Name: Ludzkie linie komórkowe guzów neuroendokrynnych jako trójwymiarowy model do badania terapii ludzkich guzów neuroendokrynnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Poznaj metodę agarozowego nakładania do hodowli trójwymiarowych sferoidów z linii komórkowych guzów neuroendokrynnych. Ta prosta technika umożliwia wygodne badanie efektów terapeutycznych leków na komórki NET.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Szczerze dziękujemy dr Wenjin Chen za pomoc w przygotowaniu programu MATLAB oraz pracownikom laboratorium histopatologii i pracowni mikroskopii Cancer Institute of New Jersey. Dziękujemy również recenzentom za ich uwagi i sugestie. Niniejsze badanie zostało sfinansowane przez Raymond and Beverly Sackler Research Foundation.

<ol><li>Taal, B. G., Visser, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+neuroendocrine+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of neuroendocrine tumours.</a> Neuroendocrinology. 80, 3-7 (2004).</li>
<li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nat. Methods. 4, 359-365 (2007).</li>
<li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+drug+screen%3A+considerations+and+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocol%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat. Protocol. 4, 309-324 (2009).</li>
<li>Chan, T. F., Vese, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+contours+without+edges%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">Active contours without edges.</a> IEEE Trans Image Process. 10, 266-277 (2001).</li>
<li>Olert, J., Wiedorn, K. H., Goldmann, T., Kühl, H., Mehraein, Y., Scherthan, H., Niketeghad, F., Vollmer, E., Müller, A. M., Müller-Navia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HOPE++Fixation%3A+A+Novel+Fixing+Method+and+Paraffin-embedding+Technique+for+Human+Soft+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology-Research+and+Practice%22%5BJournal%5D)">HOPE Fixation: A Novel Fixing Method and Paraffin-embedding Technique for Human Soft Tissues.</a> Pathology-Research and Practice. 197, 823-826 (2001).</li>
<li>Baradari, V., Huether, A., Höpfner, M., Schuppan, D., Scherübl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiproliferative+and+proapoptotic+effects+of+histone+deacetylase+inhibitors+on+gastrointestinal+neuroendocrine+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Relat.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Antiproliferative and proapoptotic effects of histone deacetylase inhibitors on gastrointestinal neuroendocrine tumor cells.</a> Endocr. Relat. Cancer. 13, 1237-1250 (2006).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), e2720(2011).</li>
<li>Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+three-dimensional+basement+membrane+cultures+to+model+oncogene-induced+changes+in+mammary+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mammary+Gland+Biol.+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis.</a> J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 9, 297-310 (2004).</li>
<li>Ivascu, A., Kubbies, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+single-tumor+spheroids+for+high-throughput+cell+function+and+toxicity+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of single-tumor spheroids for high-throughput cell function and toxicity analysis.</a> J. Biomol. Screen. 11, 922-932 (2006).</li>
<li>Napolitano, A. P., Chai, P., Dean, D. M., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+Self-Assembly+of+Complex+Cellular+Aggregates+on+Micromolded+Nonadhesive+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the Self-Assembly of Complex Cellular Aggregates on Micromolded Nonadhesive Hydrogels.</a> Tissue Engineering. 13, 2087-2094 (2007).</li>
<li>do Amaral, J. B., Rezende-Teixeira, P., Freitas, V. M., Machado-Santelli, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCF-7+cells+as+a+three-dimensional+model+for+the+study+of+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">MCF-7 cells as a three-dimensional model for the study of human breast cancer.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 1097-1107 (2011).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+An+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Przedstawiliśmy prostą, niezawodną i powtarzalną metodę tworzenia wielokomórkowych sferoidów 3D z ludzkich komórek guza neuroendokrynnego z wykorzystaniem 24-dołkowych płytek pokrytych agarozą. Sukces tej techniki polega na możliwości uzyskania pojedynczego sferoidu o jednorodnym rozmiarze i jednolitym kształcie do 6. dnia, zaczynając od stałej liczby komórek. Kluczowym krokiem jest powolne wytrząsanie płytki z komórkami NET przez pierwsze 16-24 h po wysianiu. Metoda ta może mieć zastosowanie również do powszechnych linii komórkowych: ludzkiej linii raka piersi MCF-7, ludzkiej linii gruczolakoraka jelita grubego HT-29, ludzkiej linii niedrobnokomórkowego raka płuca H1299 oraz ludzkiej linii komórek embrionalnej nerki HEK-293. Wszystkie one mogą tworzyć jednolite i zwarte sferoidy 3D do przesiewania leków terapeutycznych (dane niepoddane prezentacji). Chociaż opisano kilka metod generowania sferoidów 3D,7-10 metoda przedstawiona w niniejszej pracy nie wymaga specjalistycznych płytek ani odczynników, co czyni ją prostą i kosztowo efektywną. Nasze niepublikowane dane wykazują, że sferoidy 3D NET hodowane na agarozie naśladują geometrycznie i molekularnie ksenoprzeszczep guza NET in vivo w porównaniu z komórkami w monowarstwie 2D. Jest to zgodne z doniesieniami dotyczącymi sferoidów 3D tworzonych z innych ludzkich linii komórek rakowych.11,12 Ograniczeniem modelu 3D hodowli komórkowej jest fakt, że nie może on całkowicie zastąpić testowania skuteczności leków lub terapii in vivo, ponieważ sferoidy 3D przypominają guzy beznaczyniowe, co odróżnia je od guzów in vivo w tym aspekcie. Niemniej jednak metoda ta pomoże w niektórych aspektach wypełnić lukę i usprawnić ocenę leków terapeutycznych NET w przejściu z fazy in vitro do in vivo.
Barwienie immunofluorescencyjne wielokomórkowych sferoidów jest bardzo trudne do wykonania ze względu na duży rozmiar i geometrię pływających sferoidów 3D oraz ograniczenia mikroskopu konfokalnego. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę przygotowania do zatopienia w parafinie poprzez zastosowanie HistoGel, co umożliwia barwienie immunohistochemiczne seryjnych przekrojów sferoidów 3D na szkiełkach. Ponadto nasz autorski program w środowisku MATLAB pozwala na dokładną i powtarzalną ocenę wielkości sferoidów oraz efektywne monitorowanie skuteczności leków, co może zostać włączone do przesiewowych badań wysokoprzepustowych przy opracowywaniu leków dla pacjentów z NET.

<table><tbody><tr><td>Pożywka DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Sito do komórek 70 µm</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna taśma uszczelniająca</td><td>Nunc</td><td>236366</td><td></td></tr><tr><td>Trichostatyna A</td><td>Sigma</td><td>T8552</td><td></td></tr><tr><td>Wstrząsarka orbitalna</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-402-12</td><td></td></tr></tbody></table>

linie komórkowe ludzkich guzów neuroendokrynnych jako trójwymiarowy model do badania terapii ludzkich guzów neuroendokrynnych

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Guzy neuroendokrynne (NETs) są rzadkimi nowotworami o zapadalności wynoszącej dwie przypadki na 100,&#x200A;000 osób rocznie i stanowią 0,5% wszystkich ludzkich nowotworów złośliwych.1 Poza zabiegami chirurgicznymi w przypadku niewielkiej grupy pacjentów z chorobą ograniczoną miejscowo, terapia systemowa przynosi niewielkie lub żadne korzyści w zakresie przeżywalności. W związku z tym istnieje ogromna potrzeba lepszego zrozumienia biologii NETs, a w szczególności zdefiniowania nowych celów terapeutycznych dla pacjentów z nieoperacyjnymi lub przerzutowymi guzami neuroendokrynnymi. Trójwymiarowa (3D) hodowla komórkowa staje się popularną metodą przesiewania leków ze względu na jej przydatność w modelowaniu organizacji tkanki nowotworowej i mikrośrodowiska in vivo.2,3 Wielokomórkowe sferoidy 3D mogłyby dostarczyć cennych informacji w sposób szybszy i mniej kosztowny niż bezpośrednie przechodzenie z eksperymentów na dwuwymiarowych (2D) hodowlach komórkowych do modeli zwierzęcych (mysich).
Aby ułatwić odkrywanie nowych terapii dla pacjentów z NET, opracowaliśmy model trójwymiarowych (3D) sferoidów wielokomórkowych in vitro z wykorzystaniem ludzkich linii komórkowych NET. Komórki NET wysiewamy do nieprzylegającej płytki 24-dołkowej powlekonej agarozą i inkubujemy w warunkach fizjologicznych (5% CO2, 37 °C) przy bardzo powolnym mieszaniu przez 16-24 h po wysiewaniu. Komórki zaczynają tworzyć sferoidy wielokomórkowe w 3rd lub 4th dniu. Sferoidy przyjmują bardziej kulisty kształt do 6th dnia, w którym rozpoczyna się podawanie leków. Skuteczność terapii lekowych w sferoidach NET monitoruje się na podstawie morfologii, kształtu i rozmiaru sferoidów przy użyciu mikroskopu świetlnego w kontraście fazowym. Rozmiar sferoidów jest szacowany automatycznie za pomocą opracowanego specjalnie programu MATLAB opartego na algorytmie aktywnych konturów. Ponadto przedstawiamy prostą metodę zatapiania tych sferoidów 3D w HistoGel, co umożliwia zastosowanie standardowych technik histologicznych i immunohistochemicznych.
Jest to pierwszy raport dotyczący generowania sferoidów 3D z wykorzystaniem linii komórkowych NET w celu zbadania wpływu leków terapeutycznych. Przeprowadziliśmy również badania histologiczne tych sferoidów 3D i przedstawiliśmy przykład wpływu pojedynczego leku na wzrost oraz proliferację sferoidów NET. Nasze wyniki potwierdzają, że sferoidy NET są wartościowe dla dalszych badań nad biologią NET oraz opracowywaniem leków.

Przedstawiamy prostą platformę z nakładką z agarozy do hodowli trójwymiarowych wielokomórkowych sferoidów z wykorzystaniem linii komórkowych raka neuroendokrynnego. Metoda ta stanowi bardzo wygodny sposób badania wpływu leków terapeutycznych na komórki nowotworów neuroendokrynnych. Może ona również pomóc w tworzeniu ludzkich sferoidów nowotworów neuroendokrynnych do celów terapii antynowotworowej.

Linie komórkowe ludzkich guzów neuroendokrynnych jako trójwymiarowy model do badania terapii ludzkich guzów neuroendokrynnych

Guzy neuroendokrynne (NET) są rzadkimi nowotworami o zapadalności wynoszącej dwie osoby na 100 000 mieszkańców rocznie i stanowią 0,5% wszystkich ludzkich...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest opracowanie łatwej i prostej metody wytwarzania jednolitych, trójwymiarowych sferoidów nowotworu neuroendokrynnego oraz prostej metody przetwarzania otoczkującego HistoGelu w celu badania histologii tych sferoidów. Osiąga się to poprzez równomierne pokrycie płytek 24-dołkowych aerozolem, na których wysiewa się ludzkie komórki nowotworu neuroendokrynnego w formie zawiesiny pojedynczych komórek. Następnie płytkę inkubuje się przez noc w inkubatorze na wytrząsarce orbitalnej przy prędkości poniżej 40 RPM, a następnie przenosi na stabilną półkę w inkubatorze.Sferoidy uformują się w trzecim lub czwartym dniu, a ich wzrost i integralność są monitorowane za pomocą mikroskopii w kontraście fazowym w celu zbadania ich histologii. Trójwymiarowe sferoidy są zatapiane w ogrzanym HistoGel przed rutynowym opracowaniem w parafinie; wyniki uzyskane na podstawie obrazów wykonanych podczas mikroskopii w kontraście fazowym wykazują wzrost trójwymiarowych sferoidów guza neuroendokrynnego. Histologię sferoidów 3D analizuje się za pomocą barwienia H&amp;E oraz barwienia immunohistochemicznego przekrojów bloków parafinowych sferoidów 3D.Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejącej metody jest jej prostota, łatwość wykonania, niezawodność oraz efektywność kosztowa. Metoda ta może usprawnić badania w dziedzinie poszukiwania leków, pomagając w szybkim identyfikowaniu środków terapeutycznych dla pacjentów z guzami neuroendokrynnymi. Generalnie osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą początkowo mieć trudności z wyhodowaniem organoidów 3D o jednolitym kształcie i wielkości.Kluczem do sukcesu jest zapewnienie równomiernego pokrycia płytek 24-dołkowych agarozy oraz upewnienie się, że zawiesiny pojedynczych komórek są dobrze rozproszone i mają dokładną koncentrację. Aby zrozumieć histologię steroidów 3D, konieczne jest przeprowadzenie obróbki parenchymatycznej i barwienia immunochemicznego. Osadzanie histologiczne steroidów 3D jest kluczowym krokiem, który zostanie zaprezentowany później dzisiaj. Aby przygotować 1% agarozy do pokrywania płytek 24-dołkowych, należy dodać 1 g agarozy do 100 ml wody dejonizowanej w butelce o pojemności od 250 do 500 ml i poddać autoklawowaniu w celu sterylizacji agarozy po sterylizacji.Przenieś butelkę do kąpieli wodnej o temperaturze 70 °C na około godzinę. Aby aerozole ostygły do 70 °C, muszą być przez cały czas przechowywane w warunkach sterylnych. W komorze z laminarnym przepływem powietrza, używając pipety wielokrotnej, nanieś 200 µL aerozolu do każdego dołka płytki 2 24.Do niniejszego protokołu należy użyć płytek z płaskim dnem. Zastosować można dowolne płytki 24-dołkowe z płaskim dnem, pod warunkiem że umożliwiają one obrazowanie pod mikroskopem fazokontrastowym. Należy zakręcić roztwór aeros w dołku, aby równomiernie pokrył on dno. Optymalna objętość 200 µL aeros pozwala na utworzenie wklęsłej powierzchni, co umożliwia sferoidom formowanie powtarzalnych, kulistych kształtów.Po około 10 minutach płytki 24-dołkowe pokryte aerozolem są gotowe do użycia. Komórki Bon-1 wykorzystane w tym eksperymencie to ludzkie komórki guza neuroendokrynnego trzustki (NET), hodowane w pożywce D-M-E-M-F 12 z 10% FBS w sterylnej naczyniu do hodowli tkanek w inkubatorze z wilgotnością, w temperaturze 37 °C i przy 5% carbon dioxide. Gdy monowarstwa komórek Bon-1 osiągnie 70 do 80% konfluencji, w komorze z laminarnym przepływem powietrza przygotowuje się zawiesinę pojedynczych komórek.Usunąć pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki PBS. Oddzielić komórki od naczynia, dodając 1 mL trypsyny i inkubując w temperaturze 37 °C przez pięć minut. Sprawdzić pod mikroskopem, czy wszystkie komórki oddzieliły się od naczynia, a następnie dodać do trypsyny 9 mL pożywki wzrostowej.Kilka razy pipetuj komórki oczne w górę i w dół, aby zapewnić jednorodną zawiesinę pojedynczych komórek. Użyj sitka do komórek o rozmiarze 70 µm, aby przefiltrować komórki. Zbierz przefiltrowane komórki, a po wykonaniu odliczania komórek przygotuj zawiesinę o stężeniu 5 000 komórek na mililitr w pożywce wzrostowej D-M-E-M-F 12 z 10% FBS.Liczba komórek do wysiania powinna zostać określona empirycznie na podstawie wielkości sfer w szóstym dniu. Idealnie, wielkość sfery powinna wynosić od 300 do 400 µm średnicy. Z tego powodu wysiewamy tysiąc komórek w 200 µL na studzienkę.Aby rozpocząć tę procedurę, nanieś 200 µL zawiesiny pojedynczych komórek na każdą studzienkę pokrytą aero w wcześniej przygotowanych płytkach 24-dołkowych; uszczelnij płytki 24-dołkowe sterylną taśmą uszczelniającą, aby zapobiec parowaniu. Umieść pokryte aero płytki 24-dołkowe zawierające komórki bon one na wytrząsaczu orbitalnym przy bardzo powolnym mieszaniu w inkubatorze z nawilżeniem w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla w powietrzu; inkubuj przez noc. Następnego dnia rano przenieś płytki na stabilną platformę i utrzymuj wzrost kultur w inkubatorze. Powtarzaj czynność co trzy dni.Do każdej studni płytek należy dodać 200 µL pożywki wzrostowej. Aby uniknąć naruszenia organoidów, należy dotknąć końcówką pipety ścianki studni i pozwolić pożywce spłynąć po niej do wnętrza. Tworzenie OID na płytkach 24-dołkowych monitoruje się pod mikroskopem. Leczenie preparatami farmakologicznymi steroidów 3D rozpoczyna się w szóstym dniu hodowli.Kiedy sferoidy osiągną średnicę około 300 do 400 mikronów, moment ten uznaje się za dzień zerowy dla podania leku w szóstym dniu. Każda studzienka płytek zawiera około 400 µL medium, aby zapewnić stężenie końcowe leku na poziomie 1x w każdej studzience. Dla każdej dawki leku należy przygotować stężenie trzykrotnie wyższe od pożądanego; odpowiednią ilość zapasu leku należy rozcieńczyć w 5 mL medium wzrostowego w 15 mL probówce stożkowej, co wystarczy dla ośmiu powtórzeń. Sferoidy w każdym rzędzie płytek 24-dołkowych są oznaczone jako vehicle oraz dawka 1, 2, 3, 4 i 5. Na każdej płytce 24-dołkowej znajdują się cztery powtórzenia dla każdej dawki leku.Zazwyczaj sferoidy 3D hoduje się w co najmniej dwóch płytkach 24-dołkowych, co pozwala na uzyskanie co najmniej ośmiu powtórzeń dla każdej dawki preparatu. Przed dodaniem preparatu do poszczególnych dołków, należy odwirować płytki 24-dołkowe, aby upewnić się, że cała kondensacja z górnej powierzchni przeniesie się do dołka, ze względu na właściwości pływania sferoidów 3D. Po odwirowaniu nie usuwa się pożywki z dołków.Aby uniknąć zaburzenia sferoidów, ostrożnie dodaj 200 µL każdej dawki preparatu do odpowiednich dołków, wlewając ciecz po ściance każdego z nich. Szczelnie zamknij płytki 24-dołkowe taśmą uszczelniającą i inkubuj hodowle w humidyfikowanym inkubatorze w temperaturze 37 °C, w atmosferze powietrza z 5% CO2. Monitoruj trójwymiarowe hodowle steroidowe w wybranych punktach czasowych po podaniu leku za pomocą mikroskopu kontrastowego.Obiektyw 5x jest idealny, ponieważ w przypadku użycia obiektywu 10x PHE szybko przerastają pole widzenia obrazowania. Należy pozyskać obrazy steroidów w każdej studzience w każdym punkcie czasowym przed dodaniem HistoGel. Osadzone steroidy 3D są zbierane z płytek 24-dołkowych i utrwalane w 10% Formin.Umieść probówkę z zimnym HistoGel w zlewce wypełnionej wodą. Podgrzewaj zlewkę w kuchence mikrofalowej przez jedną minutę lub do czasu całkowitego upłynnienia żelu. Przez cały czas trwania procedury przechowuj probówkę w tej samej zlewce z wodą.Używając jednorazowej plastikowej pipety, przenieś cały steroid do kriomformy do biopsji. Pozostaw steroid przez minutę, aby opadł na dno krioformy do biopsji.Należy usunąć ciecz z formy do kriobiopsji za pomocą chusteczek Kim wipes. Bardzo delikatnie przesunąć steroid do środka dna formy do kriobiopsji, używając wykałaczki. Następnie, posługując się pipetą Pasteura, bardzo delikatnie utrzymać steroid w centrum formy do kriobiopsji.Nanieś cienką warstwę podgrzanego HistoGelu do formy do kriotomii biopsji. Nie dodawaj zbyt dużo HistoGelu. Wystarczy ilość pozwalająca na ustabilizowanie steroidów w centrum.Pozostaw steryd w HistoGelu na jedną lub dwie minuty w temperaturze pokojowej lub do momentu, aż HistoGel stężeje. Wypełnij resztę formy do kriobiopsji podgrzanym HistoGelem i pozwól mu stężeć w temperaturze pokojowej przez około 10 minut. Tuż przed wyjęciem bloku HistoGelu OIDs z formy do kriobiopsji.Pozostaw formę do mrożenia w lodzie przez jedną minutę, a następnie wyjmij nienaruszony blok steroidowy HistoGel. Owiń blok kawałkiem folii biologicznej i umieść go w kasecie do tkanek i biopsji. Przechowuj kasetę do tkanek i biopsji w pojemniku z 70%ethanol.Następnie, w przypadku hodowli na płytkach 24-dołkowych z kodem aeros, przeprowadza się rutynowe procedury obróbki tkanek do zatopienia w parafinie. Różne linie komórek neuroendokrynnych wykazują różne morfologie, co widać tutaj. Ludzka linia komórek neuroendokrynnych trzustki BON-1 oraz ludzka linia komórek neuroendokrynnych płuc H727 tworzyły sferoidy 3D.W przeciwieństwie do qgp one, ludzkie komórki sieciowe trzustki tworzą duże, porowate masy przypominające winogrona, które nie są uznawane za sferoidy. Po wysianiu komórek na 24-dołkową płytkę powleczoną agros, wielokomórkowa formacja sferoidów zazwyczaj następuje do trzeciego lub czwartego dnia, a sferoidy stają się bardziej okrągłe do szóstego dnia.Z powodu ograniczonej dostępności składników odżywczych i tlenu, komórki w gęstym rdzeniu steroidu zaczynają obumierać około 10. dnia, a do 17. dnia steroidy zaczynają ulegać dezintegracji. Ze względu na duże rozmiary lub w niektórych przypadkach wyrzucenie martwego rdzenia, steroid może zazwyczaj osiągnąć średnicę do 1000 mikronów.W tym eksperymencie jako punkt wyjścia do leczenia inhibitorem deacetylazy histonowej trikoostatyną A (TSA) wybrano sześciodniowe steroidy 3D. Wcześniej zgłaszano, że inhibitory deacetylazy histonowej wykazują działanie antyproliferacyjne i proapoptotyczne wobec komórek NET. Przedstawione obrazy obrazują morfologię steroidów 3D na początku leczenia oraz po 24, 48, 72 i 96 godzinach.V oznacza traktowanie substancją nośną (vehicle), którą w tym przypadku jest DMSO. D1 do D5 reprezentują traktowanie zwiększającymi się dawkami TSA. Wielkość OID każdego osobnika została oszacowana automatycznie za pomocą autorskiego programu komputerowego w środowisku MATLAB.Dla każdej dawki TSA w każdym punkcie czasowym zmierzono co najmniej osiem sph, a wyniki przedstawiono na tym wykresie w stosunku do kontroli (vehicle). Wszystkie dawki TSA wykazały pewien stopień hamowania wzrostu w 3D OID. Przy stężeniach TSA wynoszących 125 nano molar i 250 nano molar wzrost 3D steroidów był silnie zahamowany w celu zrozumienia histologii końcowego 3D steroidu.Barwienie H&amp;E oraz barwienie immunohistochemiczne wykonano na steroidzie 3D, który był hodowany przez 17 dni. KI 67 jest markerem komórek proliferujących, natomiast rozszczepiona kaspaza 3 jest markerem komórek apoptotycznych. Wyniki wskazują, że komórki zewnętrznej warstwy steroidu 3D aktywnie proliferują, natomiast komórki w rdzeniu są w większości nekrotyczne lub apoptotyczne.Po wykonaniu tej procedury można przeprowadzić dodatkowe testy, takie jak test CellTiter-Glo, w celu określenia żywotności komórek w tych 3D steroidach. Po opracowaniu technika ta może zostać rozszerzona na płytki 96-dołkowe w celu przeprowadzenia wysokoprzepustowych przesiewów, co ułatwi odkrywanie leków terapeutycznych w badaniach nad rakiem.

human-neuroendocrine-tumor-cell-lines-as-three-dimensional-model-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ludzie z neuroendokrynnymi liniami komórek guzów jako trójwymiarowy model do badania terapii ludzkich neuroendokrynnych guzów

Opisujemy metodologie tworzenia heterotypowych trójwymiarowych modeli in vitro, składających się z fibroblastów jajnika oraz prawidłowych komórek nabłonkowych powierzchni jajnika lub komórek nabłonkowych raka jajnika. Omówiono zastosowanie tych modeli do badania oddziaływań stroma-nabłonek, które zachodzą podczas rozwoju raka jajnika.

Heterotypowe trójwymiarowe modelowanie in vitro oddziaływań stropowo-nabłonkowych podczas inicjacji i progresji raka jajnika

Fenotypowo dzikie astrocyty i nerwowe komórki macierzyste pobrane od myszy zmodyfikowanych za pomocą floksowanych, warunkowo onkogennych alleli i przekształconych za pomocą wirusowej rekombinacji za pośrednictwem Cre mogą być używane do modelowania patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo poprzez ortotopowe wstrzykiwanie przekształconych komórek do mózgów syngenetycznych, immunologicznie kompetentnych rodzeństwa z miotu.

Modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy

Ludzkie komórki szpiczaka mnogiego (MM) wymagają wspierającego mikrośrodowiska komórek mezenchymalnych i składników macierzy zewnątrzkomórkowej do przetrwania i proliferacji. Stworzyliśmy model zarodka kurczaka in vivo z wszczepionym ludzkim szpiczakiem i komórkami mezenchymalnymi, aby zbadać wpływ leków przeciwnowotworowych na wzrost, inwazję i angiogenezę guza.

Opracowanie modelu ksenoprzeszczepu szpiczaka mnogiego u kurcząt w celu zbadania wzrostu, inwazji i angiogenezy guza

Ksenoprzeszczepy glejaka wielopostaciowego pochodzące od pacjentów mogą być miniaturyzowane do żywych mikroguzów za pomocą systemu hodowli biożelu ludzkiego 3D. Ten test 3D guza in vivo nadaje się do testowania odpowiedzi na lek i profilowania molekularnego, w tym analizy kinomicznej.

Generowanie mikroguzów przy użyciu systemu hodowli biożelu ludzkiego 3D i komórek glejaka pochodzących od pacjentów do profilowania kinomicznego i testowania odpowiedzi na leki

Opisujemy ewolucję trójwymiarowego modelu in vitro opartego na sferoidach, który umożliwia nam przetestowanie obecnego standardu eksperymentalnych schematów terapii raka płaskonabłonkowego głowy i szyi na liniach komórkowych, mając na celu ocenę podatności i odporności na terapię na pierwotnych komórkach z próbek ludzkich w przyszłości.

Testowanie terapii w sferoidalnym modelu hodowli komórkowej 3D raka płaskonabłonkowego głowy i szyi

W szerokim zakresie wskazań chorobowych, bardziej fizjologicznie istotne modele są opracowywane i wdrażane do programów odkrywania leków. Opisany tutaj nowy system modelowy pokazuje, w jaki sposób trójwymiarowe sferoidy nowotworowe mogą być hodowane i badane przesiewowo w wysokowydajnym systemie opartym na płytkach 1536-dołkowych w celu poszukiwania nowych leków onkologicznych.

Generowanie wysokoprzepustowych trójwymiarowych sferoid nowotworowych do badań przesiewowych leków

Tutaj prezentujemy powtarzalną metodę tworzenia ortotopowego mysiego modelu raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. Guzy wykazują klinicznie istotne cechy histopatologiczne choroby, w tym martwicę, słabe różnicowanie, przerzuty węzłowe i naciek immunologiczny. U myszy z guzem rozwijają klinicznie istotne objawy, w tym dysfagię, przemieszczenie szczęki i utratę wagi.

Dośluzówkowa inokulacja komórek raka płaskonabłonkowego u myszy w celu profilowania immunologicznego guza i oceny odpowiedzi na leczenie

To badanie przedstawia i opisuje protokoły do uzyskania dwóch specyficznych ludzkich organoidów nerwowych jako odpowiedniego i dokładnego modelu do badania: 1) rozwoju glejaka u człowieka w obrębie ludzkich organoidów nerwowych wyłącznie u ludzi oraz 2) różnicowania dopaminergicznego neuronów generującego trójwymiarowy organoid.

Ludzkie organoidy nerwowe do badania raka mózgu i chorób neurodegeneracyjnych

Guzy neuroendokrynne (NET) wywodzą się z komórek neuroendokrynnych grzebienia nerwowego. Rosną wolno i stanowią wyzwanie dla kultury. Przedstawiamy alternatywną strategię hodowli NET z jelita cienkiego poprzez hodowlę ich jako sferoid. Te sferoidy mają markery siatki jelita cienkiego i mogą być używane do testowania narkotyków.

Ustalenie i charakterystyka sferoid guza neuroendokrynnego jelita cienkiego

Ten artykuł wymienia kroki wymagane do zasiewu linii komórek neuroblastoma na wcześniej opisanych trójwymiarowe szkieletach opartych na kolagenie, utrzymanie wzrostu komórek przez określony czas i odzyskanie szkieletów do kilku analiz wzrostu komórek i zachowania komórek oraz zastosowań wtórnych, przystosowanych do zaspokojenia szerokiego zakresu celów eksperymentalnych.

Trójwymiarowy in vitro biomimetyczny model neuroblastomu z wykorzystaniem rusztowań na bazie kolagenu

Ten artykuł demonstruje ustandaryzowaną metodę konstruowania trójwymiarowych sferoid nowotworowych. Opisano również strategię obserwacji sferoidy i analizy głębokiego uczenia opartego na obrazach przy użyciu zautomatyzowanego systemu obrazowania.

Generowanie sferoid 3D guza do badań oceny leków

Poznaj metodę agarozowego nakładania do hodowli trójwymiarowych sferoidów z linii komórkowych guzów neuroendokrynnych. Ta prosta technika umożliwia wygodne badanie efektów terapeutycznych leków na komórki NET.

Linie komórkowe ludzkich guzów neuroendokrynnych jako trójwymiarowy model do badania terapii ludzkich guzów neuroendokrynnych

Przeglądaj więcej filmów