leków, pomagając w szybkim identyfikowaniu środków terapeutycznych dla pacjentów z guzami neuroendokrynnymi. Generalnie osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą początkowo mieć trudności z wyhodowaniem organoidów 3D o jednolitym kształcie i wielkości.

Kluczem do sukcesu jest zapewnienie równomiernego pokrycia płytek 24-dołkowych agarozy oraz upewnienie się, że zawiesiny pojedynczych komórek są dobrze rozproszone i mają dokładną koncentrację. Aby zrozumieć histologię steroidów 3D, konieczne jest przeprowadzenie obróbki parenchymatycznej i barwienia immunochemicznego. Osadzanie histologiczne steroidów 3D jest kluczowym krokiem, który zostanie zaprezentowany później dzisiaj. Aby przygotować 1% agarozy do pokrywania płytek 24-dołkowych, należy dodać 1 g agarozy do 100 ml wody dejonizowanej w butelce o pojemności od 250 do 500 ml i poddać autoklawowaniu w celu sterylizacji agarozy po sterylizacji.

Przenieś butelkę do kąpieli wodnej o temperaturze 70 °C na około godzinę. Aby aerozole ostygły do 70 °C, muszą być przez cały czas przechowywane w warunkach sterylnych. W komorze z laminarnym przepływem powietrza, używając pipety wielokrotnej, nanieś 200 µL aerozolu do każdego dołka płytki 2 24.

Do niniejszego protokołu należy użyć płytek z płaskim dnem. Zastosować można dowolne płytki 24-dołkowe z płaskim dnem, pod warunkiem że umożliwiają one obrazowanie pod mikroskopem fazokontrastowym. Należy zakręcić roztwór aeros w dołku, aby równomiernie pokrył on dno. Optymalna objętość 200 µL aeros pozwala na utworzenie wklęsłej powierzchni, co umożliwia sferoidom formowanie powtarzalnych, kulistych kształtów.

Po około 10 minutach płytki 24-dołkowe pokryte aerozolem są gotowe do użycia. Komórki Bon-1 wykorzystane w tym eksperymencie to ludzkie komórki guza neuroendokrynnego trzustki (NET), hodowane w pożywce D-M-E-M-F 12 z 10% FBS w sterylnej naczyniu do hodowli tkanek w inkubatorze z wilgotnością, w temperaturze 37 °C i przy 5% carbon dioxide. Gdy monowarstwa komórek Bon-1 osiągnie 70 do 80% konfluencji, w komorze z laminarnym przepływem powietrza przygotowuje się zawiesinę pojedynczych komórek.

Usunąć pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki PBS. Oddzielić komórki od naczynia, dodając 1 mL trypsyny i inkubując w temperaturze 37 °C przez pięć minut. Sprawdzić pod mikroskopem, czy wszystkie komórki oddzieliły się od naczynia, a następnie dodać do trypsyny 9 mL pożywki wzrostowej.

Kilka razy pipetuj komórki oczne w górę i w dół, aby zapewnić jednorodną zawiesinę pojedynczych komórek. Użyj sitka do komórek o rozmiarze 70 µm, aby przefiltrować komórki. Zbierz przefiltrowane komórki, a po wykonaniu odliczania komórek przygotuj zawiesinę o stężeniu 5 000 komórek na mililitr w pożywce wzrostowej D-M-E-M-F 12 z 10% FBS.

Liczba komórek do wysiania powinna zostać określona empirycznie na podstawie wielkości sfer w szóstym dniu. Idealnie, wielkość sfery powinna wynosić od 300 do 400 µm średnicy. Z tego powodu wysiewamy tysiąc komórek w 200 µL na studzienkę.

Aby rozpocząć tę procedurę, nanieś 200 µL zawiesiny pojedynczych komórek na każdą studzienkę pokrytą aero w wcześniej przygotowanych płytkach 24-dołkowych; uszczelnij płytki 24-dołkowe sterylną taśmą uszczelniającą, aby zapobiec parowaniu. Umieść pokryte aero płytki 24-dołkowe zawierające komórki bon one na wytrząsaczu orbitalnym przy bardzo powolnym mieszaniu w inkubatorze z nawilżeniem w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla w powietrzu; inkubuj przez noc. Następnego dnia rano przenieś płytki na stabilną platformę i utrzymuj wzrost kultur w inkubatorze. Powtarzaj czynność co trzy dni.

Do każdej studni płytek należy dodać 200 µL pożywki wzrostowej. Aby uniknąć naruszenia organoidów, należy dotknąć końcówką pipety ścianki studni i pozwolić pożywce spłynąć po niej do wnętrza. Tworzenie OID na płytkach 24-dołkowych monitoruje się pod mikroskopem. Leczenie preparatami farmakologicznymi steroidów 3D rozpoczyna się w szóstym dniu hodowli.

Kiedy sferoidy osiągną średnicę około 300 do 400 mikronów, moment ten uznaje się za dzień zerowy dla podania leku w szóstym dniu. Każda studzienka płytek zawiera około 400 µL medium, aby zapewnić stężenie końcowe leku na poziomie 1x w każdej studzience. Dla każdej dawki leku należy przygotować stężenie trzykrotnie wyższe od pożądanego; odpowiednią ilość zapasu leku należy rozcieńczyć w 5 mL medium wzrostowego w 15 mL probówce stożkowej, co wystarczy dla ośmiu powtórzeń. Sferoidy w każdym rzędzie płytek 24-dołkowych są oznaczone jako vehicle oraz dawka 1, 2, 3, 4 i 5. Na każdej płytce 24-dołkowej znajdują się cztery powtórzenia dla każdej dawki leku.

Zazwyczaj sferoidy 3D hoduje się w co najmniej dwóch płytkach 24-dołkowych, co pozwala na uzyskanie co najmniej ośmiu powtórzeń dla każdej dawki preparatu. Przed dodaniem preparatu do poszczególnych dołków, należy odwirować płytki 24-dołkowe, aby upewnić się, że cała kondensacja z górnej powierzchni przeniesie się do dołka, ze względu na właściwości pływania sferoidów 3D. Po odwirowaniu nie usuwa się pożywki z dołków.

Aby uniknąć zaburzenia sferoidów, ostrożnie dodaj 200 µL każdej dawki preparatu do odpowiednich dołków, wlewając ciecz po ściance każdego z nich. Szczelnie zamknij płytki 24-dołkowe taśmą uszczelniającą i inkubuj hodowle w humidyfikowanym inkubatorze w temperaturze 37 °C, w atmosferze powietrza z 5% CO2. Monitoruj trójwymiarowe hodowle steroidowe w wybranych punktach czasowych po podaniu leku za pomocą mikroskopu kontrastowego.

Obiektyw 5x jest idealny, ponieważ w przypadku użycia obiektywu 10x PHE szybko przerastają pole widzenia obrazowania. Należy pozyskać obrazy steroidów w każdej studzience w każdym punkcie czasowym przed dodaniem HistoGel. Osadzone steroidy 3D są zbierane z płytek 24-dołkowych i utrwalane w 10% Formin.

Umieść probówkę z zimnym HistoGel w zlewce wypełnionej wodą. Podgrzewaj zlewkę w kuchence mikrofalowej przez jedną minutę lub do czasu całkowitego upłynnienia żelu. Przez cały czas trwania procedury przechowuj probówkę w tej samej zlewce z wodą.

Używając jednorazowej plastikowej pipety, przenieś cały steroid do kriomformy do biopsji. Pozostaw steroid przez minutę, aby opadł na dno krioformy do biopsji.

Należy usunąć ciecz z formy do kriobiopsji za pomocą chusteczek Kim wipes. Bardzo delikatnie przesunąć steroid do środka dna formy do kriobiopsji, używając wykałaczki. Następnie, posługując się pipetą Pasteura, bardzo delikatnie utrzymać steroid w centrum formy do kriobiopsji.

Nanieś cienką warstwę podgrzanego HistoGelu do formy do kriotomii biopsji. Nie dodawaj zbyt dużo HistoGelu. Wystarczy ilość pozwalająca na ustabilizowanie steroidów w centrum.

Pozostaw steryd w HistoGelu na jedną lub dwie minuty w temperaturze pokojowej lub do momentu, aż HistoGel stężeje. Wypełnij resztę formy do kriobiopsji podgrzanym HistoGelem i pozwól mu stężeć w temperaturze pokojowej przez około 10 minut. Tuż przed wyjęciem bloku HistoGelu OIDs z formy do kriobiopsji.

Pozostaw formę do mrożenia w lodzie przez jedną minutę, a następnie wyjmij nienaruszony blok steroidowy HistoGel. Owiń blok kawałkiem folii biologicznej i umieść go w kasecie do tkanek i biopsji. Przechowuj kasetę do tkanek i biopsji w pojemniku z 70%ethanol.

Następnie, w przypadku hodowli na płytkach 24-dołkowych z kodem aeros, przeprowadza się rutynowe procedury obróbki tkanek do zatopienia w parafinie. Różne linie komórek neuroendokrynnych wykazują różne morfologie, co widać tutaj. Ludzka linia komórek neuroendokrynnych trzustki BON-1 oraz ludzka linia komórek neuroendokrynnych płuc H727 tworzyły sferoidy 3D.

W przeciwieństwie do qgp one, ludzkie komórki sieciowe trzustki tworzą duże, porowate masy przypominające winogrona, które nie są uznawane za sferoidy. Po wysianiu komórek na 24-dołkową płytkę powleczoną agros, wielokomórkowa formacja sferoidów zazwyczaj następuje do trzeciego lub czwartego dnia, a sferoidy stają się bardziej okrągłe do szóstego dnia.

Z powodu ograniczonej dostępności składników odżywczych i tlenu, komórki w gęstym rdzeniu steroidu zaczynają obumierać około 10. dnia, a do 17. dnia steroidy zaczynają ulegać dezintegracji. Ze względu na duże rozmiary lub w niektórych przypadkach wyrzucenie martwego rdzenia, steroid może zazwyczaj osiągnąć średnicę do 1000 mikronów.

W tym eksperymencie jako punkt wyjścia do leczenia inhibitorem deacetylazy histonowej trikoostatyną A (TSA) wybrano sześciodniowe steroidy 3D. Wcześniej zgłaszano, że inhibitory deacetylazy histonowej wykazują działanie antyproliferacyjne i proapoptotyczne wobec komórek NET. Przedstawione obrazy obrazują morfologię steroidów 3D na początku leczenia oraz po 24, 48, 72 i 96 godzinach.

V oznacza traktowanie substancją nośną (vehicle), którą w tym przypadku jest DMSO. D1 do D5 reprezentują traktowanie zwiększającymi się dawkami TSA. Wielkość OID każdego osobnika została oszacowana automatycznie za pomocą autorskiego programu komputerowego w środowisku MATLAB.

Dla każdej dawki TSA w każdym punkcie czasowym zmierzono co najmniej osiem sph, a wyniki przedstawiono na tym wykresie w stosunku do kontroli (vehicle). Wszystkie dawki TSA wykazały pewien stopień hamowania wzrostu w 3D OID. Przy stężeniach TSA wynoszących 125 nano molar i 250 nano molar wzrost 3D steroidów był silnie zahamowany w celu zrozumienia histologii końcowego 3D steroidu.

Barwienie H&E oraz barwienie immunohistochemiczne wykonano na steroidzie 3D, który był hodowany przez 17 dni. KI 67 jest markerem komórek proliferujących, natomiast rozszczepiona kaspaza 3 jest markerem komórek apoptotycznych. Wyniki wskazują, że komórki zewnętrznej warstwy steroidu 3D aktywnie proliferują, natomiast komórki w rdzeniu są w większości nekrotyczne lub apoptotyczne.

Po wykonaniu tej procedury można przeprowadzić dodatkowe testy, takie jak test CellTiter-Glo, w celu określenia żywotności komórek w tych 3D steroidach. Po opracowaniu technika ta może zostać rozszerzona na płytki 96-dołkowe w celu przeprowadzenia wysokoprzepustowych przesiewów, co ułatwi odkrywanie leków terapeutycznych w badaniach nad rakiem.