Name: Generowanie substratów dla endonukleaz systemów CRISPR/Cas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Poznaj metody generowania substratów RNA dla endonukleaz Cas w systemach CRISPR bakterii i archeonów. Techniki PCR, synteza oligonukleotydów i autorradiografia umożliwiają badanie dojrzewania crRNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Jeanette Schermuly za przygotowanie rekombinowanej polimerazy RNA T7 oraz Normanowi Ebeltowi za pomoc w przygotowaniu Rysunku 1. Praca ta była finansowana ze środków Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) oraz Max Planck Society.

1. Generowanie długich substratów pre-crRNA za pomocą PCR
<ol>
	<li>Zaprojektować startery PCR nakierowane na regiony spacerowe klastra CRISPR. Do startera forward dodać sekwencję promotora polimerazy RNA T7 (T7RNAP) (5' -taatacgactcactata-3'), a do obu starterów miejsca restrykcyjne umożliwiające klonowanie produktu PCR do wektora (np. BamHI i Hind III dla pUC19, Rys. 2A). 
	Uwaga: T7RNAP wymaga obecności reszty guanidyny do prawidłowej inicjacji transkrypcji.</li>
	<li>Przeprowadzić amplifikację PCR interesującej sekwencji pre-crRNA z DNA genomicznego.</li>
	<li>Rozdzielić produkty PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i wyciąć pożądany prążek z żelu. Strawić produkt PCR enzymami restrykcyjnymi w celu utworzenia lepkich końców (np. BamHI i HindIII, Rys. 2A). Oczyścić produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania produktów PCR, aby usunąć produkty uboczne cięcia.</li>
	<li>Przygotować reakcję ligacji zawierającą ligazę DNA T4, bufor do ligazy DNA T4 oraz produkt PCR po trawieniu i zdefosforylowany liniowy wektor pUC z odpowiadającymi lepkimi końcami w stosunku molowym 3:1. Inkubować mieszaninę w temperaturze 16 °C przez noc. Przenieść mieszaninę ligacyjną do kompetentnych komórek Escherichia coli DH5α zgodnie ze standardowymi protokołami i zastosować selekcję biało-niebieską w celu zidentyfikowania udanych ligacji.</li>
	<li>Wyizolować plazmidy z białych kolonii przy użyciu zestawu do preparatyki plazmidów. Zidentyfikować pozytywne klony poprzez sekwencjonowanie plazmidów. Alternatywnie, do przesiewania można wykorzystać PCR kolonii.</li>
</ol>
2. Generowanie pośrednich substratów pre-crRNA poprzez hybrydyzację oligonukleotydów DNA
<ol>
	<li>Zaprojektuj oligonukleotydy forward i reverse z pożądaną sekwencją powtórzeń/spacerów CRISPR. Oligonukleotydy zawierają sekwencję promotora T7 RNAP oraz terminalne miejsca restrykcyjne (np. BamHI i Hind III dla pUC19). Zakończ oligonukleotydy w sposób zapewniający powstanie lepkich końców po wyżarzaniu (patrz Rys. 2B).</li>
	<li>Przeprowadź 5'-fosforylację 1 nmol każdego oligonukleotydu w oddzielnej reakcji o objętości 20 μl zawierającej 5 μl kinazy polinukleotydowej T4 (PNK), 2 μl buforu 10x do T4 PNK oraz 2 μl ATP (10 mM). Inkubuj każdą próbkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zhybrydyzuj dwa fosforylowane oligonukleotydy. Połącz 1 μl mieszaniny fosforylowanego oligo forward (z punktu 2.2.), 1 μl mieszaniny fosforylowanego oligo reverse (z punktu 2.2.) oraz 1 μl buforu 10x do T4 DNA ligazy w reakcji o objętości 10 μl. Inkubuj próbki przez 5 min w 95 °C na bloku grzewczym lub w wrzącej wodzie, wyłącz źródło ciepła i pozwól mieszaninie ostygnąć do temperatury pokojowej (~2-3 godziny). 
	Uwaga: W tym krytycznym etapie powolny proces chłodzenia sprzyja wyżarzaniu dwóch oligonukleotydów w porównaniu do tworzenia struktur w obrębie pojedynczego oligonukleotydu.</li>
	<li>Przeprowadź ligację 4 μl mieszaniny hybrydyzacyjnej oraz 1 μl trawionego i defosforylowanego wektora pUC (0,1 μg/μl) z użyciem T4 DNA ligazy, buforu 10x do T4 DNA ligazy i 10 mM ATP w 20 μl mieszaniny ligacyjnej. Inkubuj próbkę w 16 °C przez noc.</li>
	<li>Transformuj ligowane plazmidy do kompetentnych komórek Escherichia coli DH5α zgodnie ze standardowymi protokołami i zastosuj selekcję niebiesko-białą. Izoluj plazmidy i identyfikuj pozytywne klony poprzez trawienie (w celu weryfikacji insertów o pożądanej wielkości) oraz następujące po nim sekwencjonowanie plazmidów.</li>
</ol>
3. Generowanie krótkich substratów Cas RNA poprzez syntezę niestandardowych oligonukleotydów RNA
Zaprojektuj krótkie substraty RNA dla Cas (np. sekwencje pojedynczych powtórzeń, Rys. 2C) i skorzystaj z usług komercyjnej syntezy oligonukleotydów RNA.
Uwaga: Wprowadzenie deoksyrybonukleotydu w określonej pozycji oligonukleotydu RNA (Rys. 2C) może zostać wykorzystane do precyzyjnego wskazania miejsca rozcięcia RNA.
4. Transkrypcja in vitro za pomocą polimerazy RNA T7
<ol>
	<li>Wyizoluj plazmidy z zaprojektowaną konstrukcją (z pkt 1.9. lub 2.7.) przy użyciu zestawu do maxiprepu służącego do oczyszczania plazmidów.</li>
	<li>Zlinearyzuj plazmid za pomocą enzymu restrykcyjnego, który tnie w miejscu poniżej sklonowanego fragmentu (np. HindIII). Upewnij się, że trawienie przebiegło całkowicie. 
	Uwaga: Jeśli pożądany jest odmienny, zdefiniowany koniec 3' transkryptu RNA, zaprojektowana konstrukcja powinna zawierać dodatkową specyficzną sekwencję rozpoznawania enzymu restrykcyjnego do transkrypcji typu „run-off” powyżej sekwencji HindIII.</li>
	<li>Oczyść zlinearyzowany plazmid poprzez ekstrakcję fenol:chloroform (1:1) oraz precypitację etanolem. Odzyskaj kwasy nukleinowe, resuspendując osad w sterylnej wodzie traktowanej DEPC.</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę do transkrypcji in vitro typu run-off z wykorzystaniem T7 RNAP, zawierającą 40 mM Hepes/KOH (pH 8), 22 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 1 mM spermidynę, 4 mM każdego nukleozydotrifosforanu (ATP, CTP, GTP, UTP), 40-100 μg/ml strawionego plazmidu oraz 0.1 mg/ml T7 RNAP w wodzie traktowanej DEPC. Inkubuj przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przeanalizuj otrzymane transkrypty RNA na denaturującym żelu poliakrylamidowym 12% z 8 M mocznikiem (Rys. 3A). Transkrypty RNA można oczyścić za pomocą chromatografii wymiany anionowej Mono Q13 i odzyskać poprzez precypitację etanolem frakcji RNA oraz resuspensję osadu w sterylnej wodzie traktowanej DEPC. Do późniejszego wykorzystania przechowuj RNA w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
5. Test endonukleazy Cas6
<ol>
	<li>Przygotuj 20 μl in vitro mieszanina do transkrypcji z T7 RNAP (patrz 4.4), zawierająca zmniejszoną ilość ATP (2 mM) i uzupełniona o 2.5 μl α-[32[P]-ATP (10 mCi/ml, 5000 Ci/mmol). Produkty reakcji należy oczyścić poprzez ekstrakcję z żelu z denaturującego żelu poliakrylamidowego 12% z dodatkiem 8 M mocznika. Prążki należy uwidocznić za pomocą autoradiografii.</li>
	<li>Wytworzyć i oczyścić pożądane rekombinowane białka Cas. W tym przykładzie białko Cas6 z Clostridium thermocellum oczyszczono metodą precypitacji termicznej oraz chromatografii Ni-NTA.</li>
	<li>Przygotuj reakcję testu endonukleazy (np. dla Clostridium thermocellum Cas6, mieszanina reakcyjna zawiera 20 mM Hepes (KOH pH8), 250 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 12 000 cpm substratu RNA oraz 1 μM enzym i inkubowano w 37 °C przez 30 min).</li>
	<li>Załaduj 5 μl mieszaniny reakcyjnej (+ 10 μl bufor do ładowania RNA zawierający 95% formamid) na żel poliakrylamidowy 12% z 8 M mocznikiem. Produkty cięcia po elektroforezie należy zwizualizować za pomocą autoradiografii.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Przykład substratów RNA do analizy aktywności endonukleazy Cas przedstawiono na rysunku 3A. Nanoszono alikwot 5 μl z analitycznej reakcji transkrypcji in vitro o objętości 100 μl. Należy pamiętać, że wydajność produkcji RNA różni się w zależności od zastosowanych konstruktów. Zaobserwowano, że na ilość uzyskanego RNA wpływają następujące czynniki: (i) sekwencja początkowa następująca po +1G niezbędnym do inicjacji transkrypcji, (ii) możliwość tworzenia się struktur RNA podczas transkrypcji oraz (iii) wybór miejsca restrykcyjnego dla wygenerowania pozycji cięcia run-off.
Badanie aktywności endonukleazy RNA wymaga zarówno wysoce oczyszczonych rekombinowanych białek Cas (Ryc. 3B), jak i odpowiednich kontroli negatywnych. W idealnym przypadku próbka kontroli negatywnej różni się jak najmniej od badanej reakcji endonukleazy Cas. Można to osiągnąć poprzez inkubację RNA z buforem reakcyjnym i lizatem komórkowym bez ekspresji Cas (stosując identyczną procedurę oczyszczania). Idealną kontrolą negatywną jest dodanie deoksyrybonukleotydu w proponowanym miejscu cięcia. Na Ryc. 3C przedstawiono cięcie sekwencji powtórzonej znakowanej na końcu 5' dla Cas6 z Clostridium thermocellum. W identycznych warunkach powtórzenie to przestaje być substratem, gdy w pozycji -9 wprowadzony zostanie deoksyrybonukleotyd. Metoda ta dostarcza również informacji o miejscu cięcia. Na koniec, długie, znakowane wewnętrznie pre-crRNA zostaje przecięte przez Cas6, co pozwala na zaobserwowanie dwóch fragmentów cięcia.
<img alt="Schemat CRISPR: proces edycji genów, interakcja Cas1-Cas3, transkrypcja crRNA, etapy interferencji." src="/files/ftp_upload/4277/4277fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Schematyczny przegląd aktywności CRISPR/Cas. Przegląd przedstawia insercję wirusowej sekwencji DNA (protospacera) do klastra CRISPR (adaptacja), transkrypcję i przetwarzanie macierzy CRISPR w małe crRNA przez endonukleazę Cas6, wbudowanie crRNA do kompleksu Cascade oraz interferencję w przypadku ponownego ataku wirusa w oparciu o komplementarność między crRNA a protospacerem. Motywy sąsiednie protospacera (PAM) oznaczają wirusowe sekwencje protospacerów.
<img alt="Proces transkrypcji pre-crRNA CRISPR; schemat przedstawia etapy amplifikacji PCR i transkrypcji in vitro." src="/files/ftp_upload/4277/4277fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Generowanie substratów RNA dla białek Cas. Schemat przedstawia przebieg procesu generowania (A) długich substratów pre-crRNA, (B) pośrednich substratów pre-crRNA oraz (C) krótkich substratów RNA Cas do produkcji pre-crRNA. Przedstawiono przykładowe sekwencje dla macierzy CRISPR Clostridium thermocellum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4277/4277fig2large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.
<img alt="Substraty RNA i wyniki testu endonukleazy Cas6; schemat żelu elektroforetycznego; prążek białka 28 kDa." src="/files/ftp_upload/4277/4277fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
 Rysunek 3. Test endonukleazy Cas6. A.) Żel poliakrylamidowy barwiony błękitem toluidyny z zastosowaniem zaprojektowanego na zamówienie oligonukleotydu RNA (250 pmol) oraz dwóch transkryptów RNA in vitro (5 μl z typowej reakcji o objętości 100 μl). B.) Żel SDS-PAGE preparatu Cas6 (80 pmol) z Clostridium thermocellum po wytrąceniu termicznym w 50°C przez 1 godzinę i chromatografii Ni-NTA. C.) Wykrywanie aktywności endonukleolitycznej Cas6 dla sekwencji powtórzeń znakowanych na końcu 5' oraz transkryptów pre-crRNA in vitro. Wprowadzenie dNTP w pozycji -9 znosi cięcie przez Cas6 w przypadku krótkiego substratu RNA Cas (S, Rys. 2C). Dla dojrzewania crRNA z długich substratów pre-crRNA generowany jest również 8 nt znacznik na końcu 5' (L, Rys. 2A). Prążki rozdzielono na denaturującym żelu poliakrylamidowym 12% z 8 M mocznikiem i wizualizowano za pomocą autoradiografii.

<ol><li>Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315, 1709-1712 (2007).</li>
<li>Makarova, K. S., Grishin, N. V., Shabalina, S. A., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+RNA-interference-based+immune+system+in+prokaryotes%3A+computational+analysis+of+the+predicted+enzymatic+machinery%2C+functional+analogies+with+eukaryotic+RNAi%2C+and+hypothetical+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Direct%22%5BJournal%5D)">A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action.</a> Biol. Direct. 1, 7(2006).</li>
<li>Lillestøl, R. K., Redder, P., Garrett, R. A., Brugger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+viral+defence+mechanism+in+archaeal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archaea%22%5BJournal%5D)">A putative viral defence mechanism in archaeal cells.</a> Archaea. 2, 59-72 (2006).</li>
<li>Makarova, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+classification+of+the+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems.</a> Nat. Rev. Microbiol. 9, 467-477 (2011).</li>
<li>Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321, 960-964 (2008).</li>
<li>Carte, J., Pfister, N. T., Compton, M. M., Terns, R. M., Terns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+and+cleavage+of+CRISPR+RNA+by+Cas6%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Binding and cleavage of CRISPR RNA by Cas6.</a> RNA. 16, 2181-2188 (2010).</li>
<li>Haurwitz, R. E., Jinek, M., Wiedenheft, B., Zhou, K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-+and+structure-specific+RNA+processing+by+a+CRISPR+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease.</a> Science. 329, 1355-1358 (2010).</li>
<li>Gesner, E. M., Schellenberg, M. J., Garside, E. L., George, M. M., Macmillan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+and+maturation+of+effector+RNAs+in+a+CRISPR+interference+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recognition and maturation of effector RNAs in a CRISPR interference pathway.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 688-692 (2011).</li>
<li>Carte, J., Wang, R., Li, H., Terns, R. M., Terns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas6+is+an+endoribonuclease+that+generates+guide+RNAs+for+invader+defense+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cas6 is an endoribonuclease that generates guide RNAs for invader defense in prokaryotes.</a> Genes Dev. 22, 3489-3496 (2008).</li>
<li>Wiedenheft, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+RNA-guided+surveillance+complex+from+a+bacterial+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of the RNA-guided surveillance complex from a bacterial immune system.</a> Nature. 477, 486-489 (2011).</li>
<li>Garneau, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR%2FCas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468, 67-71 (2010).</li>
<li>Sinkunas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas3+is+a+single-stranded+DNA+nuclease+and+ATP-dependent+helicase+in+the+CRISPR%2FCas+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system.</a> EMBO J. 30, 1335-1342 (2011).</li>
<li>Jahn, M. J., Jahn, D., Kumar, A. M., Söll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mono+Q+chromatography+permits+recycling+of+DNA+template+and+purification+of+RNA+transcripts+after+T7+RNA+polymerase+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mono Q chromatography permits recycling of DNA template and purification of RNA transcripts after T7 RNA polymerase reaction.</a> Nucleic Acids Res. 19, 2786-2787 (1991).</li>
<li>Sampson, J. R., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+physical+characterization+of+an+unmodified+yeast+phenylalanine+transfer+RNA+transcribed+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Biochemical and physical characterization of an unmodified yeast phenylalanine transfer RNA transcribed in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 1033-1037 (1988).</li>
<li>Dreher, T. W., Bujarski, J. J., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+viral+RNAs+synthesized+in+vitro+show+altered+aminoacylation+and+replicase+template+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutant viral RNAs synthesized in vitro show altered aminoacylation and replicase template activities.</a> Nature. 311, 171-175 (1984).</li>
<li>McGinness, K. E., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+ribonucleotides+in+the+T7+RNA+polymerase+promoter+element%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Substitution of ribonucleotides in the T7 RNA polymerase promoter element.</a> J. Biol. Chem. 277, 2987-2991 (2002).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawione metody umożliwiają generowanie substratów dla endonukleazy Cas o różnych zakresach wielkości oraz z różnym stopniem swobody w projektowaniu sekwencji. Najprostsze podejście do generowania syntetycznych substratów oligonukleotydowych RNA ogranicza się do krótkich projektów RNA ze względu na rosnące koszty i ograniczenia techniczne w tworzeniu dłuższych oligomerów RNA. Chociaż raportowano pomyślną syntezę niemodyfikowanych oligomerów RNA o długości powyżej 100 nukleotydów, praktyczne i ekonomiczne maksimum dla syntezy RNA na zamówienie wynosi poniżej 40 nukleotydów. Jednakże można zsyntetyzować dowolną daną sekwencję, a celowe wprowadzenie zmodyfikowanych nukleotydów (np. ldeoksyrybonukleotydów) może zostać wykorzystane do szczegółowej analizy miejsc cięcia. Dłuższe pre-cRNA należy generować poprzez transkrypcję in vitro.
Hybrydyzacja oligonukleotydów zawierających promotor polimerazy RNA T7 umożliwia produkcję pre-crRNA o średniej długości. Maksymalna długość rutynowo i ekonomicznie syntetyzowanych oligonukleotydów DNA wynosi nieco ponad 150 nukleotydów, co stanowi limit długości syntetycznych pre-crRNA otrzymywanych tą metodą. Złożenie kilku sparowanych oligonukleotydów DNA, które tworzą ze sobą lepkie końce, pozwala zwiększyć tę maksymalną długość, jednak wiąże się to z coraz większymi trudnościami podczas klonowania konstruktu. Główną zaletą tej metody jest możliwość generowania konstruktów pre-crRNA (a tym samym substratów dla endonukleazy Cas) o dowolnej pożądanej sekwencji. Pozwala to na testowanie syntetycznych projektów crRNA.
Wreszcie, większe pre-crRNA można uzyskać z amplikonów PCR całych genomicznych elementów CRISPR lub ich fragmentów. Zmiany w plazmidzie będącym matrycą do transkrypcji in vitro można wprowadzić za pomocą mutagenezy celowanej w celu wygenerowania wariantów pre-crRNA. Konstrukcje te mogą być wykorzystane do analizy globalnego wzorca cięcia endonukleolitycznego w obrębie całego pre-crRNA.
Pionierskie prace nad produkcją niemodyfikowanego RNA za pomocą transkrypcji in vitro polimerazą RNA T7 opierały się na tRNA 14 oraz RNA wirusa mozaiki bromii 15. Konsensusowy promotor polimerazy RNA T7 składa się z domeny rozpoznawczej (od -17 do -5) oraz domeny inicjującej (od -4 do +6), przy czym inicjacja transkrypcji następuje w kluczowej pozycji guanozyny +1 16. Pozycje poniżej +1 mogą być zmienne, co pozwala na transkrypcję niemal każdej pożądanej sekwencji RNA. Przedstawione metody generowania matryc do transkrypcji typu run-off in vitro umożliwiają syntezę in vitro kompletnych pre-crRNA, które odpowiadają genomowym regionom CRISPR lub syntetycznym wariantom pre-crRNA. Transkrypty są generowane z obecnością trifosforanu na końcu 5', chyba że reakcja transkrypcji jest inicjowana GMP w celu uzyskania końców monofosforanowych 5' 14. Takie końce są wymagane, jeśli transkrypty mają być znakowane za pomocą polinukleotydowej kinazy T4 i γ-[32P]-ATP. Aktywność tnąca enzymów Cas6 i enzymów typu Cas6 generuje crRNA zawierające grupę hydroksylową na końcu 5' oraz cykliczny fosforan 2',3'. Takie cząsteczki RNA mogą następnie zostać poddane analizie pod kątem rozpoznawania przez kompleks Cascade.

<table><tbody><tr><td>Fosfataza antarktyczna</td><td>NEB</td><td>M0289L</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; Ultra-czyste nukleotydotrifosforany do transkrypcji</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-1010 - NU-1013</td><td></td></tr><tr><td>Chromatografia cieczowa, ktapurifier 100</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotydy DNA</td><td>MWG Operon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotydy RNA</td><td>MWG Operon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji z żelu</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania PCR</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Spin Miniprep</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Plasmid Maxi</td><td>QIAGEN</td><td>12163</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R0136L</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R0104L</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza T4 DNA</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Kinaza polinukleotydowa T4</td><td>Ambion</td><td>AM2310</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza RNA T7</td><td>własna preparatyka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka roztworów deoksynukleotydów</td><td>NEB</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>System elektroforetyczny Mini-PROTEAN Tetra</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8001</td><td></td></tr><tr><td>Skaner Storm 840</td><td>GE Healthcare</td><td>163723</td><td></td></tr><tr><td>Ekran fosforowy do przechowywania</td><td>Molecular Dynamics</td><td>63-0034-81</td><td></td></tr><tr><td>Mono Q 5/50 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5166-01</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Phusion High-Fidelity</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td>użyć buforu GC</td></tr><tr><td>Błękit toluidyny</td><td>Sigma</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>pUC19</td><td>NEB</td><td>N3041S</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#947;-[&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]-ATP, &amp;alpha;-[&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]-ATP </td><td>Hartmann Analytic</td><td>SRP-401, SRP-307</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie substratów dla endonukleaz systemów crispr/cas

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

Interakcje wirusów z ich prokariotycznymi gospodarzami ukształtowały ewolucję bakterii i archeonów. Prokarioty wypracowały kilka strategii unikania ataków wirusowych, do których należą modyfikacja restrykcyjna, infekcja abortywna oraz systemy CRISPR/Cas. Te adaptacyjne systemy odpornościowe, występujące u wielu bakterii i większości archeonów, składają się z sekwencji clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) oraz szeregu genów CRISPR associated (Cas) (Ryc. 1) 1-3. Różne zestawy białek Cas i powtórzeń definiują co najmniej trzy główne, rozbieżne typy systemów CRISPR/Cas 4. Przypuszcza się, że uniwersalne białka Cas1 i Cas2 uczestniczą w pobieraniu wirusowego DNA, który wytworzy nowy element dystansowy (spacer) pomiędzy dwoma powtórzeniami na końcu 5' rozszerzającego się klastra CRISPR 5. Cały klaster jest transkrybowany do pre-crRNA zawierającego wszystkie sekwencje spacerowe i powtórzenia, a następnie przetwarzany przez enzym z różnorodnej rodziny Cas6 na mniejsze cząsteczki crRNA 6-8. crRNA te składają się z sekwencji spacerowej flankowanej przez znacznik końcowy 5' (8 nukleotydów) oraz znacznik końcowy 3' pochodzący z sekwencji powtórzenia 9. Ponowna infekcja wirusem może teraz zostać zablokowana, ponieważ nowe crRNA zostanie skierowane przez kompleks białek Cas (Cascade) do wirusowego DNA i zidentyfikuje go dzięki komplementarności zasad10. Ostatecznie, w systemach CRISPR/Cas typu 1, nukleaza Cas3 niszczy wykryte DNA najeźdźcy 11,12.
Procesy te definiują CRISPR/Cas jako adaptacyjny układ odpornościowy prokariotów i otworzyły fascynującą dziedzinę badań nad zaangażowanymi w ten proces białkami Cas. Funkcja wielu białek Cas pozostaje niejasna, a przyczyny pozornej różnorodności systemów CRISPR/Cas wymagają dalszego wyjaśnienia. Potencjalne aktywności większości białek Cas przewidziano za pomocą szczegółowych analiz komputerowych. Wykazano lub zasugerowano, że znaczna część białek Cas pełni funkcję endonukleaz 4.
W niniejszej pracy przedstawiamy metody generowania crRNA oraz prekursorów-crRNA do badań nad endoribonukleazami Cas. Różne testy aktywności endonukleazy wymagają albo krótkich sekwencji powtórzeń, które mogą być bezpośrednio syntetyzowane jako oligonukleotydy RNA, albo dłuższych sekwencji crRNA i pre-crRNA generowanych poprzez transkrypcję in vitro polimerazą RNA T7. Metodologia ta umożliwia wbudowanie nukleotydów promieniotwórczych w celu wytworzenia wewnętrznie znakowanych substratów dla endonukleaz oraz tworzenie syntetycznych lub zmutowanych crRNA. Aktywność endonukleazy Cas6 jest wykorzystywana do dojrzewania pre-crRNA do postaci crRNA z końcem 5'-hydroksylowym oraz 2',3'-cyklicznym fosforanem na końcu 3'.

Systemy CRISPR/Cas pośredniczą w odporności adaptacyjnej u bakterii i archeonów. Przypuszcza się, że wiele białek Cas pełni funkcję endorybonukleaz działających na prekursory crRNA o różnej długości. W niniejszej pracy przedstawiamy trzy różne podejścia do generowania substratów pre-crRNA na potrzeby analizy biochemicznej aktywności endonukleazy Cas.

Generowanie substratów dla endonukleaz systemów CRISPR/Cas

Interakcje wirusów z ich prokariotycznymi gospodarzami ukształtowały ewolucję bakterii i archeonów. Prokarioty wykształciły kilka strategii mających na celu...

Ogólnym celem poniższych eksperymentów jest otrzymanie substratów RNA do badania endonukleazy Cas, która odgrywa kluczową rolę w systemach odpornościowych CRISPR-Cas występujących u bakterii i archeonów. W celu uzyskania długiego matrycowego DNA do produkcji RNA in vitro można zastosować amplifikację PCR specyficznego regionu CRISPR, jeśli jest to preferowana metoda.Dwa oligonukleotydy mogą zostać zhybrydyzowane w celu wygenerowania krótszych matryc do produkcji substratowego RNA. Alternatywnie, krótkie, syntetyzowane na zamówienie sekwencje powtórzeń mogą być następnie testowane w testach z endonukleazą CAS. Ostatecznie produkcję transkryptów RNA i ich późniejsze cięcie przez endonukleazę CAS six można zwizualizować za pomocą autoradiografii.Głównym celem zaprezentowanych technik jest umożliwienie badaczom analizy przetwarzania CRISPR RNA przy użyciu substratów RNA o różnej długości. W związku z tym stosuje się różne metody generowania małych cząsteczek RNA, na przykład pojedynczych elementów powtórzeniowych, lub większych cząsteczek RNA, takich jak transkrypty CRISPR RNA obejmujące kilka spacerów. Chociaż metody te dostarczają konkretnych informacji na temat dojrzewania CRISPR RNA, podobne strategie przygotowania matrycy można zastosować w odniesieniu do innych systemów przetwarzania RNA. Procedurę zademonstrują student studiów magisterskich oraz postdoc, oboje z laboratorium zajmującego się bakteryjnymi i archeonowymi systemami odpornościowymi CRISPR.Wirusowa sekwencja DNA, zwana protospacerem, może zostać wstawiona pomiędzy dwa elementy powtarzalne w rosnącym klastrze CRISPR w procesie zwanym adaptacją. Następnie cały klaster CRISPR ulega transkrypcji, a potem jest przetwarzany w małe CRISPR RNA przez endonukleazę Cas, na przykład Cas6. Małe CRISPR RNA są następnie włączane do kompleksu białkowego Cas kaskada i pośredniczą w obronie gospodarza przed powtarzającym się atakiem wirusa, wykorzystując komplementarność zasad między CRISPR RNA a protospacerem jako sygnał do degradacji wirusowego DNA w celu wytworzenia długich substratów pre-CRISPR RNA.Zacznij od zaprojektowania starterów PCR, celujących w regiony spacerowe klastra CRISPR, poprzez dodanie sekwencji promotora polimerazy RNA T7 do startera forward. Następnie dodaj miejsca restrykcyjne do obu starterów w celu klonowania produktu PCR do wektora. Należy pamiętać, że polimeraza RNA T7 wymaga reszty guaniny do prawidłowej inicjacji transkrypcji po amplifikacji za pomocą PCR interesującej sekwencji pre-CRISPR RNA z DNA genomowego.Rozdziel produkty PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i wyizoluj z żelu pożądany fragment, a następnie poddaj produkt PCR trawieniu enzymami restrykcyjnymi w celu utworzenia lepkich końców. Następnie, po oczyszczeniu produktu PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR w celu usunięcia produktów ubocznych cięcia, dodaj T4 DNA Ligase, bufor T4 DNA Ligase oraz przecięty produkt PCR i powiązany wektor pUC z odpowiadającymi lepkimi końcami w stosunku molowym 3:1. Inkubuj reakcję ligacji w temperaturze 16 °C przez noc, a następnie wprowadź mieszaninę do kompetentnych komórek E. coli DH5α zgodnie ze standardowymi protokołami, wykorzystując selekcję niebiesko-białą w celu zidentyfikowania udanej ligacji.Na koniec wyizoluj plazmidy z białych kolonii, korzystając z zestawu do preparatyki plazmidów, i zidentyfikuj pozytywne klony poprzez sekwencjonowanie plazmidów w celu uzyskania substratów pre-CRISPR RNA o średniej wielkości. Rozpocznij od zaprojektowania oligonukleotydów forward i reverse z pożądaną sekwencją odstępów powtórzeń CRISPR, podobną do sekwencji pokazanych tutaj. Należy zauważyć, że oligonukleotydy zawierają sekwencję promotora polimerazy RNA T7, a także terminalne miejsca restrykcyjne na końcach oligonukleotydów, aby zapewnić powstanie lepkich końców.Po krótkim inkubowaniu inkubuj próbki z T4 polinukleotydową kinazą oraz buforem do T4 polinukleotydowej kinazy przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C, aby przeprowadzić fosforylację końców 5' 1 nmol każdego z oligonukleotydów. Następnie inkubuj fosforylowane oligonukleotydy sens i antysens w buforze do ligazy DNA T4 przez pięć minut w temperaturze 95 °C na bloku grzewczym. Po hybrydyzacji próbek wyłącz źródło ciepła i pozostaw mieszaninę do ostygnięcia przez około dwie do trzech godzin, aż osiągnie temperaturę pokojową.Następnie przeprowadź ligację otrzymanych oligonukleotydów z mieszaniną hybrydyzacyjną zawierającą trawiony i defosforylowany wektor P, bufor do ligacji DNA T4 oraz T4 DNA ligazę w temperaturze 16°C przez noc. Następnie wprowadź ligowane plazmidy do kompetentnych komórek E. coli szczepu DH5α zgodnie ze standardowymi protokołami, wykorzystując selekcję niebiesko-białą w celu zidentyfikowania poprawnych ligacji. Na koniec wyizoluj plazmidy i zidentyfikuj pozytywne klony poprzez trawienie enzymatyczne i następujące po nim sekwencjonowanie plazmidów.Krótkie sekwencje substratów RNA dla cas z pojedynczym powtórzeniem można zaprojektować w sposób podobny do sekwencji przedstawionych tutaj. Należy upewnić się, że w skład sekwencji wchodzi deoksyrybonukleotyd. W przypadku konieczności określenia miejsca cięcia RNA, do produkcji oligonukleotydu RNA można wykorzystać zewnętrzną firmę zajmującą się syntezą na zamówienie.Po wyizolowaniu plazmidów z wybranym, dostosowanym substratem, należy zlinearyzować plazmidy za pomocą enzymu restrykcyjnego tnącego w regionie poniżej sklonowanych fragmentów, wykorzystując zestaw do puryfikacji plazmidów maxi prep. Po upewnieniu się, że trawienie przebiegło całkowicie, należy oczyścić zlinearyzowany plazmid poprzez ekstrakcję fenolowo-chloroformową i precypitację etanolem. Kwasy nukleinowe odzyskuje się poprzez resuspensję osadu w sterylnej wodzie traktowanej DEPC.Następnie inkubuj plazmidy trawienne w świeżo przygotowanej mieszaninie do transkrypcji runoff in vitro z polimerazą RNA T7, zawierającej ATP, CTP, GTP i UTP, przez trzy godziny w temperaturze 37°C. Na koniec przeanalizuj otrzymane transkrypty RNA na denaturującym żelu poliakryloamidowym 12% z 8 M mocznikiem. Można również oczyścić transkrypty za pomocą chromatografii wymiany anionowej Mono Q, a następnie odzyskać transkrypty poprzez wytrącanie frakcji RNA etanolem i ponowne zawieszenie osadów w sterylnej wodzie traktowanej DEPC, aby przeanalizować zaprojektowane substraty za pomocą testów z endonukleazą; rozpocznij od wizualizacji prążków substratów za pomocą autoradiografii i oczyszczenia produktów reakcji poprzez ekstrakcję z żelu z 8 M mocznikiem w warunkach denaturujących.żel 12% poliakryloamidowy, a następnie wytworzyć i oczyścić pożądane rekombinowane białka Cas poprzez wytrącanie termiczne oraz chromatografię na kolumnie z niklem NTA, zgodnie z procedurą przedstawioną dla białka Cas6 z Clostridium thermocellum. Następnie połączyć białko Cas ze świeżo przygotowaną mieszaniną reakcyjną do endonukleazy i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37°C, aby umożliwić zajście reakcji testu endonukleazy. Na koniec nanieść 5 µL mieszaniny reakcyjnej na żel z 8M mocznikiem.12% żel poliakrylamidowy i wizualizacja produktów cięcia po elektroforezie za pomocą autoradiografii. Poniżej przedstawiono barwiony błękitem Coomassie żel poliakrylamidowy z autorskim oligonukleotydem RNA oraz dwoma transkryptami RNA otrzymanymi in vitro. Należy zauważyć, że wydajność produkcji RNA różni się w zależności od tego, czy konstrukty mają krótką, długą, czy średnią długość.Badanie aktywności endonukleazy RNA wymaga dodatnich i ujemnych kontroli, a także wysoko oczyszczonych rekombinowanych białek Cas. Na tej rycinie przedstawiono żel SDS-PAGE preparatu próbki Cas6 z Clostridium thermocellum.Przedstawiono przebieg chromatografii Ni-NTA po wytrącaniu termicznym, przeprowadzony wraz ze standardowym markerem białkowym. Odpowiednia próbka kontrolna ujemna powinna zawierać lizat komórkowy bez ekspresji CAS6, jednak po zastosowaniu identycznej procedury oczyszczania CAS6 stwierdzono, że preparat CAS6 posiada wymaganą wysoką czystość. Tutaj cięcie substratu sekwencji powtórzeniowej znakowanej na końcu 5' przez białko CAS6 z co Clostridium thermocellum można zwizualizować za pomocą autoradiografii.Każda ścieżka zawiera radioaktywnie znakowany substrat: RNA po inkubacji z białkiem ca six, co oznaczono znakami plus, lub z buforem jako kontrolą negatywną, co oznaczono znakami minus; substraty długie lub krótkie z dodatkiem lub bez dodatku deoksyrybonukleotydu w pozycji minus dziewięć, co miało na celu ułatwienie reakcji endonukleazy. Należy zwrócić uwagę na brak cięcia krótkich substratów w przypadku włączenia deoksyrybonukleotydu do cząsteczki RNA po zastosowaniu tej procedury.Nukleazy Cas6 mogą być również wykorzystywane jako narzędzie do generowania dojrzałych, precyzyjnie przyciętych cząsteczek RNA. Cząsteczki RNA te mogą być włączane do kompleksów Cascade w celu uzyskania informacji na temat ich udziału w interferencji w odpowiedzi na ataki wirusowe. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak projektować i wytwarzać substraty CRISPR dla nukleaz Cas.Te różne substraty są użyteczne w badaniu kwestii dotyczących dojrzewania i wykorzystania crispr Es.

substrate-generation-for-endonucleases-of-crisprcas-systems

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Generyka podłoża dla endonukleaz systemów CRISPR/Cas

Narzędzia do edycji genomu, takie jak system CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (związany z CRISPR), znacznie poprawiły skuteczność celowania w geny w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hiPSC). Niniejszy manuskrypt opisuje protokół generowania specyficznego dla linii reportera hiPSC przy użyciu rekombinacji homologicznej wspomaganej systemem CRISPR/Cas.

Wydajne generowanie reporterów knockin specyficznych dla linii neuronowej hiPSC przy użyciu systemu podwójnej nickazy CRISPR/Cas9 i Cas9

Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznego manipulowania liniami komórek somatycznych mają ogromny potencjał dla badań podstawowych i stosowanych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do produkcji nokautu generowanego przez CRISPR/Cas9 i badań przesiewowych w liniach komórkowych ssaków, z użyciem i bez użycia selektywnych markerów.

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

Ukierunkowana edycja genomu w systemie modelowym Danio rerio (danio pręgowany) została znacznie ułatwiona dzięki pojawieniu się metod opartych na CRISPR. W niniejszym artykule opisujemy uproszczony, solidny protokół generowania i identyfikacji nonsensownych alleli pochodzących z CRISPR, który obejmuje test mobilności heterodupleksowej i identyfikację mutacji przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji.

Wydajna produkcja i identyfikacja nokautów genów generowanych przez CRISPR/Cas9 w systemie modelowym Danio rerio

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Tutaj opisano protokół oznaczania białek o endogennej ekspresji znacznikami fluorescencyjnymi w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych za pomocą CRISPR/Cas9. Przypuszczalnie edytowane komórki są wzbogacane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i generowane są klonalne linie komórkowe.

Endogenne znakowanie białek w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu CRISPR/Cas9

CRISPR-Cas to potężna technologia do inżynierii złożonych genomów roślin i zwierząt. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół skutecznej edycji ludzkiego genomu przy użyciu różnych endonukleaz Cas. Zwracamy uwagę na ważne kwestie i parametry projektowe, aby zoptymalizować wydajność edycji.

Edycja genomu w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR-Cas

Prezentujemy protokół do modułowego montażu opartego na CRISPR (CRISPRmass), metody wysokoprzepustowej budowy biblioteki plazmidów UAS-cDNA/ORF u Drosophila przy użyciu publicznie dostępnych zasobów cDNA/ORF. CRISPRmass może być stosowany do edycji różnych bibliotek plazmidów.

Modułowy montaż oparty na CRISPR do wysokoprzepustowej budowy biblioteki plazmidów UAS-cDNA/ORF

Istotną przeszkodą dla technologii takich jak CRISPR są zdarzenia niezgodne z celem, które mogą zakłócić działanie ważnych genów. "Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing" (CIRCLE-seq) jest techniką opracowaną w celu identyfikacji niezamierzonych miejsc rozszczepienia. Metoda ta mapuje aktywność CRISPR-Cas9 w całym genomie z wysoką czułością i bez uprzedzeń.

CIRCLE-Seq do badania edycji genów poza celem

W tym miejscu opisujemy protokół generowania matczynego mutanta, który łączy stabilną linię knock-in zpc: cas9 z dostarczaniem kaset ekspresyjnych sgRNA za pośrednictwem Tol2.

Generowanie matczynych mutantów przy użyciu zpc:cas9 Knock-in Danio pręgowanego

Poznaj metody generowania substratów RNA dla endonukleaz Cas w systemach CRISPR bakterii i archeonów. Techniki PCR, synteza oligonukleotydów i autorradiografia umożliwiają badanie dojrzewania crRNA.

Generowanie substratów dla endonukleaz systemów CRISPR/Cas

Przeglądaj więcej filmów