Name: świnka Bac Modyfikacja systemu transpozonowego pierwotnych ludzkich limfocytów T (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Poznaj metodę modyfikacji pierwotnych ludzkich limfocytów T za pomocą systemu transpozonowego piggyBac. Technika ta umożliwia stabilną ekspresję transgenu, co jest kluczowe dla badań immunologicznych i terapii komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SS jest częściowo wspierany przez grant szkoleniowy HHMI Med into Grad w ramach programu TBMM. MHW jest częściowo wspierany przez nagrodę za rozwój zawodowy z Departamentu Spraw Weteranów oraz dzięki hojnemu wsparciu dr i pani Harold M. Selzman. Praca ta była również częściowo finansowana z grantu NIH lymphoma SPORE P50CA126752 oraz grantu NIH R01 DK093660.

Dzień 0
1. Izolacja PBMC z ludzkiej krwi
<ol>
	<li>Pobrać 20 ml świeżej krwi ludzkiej drogą nakłucia żyły do probówek vacutainer z heparyną sodową (Na-heparin).</li>
	<li>Wymieszać krew z pożywką Advanced RPMI 1,640 w stosunku 1:1 (v/v).</li>
	<li>Do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml nalać 20 ml medium lymphoprep (25 °C). Powoli nanieść 25-30 ml mieszaniny krwi i RPMI 1,640 na powierzchnię lymphoprep.</li>
	<li>Wirować przy 400 x g przez 40 min bez hamowania.</li>
	<li>Zebrać obie warstwy (wyraźną oraz rozmytą) za pomocą jednorazowej pipety do 10 ml 1x PBS (25 °C), a następnie uzupełnić objętość do 50 ml za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Wirować przy 450 x g przez 10 min.</li>
	<li>Całkowicie odessać nadsącz i dodać 20 ml Advanced RPMI 1,640.</li>
	<li>Wirować przy 400 x g przez 5 min.</li>
	<li>Odessać nadsącz. Dodać 10 ml kompletnej pożywki do limfocytów T z dodatkiem 5 ng/ml rhIL-15, uprzednio ogrzanej do 37 °C.</li>
	<li>Policzyć komórki i wysiać je do 24-dołkowej płytki hodowlanej w zagęszczeniu 2 x 106 komórek/dołek w kompletnej pożywce do limfocytów T z dodatkiem 5 ng/ml rhIL-15. Do sąsiednich dołków dodać wodę sterylną. Inkubować przez noc w wilgotnej inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
</ol>
Dzień 1
2. Powlekanie płytek przeciwciałami anty-CD28 i anty-CD3 w celu stymulacji limfocytów T
<ol>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała anty-CD28 i anty-CD3 w sterylnej wodzie do stężenia 1 μg/ml dla każdego z nich.</li>
	<li>Dodać po 500 μl każdego roztworu przeciwciał do 5 oznaczonych studzienek niepowlekanej 24-dołkowej płytki hodowlanej.</li>
	<li>Pozostałe studzienki uzupełnić sterylną wodą. Owinąć płytkę folią termokurczliwą i umieścić w lodówce w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Nuklefekcja niestymulowanych limfocytów T
<ol>
	<li>Podgrzać pożywkę do limfocytów T do 37 °C i uzupełnić o 5 ng/ml rhIL-15. Przygotować pełny roztwór do nukleofekcji, dodając 500 μl Nucleofector Supplement 1 do 2,25 ml roztworu Nucleofector.</li>
	<li>Odmiarkować po 5 μg transpozonu (Zeo-pT-CMV-eGFP) i transpozazy (pCMV-piggyBac) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Uwaga: może być konieczna optymalizacja ilości DNA transpozazy i transpozonu w celu zapewnienia optymalnej dostawy genów i zminimalizowania toksyczności komórkowej. Plazmidy można uzyskać od autorów na prośbę.</li>
	<li>Zebrać PBMC z 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej do probówki 50 ml. Policzyć liczbę komórek. Odłożyć 2 x 106 komórek do wykorzystania jako kontrola podczas cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Przenieść od 7 do 10 x 106 komórek do probówki 15 ml i wirować przy 400 x g przez 5 min, odessać nadsącz i rozbić osad poprzez lekkie uderzanie palcem w dno probówki.</li>
	<li>Dodać 100 μl pełnego roztworu do nukleofekcji limfocytów T do rozluźnionego osadu komórkowego.</li>
	<li>Przenieść mieszaninę roztworu i komórek do probówki zawierającej plazmidy.</li>
	<li>Przenieść mieszaninę roztworu, komórek i plazmidów na dno kuwety do nukleofekcji. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Przeprowadzić nukleofekcję komórek, korzystając z programu U-014 (Unstimulated T cells, human, <a href="http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/" target="_blank">http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/</a>).</li>
	<li>Natychmiast dodać do kuwety 500 μl podgrzanej pożywki z rhIL-15. Przenieść komórki do dołka płytki 24-dołkowej zawierającego 1,5 ml podgrzanej pożywki z rhIL15.</li>
	<li>Inkubować przez noc w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2.</li>
</ol>
Dzień 2
4. Nieswoista stymulacja limfocytów T
<ol>
	<li>Zebrać komórki i określić ich liczbę. Odstawić 0,5 x 106 komórek do cytometrii przepływowej w celu określenia częstotliwości występowania komórek GFP-dodatnich. Jako kontrole wykorzystać nieprzestransfekowane PBMC.</li>
	<li>Odssać roztwór przeciwciał CD3/28 z płytki niezakładanej do hodowli tkankowej i przepłukać każdą studzienkę pożywką do limfocytów T.</li>
	<li>Resuspender nukleofektowane komórki w stężeniu 0,5 x 106 komórek na ml w pełnej pożywce do CTL uzupełnionej o 5 ng/ml rhIL-15. Do 4 studzienek płytki niezakładanej do hodowli tkankowej dodać po 2,0 ml nukleofektowanych komórek. Do 5th studzienki dodać 0,5 x 106 komórek nienukleofektowanych.</li>
	<li>Inkubować przez 3 dni w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
</ol>
Dzień 5
<ol>
	<li>Zebrać stymulowane limfocyty T z niepowlekanej płytki hodowlanej.</li>
	<li>Policzyć i ponownie wysiać komórki na powlekaną płytkę hodowlaną z 24 dołkami w zagęszczeniu 0.7 x 106 cells/ml w pożywce dla limfocytów T z dodatkiem 5 ng/ml IL-15.</li>
</ol>
Dzień 7
7. Analiza ekspresji genów
<ol>
	<li>Zebrać komórki, barwić przeciwciałem anty-CD8 przeciwko ludzkim antygenom (można również zastosować anty-CD3 i anty-CD4), a następnie przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej w celu oznaczenia % ekspresji GFP.</li>
</ol>
Dzień 8 (Opcjonalnie)
8. Ekspansja limfocytów T
<ol>
	<li>W 8. dniu po transfekcji limfocyty T można przesiać do pożywki dla limfocytów T z dodatkiem IL-15 w zagęszczeniu 0.7 x 106 komórek na dołek w celu ich dalszej ekspansji16.</li>
</ol>

<ol><li>Cary, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+mutagenesis+of+baculoviruses%3A+analysis+of+Trichoplusia+ni+transposon+IFP2+insertions+within+the+FP-locus+of+nuclear+polyhedrosis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses.</a> Virology. 172 (1), 156(1989).</li>
<li>Fraser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+for+movement+of+Lepidopteran+transposon+IFP2+in+insect+cells+using+a+baculovirus+genome+as+a+target+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA.</a> Virology. 211 (2), 397(1995).</li>
<li>Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transposition+of+the+piggyBac+%28PB%29+transposon+in+mammalian+cells+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473(2005).</li>
<li>Saridey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac+transposon-based+inducible+gene+expression+in+vivo+after+somatic+cell+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer.</a> Mol. Ther. 17 (12), 2115(2009).</li>
<li>Nakanishi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposon-mediated+long-term+gene+expression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice.</a> Mol. Ther. 18 (4), 707(2010).</li>
<li>Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac+Transposon-mediated+Gene+Transfer+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells.</a> Mol. Ther. 15 (1), 139(2007).</li>
<li>Nakazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+PiggyBac+transposon+system+for+the+sustained+genetic+modification+of+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes.</a> J. Immunother. 32 (8), 826(2009).</li>
<li>Raja Manuri, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposon%2Ftransposase+system+to+generate+CD19-specific+T+cells+for+treatment+of+B-lineage+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 21 (4), 427(2010).</li>
<li>Doherty, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+piggyBac+gene+transfer+in+human+cells+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo.</a> Hum. Gene Ther. , In Press (2011).</li>
<li>Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531(2011).</li>
<li>Bonini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of T cells.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 17, Suppl 1. S15-S20 (2011).</li>
<li>Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon+and+transposase+system+for+human+application%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">A transposon and transposase system for human application.</a> Mol. Ther. 18 (4), 1531(2010).</li>
<li>Galvan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+PiggyBac+transposon+integrations+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells.</a> J. Immunother. 32 (8), 837(2009).</li>
<li>Nakazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac-Mediated+Cancer+Immunotherapy+Using+EBV-Specific+Cytotoxic+T-Cells+Expressing+HER2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor.</a> Mol. Ther. 19 (12), 2133(2011).</li>
<li>Huye, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+mTor+Inhibitors+With+Rapamycin-resistant+T+Cells%3A+A+Two-pronged+Approach+to+Tumor+Elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination.</a> Mol. Ther. 19 (12), 2239(2011).</li>
<li>Vera, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+production+of+antigen-specific+T+cells+for+preclinical+and+clinical+applications+using+gas-permeable+rapid+expansion+cultureware+%28G-Rex%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex).</a> J. Immunother. 33 (3), 305(2010).</li>
<li>Kahlig, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+transposon-mediated+stable+gene+transfer+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343(2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Opisana w niniejszej pracy metoda umożliwia stabilną modyfikację transgenową pierwotnych ludzkich limfocytów T. Wcześniej testowaliśmy wykorzystanie systemu transpozonu piggyBac w celu modyfikacji limfocytów T w celu ekspresji genu reporterowego (przez ponad 4 tygodnie), nieimmunogennego genu samobójczego, chimerycznego receptora antygenowego do immunoterapii adoptywnej (przez ponad 100 dni) oraz w celu wygenerowania oporności na leki immunosupresyjne7,13-15. Nirowirusowa modyfikacja limfocytów T do ...

<table><tbody><tr><td>Lympholyte</td><td>Cedarlane</td><td>CL5015</td><td></td></tr><tr><td>Advanced RPMI 1,640</td><td>LifeTechnologies</td><td>12633020</td><td></td></tr><tr><td>Surowica z płodu cielęcego Hyclone</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3008803</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX-I</td><td>LifeTechnologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane białko IL-15 człowieka</td><td>eBioscience</td><td>14-8159</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>AAD-1001S</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do nukleofekcji ludzkich limfocytów T</td><td>Lonza</td><td>VPA-1002</td><td></td></tr><tr><td>CD8-APC</td><td>Southern Biotech</td><td>9536-11</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD3 przeciwko ludzkiemu białku CD3</td><td>eBioscience</td><td>16-0037-81</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko ludzkiemu CD28</td><td>BD Pharmingen</td><td>555725</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa z powierzchnią do hodowli tkanek</td><td>BD Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa, nieprzystosowana do hodowli tkanek</td><td>BD Falcon</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Pełny skład pożywki do limfocytów T&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 1x Advanced RPMI 1,640&lt;br/&gt; 5% dezaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca&lt;br/&gt; 2 mM GlutamaxIM-I</td></tr></tbody></table>

modyfikacja pierwotnych ludzkich limfocytów t za pomocą systemu transpozonalnego piggybac

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

System transpozonowy piggyBac jest naturalnie aktywny i pochodzi pierwotnie od ciemnicy kapuśnianej1,2. Ten niewirusowy system opiera się na plazmidach, najczęściej wykorzystując dwa plazmidy: jeden wykazujący ekspresję enzymu transpozazy piggyBac oraz plazmid transpozonowy zawierający interesujące geny pomiędzy elementami powtórzeń odwróconych, które są niezbędne do aktywności transferu genów. PiggyBac pośredniczy w transferze genów poprzez mechanizm „wycięcia i wklejenia”, w którym transpozaza integruje segment transpozonu z genomem docelowych komórek. PiggyBac wykazał wydajną aktywność dostarczania genów w szerokim spektrum komórek owadów1,2, ssaków3-5 oraz ludzi6, w tym w pierwotnych ludzkich limfocytach T7,8. Niedawno opracowano hiperaktywną transpozazę piggyBac , która poprawiła wydajność transferu genów9,10.
Ludzkie limfocyty T stanowią przedmiot zainteresowania klinicznego w kontekście adoptywnej immunoterapii nowotworów11. Warto zauważyć, że zatwierdzono pierwsze badanie kliniczne obejmujące modyfikację ludzkich komórek T za pomocą systemu transpozonu Sleeping beauty12. Wcześniej ocenialiśmy użyteczność piggyBac jako niewirusowej metody modyfikacji genetycznej ludzkich limfocytów T. Stwierdziliśmy, że piggyBac jest efektywny w modyfikacji genetycznej ludzkich komórek T za pomocą genu reporterowego oraz nieimmunogennego indukowalnego genu samobójczego7. Analiza miejsc integracji genomowej wykazała brak preferencji dla integracji w obrębie lub w pobliżu znanych protoonkogenów13. Wykorzystaliśmy piggyBac do modyfikacji genetycznej cytotoksycznych limfocytów T w celu wprowadzenia chimerycznego receptora antygenowego skierowanego przeciwko antygenowi nowotworowemu HER2 i stwierdziliśmy, że zmodyfikowane genetycznie komórki T pośredniczą w ukierunkowanym zabijaniu komórek nowotworowych HER2-dodatnich in vitro oraz in vivo w ortotopowym modelu mysim14. Wykorzystaliśmy również piggyBac do generowania ludzkich komórek T opornych na rapamycynę, co powinno być użyteczne w terapiach przeciwnowotworowych, w których stosuje się rapamycynę15.
W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę wykorzystania piggyBac do modyfikacji genetycznej pierwotnych ludzkich limfocytów T. Procedura obejmuje izolację monocytów krwi obwodowej (PBMC) z ludzkiej krwi, a następnie hodowlę, modyfikację genetyczną oraz aktywację limfocytów T. Na potrzeby niniejszego raportu limfocyty T zostały zmodyfikowane za pomocą genu reporterowego (eGFP) w celu analizy i kwantyfikacji ekspresji genów metodą cytometrii przepływowej.
PiggyBac można wykorzystać do modyfikacji ludzkich limfocytów T za pomocą różnych genów zainteresowania. Chociaż wykorzystaliśmy piggyBac do kierowania limfocytów T przeciwko antygenom nowotworowym14wykorzystaliśmy również piggyBac w celu wprowadzenia indukowalnego przełącznika bezpieczeństwa, pozwalającego na eliminację zmodyfikowanych genetycznie komórek w razie potrzeby7Duża pojemność ładunkowa piggyBac umożliwiło również transfer genu dużej cząsteczki mTOR (15 kb) opornej na rapamycynę15W związku z tym przedstawiamy niewirusową metodologię stabilnej modyfikacji genetycznej pierwotnych ludzkich limfocytów T do szerokiego zakresu zastosowań.

Schemat przedstawiający etapy modyfikacji genetycznej ludzkich limfocytów T za pomocą genu reporterowego (eGFP) przedstawiono na Rysunku 1. Plazmidy te są dostępne na prośbę autorów. Schemat przedstawiający etapy modyfikacji genetycznej ludzkich limfocytów T za pomocą genu reporterowego (eGFP) przedstawiono na Rysunku 2. Konieczna jest aktywacja limfocytów T, aby pobudzić je do podziałów, ekspansji i propagacji w hodowli. Zmodyfikowane ludzkie limfocyty T hodowano, a następnie analizowan...

Opisujemy metodę modyfikacji genetycznej pierwotnych ludzkich limfocytów T za pomocą transgenu przy użyciu niewirusowego systemu transpozonu piggyBac. Limfocyty T zmodyfikowane z wykorzystaniem systemu transpozonu piggyBac wykazują stabilną ekspresję transgenu.

Modyfikacja pierwotnych ludzkich limfocytów T za pomocą systemu transpozonalnego piggyBac

System transpozonu piggyBac jest naturalnie aktywny i pochodzi pierwotnie z ćmy zwanej kapustniakiem 1,2. Ten niewirusowy system opiera się na plazmidach, większość...

Ogólnym celem tej procedury jest stabilna modyfikacja genetyczna pierwotnych ludzkich limfocytów T przy użyciu niewirusowego systemu transpozonowego. Najpierw należy pobrać krew ludzką, a następnie wyizolować mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMC). Następnie przeprowadza się nuklefekcję PBMC systemem transpozonu piggyBac oraz wybranym transgenem, np. EGFP. W kolejnym kroku limfocyty T stymuluje się do proliferacji w hodowli.Następnie należy przeanalizować limfocyty T pod kątem ekspresji transgenu. Ostatecznie analiza z wykorzystaniem cytometrii przepływowej służy do wykazania stabilnej ekspresji transgenu w limfocytach T zmodyfikowanych za pomocą systemu transposonów piggyback. W przeciwieństwie do transfekcji plazmidowej ludzkich limfocytów T, transposony mają tę zaletę, że stabilnie integrują transgeny, zapewniając ich długotrwałą ekspresję.Kluczem jest przestrzeganie bardzo specyficznego protokołu postępowania z PBMC podczas izolacji oraz po nukleofekcji; po raz pierwszy wdrożyliśmy tę metodę w celu stworzenia stabilnych linii komórkowych człowieka do ekspresji różnych genów. Podejście to pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, takie jak sposób modyfikacji limfocytów T w celu poprawy ich funkcji. Procedurę tę, z wykorzystaniem wenipunkcji, zademonstrują Sunon i Saha, studenci studiów doktoranckich z mojego laboratorium.Pobrać 20 mililitrów świeżej ludzkiej krwi do probówek vacutainer z heparyną sodową. Zmieszać krew z pożywką advanced RPMI 1640 w stosunku jeden do jednego. Następnie dodać 20 mililitrów medium lympho prep do probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów.Powoli nanieś warstwę od 25 do 30 mililitrów rozcieńczonej krwi na przygotowany preparat limfocytów i wiruj z prędkością 400 ×g przez 40 minut bez przerw. Przenieś zarówno wyraźną, jak i rozmytą warstwę do 10 mililitrów PBS o temperaturze pokojowej. Uzupełnij całkowitą objętość do 50 mililitrów za pomocą PPBS.Następnie zebrać komórki poprzez wirowanie przy 450 ×g przez 10 minut, całkowicie odessać supernatant, a następnie raz przemyć komórki 20 ml advanced RPMI po wirowaniu. Resuspender osad komórkowy w 10 ml kompletnej pożywki dla limfocytów T, uzupełnionej o 5 ng/ml rekombinowanego ludzkiego IL 15. Policzyć komórki, a następnie wysiać je do 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej w zagęszczeniu 2 × 10⁶ komórek na dołek.Następnie do pozostałych sąsiednich dołków należy dodać sterylną wodę. P BMCs inkubować przez noc w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. Przeciwciała anty-CD 28 oraz anty-CD 3 rozcieńczyć w sterylnej wodzie do stężenia 1 µg/mL.Do pięciu oznakowanych studzienek niepowlekanej 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej dodaj po 500 µL każdego z roztworów przeciwciał. Do pozostałych studninek dodaj wodę sterylną. Owiń płytkę i przechowuj w temperaturze 4 °C.Podgrzej pożywkę do limfocytów T do 37 °C i uzupełnij ją o 5 ng/mL rekombinowanej ludzkiej IL 15. Przygotuj również świeży, kompletny roztwór efektorów jądrowych. Następnie odmierz po 5 µg transpozonu i transpose A do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.Można być konieczne zoptymalizowanie ilości transpozazy A oraz DNA transpononu w celu uzyskania optymalnej dostawy genu. Aby zminimalizować toksyczność komórkową, przenieś PBM CS z 24-dołkowej płytki do hodowli tkanek do probówki o pojemności 50 ml. Po policzeniu komórek, odstaw 2 × 10⁶ PBMC do wykorzystania jako kontrola podczas cytometrii przepływowej.Następnie przenieś od 7 do 10 milionów komórek do probówki o pojemności 15 ml i wiruj przy 400 ×g przez pięć minut. Odessaj supernatant i delikatnie rozluźnij osad poprzez opukiwanie probówki palcem. Do rozluźnionego osadu komórkowego dodaj 100 µL kompletnego roztworu do nukleofekcji limfocytów T.Teraz dodaj mieszaninę komórek w roztworze do plazmidów. Następnie przenieś mieszaninę komórek i plazmidów na dno kubka do nukleofekcji. Należy uważać, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza. Przeprowadź nukleofekcję komórek, korzystając z programu U-014.W przypadku niestymulowanych ludzkich limfocytów T przenieść komórki do dołka zawierającego 1,5 mililitra podgrzanego medium z dodatkiem R-H-I-I-L 15; inkubować niepoddane transfekcji niestymulowane limfocyty T w inkubatorze do hodowli komórkowej przez noc. Po zbiorze komórek określić ich liczbę; odłożyć 0,5 × 10⁶ nietransfekowanych PBMC jako kontrole do oznaczania częstotliwości komórek GFP-dodatnich metodą cytometrii przepływowej. Następnie odessać roztwór przeciwciała CD 3 28 z płytki niepowlekanej do hodowli tkanek i przepłukać każdy dołek medium do limfocytów T, a następnie resuspenderować.Komórki poddane działaniu nukleazy w stężeniu 0,5 × 10⁶ komórek/ml. W kompletnej pożywce CTL, uzupełnionej o 5 ng/ml RH IL 15, dodać 2,0 ml tych komórek do czterech studzienek płytki do hodowli tkankowych.Dodaj 0,5 × 10⁶ dotkniętych komórek nienuklearnych do 10⁵. Inkubuj płytkę przez trzy dni w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂.W piątym dniu należy zebrać stymulowane limfocyty T z niepowlekanej płytki do hodowli tkanek. Następnie przenieść je do powlekanej płytki 24-dołkowej w zagęszczeniu 0,7 × 10⁶ komórek na ml w pożywce dla limfocytów T zawierającej 5 ng/ml IL 15. Po zebraniu komórek należy przeprowadzić immunobarwienie przeciwko CD8, CD3 lub CD4 w celu oceny procentowej ekspresji GFP; jeśli wymagana jest ekspansja limfocytów T, preparaty komórkowe należy poddać analizie za pomocą cytometrii przepływowej.Następnie ósmego dnia, po transfekcji, wysiej komórki z gęstością 0,7 × 10⁶ komórek na studzienkę w pośrodku dla limfocytów T zawierającym IL 15 w celu modyfikacji genetycznej ludzkich limfocytów T za pomocą systemu piggyback. Pierwotne ludzkie komórki są transfekowane dwoma plazmidami. Plazmid transpozazy napędza konstytutywną ekspresję białka piggyback pod promotorem CMV.Plazmid transpo zawiera reporter GFP oraz odwrócone powtórzenia piggyback niezbędne do transferu genów. Stabilną ekspresję transgenu GFP w limfocytach T zmodyfikowanych za pomocą systemu transposonów piggyback można badać za pomocą analizy FACS. W tym przypadku komórki barwiono przeciwciałem anty-CD8 sprzężonym z PC, a następnie analizowano fluorescencję EGFP i APC w pierwszym dniu.Ekspresja EGFP jest wykrywalna w 76,4% komórek CD8+. Spadek ekspresji EGFP między pierwszym a siódmym dniem wynika prawdopodobnie z faktu, że nie wszystkie transfektowane komórki ulegają stabilnej integracji transpozonu z DNA. Powinni Państwo mieć teraz dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować PBMC oraz jak stabilnie wprowadzać geny.Zmodyfikuj je za pomocą systemu transpozycji piggyback. Pamiętaj o stosowaniu techniki sterylnej podczas wykonywania flebotomii. Pracuj sprawnie, aby zachować żywotność komórek.Po wykonaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak test cytotoksyczności limfocytów T, w celu określenia swoistości antygenowej tych komórek. Przyszłe eksperymenty będą badać wykorzystanie transpozonów w immunoterapii nowotworów opartej na limfocytach T u myszy.

piggybac-transposon-system-modification-of-primary-human-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

piggyBac System transpozonowy Modyfikacja pierwotnych ludzkich komórek T

Przedstawiamy protokół otrzymywania swoistych dla antygenu limfocytów T myszy z wykorzystaniem transdukcji...

Retrowirusowa transdukcja receptorów limfocytów T w limfocytach T myszy

Ten film demonstruje procedurę generowania neuronów ruchowych poprzez transfekcję ludzkich iPSC za pomocą systemu transpozonów PiggyBac poprzez ektopową ekspresję czynników transkrypcyjnych specyficznych dla linii.

Edycja genów za pośrednictwem transpozonów PiggyBac w ludzkich iPSC: procedura integracji genu zainteresowania w ludzkich iPSC za pomocą systemu transpozonów PiggyBac

wyrażające specyficzny dla CD19 receptor antygenu chimerycznego (CAR) są podawane jako eksperymentalne leczenie nowotworów złośliwych komórek B w naszych pierwszych badaniach klinicznych terapii genowej u ludzi. Opisujemy modyfikację genetyczną limfocytów T przy użyciu systemu Śpiącej Królewny (SB) w celu wprowadzenia specyficznego dla CD19 CAR i selektywnej propagacji na zaprojektowanych sztucznych komórkach prezentujących antygen CD19 +.

Kliniczne zastosowanie śpiącej królewny i sztucznych komórek prezentujących antygen do genetycznej modyfikacji limfocytów T z krwi obwodowej i pępowinowej

W tym badaniu generujemy indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z komórek płynu owodniowego myszy, używając systemu transpozonów nieopartego na wirusach.

Produkcja pluripotencjalnych komórek macierzystych z komórek płynu owodniowego myszy przy użyciu systemu transpozonów

Ten protokół opisuje metodę osiągnięcia stabilnej integracji interesującego genu z ludzkim genomem przez regulowany transkrypcyjnie system Śpiącej Królewny. Opisano przygotowanie do integracji wadliwych wektorów lentiwirusowych, transdukcję in vitro komórek ludzkich oraz test molekularny na transdukowanych komórkach.

Skuteczna metoda transpozycji in vitro za pomocą regulowanego transkrypcyjnie systemu Śpiącej Królewny zapakowanego w wadliwy wektor lentiwirusowy z uszkodzoną integracją

Przedstawiamy 9-dniowy protokół transdukcji i ekspansji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej makaków rezusów, który daje komórki o doskonałej koekspresji interesujących genów w liczbie wystarczającej do badań infuzyjnych skuteczności komórek.

Transdukcja i ekspansja pierwotnych limfocytów T w ciągu dziewięciu dni z utrzymaniem fenotypu pamięci centralnej

Tutaj opisujemy szczegółową metodę bezproblemowej edycji genów w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu plazmidu dawcy opartego na piggyBac i mutanta nickazy Cas9. Do eksonu 8 locus czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) wprowadzono dwie mutacje punktowe.

Wprowadzenie mutacji punktowych do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu płynnej edycji genomu

Opracowaliśmy protokół transfekcji pierwotnych komórek ludzkiego nabłonka barwnikowego za pomocą elektroporacji za pomocą genu kodującego czynnik pochodzenia pigmentu (PEDF) za pomocą systemu transpozonów Śpiącej Królewny (SB). Udaną transfekcję wykazano za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR), immunoblottingu i testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Oparta na elektroporacji modyfikacja genetyczna pierwotnych ludzkich komórek nabłonka barwnikowego przy użyciu systemu transpozonów Sleeping Beauty

Tutaj przedstawiono protokół izolacji i transfekcji pierwotnych komórek nabłonka tęczówki i barwnika siatkówki od różnych ssaków (myszy, szczury, króliki, świnie i bydło). Metoda ta idealnie nadaje się do badania podejść do ocznej terapii genowej w różnych konfiguracjach do analiz ex vivo i badań in vivo, które można przenieść na ludzi.

Izolacja, hodowla i inżynieria genetyczna pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego ssaków do niewirusowej terapii genowej

Udana transformacja linii zarodkowej u jesiennego robaka wojskowego, Spodoptera frugiperda, została osiągnięta przy użyciu mRNA nadpobudliwej transposazy piggyBac.

Nadpobudliwa transformacja linii zarodkowej za pośrednictwem transpozy piggyBac u jesiennego robaka wojskowego, Spodoptera frugiperda

Szczegółowy protokół jest dostępny dla użycia technologii CRISPR/Cas9 w celu osiągnięcia wysoce efektywnego docelowego wkręcania dużych, multicistronicznych konstruktów w pierwotnych ludzkich limfocytach T za pośrednictwem homologii (HMEJ) szlaku naprawy DNA. Limfocyty T zmodyfikowane za pomocą tego protokołu adaptowalnego do cGMP utrzymują doskonałą ekspansję komórek, cytotoksyczność i produkcję cytokin.

Inżynieria niewirusowa pierwotnych ludzkich limfocytów T poprzez ukierunkowaną integrację dużych matryc DNA za pośrednictwem homologii

Poznaj metodę modyfikacji pierwotnych ludzkich limfocytów T za pomocą systemu transpozonowego piggyBac. Technika ta umożliwia stabilną ekspresję transgenu, co jest kluczowe dla badań immunologicznych i terapii komórkowych.

Modyfikacja pierwotnych ludzkich limfocytów T za pomocą systemu transpozonalnego piggyBac

Przeglądaj więcej filmów