Wizualny opis rozwarstwienia naczyń naczyniowych powierzchni mózgu i związanych z nim opon mózgowych oraz splotu naczyniówkowego z mózgu szczura
14 listopada 2012
Ta prezentacja wideo pokazuje metodę pozyskiwania dwóch najważniejszych wysoce unaczynionych struktur, które wspierają funkcjonowanie przodomózgowia. Są to unaczynienie powierzchni mózgu (powierzchowne) wraz z powiązanymi oponami mózgowymi (MAV) i splotem naczyniówkowym, które są niezbędne do przepływu krwi w mózgu i homeostazy płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF).
Ogólnym celem tej procedury jest skuteczne i szybkie wypreparowanie części skórnej i pajęczynówki opon mózgowych oraz związanego z nimi naczynia tętniczego, pokrywając powierzchnię kory przodomózgowia i śródmózgowia, wzgórza i kalii, a także pobranie splotu naczyniówkowego z komór bocznych. Osiąga się to poprzez usunięcie szyszynki i oddzielenie opon mózgowych i drzew tętniczych przykuwanych do przodomózgowia. Po drugie, tętnice i tętnice na powierzchni kory są ostrożnie usuwane, zaczynając od brzusznego koła Willisa, a następnie przechodząc do grzbietowych powierzchni korowych, tak aby skórka i pozostałe błony pajęczynówkowe pozostały przyczepione do układu naczyniowego, upewniając się, że minimalizuje zbieranie sąsiednich tkanek powierzchni kory.
Następnie kora i włókna spoidła są wycinane z dala od przegrody i hipokampa, odsłaniając komory boczne, aby umożliwić pobranie splotu naczyniówkowego. Na koniec hipokamp jest usuwany, odsłaniając wzgórze i kalusy śródmózgowia. Opony mózgowe i związane z nimi naczynia krwionośne pokrywające ten obszar są następnie preparowane.
Ostatecznie integralność i swoistość wypreparowanych opon mózgowych i związanego z nimi naczynia tętniczego, a także splotu naczyniówkowego, można określić, porównując profile ekspresji genów każdego z tych regionów. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach związanych z naczyniami krwionośnymi, które wspierają funkcjonowanie mózgu. Obejmuje podobieństwa i porównania oraz różnice w funkcji splotu naczyniówkowego w porównaniu z oponami mózgowymi i związanym z nimi unaczynieniem tętniczym w odniesieniu do przepływu krwi, funkcji płynu mózgowo-rdzeniowego, urazów neurotoksycznych i urazów mózgu.
Aby rozpocząć ten protokół, umieść mózgi dopiero co usunięte ze szczurów natychmiast po ich eutanazji w lodowatym, normalnym roztworze soli fizjologicznej na pięć minut. Ważne jest, aby pozwolić mózgowi ochłodzić się przez ten czas przed preparacją, tak aby cztery opony mózgowe i związane z nimi naczynia tętnicze lub MAV mogły zostać oddzielone od powierzchni kory. Następnie umieść mózg na dnie szklanej szalki Petriego spoczywającej na lodzie z jednym centymetrem lodu, zimną, normalną solą fizjologiczną lub 0,1 molowym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem sodu o pH 7,4.
Wszystkie sekcje powinny być wykonywane za pomocą mózgu, najczęściej zanurzonego w soli fizjologicznej. Aby rozpocząć sekcję, umieść grzbietową stronę mózgu na szalce Petriego i zlokalizuj szyszynkę, która znajduje się w najbardziej rozpieszczonym obszarze brzusznym między dwiema półkulami. Tylko rostralnie do móżdżku i tuż poniżej lub na powierzchni opon mózgowych.
Nad colli. Usuń szyszynkę za pomocą dwóch małych kleszczyków z wygiętą końcówką. Należy pamiętać, że szyszynka ma różowy kolor jak kora mózgowa, ale często jest otoczona resztkami resztkowej krwi i naczyń krwionośnych po usunięciu mózgu.
Następnie odwróć mózg do góry nogami na szalce Petriego. Następnie oddziel tętnicę kręgową i mniejsze tętnice i opony mózgowe pokrywające most od opon mózgowych i naczyń krwionośnych przodomózgowia. Następnie rozpocznij usuwanie MAV.
Ważne jest, aby rozpocząć proces rozwarstwiania brzusznie od głównych tętnic koła Willisa, tętnic środkowych mózgu i tętnic przednich. Następnie, zaczynając od dowolnej półkuli, użyj małych kleszczyków ze zgiętą końcówką, aby przeciąć tylną tętnicę łączącą tuż za wewnętrznym połączeniem tętnicy szyjnej, oddzielając w ten sposób bardziej przednie i tylne drzewa tętnicze przodomózgowia. Następnie powtórz ten sam proces dla przeciwległej półkuli.
Teraz chwytając MCA i tętnicę przednią kleszczami, delikatnie pociągnij w przednim kierunku grzbietowym, tak aby MAV pokrywający brzuszną korę przednią został uniesiony nad i wokół przewodu węchowego. To usuwa znaczną część MAV pokrywającą przednią korę. Obróć mózg pod kątem od 45 do 90 stopni do szalki Petriego, aby boczne, bardziej przednie obszary MAV otaczające boczne obszary korowe mogły zostać uwolnione od kory, chwyć MCA i powiązane tętnice i delikatnie pociągnij grzbietowo wzdłuż kory.
W razie potrzeby końce kleszczy mogą być użyte do podniesienia i uwolnienia głównych tętnic z kory podczas sekcji. Teraz usuń bardziej tylne boczne obszary MAV. Należy pamiętać, że najlepiej jest przełączać się z jednej półkuli na drugą podczas tego procesu zbioru, aby upewnić się, że MAV pozostaje zimny i nawodniony, a także przełączać półkule, jeśli napotkasz jakikolwiek opór w uwolnieniu MAV z kory.
Na koniec, aby usunąć najbardziej grzbietowe obszary MAV otaczające pierwotną korę somatosensoryczną i ruchową, obróć grzbietową stronę mózgu do góry, aby uwolnić tę część od mózgu, użyj końców kleszczy wzdłuż zatoki strzałkowej. Ta część zebranego MAV może być tymczasowo przechowywana w lodowatym roztworze soli fizjologicznej do czasu, gdy będzie potrzebna do badań i analizy, lub zamrożona do późniejszego przetworzenia. Często MAV pokrywający najbardziej tylne obszary kory mózgowej pozostaje przyczepiony.
Jego usunięcie pokazane zostało w poszczególniejszym fragmencie tego filmu. Aby usunąć splot naczyniówkowy, najpierw umieść mózg grzbietowo do góry i przytrzymaj go na miejscu za pomocą większych kleszczy. Następnie wepchnij mniejsze kleszcze w dół przez linię środkową między półkulami i użyj końców, aby przebić korę i ciało modzelowate do górnej części linii środkowej hipokampa.
Następnie użyj kleszczy, aby odciągnąć korę z modzelem od grzbietowego hipokampa i przegrody, odsłaniając większość komory bocznej. Splot naczyniówkowy można zlokalizować i zidentyfikować za pomocą falistej czerwonej linii wyznaczającej główną tętnicę biegnącą na jego długości. Użyj dwóch końców kleszczy, aby podważyć boczne ścianki trzeciej komory i powiększyć ją na najbardziej rozpieszczonym końcu.
Następnie za pomocą małych kleszczy wyciągnij ten koniec splotu naczyniówkowego. Następnie użyj kleszczy, aby powiększyć bardzo przedni obszar między przegrodą a skorupą ogoniastą i uwolnij splot naczyniówkowy również na tym końcu. Wykonaj również tę samą procedurę na przeciwległej półkuli, aby uzyskać drugi pozostały splot naczyniówkowy.
Ponownie, tkanka ta może być tymczasowo przechowywana w lodzie, zimnie, soli fizjologicznej lub zamrożona do późniejszego przetworzenia. Aby usunąć pozostały MAV pokrywający najbardziej tylne obszary rozpieszczania kory, najpierw usuń cały hipokamp z obu półkul, odsłaniając MAV nad wzgórzem i colliculi. Należy zauważyć, że usunięcie tej części MAV będzie znacznie łatwiejsze niż usunięcie jej z kory w przypadku pozostałej części MAV.
Chwytając większy układ krwionośny pokrywający przednią część wzgórza i delikatnie ciągnąc za kolczaste, ten układ naczyniowy jest połączony z siecią naczyń supralnych i dostarcza krew do grzbietowego hipokampa i grzbietowej sieci wzgórza. Odsuń się od siebie, a w końcu sieć supra zostanie uwolniona i będzie można dotrzeć do ostatnich części koła tętniczego dosier. W tym momencie należy zachować większą ostrożność, aby usunąć wszelkie pozostałe MAV na powierzchni ziarnistej tylnej linii kory pierwotnej, słuchowej i wzrokowej.
Wszelkie pozostałe tylne brzuszne korowe MAV zebrane za pomocą tego drugiego odcinka MAV wzgórza i kalii powinny zostać usunięte i dodane do pierwszego wypreparowanego odcinka korowego MAV, jeśli mają być analizowane oddzielnie. Następnie, aby porównać profile ekspresji genów między korą ciemieniową prążkowia a regionami MAV w warunkach kontrolnych, analizę ekspresji genów można przeprowadzić przy użyciu całego genomu szczura Agilent 0 1 4 8 7 9, cztery na 44 060 merów oligonukleotydów. Więcej szczegółów na temat przetwarzania, skanowania i początkowego przechowywania danych można znaleźć w Thomas et al.
Gdy sekcja zostanie wykonana prawidłowo. Powstałe tkanki MAV powinny znajdować się w dwóch nienaruszonych jednostkach o łącznej wadze około 35 do 45 miligramów. Początkowo wypreparowany MAV otaczający większość kory powinien ważyć około 25 miligramów, a ten pokrywający wzgórze, kalie i korę potyliczną powinien ważyć około 15 miligramów.
Tkanka powinna mieć lekko różowawy kolor od resztkowej krwi w układzie naczyniowym. Pobrany obustronny splot naczyniówkowy powinien znajdować się w dwóch nienaruszonych próbkach tkanki, z których każda waży od jednego do dwóch miligramów, jak pokazano tutaj. Tutaj widzimy porównanie profili ekspresji genów w prążkowiu kory ciemieniowej i MAV w warunkach kontrolnych.
Górny wykres przedstawia wyrażenie w prążkowiu w porównaniu z korą ciemieniową. Podczas gdy dolny wykres pokazuje ekspresję w MAV w porównaniu z korą ciemieniową, można zauważyć, że prążkowie i kora ciemieniowa są znacznie bliżej ze sobą powiązane niż MAV. Tutaj widzimy różnicę ekspresji genów w MAV w odpowiedzi na hipertermię w porównaniu z kontrolą, w odpowiedzi na amfetaminę w porównaniu z kontrolą oraz w hipertermii w porównaniu z amfetaminą.
Wreszcie, tutaj widzimy geny o ponad 15-krotnej ekspresji w MAV w porównaniu z korą ciemieniową i prążkowiem charakteryzującymi się funkcją. Wiele z tych genów jest związanych z układem naczyniowym i/lub układem odpornościowym. Inne geny z bardzo dużymi zmianami fałdowania to białka macierzy zewnątrzkomórkowej, transportery saute oraz metabolizm lipidów i kwasów retinowych.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o cierpliwości podczas preparowania MAV. Ważne jest również, aby mózg pozostawał zanurzony w izotonicznym roztworze soli fizjologicznej lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanami podczas całego rozbioru. Zaleca się również przećwiczenie sekcji MAV na czterech lub pięciu szczurach przed uzyskaniem tkanek do generowania danych eksperymentalnych.
Przegląd
Ta prezentacja wideo demonstruje metodę pobierania naczyń krwionośnych powierzchni mózgu i splotu naczyniowego, która jest kluczowa dla utrzymania przepływu krwi mózgowej i homeostazy płynu mózgowo-rdzeniowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia naczyniowa
- Neuroanatomia
Tło
- Naczynia krwionośne powierzchni mózgu i splot naczyniowy są niezbędne dla funkcjonowania mózgu.
- Zrozumienie ich ról może pomóc w badaniach nad dynamiką płynu mózgowo-rdzeniowego.
- Techniki sekcji są niezbędne do badania tych struktur.
- Profile ekspresji genów mogą ujawnić funkcjonalne różnice między tymi składnikami układu krążenia.
Cel badania
- Aby efektywnie sekcjonować i pobierać oponę mózgową oraz związaną z nią strukturę naczyniową.
- Aby zbadać związek między splotem naczyniowym a funkcją płynu mózgowo-rdzeniowego.
- Aby dostarczyć informacji na temat neurotoksycznych obrażeń i urazów mózgu.
Zastosowane metody
- Sekcja opon mózgowych i układu naczyń krwionośnych od mózgu szczura.
- Ostrożne usunięcie splotu naczyniowego z komór bocznych.
- Użycie kleszczyków do precyzyjnego pobierania z minimalnym uszkodzeniem otaczających tkanek.
- Porównanie profili ekspresji genów w celu oceny integralności zebranych tkanek.
Główne wyniki
- Udana sekcja opon mózgowych i związanych z nimi naczyń krwionośnych.
- Pobranie splotu naczyniowego zostało osiągnięte przy minimalnym uszkodzeniu tkanek.
- Analiza ekspresji genów wskazała odrębne profile dla każdego pobranego obszaru.
- Zdobyte wglądy w funkcjonalne role splotu naczyniowego i opon mózgowych.
Wnioski
- Ta metoda zapewnia niezawodne podejście do badania struktur naczyniowych mózgu.
- Zrozumienie tych składników może zwiększyć wiedzę na temat dynamiki płynu mózgowo-rdzeniowego.
- Przyszłe badania mogą budować na tych wynikach, aby lepiej zrozumieć funkcjonowanie i patologię mózgu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma researchers to isolate and analyze two critical neurovascular structures—the meninges-associated vasculature (MAV) and choroid plexus—supporting target validation in CNS drug discovery. By providing biochemically viable tissue for gene expression profiling, it facilitates mechanistic de-risking of vascular and fluid homeostasis pathways implicated in neurodegenerative and neuropsychiatric disorders. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking vascular function to neurotoxic insults such as amphetamine exposure and hyperthermia.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vascular and immune-related gene expression in MAV to validate targets involved in neurovascular coupling and blood-brain barrier function.
- Operational Value: Provides a standardized dissection workflow yielding intact MAV and choroid plexus tissues suitable for downstream omics analysis.
- Predictive Value: Supports biomarker discovery by revealing differential gene expression in response to neurotoxic challenges, aiding in target prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates tissue preparations with preserved vascular integrity, enabling reliable assay development for cerebrovascular and CSF-regulating targets.
- Operational Value: Dissection takes 5–10 minutes, allowing high-throughput tissue preparation for screening campaigns.
- Reproducibility Value: Consistent harvesting of MAV (~25–35 mg cortex-associated, ~15 mg thalamic) and choroid plexus (1–2 mg per side) supports standardized input for comparative analyses.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Harvested tissues are disease-relevant models for studying vascular responses to insults mimicking clinical conditions such as traumatic brain injury and neurotoxicity.
- Mechanistic De-risking: Gene expression comparisons between MAV, choroid plexus, and cortical regions help de-risk targets by clarifying vascular-specific versus CNS-parenchymal signaling.
- Preclinical Continuity: Enables longitudinal assessment of vascular target engagement across discovery to preclinical stages using consistent tissue isolation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven target validation and feeding into lead identification through vascular pathway elucidation.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification by isolating meningeal vasculature and choroid plexus to study their distinct roles in cerebral blood flow and CSF homeostasis.
- Screening: Produces standardized tissue inputs enabling reproducible compound testing in vascular and neuroimmune assays.
- Analytics: Generates quantitative gene expression outputs (e.g., via Agilent whole rat genome arrays) that allow comparison of vascular responses across experimental conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by linking MAV and choroid plexus molecular profiles to pathophysiological states such as hyperthermia-induced neurotoxicity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue isolation platform applicable across multiple CNS projects studying vascular, meningeal, or choroid plexus targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in neurovascular and CSF-related pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized dissection technique and tissue handling in isotonic saline.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early vascular response data, reducing late-stage failure risk in CNS programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on vascular target engagement and functional relevance to brain homeostasis.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy and microsurgical dissection techniques to isolate delicate meningeal and vascular tissues.
- Dependent on dissection instrumentation such as fine forceps and controlled environment (ice-cold saline) to maintain tissue viability.
- Necessitates cross-team standardization between histology, molecular biology, and pharmacology teams for consistent tissue preparation and analysis.
- Adaptation considerations include adjusting dissection depth for different rat strains or ages to avoid cortical contamination.
- Practical limitation: Risk of meningeal tearing or vascular damage if dissection is performed too rapidly or without proper tissue hydration.
