Name: System hodowli oligodendrocytów pochodzących od przodków z mózgu ludzkiego płodu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-20T11:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: Poznaj metodę różnicowania ludzkich komórek progenitorowych w oligodendrocyty in vitro bez komórek wspierających. Protokół umożliwia uzyskanie czystych populacji do badań nad biologią oligodendrocytów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to było wspierane przez Wewnętrzny Program Badawczy w Narodowych Instytutach Zdrowia (NIH), NINDS. Autorzy pragną podziękować wszystkim członkom Laboratorium Medycyny Molekularnej i Neuronauki, Rickowi Dreyfussowi za pomoc w mikroskopii oraz Pamele C. Sieving za pomoc w redakcji.

Uwaga: W rutynowej hodowli progenitorów neuronalnych i komórek linii oligodendrocytycznej inkubację przeprowadzono w temperaturze 37 °C w humidyfikowanej atmosferze 5% CO2. Co 2 dni pożywkę wymieniano, stosując od 50 do 100% świeżej pożywki, jeżeli konfluencja hodowli wynosiła 40-70%. W momencie osiągnięcia niemal pełnej konfluencji hodowle pasażowano w zagęszczeniu 2-2.5e6/kolbę T75, zazwyczaj w cyklu tygodniowym.
1. Przygotowanie powlekanej kolby
<ol>
	<li>Aby przygotować powlekane kolby, rozpuścić 5 mg poli-D-lizyny (PDL) w 100 ml wody dejonizowanej (DI-water), a następnie powlec kolby T75 stężeniem 50 μg/ml PDL w temperaturze pokojowej (RT) w ciemności. Po 1½ h odessać PDL i jednorazowo przepłukać kolby wodą DI-water. Pozostawić kolby do wyschnięcia przed wysianiem komórek (Tabela 1).</li>
</ol>
2. Rozpoczęcie różnicowania komórek progenitorowych neuronów w oligodendrocyty pochodzące z progenitorów (PDO)
Protokół izolacji ludzkich komórek progenitorowych OUN został opisany w poprzedniej publikacji i nie stanowi części niniejszego protokołu1. Ludzkie komórki progenitorowe OUN wyizolowano z telencefalonu płodu w 8. tygodniu ciąży, zgodnie z wytycznymi NIH.
<ol>
	<li>Hodować multipotencjalną populację komórek progenitorowych neuronów w kolbach powlekanych PDL w pożywce Neurobasal uzupełnionej o 25 ng/ml bFGF oraz 20 ng/ml epidermal growth factor (EGF) (Rycina 1A). Nie należy ich używać, jeśli przekroczyły one 11. pasaż (p11).</li>
	<li>Rozpocząć różnicowanie komórek progenitorowych neuronów, gdy kultura osiągnie około 70% konfluencji.</li>
	<li>Przygotować kompletną pożywkę do różnicowania oligodendrocytów, używając bezsurowiczej pożywki DMEM/HAMS F12 1:1 uzupełnionej o albuminę surowiczą wołu, L-glutaminę, gentamycynę, komponenty N2, T3, Shh, NT-3, bFGF oraz PDGF-AA (Tabela 1). Pożywka ta będzie określana jako pożywka do oligodendrocytów z czynnikami wzrostu (pożywka oligo + GF).</li>
	<li>Usunąć pożywkę dla progenitorów z kolb, przepłukać komórki raz solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), a następnie dodać pożywkę oligo + GF (szczegóły opisane w 2.3), aby rozpocząć różnicowanie w kierunku oligodendrocytów. Rosnąć będą tylko komórki zdeterminowane do linii oligodendrocytarnej (Rycina 1B). Hodować komórki w tej pożywce przez 3 tygodnie.</li>
	<li>W każdym tygodniu, gdy komórki osiągną 90-95% konfluencji, przeprowadzić pasaż za pomocą trypsyny (0,05%)-EDTA (0,1%) (4 ml dla kolby T75). Przenieść całą pożywkę od komórek przeznaczonych do pasażu do probówki stożkowej 50 ml; ta pożywka warunkowana zostanie użyta do zneutralizowania trypsyny. Należy dopilnować, aby nie wysuszyć komórek. Następnie dodać trypsynę.</li>
	<li>Inkubować komórki w trypsynie przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT), delikatnie stukując kolbę kilka razy, aby wspomóc odrywanie się komórek.</li>
	<li>Zneutralizować trypsynę, dodając 4-5 ml pożywki warunkowanej do kolby z odłączonymi komórkami.</li>
	<li>Przenieść pożywkę i komórki do tej samej probówki stożkowej 50 ml. Odwirować pożywkę i komórki przy 1 200 rpm (~300 ×g) przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Odssać nadsącz, resuspendować osad komórkowy, delikatnie przechylając probówkę, a następnie dodać świeżą pożywkę oligo + GF. Delikatnie pipetować pożywkę i komórki w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórkową.</li>
	<li>Policzyć komórki i przenieść 2,5e6 do każdej nowej kolby T75 powlekanej PDL.</li>
</ol>
3. Końcowy etap różnicowania oligodendrocytów
<ol>
	<li>Po 3 tygodniach hodowli w pożywce oligo + GF, gdy komórki osiągną 70-80% konfluencji, rozpocząć końcowy proces różnicowania (Rysunek 1C).</li>
	<li>Przygotować pożywkę w ten sam sposób co pożywkę oligo + GF, ale bez dodawania czterech GF: Shh, NT-3, bFGF i PDGF-AA. Pożywkę bez tych czterech GF definiuje się jako pożywkę oligo - GF.</li>
	<li>Odssać pożywkę oligo + GF z kolby, przepłukać raz PBS, a następnie dodać całkowitą objętość 16 ml pożywki, z czego ¾ (12 ml) stanowi pożywka oligo - GF, a ¼ (4 ml) to pożywka warunkowana PDN (na okres 6-10 dni). Stosowanie pożywki warunkowanej PDN nie jest krytyczne dla procesu różnicowania ani przeżywalności komórek. W rzeczywistości zaobserwowano, że tylko bezpośredni kontakt PDO z komórkami PDN w eksperymentach z kokulturą wpływał na czas przeżycia PDO. Czas przeżycia w pożywce oligo - GF może zostać wydłużony do dwóch lub trzech tygodni, jeśli komórki PDO są hodowane w kokulturze z komórkami PDN. Protokół różnicowania ludzkich progenitorowych komórek neuralnych w PDN został opisany w poprzedniej publikacji i nie stanowi części niniejszego protokołu1. Usunięcie czynników wzrostu z pożywki prowadzi do progresywnego różnicowania hodowli komórek z licznymi wypustkami (Rysunek 1D).</li>
</ol>
4. Analiza z użyciem cytometrii przepływowej
Analiza z wykorzystaniem cytometrii przepływowej porównuje nabywanie markerów oligodendrocytów podczas procesu różnicowania w odniesieniu do markerów ich populacji wyjściowej.
<ol>
	<li>Użyć progenitorów neuronalnych jako kontroli. Wysiać komórki PDO w liczbie 2.5x106 komórek do dwóch kolb T75 powlekanych poli-D-lizyną w pożywce oligo + GF.</li>
	<li>Tydzień później wymienić pożywkę na świeżą pożywkę oligo + GF w kolbach służących jako kultura kontrolna dla żywotności komórek, podczas gdy w pozostałych kolbach zastosowano pożywkę oligo - GF.</li>
	<li>Do dysocjacji komórek PDO w obu pożywkach należy użyć papainy w stężeniu 20 U/ml, a nie trypsyny. Wynika to z faktu, że papaina działa łagodniej na komórki podczas dysocjacji, co pozwala zachować morfologię komórkową.</li>
	<li>Dodać 5 ml zrównoważonego roztworu soli Earle'a (EBSS) do fiolki z papainą. Pozostawić fiolkę w temperaturze 37 °C przez 10 min lub do całkowitego rozpuszczenia papainy i uzyskania klarownego roztworu. Jest to roztwór papainy stosowany do dysocjacji komórek.</li>
	<li>Dodać 0.5 ml EBSS do fiolki z Deoksyrybonukleazą I (DNase) (Tabela 1). Delikatnie wymieszać. Dodać 0.25 ml tego roztworu do fiolki z rozpuszczoną papainą. Preparat ten zawiera końcowe stężenie około 20 U/ml papainy i 0.005% DNase.</li>
	<li>Nanieść roztwór papainy (opisany powyżej) na komórki i inkubować w 37 °C przez 15-30 min; monitorować odrywanie się komórek za pomocą mikroskopu. Przerwać reakcję, dodając 5 ml pożywki z GF lub bez GF, a następnie wirować przy 1,200 rpm przez 7 min.</li>
	<li>Przenieść osady komórkowe z obu kolb do dwóch różnych probówek polipropylenowych o pojemności 5 ml i przemyć je zwykłą pożywką fizjologiczną (NPM: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 10 mM Hepes i 10 mM glukozy) uzupełnioną o 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (NPM+BSA).</li>
	<li>Przeprowadzić immunobarwienie powierzchniowe w 4 °C przez 20 min, stosując specyficzne i odpowiednio miareczkowane przeciwciała pierwszorzędowe przeciwko A2B5, O4 i GalC (Tabela 2).</li>
	<li>Przemyć komórki roztworem NPM+BSA w 4 °C przez 5 min, a następnie inkubować je ze specyficznymi przeciwciałami drugorzędowymi w 4 °C przez 20 min (Tabela 2).</li>
	<li>Aby zbarwić antygeny wewnątrzkomórkowe, w tym nestynę, kwaśne białko włókienkowe gleju (GFAP), β-tubulinę klasy III oraz podstawowe białko mieliny (MBP) (Tabela 2), utrwalić komórki w 2% paraformaldehydzie (PFA) przez 20 min w temperaturze pokojowej (RT) i permeabilizować zimnym 70% etanolem przez 15 min w -20 °C.</li>
	<li>Przemyć komórki 1x PBS i inkubować ze specyficznymi przeciwciałami drugorzędowymi (Tabela 2).</li>
	<li>W celu odróżnienia całych komórek od debris subkomórkowych podczas analizy cytometrycznej, zbarwić komórki 4,6-diamidyno-2-fenylindołem, dihydrochlorkiem (DAPI) (Life Technologies, Grand Island, NY).</li>
	<li>Podczas optymalizacji powyższego protokołu przeprowadzono wszystkie odpowiednie eksperymenty kontrolne w celu potwierdzenia specyficzności każdego odczynnika immunologicznego. W przypadku przeciwciał bezpośrednio znakowanych, odpowiednią kontrolą negatywną było przeciwciało bezpośrednio sprzężone z tym samym izotypem klasy (lub podklasy) immunoglobulin i tym samym fluorochromem co przeciwciało pierwszorzędowe (tj. kontrola izotypowa). W przypadku pośredniego immunobarwienia przeciwciałami pierwszorzędowymi, odpowiednią kontrolą negatywną było przeciwciało drugorzędowe sprzężone z interesującym fluorochromem, skierowane specyficznie przeciwko klasie (lub podklasie) immunoglobulin gatunku, w którym wygenerowano przeciwciało pierwszorzędowe. Gdy razem używano przeciwciał pierwszorzędowych od wielu gatunków (mysz, królik, kurczak), stosowano przeciwciało drugorzędowe skierowane przeciwko przeciwciału pierwszorzędowemu każdego gatunku; każde użyte przeciwciało drugorzędowe było zazwyczaj adsorbowane krzyżowo przeciwko immunoglobulinom innych gatunków, aby zminimalizować reaktywność krzyżową międzygatunkową. Kontrole pozytywne obejmowały bezpośrednie lub pośrednie immunobarwienie preparatów komórkowych znanych z ekspresji interesujących antygenów, z wykorzystaniem bezpośrednich lub pośrednich reakcji immunologicznych z przeciwciałami pierwszorzędowymi specyficznymi dla tych antygenów. Powyższe metody optymalizacji przeprowadzono raz dla każdego rodzaju eksperymentów immunobarwienia. Kontrolne reakcje immunologiczne nie wykazały istotnej reaktywności krzyżowej między epitopami przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych. Cytometrię przepływową wykonano na jednorodnie zawieszonych komórkach znakowanych fluorescencyjnie przy użyciu sortera komórkowego FACVantage SE (BD Biosciences, San Jose, CA) wyposażonego w trzy lasery, zapewniające długości fal wzbudzenia nastrojone na 488 nm, 647 nm oraz szerokie UV (351-364 nm) (Rysunek 2).</li>
</ol>
5. Analiza immunofluorescencyjna
Uwaga: Do eksperymentów z immunofluorescencją PDO wysiewa się w pożywce oligo + GF lub pożywce oligo - GF w zagęszczeniu 2.5e5 w płytkach 6-dołkowych pokrytych PDL. Komórki utrwala się w 2% PFA w różnych punktach czasowych po usunięciu czynników wzrostu. Barwienie przeciwciałami przeprowadza się bezpośrednio na plastikowych płytkach 6-dołkowych, zamiast na szklanych lamelkach.
<ol>
	<li>Usunąć medium i dodać 2% PFA. Inkubować przez 10 min w RT. Odpiąć PFA. Przemyć komórki 3 razy PBS, po 5 min za każdym razem. Należy uważać, aby nie doprowadzić do wyschnięcia komórek.</li>
	<li>Przeprowadzić permeabilizację komórek w celu wykrycia markerów wewnątrzkomórkowych, stosując 0,25% roztwór Tritonu w PBS przez 10 min w RT.</li>
	<li>Aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu, zablokować komórki przez 10 min za pomocą HHG (bufor HEPES 1 mM, 2% surowicy konia i 10% surowicy kozy w zrównoważonym roztworze soli Hanksa). Rozcieńczyć specyficzne przeciwciała pierwszorzędowe (Tabela 2) do ustalonego stężenia w HHG. Nanieść rozcieńczone przeciwciała na komórki. Inkubować przez 1 h w RT na wytrząsarkach lub przez noc w 4 °C.</li>
	<li>Przemyć komórki 3 razy PBS, po 5 min za każdym razem. Rozcieńczyć odpowiednie przeciwciała drugorzędowe (Tabela 2) sprzężone z fluorochromem do ustalonego stężenia w HHG. Nanieść mieszaninę rozcieńczonych przeciwciał drugorzędowych na komórki. Inkubować przez 1 h w RT na wytrząsarce w ciemności.</li>
	<li>Przemyć komórki 3 razy PBS, po 5 min za każdym razem.</li>
	<li>Aby uniknąć fotobleachingu, dodać do komórek 10 μl Prolong Gold z DAPI i nałożyć na nie szklaną lamellkę. Zwizualizować znakowane komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Axiovert 200M (Zeiss, Thornwood, NY) (Rycina 3).</li>
</ol>

<ol><li>Messam, C. A., Hou, J., Gronostajski, R. M., Major, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+pathway+of+human+brain+progenitor+cells+identified+by+JC+virus+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Lineage pathway of human brain progenitor cells identified by JC virus susceptibility.</a> Ann. Neurol. 53, 636-646 (2003).</li>
<li>Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bFGF+regulates+the+proliferative+fate+of+unipotent+%28neuronal%29+and+bipotent+%28neuronal%2Fastroglial%29+EGF-generated+CNS+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells.</a> Neuron. 11, 951-966 (1993).</li>
<li>Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+factors+direct+the+differentiation+of+stem+cells+from+the+fetal+and+adult+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system.</a> Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).</li>
<li>McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the central nervous system.</a> Science. 276, 66-71 (1997).</li>
<li>Belachew, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+NG2+proteoglycan-expressing+progenitor+cells+are+intrinsically+multipotent+and+generate+functional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Postnatal NG2 proteoglycan-expressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons.</a> J. Cell Biol. 161, 169-186 (2003).</li>
<li>Almazan, G., McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oligodendrocyte+precursor+cell+line+from+rat+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">An oligodendrocyte precursor cell line from rat optic nerve.</a> Brain Res. 579, 234-245 (1992).</li>
<li>Filipovic, R., Zecevic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+role+of+minocycline+in+co-cultures+of+human+fetal+neurons+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective role of minocycline in co-cultures of human fetal neurons and microglia.</a> Exp. Neurol. 211, 41-51 (2008).</li>
<li>Goldman, S. A., Natesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+niche-defying+feat%3A+induced+oligoneogenesis+in+the+adult+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A niche-defying feat: induced oligoneogenesis in the adult dentate gyrus.</a> Cell Stem Cell. 3, 125-126 (2008).</li>
<li>Nunes, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+isolation+of+multipotential+neural+progenitor+cells+from+the+subcortical+white+matter+of+the+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain.</a> Nat. Med. 9, 439-447 (2003).</li>
<li>Lyssiotis, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+histone+deacetylase+activity+induces+developmental+plasticity+in+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Inhibition of histone deacetylase activity induces developmental plasticity in oligodendrocyte precursor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14982-14987 (2007).</li>
<li>Sim, F. J., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White+matter+progenitor+cells+reside+in+an+oligodendrogenic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Ernst+Schering+Res.+Found+Workshop%22%5BJournal%5D)">White matter progenitor cells reside in an oligodendrogenic niche.</a> Ernst Schering Res. Found Workshop. , 61-81 (2005).</li>
<li>Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glial+progenitor+cell+that+develops+in+vitro+into+an+astrocyte+or+an+oligodendrocyte+depending+on+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium.</a> Nature. 303, 390-396 (1983).</li>
<li>Windrem, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cells+derived+from+the+adult+human+subcortical+white+matter+disperse+and+differentiate+as+oligodendrocytes+within+demyelinated+lesions+of+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Progenitor cells derived from the adult human subcortical white matter disperse and differentiate as oligodendrocytes within demyelinated lesions of the rat brain.</a> J. Neurosci. Res. 69, 966-975 (2002).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat. Protoc. 2, 1044-1051 (2007).</li>
<li>Armstrong, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+immature+oligodendrocyte+lineage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells.</a> Methods. 16, 282-292 (1998).</li>
<li>Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+oligodendrocytes+from+embryonic+stem+cells%3A+conserved+SHH+signaling+networks+and+divergent+FGF+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects.</a> Development. 136, 1443-1452 (2009).</li>
<li>Gard, A. L., Williams, W. C. 2nd, Burrell, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroblasts+distinguished+from+O-2A+glial+progenitors+by+surface+phenotype+%28O4%2BGalC-%29+and+response+to+cytokines+using+signal+transducer+LIFR+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta.</a> Dev. Biol. 167, 596-608 (1995).</li>
<li>Hu, B. Y., Du, Z. W., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+oligodendrocytes+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human oligodendrocytes from pluripotent stem cells.</a> Nat. Protoc. 4, 1614-1622 (2009).</li>
<li>Reubinoff, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neural progenitors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).</li>
<li>Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oligodendrocyte+and+its+many+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The oligodendrocyte and its many cellular processes.</a> Trends Cell Biol. 3, 191-197 (1993).</li>
<li>Zhang, S. C., Ge, B., Duncan, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+human+oligodendroglial+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Tracing human oligodendroglial development in vitro.</a> J. Neurosci. Res. 59, 421-429 (2000).</li>
<li>Bradl, M., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocytes%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 37-53 (2010).</li>
<li>Chong, S. Y., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tapping+into+the+glial+reservoir%3A+cells+committed+to+remaining+uncommitted%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tapping into the glial reservoir: cells committed to remaining uncommitted.</a> J. Cell Biol. 188, 305-312 (2010).</li>
<li>Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+development+and+the+onset+of+myelination+in+the+human+fetal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain.</a> Front Neuroanat. 3, 5(2009).</li>
<li>Rao, R. C., Boyd, J., Padmanabhan, R., Chenoweth, J. G., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+serum-free+derivation+of+oligodendrocyte+precursors+from+neural+stem+cell-enriched+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient serum-free derivation of oligodendrocyte precursors from neural stem cell-enriched cultures.</a> Stem Cells. 27, 116-125 (2009).</li>
<li>D'Intino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triiodothyronine+administration+ameliorates+the+demyelination%2Fremyelination+ratio+in+a+non-human+primate+model+of+multiple+sclerosis+by+correcting+tissue+hypothyroidism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroendocrinol%22%5BJournal%5D)">Triiodothyronine administration ameliorates the demyelination/remyelination ratio in a non-human primate model of multiple sclerosis by correcting tissue hypothyroidism.</a> J. Neuroendocrinol. 23, 778-790 (2011).</li>
<li>Cui, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+different+gestational+stages+exhibit+substantially+different+potential+to+myelinate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Human fetal oligodendrocyte progenitor cells from different gestational stages exhibit substantially different potential to myelinate.</a> Stem Cells Dev. , (2012).</li>
<li>Messam, C. A., Hou, J., Major, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexpression+of+nestin+in+neural+and+glial+cells+in+the+developing+human+CNS+defined+by+a+human-specific+anti-nestin+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Coexpression of nestin in neural and glial cells in the developing human CNS defined by a human-specific anti-nestin antibody.</a> Exp. Neurol. 161, 585-596 (2000).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Niniejszy protokół opisuje sposób otrzymywania płodowych oligodendrocytów z pierwotnych ludzkich komórek progenitorowych neuronów oraz charakteryzację ich fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej i barwienia immunofluorescencyjnego. Ekspansja i wzrost progenitorów neuronów z płodowego OUN została bardzo dobrze opisana1-4. Jednakże pozyskanie wystarczającej liczby ludzkich oligodendrocytów do eksperymentów in vitro pozostaje trudne, mimo że możliwe jest zidentyfikowanie i wyizolowanie prekursorów gle...

<table><tbody><tr><td>DMEM/HAMS F12 1:1</td><td>Omega Scientist</td><td>DM-251</td><td>1X</td></tr><tr><td>Albumina bydlęca</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td>1%</td></tr><tr><td>Gentamicyna</td><td>Quality Biologicals</td><td>120-098-031</td><td> 50 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Quality Biologicals</td><td>118-084-061</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T2877</td><td>3 nM</td></tr><tr><td>Składniki N2</td><td>Gibco BRL</td><td>17502</td><td>1:100</td></tr><tr><td>NT-3</td><td>PeproTech Inc</td><td>450-03</td><td>2 ng/ml</td></tr><tr><td>Shh</td><td>R&amp;System amp;D</td><td>1314-SH/CF</td><td>2 ng/ml</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-18B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>PDGF-AA</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-13A</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>PDL</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td>50 &amp;mu;g/m</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15712</td><td>2%</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Quality Biologicals</td><td>118-087-721</td><td></td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Worthington</td><td>LK003178</td><td>20 U/ml</td></tr><tr><td>Fiolki z DNazą</td><td>Worthington</td><td>LK003172</td><td>0.005%</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Worthington</td><td>LK003188</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold&lt;br/&gt; z DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;Tabela 1.&lt;/strong&gt; Odczynniki.&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;tabela obramowanie=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Przeciwciała pierwszorzędowe (wszystkie w rozcieńczeniu 1: &amp;mu;g/ml)&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Gatunek, izotyp&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Różnicowanie ludzkich progenitorów neuronalnych w neuronalne i glejowe typy komórek stanowi model służący do badania i porównywania molekularnej regulacji rozwoju linii komórek neuronalnych. Ekspansja in vitro progenitorów neuronalnych z tkanki płodowego OUN została dobrze scharakteryzowana. Pomimo identyfikacji i izolacji progenitorów glejowych z dorosłej ludzkiej istoty białej podkorowej oraz opracowania różnych warunków hodowli w celu ukierunkowania różnicowania płodowych progenitorów neuronalnych w oligodendrocyty wytwarzające mielinę, pozyskanie wystarczającej liczby ludzkich oligodendrocytów do eksperymentów in vitro pozostaje trudne. Opisano różnicowanie prekursorów lub progenitorów oligodendrocytów (OPC) GalC+ (galaktocerebrosyd+) i O4+ z komórek prekursorowych neuronalnych z wykorzystaniem mózgu płodowego z drugiego trymestru. Jednak komórki te nie proliferują wobec braku komórek wspierających, w tym astrocytów i neuronów, i są szybko tracone w czasie hodowli. Nadal istnieje zapotrzebowanie na system hodowli umożliwiający otrzymywanie komórek linii oligodendrocytarnej odpowiednich do eksperymentów in vitro. Hodowla pierwotnych ludzkich oligodendrocytów mogłaby być, na przykład, użytecznym modelem do badania patogenezy neurotropowych czynników zakaźnych, takich jak ludzki poliomawirus JCV, który in vivo infekuje te komórki. Hodowane komórki te mogłyby również służyć jako modele innych chorób demielinizacyjnych ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Pierwotne, pochodzące z ludzkiego mózgu płodowego, multipotencjalne komórki progenitorowe neuronalne proliferują in vitro, zachowując zdolność do różnicowania się w neurony (neurony pochodzące z progenitorów, PDN) i astrocyty (astrocyty pochodzące z progenitorów, PDA). Niniejsze badanie wykazuje, że można indukować różnicowanie progenitorów neuronalnych poprzez wiele etapów rozwoju linii oligodendrocytarnej (oligodendrocyty pochodzące z progenitorów, PDO). Hodujemy komórki progenitorowe neuronalne w bezserwatkowym medium DMEM-F12 uzupełnionym o podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), czynnik wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), czynnik neurotroficzny 3 (NT-3), N-2 oraz trijodotyroninę (T3). Hodowane komórki są pasażowane w zagęszczeniu 2,5e6 komórek na kolby 75 cm mniej więcej co siedem dni. W tych warunkach większość komórek w hodowli zachowuje morfologię charakteryzującą się nielicznymi wypustkami i wykazuje ekspresję markerów komórek pre-oligodendrocytarnych, takich jak A2B5 i O-4. Po usunięciu czterech czynników wzrostu (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) i dodaniu medium kondycjonowanego z PDN, komórki zaczynają wytwarzać więcej wypustek i wykazują ekspresję markerów specyficznych dla różnicowania oligodendrocytów, takich jak GalC i podstawowe białko mieliny (MBP). Przeprowadziliśmy charakterystykę fenotypową z wykorzystaniem wielokolorowej cytometrii przepływowej w celu identyfikacji unikalnych markerów oligodendrocytów. &lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Przeciwciała wtórne&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td colspan=&quot;5&quot;&gt;&lt;strong&gt;Cytometria przepływowa&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;A2B5-Biotyna &lt;/td&gt; &lt;td&gt;Mysz &lt;/td&gt; &lt;td&gt; IgM &lt;/td&gt; &lt;td&gt;Gift J. Nielson &lt;/td&gt; &lt;td&gt; Streptawidyna PETR, Invitrogen, CA &lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;O4-FITC &lt;/td&gt; &lt;td&gt;Mysz &lt;/td&gt; &lt;td&gt; IgM &lt;/td&gt; &lt;td&gt; Dar od J. Nielson&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;A2B5 &lt;/td&gt; &lt;td&gt;Mysz &lt;/td&gt; &lt;td&gt;IgM &lt;/td&gt; &lt;td&gt;Millipore, MA &lt;/td&gt; &lt;td&gt;g&amp;alpha;przeciwciało IgM-FITC, Invitrogen, CA&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;O4 &lt;/td&gt; &lt;td&gt;Mysz &lt;/td&gt; &lt;td&gt;IgM&lt;/td&gt; &lt;td&gt; Millipore, MA &lt;/td&gt; &lt;td&gt; g&amp;alpha;przeciwciało IgM-FITC, Invitrogen, CA&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;GalC &lt;/td&gt; &lt;td&gt;Mysz &lt;/td&gt; &lt;td&gt; IgG&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt; Millipore, MA &lt;/td&gt; &lt;td&gt; g&amp;alpha;mIgG&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;-PE, Southern Biotech, AL&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;MBP&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Kurczak &lt;/td&gt; &lt;td&gt;IgY &lt;/td&gt; &lt;td&gt; Millipore, MA &lt;/td&gt; &lt;td&gt; d&amp;alpha;ck IgY-AMCA, Jackson Immu., PA &lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Nestyna &lt;/td&gt; &lt;td&gt;Mysz &lt;/td&gt; &lt;td&gt;IgG&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt; &lt;/td&gt; &lt;td&gt; Messam &lt;em&gt;it al.&lt;/em&gt; 2000&lt;sup&gt;28&lt;/sup&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;g&amp;alpha;anty-IgG mysie&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;-PECy5, Invitrogen, CA&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;GFAP &lt;/td&gt; &lt;td&gt; Królik &lt;/td&gt; &lt;td&gt;IgG &lt;/td&gt; &lt;td&gt; Millipore, MA &lt;/td&gt; &lt;td&gt; g&amp;alpha;rb IgG-PE, Jackson Immu, PA &lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&amp;#946;tubulina III &lt;/td&gt; &lt;td&gt; Mysz &lt;/td&gt; &lt;td&gt;IgG&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &lt;/td&gt; &lt;td&gt;Covance, CA &lt;/td&gt; &lt;td&gt; g&amp;alpha;mysie IgG&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;a-PETR, Invitrogen, CA&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td colspan=&quot;6&quot;&gt;&lt;strong&gt;Immunocytochemia&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&amp;#946;tubulina III&lt;br/&gt;(1:1,500) &lt;/td&gt; &lt;td&gt;Mysz &lt;/td&gt; &lt;td&gt; IgG&lt;sub&gt;2a&lt;/sub&gt; &lt;/td&gt; &lt;td&gt; Covance, CA &lt;/td&gt; &lt;td&gt; g&amp;alpha;mysia IgG&lt;sub&gt;2a&lt;/sub&gt;-FITC, Invitrogen, CA&lt;br/&gt; (1:1,000)&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;GFAP &lt;br/&gt; (1:1,000) &lt;/td&gt; &lt;td&gt;Królik &lt;/td&gt; &lt;td&gt; IgG &lt;/td&gt; &lt;td&gt; Millipore, MA &lt;/td&gt; &lt;td&gt;g&amp;alpha;królicze IgG-FITC, Jackson Immu, PA&lt;br/&gt; (1:500)&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;MBP &lt;br/&gt; (1:50)&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Kurczak &lt;/td&gt; &lt;td&gt; IgY &lt;/td&gt; &lt;td&gt; Millipore, MA &lt;/td&gt; &lt;td&gt;d&amp;alpha;ck IgY-FITC, Jackson Immu, PA&lt;br/&gt; (1:100) &lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;O4 &lt;br/&gt; (1:100) &lt;/td&gt; &lt;td&gt;Mysz &lt;/td&gt; &lt;td&gt; IgM &lt;/td&gt; &lt;td&gt; Millipore, MA &lt;/td&gt; &lt;td&gt; g&amp;alpha;m IgM-AF546, Invitrogen, CA &lt;br/&gt; (1:100)&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;GalC &lt;br/&gt; (1:10) &lt;/td&gt; &lt;td&gt;Królik &lt;/td&gt; &lt;td&gt;IgG &lt;/td&gt; &lt;td&gt;Millipore, MA &lt;/td&gt; &lt;td&gt;g&amp;alpha;m IgM-AF750, Invitrogen, CA&lt;br/&gt; (1:100)&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt; &lt;/table&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;Tabela 2. &lt;/strong&gt; Przeciwciała (Ab) wykorzystane w analizach cytometrii przepływowej i immunocytochemicznej. &lt;strong&gt;Koniugaty przeciwciał: &lt;/strong&gt;PE, fikocyjanina&amp;#8211;rytryna; PETR, fyc&amp;#8211;rythrin Texas Red; AMCA, octan aminometylokumaryny; Cy, cyjanina; FITC, izotiocyjanian fluoresceiny. &lt;strong&gt;Immunoglobuliny:&lt;/strong&gt; immunoglobulina &lt;strong&gt;AF:&lt;/strong&gt; Alexa Fluor; g&amp;alpha;m: kozie przeciwko mysim; g&amp;alpha;rb: kozia antykrólicza; d&amp;alpha;ck: osioł przeciwko kurczakowi.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

system hodowli oligodendrocytów pochodnych z komórek progenitorowych ludzkiego płodu

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Różnicowanie ludzkich prekursorów neuronalnych w typy komórek neuronalnych i glejowych stanowi model do badania i porównywania molekularnej regulacji rozwoju linii komórek nerwowych. Ekspansja in vitro prekursorów neuronalnych z płodowej tkanki OUN została dobrze scharakteryzowana. Pomimo identyfikacji i izolacji prekursorów glejowych z podkorowej białej materii dorosłego człowieka oraz opracowania różnych warunków hodowli w celu ukierunkowania różnicowania płodowych prekursorów neuronalnych w oligodendrocyty wytwarzające mielinę, pozyskanie wystarczającej liczby ludzkich oligodendrocytów do eksperymentów in vitro pozostaje trudne. Opisano różnicowanie galaktocerebrozydowych+ (GalC) i O4+ komórek prekursorowych lub progenitorowych oligodendrocytów (OPC) z komórek prekursorowych neuronów z wykorzystaniem mózgu płodu w drugim trymestrze. Jednakże komórki te nie proliferują wobec braku komórek wspierających, takich jak astrocyty i neurony, i są szybko utracone w czasie trwania hodowli. Istnieje zatem zapotrzebowanie na system hodowli pozwalający na wytwarzanie komórek linii oligodendrocytów odpowiednich do eksperymentów in vitro.
Hodowla pierwotnych ludzkich oligodendrocytów mogłaby być na przykład użytecznym modelem do badania patogenezy neurotropowych czynników zakaźnych, takich jak ludzki poliomawirus JCV, który in vivo infekuje te komórki. Hodowane komórki te mogłyby również stanowić modele innych chorób demielinizacyjnych ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Pierwotne, wielopotencjalne ludzkie komórki progenitorowe układu nerwowego pochodzące z mózgu płodowego proliferują in vitro, zachowując zdolność do różnicowania się w neurony (neurony pochodzące z progenitorów, PDN) i astrocyty (astrocyty pochodzące z progenitorów, PDA). Niniejsze badanie pokazuje, że progenitory neuronalne mogą zostać indukowane do różnicowania się poprzez wiele etapów rozwoju linii oligodendrocytarnej (oligodendrocyty pochodzące z progenitorów, PDO). Hodujemy komórki progenitorowe układu nerwowego w bezserwatkowym medium DMEM-F12 uzupełnionym o podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), czynnik wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGF-AA), białko Sonic hedgehog (Shh), czynnik neurotroficzny 3 (NT-3), N-2 oraz trijodotyroninę (T3). Hodowane komórki są pasażowane w zagęszczeniu 2.5e6 komórek na kolby 75cm w przybliżonych odstępach siedmiodniowych. W tych warunkach większość komórek w hodowli zachowuje morfologię charakteryzującą się niewielką liczbą wypustek i wykazuje ekspresję markerów komórek pre-oligodendrocytarnych, takich jak A2B5 i O-4. Po usunięciu czterech czynników wzrostu (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) i dodaniu medium kondycjonowanego z PDN, komórki zaczynają wytwarzać więcej wypustek i wykazują ekspresję markerów specyficznych dla różnicowania oligodendrocytów, takich jak GalC i podstawowe białko mieliny (MBP). Przeprowadziliśmy charakterystykę fenotypową z wykorzystaniem wielokolorowej cytometrii przepływowej w celu zidentyfikowania unikalnych markerów oligodendrocytów.

Bardzo ważne jest rozpoczęcie procesu różnicowania od hodowli komórek progenitorowych neuronów o konfluencji 70%-80% (Rysunek 1A). Wiele komórek obumrze po zmianie pożywki hodowlanej z pożywki dla progenitorów na pożywkę dla oligodendrocytów, ponieważ zawiera ona specyficzne czynniki wzrostu. Wskazuje to, że wzrost komórek progenitorowych neuronów, które nie są zobligowane do fenotypu oligodendrocytycznego, nie będzie wspierany przez nową pożywkę (Rysunek 1B). Inkubacja w pożywce dla oli...

Pierwotne, wielopotencjalne komórki progenitorowe pochodzące z ludzkiego płodowego mózgu proliferują in vitro, zachowując zdolność do różnicowania się w neurony i astrocyty. Niniejsza praca wykazuje, że progenitorom neuralnym można indukować różnicowanie poprzez kolejne stadia linii oligodendrocytarnej za pomocą kondycjonowania wybranymi czynnikami wzrostu.

System hodowli oligodendrocytów pochodnych z komórek progenitorowych ludzkiego płodu

Różnicowanie ludzkich progenitorów neuronalnych w typy komórek neuronalnych i glejowych stanowi model do badania i porównywania regulacji molekularnej rozwoju linii komórek nerwowych. Ekspansja in vitro progenitorów neuronalnych z tkanki płodowego OUN została dobrze opisana. Pomimo identyfikacji i izolacji progenitorów glejowych z dorosłej podkorowej białej istoty ludzkiego mózgu oraz opracowania różnych warunków hodowli w celu ukierunkowania różnicowania płodowych progenitorów neuronalnych w produkujące mielinę oligodendrocyty, pozyskiwanie wystarczającej liczby ludzkich oligodendrocytów do eksperymentów in vitro wciąż pozostaje trudne. Opisano różnicowanie prekursorów lub progenitorów oligodendrocytów (OPC) GalC+ (galaktocerebrosyd+) i O4+ z komórek prekursorowych neuronów z wykorzystaniem mózgu płodowego z drugiego trymestru. Jednakże komórki te nie proliferują wobec braku komórek wspierających, w tym astrocytów i neuronów, i są szybko tracone w czasie trwania hodowli. Wciąż istnieje potrzeba stworzenia systemu hodowli pozwalającego na uzyskanie komórek linii oligodendrocytów odpowiednich do eksperymentów in vitro. Hodowla pierwotnych ludzkich oligodendrocytów mogłaby być, na przykład, przydatnym modelem do badania patogenezy neurotropowych czynników zakaźnych, takich jak ludzki polyomavirus (JCV), który in vivo infekuje te komórki. Hodowane komórki mogłyby również służyć jako modele innych chorób demielinizacyjnych ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Pierwotne, pochodzące z ludzkiego mózgu płodowego, multipotencjalne komórki progenitorowe neuronów proliferują in vitro, zachowując zdolność do różnicowania się w neurony (neurony pochodzące z progenitorów, PDN) i astrocyty (astrocyty pochodzące z progenitorów, PDA). Niniejsze badanie wykazuje, że progenitorzy neuronalni mogą być indukowani do różnicowania się poprzez wiele etapów rozwoju linii oligodendrocytów (oligodendrocyty pochodzące z progenitorów, PDO). Hodujemy komórki progenitorowe neuronów w bezsurowiczym medium DMEM-F12 uzupełnionym o podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), czynnik wzrostu pochodzący z płytek krwi (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), czynnik neurotroficzny 3 (NT-3), N-2 oraz trijodotyroninę (T3). Hodowane komórki są pasażowane w gęstości 2,5e6 komórek na kolby o powierzchni 75 cm² mniej więcej co siedem dni. W tych warunkach większość komórek w hodowli utrzymuje morfologię charakteryzującą się niewielką liczbą wypustek i wykazuje ekspresję markerów komórek pre-oligodendrocytów, takich jak A2B5 i O-4. Po usunięciu czterech czynników wzrostu (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) i dodaniu medium kondycjonowanego przez PDN, komórki zaczynają wytwarzać więcej wypustek i wykazują ekspresję markerów specyficznych dla różnicowania oligodendrocytów, takich jak GalC i podstawowe białko mieliny (MBP). Przeprowadziliśmy charakterystykę fenotypową z wykorzystaniem wielokolorowej cytometrii przepływowej w celu zidentyfikowania unikatowych markerów oligodendrocytów.

W tym filmie zaprezentowano metodę różnicowania pierwotnych ludzkich płodowych komórek progenitorowych neuronów w oligodendrocyty. Najpierw komórki progenitorowe neuronów są hodowane w medium dla progenitorów do osiągnięcia stanu niemal pełnej konfluencji. Następnie medium dla progenitorów wymienia się na medium dla oligodendrocytów, uzupełnione o czynniki wzrostu, które stymulują proces różnicowania. Następnie komórki są hodowane i namnażane przez trzy tygodnie.Następnie pożywkę dla oligodendrocytów uzupełnioną o czynniki wzrostu wymienia się na pożywkę dla oligodendrocytów bez czynników wzrostu i hoduje komórki przez kolejne od 6 do 10 dni, aż do momentu zaobserwowania zmian fenotypowych pod mikroskopem. Różnicowanie potwierdza się następnie za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej oraz cytometrii przepływowej z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych dla linii oligodendrocytów. Ostatecznie pomyślnie zróżnicowane oligodendrocyty mogą być wykorzystane w badaniach in vitro nad biologią oligodendrocytów i ich interakcjami z czynnikami zakaźnymi, takimi jak ludzki poliomawirus JCV.Jedną z rzeczywistych zalet techniki opracowanej w naszym laboratorium w porównaniu z metodami opisanymi w literaturze jest fakt, że w naszym systemie oligodendrocyty mogą być hodowane i różnicowane bez konieczności stosowania komórek wspierających, takich jak astrocyty i neurony. Kolejną zaletą naszego protokołu jest, naszym zdaniem, możliwość hodowli dużej liczby tych prekursorowych oligodendrocytów wykazujących ekspresję markerów takich jak ol4, które mogą być hodowane w kulturze bezpatogenowej przez wiele tygodni, tworząc liczne populacje komórek przy jednoczesnym zachowaniu ich fenotypu. Końcowym wynikiem różnicowania jest uzyskanie niemal czystej populacji oligodendrocytów.Pomysł na tę metodę pojawił się u nas podczas analizy obszernej literatury dotyczącej różnicowania oligodendrocytów in vitro w komórkach szczura i myszy. Inni badacze usuwali czynniki wzrostu z hodowli w celu zakończenia procesu różnicowania komórek. Procedurę tę zgodnie z naszym protokołem zaprezentuje Alexa Bandon, studentka studiów licencjackich w naszym laboratorium tutaj, w NINDS.W ramach przygotowania do różnicowania, wyhoduj multipotencjalną populację komórek progenitorowych układu nerwowego w kolbach powlekanych polilizyną w podstawowym medium neuronalnym, uzupełnionym o BFGF i EGF; usuń wszelkie niewykorzystane komórki. Gdy kultura osiągnie około 70 do 80% konfluencji, rozpocznij różnicowanie. W tym celu odessań medium dla progenitorów z kolb.Przepłucz komórki raz w PBS, a następnie dodaj 12 mililitrów podłoża oligo z czynnikami wzrostu. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotną atmosferą i 5% carbon dioxide. Po jednym tygodniu pozostałe komórki będą wykazywać wąską morfologię bipolarną.Gdy zróżnicowane komórki osiągną co najmniej 70% konfluencji, usunąć pożywkę i przenieść ją do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Odstawić zachowaną pożywkę warunkową do późniejszego użycia. Następnie szybko dodać do komórek 4 ml 0,05% trypsyny z 0,1% EDTA i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Kolbę należy delikatnie kilkukrotnie opukać, aby ułatwić odrywanie się komórek. Po inkubacji należy zneutralizować działanie trypsyny, dodając do kolby od 4 do 5 ml zachowanego medium kondycjonowanego. Następnie medium wraz z komórkami należy przenieść z powrotem do probówki stożkowej o pojemności 50 ml.Następnie odwiruj medium i komórki przy 310 RCF przez siedem minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu wirowania odessaj nadsącz. Resuspenduj osad komórkowy, delikatnie opukując probówkę, a następnie dodaj świeże medium oligo z czynnikami wzrostu.Delikatnie pipetuj medium i komórki w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórkową. Policz komórki za pomocą cytometru hematologicznego. Następnie przenieś 2,5 miliona komórek do nowych kolb T 75 powlekanych polilizyną i umieść hodowlę w inkubatorze. Po trzech tygodniach, gdy komórki osiągną 80 do 85% konfluencji, odessaj z kolby medium oligo z czynnikami wzrostu.Przepłucz raz buforem PBS, a następnie dodaj 12 mililitrów medium oligo bez czynników wzrostu oraz cztery mililitry nieukondycjonowanego medium dla neuronów pochodzących z komórek progenitorowych. Hoduj komórki w tym medium przez 6 do 10 dni, wymieniając je w dni co drugi. Ocen przede wszystkim stopień różnicowania oraz konfluencję komórek za pomocą mikroskopii kontrastowej i wymień co najmniej 50% medium po odstawieniu czynników wzrostu; komórki będą stopniowo rozwijać liczne wypustki, co świadczy o prawidłowym różnicowaniu komórek w oligodendrocyty pochodzące z komórek progenitorowych.Na tym etapie oligodendrocy pochodzące z komórek progenitorowych mogą zostać wykorzystane do cytometrii przepływowej lub eksperymentów z immunofluorescencją, zgodnie z opisem w następnych sekcjach tego filmu. Analiza cytometryczna pozwala porównać nabywanie markerów oligodendrocytów podczas procesu różnicowania w relacji do ich populacji rodzicielskiej. Ludzkie komórki progenitorowe neuronów służą jako kontrole. Do każdej z dwóch kolb T 75 powlekanych polilizyną przenosi się 2,5 miliona oligodendrocytów pochodzących z komórek progenitorowych w medium oligo z czynnikami wzrostu; inkubacja w 37 °C. Tydzień później w jednej z kolb należy wymienić medium na świeże medium oligo zawierające czynniki wzrostu, aby służyło ono jako kontrola żywotności komórek.Wymień pożywkę w drugiej kolbie na świeżą pożywkę do oligodendrocytów bez czynników wzrostu. Hoduj te komórki przez maksymalnie 10 dni; od trzech do dziewięciu dni po usunięciu czynników wzrostu komórki zaczną wytwarzać więcej wypustek typowych dla fenotypu oligodendrocytów. Aby odseparować komórki oligodendrocytów pochodzące z komórek progenitorowych, odessaj pożywkę i dodaj 5,25 milliliters roztworu perian do każdej kolby.Zamiast trypsyny stosuje się Perian, ponieważ wykazuje on łagodniejsze działanie na komórki podczas dysocjacji. Aby zachować morfologię komórkową, inkubowano w temperaturze 37 °C przez 15 do 30 minut. Okresowo sprawdzano odrywanie się komórek za pomocą mikroskopu.Po ododerwaniu komórek należy dodać pięć mililitrów pożywki z czynnikami wzrostu lub bez nich, aby zatrzymać reakcję. Następnie zawartość każdej kolby należy przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Probówki należy wirować z siłą 310 RCF przez siedem minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu należy odessać nadsącz i zawiesić osady komórkowe w czterech mililitrach normalnej pożywki fizjologicznej, uzupełnionej o jeden miligram na mililitr albuminy surowicy bydlęcej lub NPM plus BSA.Następnie należy policzyć komórki w ten sam sposób co wcześniej, a następnie dla każdego wariantu immunobarwienia przenieść 1 milion komórek do pięciomililitrowej probówki z polipropylenu. Należy pamiętać o uwzględnieniu wszystkich odpowiednich kontroli, aby potwierdzić swoistość każdego odczynnika immunologicznego. Następnie, w celu przeprowadzenia immunobarwienia, komórki inkubuje się najpierw z przeciwciałami przeciwko białkom powierzchniowym A2B5, O4 oraz Gal C. Komórki są następnie przemywane w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał pierwszorzędowych i inkubowane z odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi znakowanymi fluorochromem.Następnie komórki ponownie przemywa się, aby usunąć przeciwciała wtórne. Po utrwaleniu 2%paraldehydem i permeabilizacji zimnym, 70%etanolem, w celu zabarwienia białek wewnątrzkomórkowych, komórki przemywa się, a następnie inkubuje z przeciwciałami przeciwko nestynie, kwaśnemu białku włókienstwa gliozy, beta-tubulinie klasy trzeciej oraz podstawowemu białku mieliny. Następnie usuwa się niezwiązane przeciwciała pierwotne poprzez przemywanie.Komórki inkubuje się z odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi znakowanymi fluorochromami. Na koniec, aby odróżnić całe komórki od resztek subkomórkowych podczas analizy cytometrycznej, komórki barwi się za pomocą 4',6-diamidyno-2-fenyloindol dihydrochlororetum (DAPI). Analizę cytometryczną wykonuje się na urządzeniu wyposażonym w trzy lasery, zapewniające długości fal wzbudzenia dostrojone do 488 nanometrów, 647 nanometrów oraz szerokopasmowe UV. W celu przygotowania do mikroskopii immunofluorescencyjnej, przygotowuje się szkiełka pokryte poli-L-lizyną.Płytki sześciodołkowe zawierające 250 000 komórek oligodendrocytów pochodzących z komórek progenitorowych na dołek. Dla każdego punktu czasowego potrzebne są dwie płytki. Jedna hodowana z czynnikami wzrostu i jedna bez nich, gdy komórki osiągną 70 do 80% konfluencji.Odssać pożywkę z czynnikami wzrostu z płytki. Przepłukać raz roztworem PBS, a następnie dodać 12 ml pożywki bez czynników wzrostu. Przeprowadzić barwienie immunocytochemiczne w piątym i dziewiątym dniu po odstawieniu czynników wzrostu w następujący sposób: najpierw utrwalić komórki w 2% PFA przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Następnie usunąć PFA i przemyć komórki trzykrotnie za pomocą PBS, po pięć minut każdego razu. Potem potraktować komórki 0,25% Tritonem, a następnie, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu, zablokować komórki przy użyciu 2% surowicy konia i 10% surowicy kozy. Po blokowaniu inkubować komórki z przeciwciałami przeciwko beta three tubulin, G-F-A-P-M-V-P oh four oraz gal C. Następnie wypłukać niezwiązane przeciwciała z komórek i inkubować komórki z odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi znakowanymi fluorochromem.Wypłucz niezwiązane przeciwciała wtórne z komórek, a następnie, aby zapobiec fotobieleniu i odbarwieniu, zamocuj jądra. Przykryj preparat, stosując 10 µL Prolong Gold z DPI.Wizualizuj znakowane komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednim zestawem filtrów, aby ustalić, czy ludzkie pierwotne komórki progenitorowe neuronów mogą różnicować się w oligodendrocyty. Multipotentne komórki progenitorowe neuronów hodowano zgodnie z opisem w tym filmie. Zmiany fenotypowe monitorowano następnie za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii immunofluorescencyjnej.Jak widać tutaj. Większość progenitorów neuronalnych wykazuje ekspresję markera komórek macierzystych neuroepithelialnych nesting, podczas gdy tylko niewielkie subpopulacje wykazują ekspresję markerów restrykcyjnych dla danej linii, takich jak marker astrocytów GFAP, marker neuronalny beta-tubulina klasy III lub marker oligodendrocytów ol4. Po zastąpieniu pożywki hodowlanej pożywką do oligodendrocytów z dodatkiem czynników wzrostu i hodowaniu komórek przez jeden tydzień, po dwóch tygodniach zaobserwowano spadek ekspresji nesting oraz wzrost ekspresji A2B5.Ekspresja nestyny uległa dalszemu zmniejszeniu, natomiast ekspresja markera prekursorów neuroglejalnych A2B5 wzrosła. Ekspresja innego markera oligodendrocytów, O4, również wzrosła dwa dni po wycofaniu czynników wzrostu. Ekspresja O4 oraz ekspresja GALC, późnego markera oligodendrocytów, wzrosły sześć dni po wycofaniu czynników wzrostu. Współekspresja O4 i GALC wzrosła i była porównywalna ze współekspresją GALC i MBP.Wieloeptitowe barwienie immunologiczne wykazało, że 72% komórek w hodowli wykazywało ekspresję MBP. Dalsze dowody na różnicowanie oligodendrocytów pochodzących z komórek progenitorowych scharakteryzowano za pomocą testu immunofluorescencji. Dwa dni po usunięciu czynników wzrostu wykryto ekspresję MVP, zaznaczoną kolorem zielonym.Wartość ta wzrosła w piątym dniu i uległa dalszemu zwiększeniu w dziewiątym dniu. Lokalizacja MVP w zróżnicowanych oligodendrocytach jest wyraźna. Wspólnie dane te wskazują, że hodowle ludzkich płodowych komórek progenitorowych układu nerwowego z zastosowaniem opisaną metodą są zdolne do proliferacji in vitro, zachowując jednocześnie zdolność do różnicowania się poprzez stadia linii oligodendrocytów.Po opracowaniu tego protokołu technika ta pozwala badaczom z dziedziny biologii rozwoju, neuronauki i wirusologii badać biologię ludzkiego mózgu oraz choroby go dotykające, w szczególności te, które prowadzą do schorzeń istoty białej.

progenitor-derived-oligodendrocyte-culture-system-from-human-fetal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

System kultury oligodendrocytów pochodzących od progenitorów z ludzkiego mózgu płodowego

Ten artykuł opisuje metody uzyskiwania wzbogaconych populacji mysich komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) w hodowli podstawowej, które różnicują się w celu wytworzenia dojrzałych oligodendrocytów (OL). Ponadto w raporcie opisano techniki wytwarzania mysich kokultur mielinizacyjnych poprzez wysiewanie mysich OPC na łożu neurytowym neuronów zwojowych korzenia grzbietowego myszy (DRGN).

Wyprowadzanie wzbogaconych kultur oligodendrocytów i kokultur mielinizujących oligodendrocyty/neurony z postporodowych tkanek myszy

Niniejszy protokół opisuje metodę otrzymywania prekursorów ograniczeń glejowych (Glial Restricted Precursors) z płodowych rdzeni kręgowych oraz ich utrzymywanie in vitro w celu transplantacji lub badania linii oligodendrocytów.

Wyizolowanie prekursorów ograniczonych do linii glejowej (GRP) od myszy w 13. dniu embrionalnym (E13)

Ten film demonstruje szczegółowy protokół izolowania ścian bocznych komór od mózgu dorosłej myszy i przeprowadzania enzymatycznej dysocjacji tkanek w celu uzyskania pojedynczych komórek. Komórki te są następnie poddawane specyficznym warunkom hodowli, które selektywnie zwiększają proliferację nerwowych komórek macierzystych i promują ich różnicowanie w kokultury oligodendrocytów i astrocytów.

Uzyskiwanie mieszanej kultury oligodendrocytów i astrocytów z dorosłych komórek macierzystych nerwowych myszy

Ten film demonstruje ustanowienie kokultury ludzkich neuronów indukowanych (iN) i indukowanych komórek prekursorowych oligodendrocytów (iOPC). iN są mieszane z iOPC w kokulturze, a następnie inkubowane, aby wspierać dojrzewanie zarówno iN do neuronów, jak i iOPC do oligodendrocytów. Neurony tworzą połączenia synaptyczne z innymi neuronami i oligodendrocytami, podczas gdy oligodendrocyty rozwijają osłonki mielinowe wokół aksonów neuronów.

Metoda wspólnej hodowli do modelowania interakcji neuron-oligodendrocyty

Ten film demonstruje technikę izolacji i hodowli komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) z kory mózgowej szczeniąt myszy.

Izolowanie i hodowla komórek prekursorowych oligodendrocytów z kory mózgowej szczeniąt myszy

Oligodendrocyty to komórki mielinizujące ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje metodę izolacji i hodowli ich prekursorów, komórek progenitorowych oligodendrocytów, z kory szczura, a także szybką i wiarygodną metodę ilościową oceny oligodendrogenezy in vitro w odpowiedzi na czynniki eksperymentalne.

Przygotowanie hodowli progenitorowych oligodendrocytów szczurów i kwantyfikacja oligodendrogenezy za pomocą skanowania fluorescencyjnego w podwójnej podczerwieni

Tutaj prezentujemy skuteczną metodę oczyszczania oligodendrocytów i produkcji pożywki kondycjonowanej przez oligodendrocyty, która może być wykorzystana do eksperymentów z kokulturą.

Wytwarzanie oligodendrocytów i pożywki kondycjonowanej oligodendrocytami do eksperymentów z kokulturą

Prezentowany protokół opisuje metodę badania wzrostu neurytów i oceny neurotoksyczności związków małocząsteczkowych.

Test wzrostu neurytów i ocena neurotoksyczności z ludzkimi neuronami pochodzącymi z neuronów progenitorowych

Interakcje neuron-glej w neurodegeneracji nie są dobrze poznane z powodu nieodpowiednich narzędzi i metod. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowane protokoły uzyskiwania indukowanych neuronów, komórek prekursorowych oligodendrocytów i oligodendrocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz podajemy przykłady wartości tych metod w zrozumieniu wkładu specyficznego typu komórki w chorobie Alzheimera.

Generowanie ludzkich neuronów i oligodendrocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania interakcji neuron-oligodendrocyty

Opisujemy produkcję mieszanych kultur astrocytów i komórek prekursorowych oligodendrocytów pochodzących z płodowych lub dorosłych nerwowych komórek macierzystych różnicujących się w dojrzałe oligodendrocyty, oraz modelowanie in vitro szkodliwych bodźców. Połączenie z techniką badań przesiewowych o wysokiej zawartości komórek tworzy niezawodny i solidny system badań przesiewowych leków.

Analiza przesiewowa, różnicowanie i dojrzewanie płodowych i dorosłych komórek macierzystych pochodzących z płodowych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego

Przedstawiamy protokół generowania organoidu ludzkiego mózgu z rezydującym mikroglejem poprzez włączenie do rozwoju organoidów komórek progenitorowych pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do rozwoju organoidów.

Wyprowadzenie organoidu ludzkiego mózgu z rozwojem mikrogleju

Poznaj metodę różnicowania ludzkich komórek progenitorowych w oligodendrocyty in vitro bez komórek wspierających. Protokół umożliwia uzyskanie czystych populacji do badań nad biologią oligodendrocytów.

System hodowli oligodendrocytów pochodnych z komórek progenitorowych ludzkiego płodu

Przeglądaj więcej filmów