Name: Ex vivo Hodowla całych, rozwijających się mózgów Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Poznaj metodę hodowli eksplantatów całych mózgów Drosophila w warunkach ex vivo. Technika umożliwia naśladowanie rozwoju ciał grzybopodobnych in vivo oraz szczegółową analizę procesów neurobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować wszystkim członkom naszego laboratorium za porady, pomocne dyskusje oraz uwagi do manuskryptu. Szczególne podziękowania kierujemy do Marty Koch i Bassema Hassana za doskonałą sugestię, aby w eksperymentach dotyczących przebudowy odczekać do 1,5 godziny APF przed wypreparowaniem mózgów do hodowli. Dziękujemy również ośrodkowi obrazowania NHGRI za możliwość skorzystania z mikroskopu konfokalnego. Praca ta była wspierana przez Basic Neuroscience Program w ramach NINDS Intramural Research Program, NIH (Z01 NS003106).

A. Przygotowanie pożywek
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę kompletną poprzez sterylizację filtracyjną pożywki Schneidera dla Drosophila, uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny/streptomycyny.</li>
	<li>Pożywkę należy przygotowywać na świeżo przed każdym użyciem. Alternatywnie można rozmrozić świeżą porcję wcześniej zamrożonej pożywki.</li>
	<li>Przed hodowlą do pożywki dodać 10 μg/ml insuliny oraz 2 μg/ml ekdysonu. Substancje te przygotowano w formie stężonych roztworów stokowych i zamrożono w małych porcjach. Rozmrożonych porcji nie zamrażano ponownie.</li>
	<li>Wszystkie roztwory robocze powinny być utrzymywane w temperaturze 25 °C.</li>
</ol>
Hodowla mózgów larwalnych
1. Wybór i sekcja mózgów larwalnych
<ol>
	<li>Do wkładki do hodowli komórkowej Millicell 12 mm dodać 500 μl pożywki. Wypreparowane mózgi zostaną umieszczone w tych wkładkach, aby ułatwić późniejsze barwienie immunocytochemiczne.</li>
	<li>Na szkiełko zegarowe do preparacji nanieść niewielką ilość przygotowanej pożywki.</li>
	<li>Za pomocą małej szpatułki wyłowić poruszające się larwy trzeciego stadium i umieścić je na szkiełku zegarowym. (Przypuszczamy, że metoda hodowli ex vivo byłaby równie skuteczna w przypadku larw pierwszego lub drugiego stadium, jednak nie zostało to przetestowane).</li>
	<li>Trzymając tylny koniec larwy pęsetą, ostrożnie otworzyć koniec przedni za pomocą drugiej pęsety nr 5.</li>
	<li>Szybko wypreparować mózg, zachowując ciągłość brzusznego sznura nerwowego.</li>
</ol>
2. Hodowla ex vivo wypreparowanych mózgów larwalnych
<ol>
	<li>Używając uprzednio zwilżonych końcówek do pipety, ostrożnie przenieś mózg do insertów do hodowli komórkowej, uprzednio wypełnionych pożywką.</li>
	<li>Przenieś mózgi w pożywce do inkubatora w temperaturze 25 °C aż do osiągnięcia pożądanego punktu czasowego. Metoda ta działa efektywnie do 48 hr hodowli.</li>
	<li>Wymień pożywkę po 8 godzinach. Po tym czasie wymieniaj połowę pożywki co 5-6 godzin.</li>
</ol>
3. Manipulacja farmakologiczna mózgów larw
Tę metodę hodowli ex vivo można wykorzystać do farmakologicznego potwierdzenia interakcji genetycznych wykazanych wcześniej w naszym laboratorium 1.
<ol>
	<li>Do przygotowanego medium dodać 100 μM roscovityny i 100 μM olomucyny.</li>
	<li>Przenieść wypreparowane mózgi do tego medium.</li>
	<li>Kulturować mózgi w temperaturze 25 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Wymienić medium po 8 godzinach. Następnie wymieniać połowę medium (z dodatkiem leków) co 5-6 godzin.</li>
</ol>
Hodowla mózgów poczwarki
1. Wybór pociorek do sekcji
<ol>
	<li>Oznacz białe poczwarki na butelkach/fiolkach.</li>
	<li>Wybierz wyłącznie poczwarki całkowicie białe. Nie należy uwzględniać poczwarek z jakimkolwiek zabarwieniem.</li>
	<li>Ten etap odpowiada 0 godzin po utworzeniu puparium (APF).</li>
	<li>Poczwarki te będą gotowe do sekcji 1,5 godziny po oznaczeniu. Krok ten jest kluczowy, aby zapewnić zachodzenie pruningowania rozwojowego w hodowli ex vivo.</li>
</ol>
2. Disekcja poczwarek
<ol>
	<li>Do wkładki do hodowli komórkowej Millicell 12 mm należy dodać 500 μl pożywki. (Wypreparowane mózgi zostaną umieszczone w tych wkładkach, aby ułatwić późniejsze barwienie immunocytochemiczne).</li>
	<li>Po osiągnięciu pożądanego punktu czasowego należy nalać niewielką ilość przygotowanej pożywki na szkiełko zegarowe do preparacji.</li>
	<li>Używając małej, wilgotnej szpatułki, należy pobrać poczwarki wcześniej wyznaczonych do preparacji i umieścić je na szkiełku zegarowym.</li>
	<li>Trzymając tylny koniec poczwarki pęsetą, należy ostrożnie otworzyć przedni koniec pochewki poczwarki drugą pęsetą nr 5.</li>
	<li>Należy szybko wypreparować mózg, zachowując nienaruszoną i przytwierdzoną strukturę brzusznego sznura nerwowego.</li>
</ol>
3. Hodowla ex vivo wypreparowanych mózgów poczwarki
<ol>
	<li>Ostrożnie przenieś mózg do wkładek do hodowli komórkowej, uprzednio wypełnionych pożywką.</li>
	<li>Przenieś mózgi w pożywce do inkubatora w temperaturze 25 °C aż do osiągnięcia pożądanego punktu czasowego. W przedstawionym eksperymencie metodę tę stosowano do 10 godzin hodowli, jednak w razie potrzeby można ją przedłużyć o dłuższe okresy obserwacji i traktowania.</li>
	<li>W przypadku punktów czasowych przekraczających 8 godzin APF, wymieniaj pożywkę co 5-6 godzin.</li>
</ol>
Od tego kroku protokół pozostaje taki sam zarówno dla larw, jak i pociorek.
B. Fixacja wypreparowanych mózgów
<ol>
	<li>Po osiągnięciu pożądanego punktu czasowego usunąć medium i dodać 500 μl 4% formaldehydu w 1x PBS z 0,5% Triton X-100 (PBST) na 30 minut, wymieniając formaldehyd na świeży po 15 minutach.</li>
	<li>Należy dopilnować, aby mózgi nie wyschły podczas wymiany medium na utrwalacz.</li>
	<li>Usunąć formaldehyd, wykonując cztery 10-minutowe przemycia w 1x PBS z 0,5% TritonX-100 (PBST).</li>
</ol>
C. Barwienie utrwalonych mózgów
<ol>
	<li>Po wypłukaniu formaldehydu blokować mózgi przez 1 godzinę w roztworze blokującym składającym się z 1x PBS z 1% normalnym surowicą kozią i 1% albuminą surowiczą wołową (BSA).</li>
	<li>Dodać przeciwciała pierwszorzędowe przygotowane w roztworze blokującym.</li>
	<li>Inkubować mózgi przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnego dnia rano wypłukać przeciwciała pierwszorzędowe, wykonując cztery 10-minutowe płukania w roztworze PBST.</li>
	<li>Dodać przeciwciała drugorzędowe przygotowane w roztworze blokującym.</li>
	<li>Pozostawić w temperaturze pokojowej na 4 godziny.</li>
	<li>Wypłukać przeciwciała drugorzędowe, wykonując cztery 10-minutowe płukania w roztworze PBST.</li>
</ol>
D. Montowanie utrwalonych i barwionych mózgów do mikroskopii
<ol>
	<li>Równoważyć mózgi w medium montażowym Vectashield przez 1 godzinę.</li>
	<li>Zamontować mózgi na szkiełkach przedmiotowych, używając medium montażowego Vectashield.</li>
	<li>Przed nałożeniem szkiełka nakrywki, umieścić szklane podkładki po obu stronach mózgów. Zapobiega to zmiażdżeniu mózgów, utrzymując jednocześnie próbkę na tyle cienką, aby można było przeskanować wszystkie płaszczyzny ogniskowania za pomocą mikroskopu konfokalnego. Podczas montażu mózgi orientowano w przybliżeniu tak, aby ułatwić obrazowanie interesujących cech. W razie potrzeby obrazy mózgu obracano w oprogramowaniu Imaris, aby uzyskać optymalny widok do dokumentacji i pomiarów.</li>
	<li>Uszczelnić szkiełka nakrywkowe bezbarwnym lakierem do paznokci.</li>
	<li>Przechowywać szkiełka w ciemności.</li>
</ol>
E. Reprezentatywne wyniki
Rycina 1 przedstawia panel mózgów larw w trzecim stadium rozwoju (A) much typu dzikiego oraz (B) much wykazujących ekspresję pochodnej dominantno-negatywnej Cdk5 (Cdk5DN) (Connell-Crowley et al., 2000). W obu przypadkach w neuronach gamma ciała grzybiastych (MB) wykazano ekspresję aktyny-GFP (kolor zielony). Jak opisano wcześniej (Trunova et al., 2011), w proksymalnych aksonach neuronów gamma typu dzikiego znajduje się obszar, w którym nie kumuluje się aktyna-GFP, co objawia się jako „strefa przejaśnienia” (A, nawias), a białko fasciklina 2 (kolor czerwony) kumuluje się w aksonach jedynie do brzusznej granicy tej strefy (biała pozioma linia). Linia przerywana na trzecim panelu Ryciny 1(A) wskazuje położenie MB, podkreślając „strefę przejaśnienia” aktyny oraz jej brzuszną granicę. U much wykazujących ekspresję Cdk5DN strefa przejaśnienia aktyny nie występuje (B), a immunoreaktywność fascikliny 2 (FasII) rozprzestrzenia się grzbietowo przez ten obszar. (Należy zauważyć, że zmienna liczba aksonów dodatnich pod kątem FasII biegnie poziomo przez MB; nie mają one związku z fenotypem). Pasek skali reprezentuje 20 μm.
Stosując naszą metodę hodowli ex vivo, traktowaliśmy muchy typu dzikiego kombinacją roscovityny i olomoucyny, będących farmakologicznymi inhibitorami aktywności Cdk5. Rysunek 2 przedstawia panel mózgów larw trzeciego stadium rozwoju much typu dzikiego z grupy kontrolnej (A) oraz grupy traktowanej lekami (B). Podobnie jak u much wykazujących ekspresję dominującego negatywnego konstruktu Cdk5, mózgi traktowane inhibitorami Cdk5 przez 24 godziny wykazują charakterystyczną utratę strefy przejaśnienia aktyny oraz przesunięcie granicy FasII (nawiasy kwadratowe). Białe linie wskazują położenie granicy FasII u typu dzikiego. Pasek skali reprezentuje 20 μm.
Rysunek 3 przedstawia reprezentatywną serię ciał grzybowatych Drosophila z okresu 0-10 godzin APF, znakowanych skierowanym do błony mCD8-GFP (kolor zielony). Nawiasy wskazują kielich, czyli projekcje dendrytyczne ciał grzybowatych (MB). Przed metamorfozą widoczne są aksony MB biegnące grzbietowo-brzusznie w grubych pęczkach, a także „poświata” sygnału fluorescencyjnego pochodząca z gęstego drzewa dendrytycznego (nawias). Panel A przedstawia mózgi wypreparowane w wyznaczonym czasie. Należy zwrócić uwagę na pruning dendrytów w obszarze wskazanym nawiasami, tak że do 6-8 h APF poświata sygnału dendrytycznego znika (podczas gdy sygnał aksonalny pozostaje niezmieniony). Mózgi w panelu B zostały wypreparowane w 0 h APF, przed wewnętrznym pikiem ekdysonu (Truman and Riddiford, 2002), i hodowane ex vivo zgodnie z opisem. Nie wykazują one rozwojowego pruningu dendrytów; przeciwnie, sygnał dendrytyczny utrzymuje się w 10 h APF. Aby temu zapobiec, poczwarki są znakowane w 0 h APF, ale wypreparowywane i hodowane w 1,5 h APF. Panel C przedstawia reprezentatywną serię tych ciał grzybowatych Drosophila z okresu 0-10 godzin APF. Podobnie jak w próbkach niehodowanych, sygnał dendrytyczny jest niewykrywalny do 8 h APF. Pasek skali reprezentuje 20 μm.

<ol><li>Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdk5+regulates+the+size+of+an+axon+initial+segment-like+compartment+in+mushroom+body+neurons+of+the+Drosophila+central+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain.</a> J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).</li>
<li>Nakada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+anchored+proteins+forms+membrane+diffusion+barriers+during+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization.</a> Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).</li>
<li>Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+the+p53+tumor+suppressor+protein+family+and+Cdk5%3A+novel+therapeutic+approaches+for+the+treatment+of+neurodegenerative+disease+using+selective+Cdk+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors.</a> Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).</li>
<li>Kahsai, L., Zars, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+and+memory+in+Drosophila%3A+behavior%2C+genetics%2C+and+neural+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system.</a> Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).</li>
<li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies%3A+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126, 4065-4076 (1999).</li>
<li>Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+pruning+during+Drosophila+metamorphosis%3A+evidence+for+local+degeneration+and+requirement+of+the+ubiquitin-proteasome+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system.</a> Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).</li>
<li>Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+requirement+of+the+USP%2FEcR-B+ecdysone+receptor+for+mushroom+body+neuronal+remodeling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila.</a> Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).</li>
<li>Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cyclin-dependent+kinase+Cdk5+controls+multiple+aspects+of+axon+patterning+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo.</a> Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).</li>
<li>Truman, J. W., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+insights+into+the+evolution+of+metamorphosis+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).</li>
<li>Noguchi, T., Miller, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+actin+dynamics+in+individualization+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Development. 130, 1805-1816 (2003).</li>
<li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1%2Fdynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).</li>
<li>Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+time-lapse+imaging+and+dominant+negative+receptors+to+dissect+the+steroid+receptor+control+of+neuronal+remodeling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila.</a> Development. 133, 275-288 (2006).</li>
<li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Developing+and+Adult+Drosophila+Brains+and+Retinae+for+Live+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (37), e1936(2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Przewlekłe manipulacje genetyczne strukturą i funkcją tkanek, w tym mutacje i ekspresja transgenów, zazwyczaj wywołują kombinację efektów natychmiastowych oraz późnych konsekwencji pośrednich, które mogą być bardzo trudne do rozdzielenia. Uzupełnienie metod genetycznych o farmakologię może ułatwić badanie przebiegu czasowego powstawania fenotypu. Przykładowo, było to skuteczne podejście do analizy udziału różnych komponentów cytoszkieletu podczas spermatogenezy u Drosophila 10. W obecnym przykładzie p...

<table><tbody><tr><td>Pożywka Schneidera dla Drosophila</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Płódca bydlęca surowica (inaktywowana termicznie)</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>10% </td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>1% </td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Invitrogen</td><td>12585-014</td><td>10&amp;mu;g/ml </td></tr><tr><td>Ekdyzon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5142</td><td>2&amp;mu;g/ml </td></tr><tr><td>Roscityna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7772</td><td>100&amp;mu;M </td></tr><tr><td>Olomoucyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0886</td><td>100&amp;mu;M </td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Invitrogen</td><td>50062Z</td><td>1% </td></tr><tr><td>Seryjna albumina bydlęca</td><td>Fisher Scientific</td><td>M9501</td><td>1% </td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4551</td><td>4% </td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td>0.5% </td></tr><tr><td>Fosforanowy bufor solny (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>70011-044</td><td>1X </td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli komórkowej Millicell</td><td>EMD Millipore</td><td>PI8P01250</td><td></td></tr><tr><td>Płytka wielodołkowa, 4 dołki</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Łaseczki</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla ex vivo całych, rozwijających się mózgów drosophila

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Opisujemy metodę hodowli ex vivo całych mózgów Drosophila. Może ona służyć jako uzupełnienie przewlekłych manipulacji genetycznych w badaniach nad biologią komórki i rozwojem struktur centralnych mózgu, umożliwiając ostre interwencje farmakologiczne oraz obrazowanie procesów komórkowych na żywo. Jako przykład zastosowania tej techniki, wcześniejsze prace naszego laboratorium1 wykazały istnienie wcześniej nieznanego przedziału subkomórkowego, znajdującego się pomiędzy przedziałem aksonalnym a somatodendrytycznym aksonów w centralnym mózgu Drosophila. Wykazano genetycznie, że rozwój tego przedziału, określanego jako początkowy segment aksonu (AIS)2, zależy od specyficznej dla neuronów kinazy zależnej od cyklin, Cdk5. Pokazujemy tutaj, że traktowanie ex vivo mózgów larw Drosophila typu dzikiego swoistymi dla Cdk5 inhibitorami farmakologicznymi, takimi jak roscowityna i olomucyna3, powoduje ostre zmiany w organizacji aktyny oraz w lokalizacji białka powierzchni komórki Fasciclin 2, które naśladują zmiany obserwowane u mutantów z genetycznym brakiem aktywności Cdk5.
Drugim przykładem techniki hodowli ex vivo jest przebudowa połączeń embrionalnych neuronów gamma ciała grzybowatego (MB) podczas metamorfozy z larwy w osobnika dorosłego. Ciało grzybowate jest ośrodkiem uczenia się i pamięci węchowej u muchy4, a wspomniane neurony gamma usuwają swoje odgałęzienia aksonalne i dendrytyczne podczas rozwoju poczwarki, a następnie w późniejszym punkcie czasowym ponownie rozbudowują odgałęzienia, aby ustanowić wzorzec unerwienia dorosłego osobnika5. Wykazano, że usuwanie tych neuronów MB zachodzi poprzez lokalną degenerację odgałęzień neurytów6, w mechanizmie wyzwalanym przez ekdyson – hormon steroidowy działający na receptor ekdysonu B17 – i zależnym od aktywności systemu ubikwityna-proteasom6. Nasza metoda hodowli ex vivo może być wykorzystana do dalszego badania mechanizmu przebudowy rozwojowej. Stwierdziliśmy, że w warunkach hodowli ex vivo neurony gamma MB odtwarzały proces usuwania rozwojowego z przebiegiem czasowym zbliżonym do tego in vivo. Niezbędne było jednak odczekanie 1,5 godziny po utworzeniu puparium przed wypreparowaniem tkanki, aby komórki nieodwracalnie zaangażowały się w metamorfozę; sekcja zwierząt w momencie rozpoczęcia pupariacji prowadziła do niewielkiej metamorfozy w kulturze lub jej całkowitego braku. Zatem, przy odpowiednich modyfikacjach, podejście hodowli ex vivo można zastosować do badania zarówno dynamicznych, jak i stacjonarnych aspektów biologii centralnego mózgu.

Niniejszy artykuł opisuje metodę, za pomocą której można naśladować in vivo opracowanie Muszka owocówka ciało grzybowate w ex vivo system hodowlany

Hodowla ex vivo całych, rozwijających się mózgów Drosophila

Opisujemy metodę hodowli ex vivo całych mózgów Drosophila. Może ona służyć jako przeciwwaga dla chronicznych manipulacji genetycznych w celu...

Ogólnym celem tej procedury jest hodowla całych rozwijających się mózgów muszek Drosophila, larw oraz poczwerek w warunkach ex vivo. Jest to realizowane poprzez uprzednią identyfikację odpowiedniego stadium rozwoju Drosophila, larw oraz poczwerek. Następnie mózgi są szybko wypreparowywane.Następnie mózgi są hodowane przez wymagany czas w temperaturze 25°C. Na koniec hodowane mózgi są utrwalane, barwione, montowane i obrazowane. Ostatecznie wyniki pokazują, że możliwe jest naśladowanie rozwoju ciał grzybniowych oph in vivo poprzez technikę hodowli ex vivo.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest możliwość emulowania fenotypów in vivo w ciałach grzybowatych muszki owocówki w warunkach hodowli ex vivo, co pozwala na analizę dynamiki procesu rozwojowego z wysoką rozdzielczością. Aby hodować mózgi larwalne, po przygotowaniu świeżego, kompletnego medium z insuliną i act Dyson, nalać 500 µL do 12 mm szalki hodowlanej z wkładką do traktowania lekami. Przygotować kompletne medium zawierające po 100 µM Rosco battin oraz oli moin.Dodaj niewielką ilość pożywki do szkiełka zegarkowego. Używając małej szpatułki, zbierz wędrujące larwy trzeciego stadium i umieść je w szkiełku zegarkowym. Następnie, za pomocą pęsety, przytrzymaj tylny koniec larwy.Następnie za pomocą pęsety nr 5 ostrożnie otwórz przedni koniec i szybko wypreparuj mózg, pozostawiając nienaruszonym brzuszny sznur nerwowy. Używając uprzednio zwilżonych końcówek pipet, ostrożnie przenieś mózg do wcześniej przygotowanej szalki hodowlanej. Następnie przygotuj wilgotną komorę i umieść w niej szalkę.Inkubuj mózg w temperaturze 25 °C przez maksymalnie 48 godzin w celu hodowli mózgów w stadium pupila. Zacznij od oznakowania probówek białym pisakiem. Zapisz ten etap jako zero godzin po utworzeniu ER lub PF w 1,5 godziny.Do naczynia hodowlano-kulturowego o średnicy 12 mm z wkładką dodaj 500 µL pożywki kompletnej. Nanieś niewielką ilość przygotowanej pożywki na szkiełko zegarkowe do sekcji. Następnie, używając małej wilgotnej szpatułki, pobierz wcześniej oznakowane do sekcji PPE i umieść je na szkiełku zegarkowym.Biała poczwarka po lewej stronie reprezentuje punkt czasowy zero, a po prawej pokazano stan po 1,5 godzinie od PF. Następnie, trzymając tylny koniec poczwarki pęsetą, należy użyć pęsety nr 5, aby ostrożnie otworzyć przednią część poczwarki. Następnie szybko należy usunąć mózg, zachowując nienaruszone i przytwierdzone połączenie z nerwem brzusznym. Po odcięciu końcówki plastikowego tipa o objętości 20 µL, należy zwilżyć końcówkę pipety i użyć jej do ostrożnego przeniesienia mózgów poczwarek do naczyń z pożywką.Inkubuj je w temperaturze 25 °C przez wybrany czas. Po zakończeniu inkubacji mózgów larwalnych lub poczwarek, usuń medium i dodaj 500 µL 4% formaldehydu w buforze PBST. Inkubuj przez 15 minut, a następnie wymień roztwór na świeży 4% formaldehyd buforowany i inkubuj przez kolejne 15 minut.Użyj buforu XPBS z dodatkiem 0,5% Triton X 100, aby przemyć mózgi czterokrotnie przez 10 minut podczas każdego mycia. Po ostatnim przemyciu inkubuj próbki przez jedną godzinę w roztworze blokującym.Dodaj przeciwciała pierwszorzędowe w roztworze blokującym i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka przemyj próbki roztworem PBST cztery razy po 10 minut. Następnie inkubuj z przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze pokojowej przez cztery godziny.Powtórz etapy płukania, aby przygotować mózgi do badania mikroskopowego. Rozpocznij od inkubacji tkanek w medium montażowym przez jedną godzinę w celu wyrównania stężeń, a następnie zamocuj je na szkiełkach przedmiotowych, aby zapobiec zgniataniu próbek. Po obu stronach umieść szkiełeczka przykrywowe.Następnie nałóż szkiełka nakrywki, uszczelniając je lakierem do paznokci. Przechowuj preparaty w ciemności. Na tej rycinie przedstawiono panel mózgów larw w trzecim stadium rozwojowym od much typu dzikiego oraz much wykazujących ekspresję dominatywnie negatywnej pochodnej CDK5 (CDK5 dn); w obu przypadkach ekspresja actin GFP w neuronach gamma ciała grzybowatego (MB) przebiega zgodnie z wcześniejszym opisem. W proksymalnych aksonach neuronów gamma typu dzikiego istnieje obszar, w którym nie gromadzi się actin GFP, co objawia się jako strefa przejaśnienia, natomiast białko fascially 2 gromadzi się w aksonach jedynie do brzusznej granicy tej strefy.Linie przerywane wskazują położenie MB, wyróżniając strefę przejaśnienia aktyny oraz jej brzeg brzuszny. U much wykazujących ekspresję CDK five dn strefa przejaśnienia aktyny nie występuje, a immunoreaktywność fascially two lub fast two rozprzestrzenia się grzbietowo przez ten obszar. Stosując przedstawioną tutaj metodę hodowli ex vivo, mózgi much typu dzikiego poddano działaniu kombinacji farmakologicznych inhibitorów aktywności CDK five: ROS cottin oraz ene.Przedstawiono tutaj panel mózgów larw trzeciego stadium rozwoju much dzikiego typu z grupy kontrolnej oraz leczonej lekiem; u much wykazujących ekspresję konstruktu dominująco negatywnego CDK5, w mózgach poddanych działaniu inhibitorów CDK5 przez 24 godziny widoczna jest charakterystyczna utrata strefy klarownej (clear zone) oraz przesunięcie granicy fascii 2. Dwie białe linie wskazują pozycję granicy fascii 2 u osobników dzikiego typu; przedstawiono tutaj reprezentatywną serię ciał grzybowych Drosophila od 0 do 10 godzin.PF oznakowany z wykorzystaniem ukierunkowanego na błonę MCD eight GFP wskazuje na projekcje dendrytyczne MB, określane jako calyx przed metamorfozą. Aksony MB przebiegają grzbietowo-brzusznie w grubych pęczkach, a sygnał fluorescencyjny pochodzi z gęstego drzewa dendrytycznego.Ta kolumna przedstawia mózgi wypreparowane w wskazanym czasie. Zwróć uwagę na przycinanie dendrytów w obszarze wskazanym nawiasami, tak że w ciągu sześciu do ośmiu godzin po PF sygnał dendrytów haze znika. Mózgi w tej kolumnie zostały wypreparowane w zero godzin przed PF, przed aktem wewnętrznym.Dyson spike i hodowla x vivo w wskazanych odstępach czasu wykazują brak rozwojowego przycinania dendrytów. Przeciwnie, sygnał dendrytyczny utrzymuje się przez 10 godzin a PF; aby to obejść, PPR oznaczono w zero godzin EPF, a następnie wypreparowano w 1,5 godziny a PF i poddano hodowli. Ta kolumna przedstawia reprezentatywną serię tych ciał grzybiastych DLA od zero do 10 godzin.W przypadku próbek niehodowanych, sygnał dendrytyczny jest niewykrywalny po ośmiu godzinach PF. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak hodować mózgi rosler ex vivo. Powinni Państwo być w stanie wyizolować mózgi z larw w późnym stadium lub z prepup przed lub po skoku hormonalnym, który inicjuje przeobrażenie. Następnie powinni Państwo być w stanie przeanalizować utrwalony materiał za pomocą mikroskopii lub wykorzystać mózgi jako materiał wyjściowy do obrazowania żywych komórek.

ex-vivo-culturing-of-whole-developing-drosophila-brains

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ex vivo hodowla całych, rozwijających się mózgów Drosophila

Niniejszy film prezentuje przygotowanie pierwotnych kultur neuronalnych z mózgów poczwarki Drosophila w późnym stadium rozwoju. Obrazy żywych kultur pokazują wypustki neurytów oraz obrazowanie poziomu wapnia z wykorzystaniem Fura-2.

Pierwotne kultury neuronalne z mózgów poczwarki Drosophila w późnym stadium rozwoju

W niniejszym filmie zaprezentowano procedurę izolacji całych mózgów dorosłych muszek Drosophila w celu przygotowania do rejestracji z pojedynczych neuronów przy użyciu standardowej techniki whole-cell. Materiał zawiera obrazy komórek i neuronów znakowanych GFP, zarejestrowane podczas pomiarów.

Rejestracja z całej komórki z mózgu dorosłej muchy Drosophila

Niniejszy protokół opisuje trzy preparaty Drosophila: 1) wypreparowanie mózgu dorosłego osobnika, 2) wypreparowanie siatkówki dorosłego osobnika oraz 3) wypreparowanie kompleksów rozwijającego się krążka oka i mózgu. Szczególny nacisk położono na specjalne techniki przygotowania i warunki obrazowania żywych tkanek, choć wszystkie preparaty mogą być wykorzystane do immunohistochemii tkanek utrwalonych.

Przygotowanie rozwijających się oraz dorosłych mózgów i siatkówek Drosophila do obrazowania na żywo

Opisujemy procedurę przygotowania zarodków Drosophila na różnych etapach rozwoju w celu wizualizacji embrionalnego układu nerwowego podczas embriogenezy.

Wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w całych zarodkach Drosophila

Ten film demonstruje protokół do identyfikacji czynników egzogennych, które inicjują reaktywację nerwowych komórek macierzystych mózgu Drosophila ze stanu spoczynku. Świeżo wyklute larwy są preparowane w celu wyizolowania ich mózgów, które są następnie hodowane w pożywce z lub bez hormonu testowego w celu oceny potencjału hormonu do indukowania reaktywacji i proliferacji nerwowych komórek macierzystych.

Analiza reaktywacji nerwowych komórek macierzystych w hodowanych eksplantatach mózgu Drosophila

Źródło: Ishimoto, H. et. al.,, Obrazowanie wapnia ex vivo do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u Drosophila. J. Vis. exp. (2018) Ten film przedstawia obrazowanie wapnia do badaniaDrosophila reakcje mózgu na neuropeptydy. Neurony wyrażające fluorescencyjny wskaźnik wapnia ujawniają wewnątrzkomórkową dynamikę wapnia i funkcjonalne odpowiedzi na cząsteczki sygnałowe.

Obrazowanie wapnia ex vivo w celu zbadania reakcji mózgu Drosophila na neuropeptydy

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Mózg dorosłego Drosophila jest cennym systemem do badania obwodów neuronalnych, wyższych funkcji mózgu i złożonych zaburzeń. Skuteczna metoda wycinania całej tkanki mózgowej z małej głowy muchy ułatwi badania oparte na mózgu. Tutaj opisujemy prosty, jednoetapowy protokół preparacji dorosłych mózgów o dobrze zachowanej morfologii.

Prosty, jednoetapowy protokół preparacyjny do przygotowania mózgów dorosłych osobników Drosophila

Celem tego protokołu jest stworzenie ex vivo hodowli mózgu larw Drosophila zoptymalizowanej do monitorowania okołodobowych rytmów molekularnych za pomocą długoterminowego fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego. Omówiono również zastosowanie tej metody do testów farmakologicznych.

Obrazowanie na żywo fluorescencji w rozdzielczości pojedynczej komórki zegarów okołodobowych Drosophila w hodowli mózgu larw

Ten artykuł opisuje protokół obrazowania ex vivo wapnia mózgu Drosophila. W tej metodzie do buforu można zastosować naturalne lub syntetyczne związki, aby przetestować ich zdolność do aktywacji określonych neuronów w mózgu.

Ex vivo Obrazowanie wapnia do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u Drosophila

Ustalono metodę reaktywacji uśpionych nerwowych komórek macierzystych w hodowanych eksplantatach mózgu Drosophila. Za pomocą tej metody można oddzielić rolę sygnałów ogólnoustrojowych od sygnałów wewnętrznych w tkance w regulacji spoczynku, wejścia i wyjścia nerwowych komórek macierzystych.

Reaktywacja nerwowych komórek macierzystych w hodowanych eksplantatach mózgu Drosophila

Poznaj metodę hodowli eksplantatów całych mózgów Drosophila w warunkach ex vivo. Technika umożliwia naśladowanie rozwoju ciał grzybopodobnych in vivo oraz szczegółową analizę procesów neurobiologicznych.

Hodowla ex vivo całych, rozwijających się mózgów Drosophila

Przeglądaj więcej filmów