Wizualny opis sekcji naczyń powierzchniowych mózgowia oraz powiązanych opon mózgowych i splotów naczyniowych z mózgu szczura

Ogólnym celem niniejszej procedury jest efektywne i szybkie wypreparowanie warstw peelingowej i pajączkowej opon mózgowych oraz powiązanych z nimi naczyń tętniczych, pokrywających powierzchnię kory przedmózowia, śródmózowia, wzgórza i ciała modzelowatego, a także pobranie splotów naczyniowych z komór bocznych. Cel ten osiąga się poprzez najpierw usunięcie szyszynki oraz oddzielenie opon i drzew tętniczych przylegających do przedmózowia. Następnie ostrożnie usuwa się tętnice i arteriole z powierzchni kory, zaczynając od brzusznego kręgu Willisa, a następnie przechodząc do grzbietowych powierzchni korowych, tak aby warstwa peelingowa i pozostałe błony pającznikowate pozostały przytwierdzone do naczyń, dbając jednocześnie o zminimalizowanie pobierania przyległych tkanek powierzchni kory.

Następnie korę oraz włókna komisuralne oddziela się od przegrody i hipokampa, odsłaniając komory boczne, aby umożliwić pobranie splotów naczyniowych. Na koniec usuwa się hipokamp, odsłaniając wzgórze i trzon mózgowia. Następnie usuwa się oponie mózgowe oraz powiązane z nimi naczynia krwionośne pokrywające ten obszar.

Ostatecznie integralność i swoistość wypreparowanych opon mózgowych i powiązanego z nimi układu naczyń tętniczych, a także splotów naczyniówkowych, można określić poprzez porównanie profili ekspresji genów każdej z tych stron. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach dotyczących układu naczyniowego wspierającego funkcje mózgu. Obejmuje ona analiza podobieństw i różnic w funkcjonowaniu splotów naczyniówkowych w porównaniu z oponami mózgowymi i powiązanym z nimi układem naczyń tętniczych w odniesieniu do przepływu krwi, funkcji płynu mózgowo-rdzeniowego, uszkodzeń neurotoksycznych oraz urazów mózgu.

Aby rozpocząć ten protokół, należy umieścić mózgi szczurów, wyjęte natychmiast po ich eutanazji, w lodowatej soli fizjologicznej na pięć minut. Ważne jest, aby pozwolić mózgowi ostygnąć przez ten czas przed sekcją, co umożliwi oddzielenie opon mózgowych i związanej z nimi sieci naczyń tętniczych (MAV) od powierzchni kory. Następnie należy umieścić mózg na dnie szklanej płytki Petri znajdującej się na lodzie, z dodatkiem jednego centymetra lodowatej soli fizjologicznej lub 0,1 M buforu fosforanowego (PBS) o pH 7,4.

Wszelkie etapy sekcji powinny być przeprowadzane z mózgiem w większości zanurzonym w soli fizjologicznej. Aby rozpocząć sekcję, umieść mózg stroną grzbietową do góry w szalce Petriego i zlokalizuj szyszynkę, która znajduje się w najbardziej brzusznym obszarze między obiema półkulami. Znajduje się ona bezpośrednio rostralnie względem móżdżku, tuż pod oponami mózgowymi lub na ich powierzchni.

Przez colli. Usunąć szyszynkę, używając dwóch małych pęset z wygiętymi końcówkami. Należy zauważyć, że szyszynka ma różowy kolor, podobnie jak kora, ale często jest otoczona pozostałościami krwi i naczyń krwionośnych powstałymi podczas usuwania mózgu.

Następnie odwróć mózg do góry dnem w szalce Petriego. Następnie oddziel tętnicę kręgową, mniejsze tętnice oraz oponu mózgowe pokrywające most z opon i naczyń krwionośnych przedmózgowia. Następnie rozpocznij usuwanie MAV.

W procesie sekcji ważne jest, aby rozpocząć od strony brzusznej, od głównych tętnic kręgu Willisa, tętnic środkowych mózgu oraz tętnic przednich. Następnie, zaczynając od dowolnej półkuli, należy użyć małej pęsety z zakrzywionymi końcówkami, aby przeciąć tętnicę łączącą tylną tuż za miejscem połączenia z tętnicą szyjną wewnętrzną, oddzielając w ten sposób przednie i tylne drzewa tętnicze przedmózgowia. Następnie należy powtórzyć tę samą procedurę dla przeciwległej półkuli.

Teraz, chwytając pęsetą tętnicę środkową mózgu (MCA) oraz tętnicę przednią, delikatnie pociągnij w kierunku przednio-grzbietowym, tak aby malformacja tętniczo-żylna (MAV) pokrywająca brzuszną część przedniej kory została uniesiona ponad i wokół pasma węchowego. Dzięki temu usunięta zostanie znaczna część MAV pokrywającej przednią korę. Obróć mózg pod kątem od 45 do 90 stopni względem szalki Petriego, tak aby boczne, bardziej przednie obszary MAV otaczające boczne regiony kory mogły zostać oddzielone od kory, następnie chwyć MCA i powiązane tętnice i delikatnie pociągnij w kierunku grzbietowym wzdłuż kory.

W razie potrzeby końcówki pęsety można wykorzystać do uniesienia i uwolnienia głównych tętnic z kory podczas sekcji. Następnie usuwa się bardziej tylne obszary boczne MAV. Należy pamiętać, że podczas tego procesu pobierania najlepiej przełączać się z jednej półkuli na drugą, aby zapewnić, że MAV pozostaje schłodzone i nawodnione; należy również zmienić półkulę, jeśli napotkany zostanie jakikolwiek opór podczas uwalniania MAV z kory.

Na koniec, aby usunąć najbardziej grzbietowe obszary MAV otaczające pierwotną korę somatosensoryczną i ruchową, obróć mózg stroną grzbietową do góry, aby uwolnić tę sekcję z mózgu, używając końcówek pęsety wzdłuż zatoki strzałkowej. Tą część pobranego MAV można przechowywać tymczasowo w lodowatej soli fizjologicznej do czasu przeprowadzenia testów i analiz lub zamrozić do późniejszego przetworzenia. Często MAV pokrywający najbardziej tylne obszary kory pozostaje przytwierdzony.

Sposób jego usunięcia przedstawiono w dalszej części tego filmu. Aby usunąć splot naczyniowy, należy najpierw ułożyć mózg grzbietem do góry i unieruchomić go za pomocą większych pincet. Następnie należy wprowadzić mniejszy pincet wzdłuż linii środkowej pomiędzy półkulami i za pomocą jego końców przebić korę oraz ciało modzelowate, docierając do górnej części linii środkowej hipokampa.

Następnie za pomocą pęsety odsunąć korę wraz z ciałem modzelowatym od grzbietowej części hipokampa i przegrody, odsłaniając większość komory bocznej. Splot naczyniowy można zlokalizować i zidentyfikować po falistej czerwonej linii wyznaczającej główną tętnicę biegnącą wzdłuż jego długości. Używając obu końców pęsety, rozsunąć boczne ściany trzeciej komory i poszerzyć ją w jej najbardziej zwężonym odcinku.

Następnie, używając małej pęsety, wyciągnij ten koniec splotu naczyniowego. Kolejno, za pomocą pęsety poszerz obszar najbardziej przedni pomiędzy przegrodą a obszarem jądra ogoniastego i putamen, a następnie wyciągnij splot naczyniowy również z tego końca. Przeprowadź tę samą procedurę w przeciwległej półkuli, aby uzyskać drugi pozostały splot naczyniowy.

Ponownie, tkankę tę można tymczasowo przechowywać w lodzie, w zimnej soli fizjologicznej lub zamrozić do późniejszej obróbki. Aby usunąć pozostałą część MAV pokrywającą najbardziej tylne obszary kory, należy najpierw usunąć cały hipokamp z obu półkul, odsłaniając MAV nad wzgórzem i wzgórzamistymi. Należy zauważyć, że usunięcie tej części MAV będzie znacznie łatwiejsze niż usunięcie pozostałej części MAV z kory.

Poprzez uchwycenie większych naczyń krwionośnych pokrywających przednią część wzgórza i delikatne odciągnięcie w kierunku koddly, naczynia te zostają połączone z siecią Supra cocurricular i dostarczają krew do grzbietowej części hipokampa oraz sieci grzbietowej części wzgórza. Odciągając w kierunku koddly, sieć supra zostanie w końcu uwolniona, a następnie będzie można dotrzeć do ostatnich fragmentów kręgu tętniczego koddle. Na tym etapie należy zachować szczególną ostrożność podczas usuwania pozostałych MAV z powierzchni pierwotnej kory słuchowej i wzrokowej oraz kory ziarnistej retros lineal.

Wszelkie pozostałe fragmenty tylnej brzusznej kory MAV pobrane podczas tego drugiego etapu sekcji MAV wzgórza i ciała modzelowatego powinny zostać usunięte i dodane do pierwszej sekcji MAV kory, jeżeli mają być one analizowane oddzielnie. Następnie, aby porównać profile ekspresji genów między prążkowiem, korą ciemieniową a obszarami MAV w warunkach kontrolnych, analizę ekspresji genów można przeprowadzić przy użyciu macierzy oligonukleotydowych Agilent 0 1 4 8 7 9 dla całego genomu szczura, 4x44, 060 mer. Dalsze szczegóły dotyczące przetwarzania, skanowania i wstępnego przechowywania danych można znaleźć w pracy Thomas et al.

Przy prawidłowym przeprowadzeniu sekcji uzyskane tkanki MAV powinny stanowić dwie nienaruszone części o łącznej masie od około 35 do 45 mg. Tkanka MAV wypreparowana w pierwszej kolejności, otaczająca większość kory, powinna ważyć około 25 mg, natomiast ta pokrywająca wzgórze, ciała modzelowate i korę potyliczną powinna ważyć około 15 mg.

Tkanka powinna mieć lekko różowy kolor ze względu na krew pozostałą w naczyniach krwionośnych. Pobranym obustronnie splotem naczyniówkowym powinny być dwie nienaruszone próbki tkanki, z których każda waży od jednego do dwóch miligramów, jak pokazano tutaj. Tutaj widzimy porównanie profili ekspresji genów w prążkowiu, korze ciemieniowej i MAV w warunkach kontrolnych.

Górny wykres przedstawia ekspresję w prążkowiu w porównaniu z korą ciemieniową. Podczas gdy dolny wykres przedstawia ekspresję w MAV w porównaniu z korą ciemieniową, można zauważyć, że prążkowie i kora ciemieniowa są ze sobą znacznie bardziej powiązane niż MAV. Tutaj widzimy różnicową ekspresję genów w MAV w odpowiedzi na hipertermię w porównaniu z kontrolą, w odpowiedzi na amfetaminę w porównaniu z kontrolą oraz w hipertermii w zestawieniu z amfetaminą.

Na koniec widzimy geny o ekspresji ponad 15-krotnie wyższej w MAV w porównaniu z korą ciemieniową i prążkowiem, scharakteryzowane według funkcji. Wiele z tych genów wiąże się z układem naczyniowym i/lub układem odpornościowym. Inne geny o bardzo dużych zmianach krotności to białka macierzy zewnątrzkomórkowej, transportery solute oraz metabolizm lipidów i kwasu retinowego.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zachować cierpliwość podczas dyssekcji MAV. Należy również zadbać o to, aby mózg przez cały czas trwania dyssekcji pozostawał zanurzony w izotonicznym roztworze soli fizjologicznej lub buforze fosforanowym (PBS). Zaleca się ponadto przećwiczenie sekcji MAV na czterech lub pięciu szczurach przed pobraniem tkanek do generowania danych eksperymentalnych.