Generowanie substratów dla endonukleaz systemów CRISPR/Cas

Ogólnym celem poniższych eksperymentów jest otrzymanie substratów RNA do badania endonukleazy Cas, która odgrywa kluczową rolę w systemach odpornościowych CRISPR-Cas występujących u bakterii i archeonów. W celu uzyskania długiego matrycowego DNA do produkcji RNA in vitro można zastosować amplifikację PCR specyficznego regionu CRISPR, jeśli jest to preferowana metoda.

Dwa oligonukleotydy mogą zostać zhybrydyzowane w celu wygenerowania krótszych matryc do produkcji substratowego RNA. Alternatywnie, krótkie, syntetyzowane na zamówienie sekwencje powtórzeń mogą być następnie testowane w testach z endonukleazą CAS. Ostatecznie produkcję transkryptów RNA i ich późniejsze cięcie przez endonukleazę CAS six można zwizualizować za pomocą autoradiografii.

Głównym celem zaprezentowanych technik jest umożliwienie badaczom analizy przetwarzania CRISPR RNA przy użyciu substratów RNA o różnej długości. W związku z tym stosuje się różne metody generowania małych cząsteczek RNA, na przykład pojedynczych elementów powtórzeniowych, lub większych cząsteczek RNA, takich jak transkrypty CRISPR RNA obejmujące kilka spacerów. Chociaż metody te dostarczają konkretnych informacji na temat dojrzewania CRISPR RNA, podobne strategie przygotowania matrycy można zastosować w odniesieniu do innych systemów przetwarzania RNA. Procedurę zademonstrują student studiów magisterskich oraz postdoc, oboje z laboratorium zajmującego się bakteryjnymi i archeonowymi systemami odpornościowymi CRISPR.

Wirusowa sekwencja DNA, zwana protospacerem, może zostać wstawiona pomiędzy dwa elementy powtarzalne w rosnącym klastrze CRISPR w procesie zwanym adaptacją. Następnie cały klaster CRISPR ulega transkrypcji, a potem jest przetwarzany w małe CRISPR RNA przez endonukleazę Cas, na przykład Cas6. Małe CRISPR RNA są następnie włączane do kompleksu białkowego Cas kaskada i pośredniczą w obronie gospodarza przed powtarzającym się atakiem wirusa, wykorzystując komplementarność zasad między CRISPR RNA a protospacerem jako sygnał do degradacji wirusowego DNA w celu wytworzenia długich substratów pre-CRISPR RNA.

Zacznij od zaprojektowania starterów PCR, celujących w regiony spacerowe klastra CRISPR, poprzez dodanie sekwencji promotora polimerazy RNA T7 do startera forward. Następnie dodaj miejsca restrykcyjne do obu starterów w celu klonowania produktu PCR do wektora. Należy pamiętać, że polimeraza RNA T7 wymaga reszty guaniny do prawidłowej inicjacji transkrypcji po amplifikacji za pomocą PCR interesującej sekwencji pre-CRISPR RNA z DNA genomowego.

Rozdziel produkty PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i wyizoluj z żelu pożądany fragment, a następnie poddaj produkt PCR trawieniu enzymami restrykcyjnymi w celu utworzenia lepkich końców. Następnie, po oczyszczeniu produktu PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR w celu usunięcia produktów ubocznych cięcia, dodaj T4 DNA Ligase, bufor T4 DNA Ligase oraz przecięty produkt PCR i powiązany wektor pUC z odpowiadającymi lepkimi końcami w stosunku molowym 3:1. Inkubuj reakcję ligacji w temperaturze 16 °C przez noc, a następnie wprowadź mieszaninę do kompetentnych komórek E. coli DH5α zgodnie ze standardowymi protokołami, wykorzystując selekcję niebiesko-białą w celu zidentyfikowania udanej ligacji.

Na koniec wyizoluj plazmidy z białych kolonii, korzystając z zestawu do preparatyki plazmidów, i zidentyfikuj pozytywne klony poprzez sekwencjonowanie plazmidów w celu uzyskania substratów pre-CRISPR RNA o średniej wielkości. Rozpocznij od zaprojektowania oligonukleotydów forward i reverse z pożądaną sekwencją odstępów powtórzeń CRISPR, podobną do sekwencji pokazanych tutaj. Należy zauważyć, że oligonukleotydy zawierają sekwencję promotora polimerazy RNA T7, a także terminalne miejsca restrykcyjne na końcach oligonukleotydów, aby zapewnić powstanie lepkich końców.

Po krótkim inkubowaniu inkubuj próbki z T4 polinukleotydową kinazą oraz buforem do T4 polinukleotydowej kinazy przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C, aby przeprowadzić fosforylację końców 5' 1 nmol każdego z oligonukleotydów. Następnie inkubuj fosforylowane oligonukleotydy sens i antysens w buforze do ligazy DNA T4 przez pięć minut w temperaturze 95 °C na bloku grzewczym. Po hybrydyzacji próbek wyłącz źródło ciepła i pozostaw mieszaninę do ostygnięcia przez około dwie do trzech godzin, aż osiągnie temperaturę pokojową.

Następnie przeprowadź ligację otrzymanych oligonukleotydów z mieszaniną hybrydyzacyjną zawierającą trawiony i defosforylowany wektor P, bufor do ligacji DNA T4 oraz T4 DNA ligazę w temperaturze 16°C przez noc. Następnie wprowadź ligowane plazmidy do kompetentnych komórek E. coli szczepu DH5α zgodnie ze standardowymi protokołami, wykorzystując selekcję niebiesko-białą w celu zidentyfikowania poprawnych ligacji. Na koniec wyizoluj plazmidy i zidentyfikuj pozytywne klony poprzez trawienie enzymatyczne i następujące po nim sekwencjonowanie plazmidów.

Krótkie sekwencje substratów RNA dla cas z pojedynczym powtórzeniem można zaprojektować w sposób podobny do sekwencji przedstawionych tutaj. Należy upewnić się, że w skład sekwencji wchodzi deoksyrybonukleotyd. W przypadku konieczności określenia miejsca cięcia RNA, do produkcji oligonukleotydu RNA można wykorzystać zewnętrzną firmę zajmującą się syntezą na zamówienie.

Po wyizolowaniu plazmidów z wybranym, dostosowanym substratem, należy zlinearyzować plazmidy za pomocą enzymu restrykcyjnego tnącego w regionie poniżej sklonowanych fragmentów, wykorzystując zestaw do puryfikacji plazmidów maxi prep. Po upewnieniu się, że trawienie przebiegło całkowicie, należy oczyścić zlinearyzowany plazmid poprzez ekstrakcję fenolowo-chloroformową i precypitację etanolem. Kwasy nukleinowe odzyskuje się poprzez resuspensję osadu w sterylnej wodzie traktowanej DEPC.

Następnie inkubuj plazmidy trawienne w świeżo przygotowanej mieszaninie do transkrypcji runoff in vitro z polimerazą RNA T7, zawierającej ATP, CTP, GTP i UTP, przez trzy godziny w temperaturze 37°C. Na koniec przeanalizuj otrzymane transkrypty RNA na denaturującym żelu poliakryloamidowym 12% z 8 M mocznikiem. Można również oczyścić transkrypty za pomocą chromatografii wymiany anionowej Mono Q, a następnie odzyskać transkrypty poprzez wytrącanie frakcji RNA etanolem i ponowne zawieszenie osadów w sterylnej wodzie traktowanej DEPC, aby przeanalizować zaprojektowane substraty za pomocą testów z endonukleazą; rozpocznij od wizualizacji prążków substratów za pomocą autoradiografii i oczyszczenia produktów reakcji poprzez ekstrakcję z żelu z 8 M mocznikiem w warunkach denaturujących.

żel 12% poliakryloamidowy, a następnie wytworzyć i oczyścić pożądane rekombinowane białka Cas poprzez wytrącanie termiczne oraz chromatografię na kolumnie z niklem NTA, zgodnie z procedurą przedstawioną dla białka Cas6 z Clostridium thermocellum. Następnie połączyć białko Cas ze świeżo przygotowaną mieszaniną reakcyjną do endonukleazy i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37°C, aby umożliwić zajście reakcji testu endonukleazy. Na koniec nanieść 5 µL mieszaniny reakcyjnej na żel z 8M mocznikiem.

12% żel poliakrylamidowy i wizualizacja produktów cięcia po elektroforezie za pomocą autoradiografii. Poniżej przedstawiono barwiony błękitem Coomassie żel poliakrylamidowy z autorskim oligonukleotydem RNA oraz dwoma transkryptami RNA otrzymanymi in vitro. Należy zauważyć, że wydajność produkcji RNA różni się w zależności od tego, czy konstrukty mają krótką, długą, czy średnią długość.

Badanie aktywności endonukleazy RNA wymaga dodatnich i ujemnych kontroli, a także wysoko oczyszczonych rekombinowanych białek Cas. Na tej rycinie przedstawiono żel SDS-PAGE preparatu próbki Cas6 z Clostridium thermocellum.

Przedstawiono przebieg chromatografii Ni-NTA po wytrącaniu termicznym, przeprowadzony wraz ze standardowym markerem białkowym. Odpowiednia próbka kontrolna ujemna powinna zawierać lizat komórkowy bez ekspresji CAS6, jednak po zastosowaniu identycznej procedury oczyszczania CAS6 stwierdzono, że preparat CAS6 posiada wymaganą wysoką czystość. Tutaj cięcie substratu sekwencji powtórzeniowej znakowanej na końcu 5' przez białko CAS6 z co Clostridium thermocellum można zwizualizować za pomocą autoradiografii.

Każda ścieżka zawiera radioaktywnie znakowany substrat: RNA po inkubacji z białkiem ca six, co oznaczono znakami plus, lub z buforem jako kontrolą negatywną, co oznaczono znakami minus; substraty długie lub krótkie z dodatkiem lub bez dodatku deoksyrybonukleotydu w pozycji minus dziewięć, co miało na celu ułatwienie reakcji endonukleazy. Należy zwrócić uwagę na brak cięcia krótkich substratów w przypadku włączenia deoksyrybonukleotydu do cząsteczki RNA po zastosowaniu tej procedury.

Nukleazy Cas6 mogą być również wykorzystywane jako narzędzie do generowania dojrzałych, precyzyjnie przyciętych cząsteczek RNA. Cząsteczki RNA te mogą być włączane do kompleksów Cascade w celu uzyskania informacji na temat ich udziału w interferencji w odpowiedzi na ataki wirusowe. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak projektować i wytwarzać substraty CRISPR dla nukleaz Cas.

Te różne substraty są użyteczne w badaniu kwestii dotyczących dojrzewania i wykorzystania crispr Es.