Name: Podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów terapii genowej i komórek macierzystych do okołoporodowego oka myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 9 s
Description: Poznaj technikę chirurgiczną podsiatkówkowego wstrzyknięcia wektorów terapii genowej i komórek macierzystych do oka myszy. Metoda umożliwia precyzyjne dostarczanie terapeutyków w badaniach nad chorobami siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Research to Prevent Blindness; Pomoc eksperymentalna od Takayuki Nagasaki; Niniejsze badanie jest zgodne z oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wizualnych. KJW jest wspierany przez granty NIH 5T32EY013933 oraz 5T32DK007647-20. VBM jest wspierany przez grant NIH K08EY020530.

1. Przygotowanie urządzeń do iniekcji podsiatkówkowej
<ol>
 <li>Należy zakupić lub wykonać igłę o średnicy 100 μm z szklanej rurki kapilarnej. Można to zrobić ręcznie, używając wyciągacza pipet Sutter P-97 lub innego podobnego urządzenia. Koniec rurki kapilarnej jest podgrzewany i wyciągany, aż osiągnie pożądaną średnicę (100 μm). W przypadku wektorów do terapii genowej można zastosować igłę o mniejszej średnicy; jednakże jest to zalecana średnica dla iniekcji komórek, aby uniknąć ich uszkodzenia oraz uszkodzenia oka. W porównaniu z igłami stalowymi, szklana igła kapilarna ma bardzo cienką, ale tępą końcówkę, co umożliwia wizualizację płynu wstrzykiwanego i dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej bez powodowania przerwania siatkówki. W razie potrzeby należy oczyścić wyciągnięte igły 70% etanolem i przechowywać w sterylnym pojemniku. Jednym ze sposobów utrzymania igłowych urządzeń do iniekcji w sterylnym środowisku i pod przykryciem jest użycie sterylnej szalki hodowli tkankowej o średnicy 15 cm z taśmą mocującą igły w miejscu. Na tym etapie należy dokończyć konfigurację w sali operacyjnej, w której będzie przeprowadzana procedura. Najłatwiej jest stale przechowywać cały sprzęt w sali operacyjnej, aby zachować jego sterylność, szczególnie jeśli procedura odbywa się w obiekcie z barierami biologicznymi.</li>
 <li>Należy zassać silikon do igły iniekcyjnej, a następnie go wypchnąć, aby pozostawić powłokę wzdłuż wewnętrznych ścianek igły. Powłoka silikonowa maksymalizuje przepływ komórek i wirusów przez światło igły, które w przeciwnym razie przylegałyby do wewnętrznych ścianek szklanej kapilary.</li>
 <li>Należy przygotować fragment sterylnej plastikowej rurki o długości około 8 cm, odcinając zestaw do pobierania krwi o rozmiarze 25 ¾-gauge z łącznikiem luer-lock w punkcie bezpośrednio za igłą (usuwając igłę z rurki).</li>
 <li>Należy napełnić strzykawkę Sub-Q 1 ml 26 5/8-gauge z końcówką slip-tip sterylnym roztworem soli fizjologicznej, a następnie zdjąć igłę ze strzykawki.</li>
 <li>Należy przyłączyć igłę iniekcyjną do odciętego końca plastikowej rurki, a strzykawkę do łącznika luer-lock po drugiej stronie.</li>
 <li>Należy zassać sterylną sól fizjologiczną, aby wypełnić przestrzeń martwą w rurce i igle kapilarnej, wypychając niewielką ilość soli przez igłę, aby upewnić się, że jest ona prawidłowo przyłączona i nie ma wycieków. Następnie do końcówki igły iniekcyjnej należy zassać niewielką ilość powietrza, około 1 μl. Oddzieli to sól fizjologiczną od płynu do iniekcji i zapewni wizualny sygnał wskazujący koniec płynu wstrzykiwanego podczas procedury chirurgicznej. Aparatura do iniekcji powinna być podczas zabiegu trzymana na czystej powierzchni przetartej 70% etanolem. Ponadto cały sprzęt używany podczas procedury chirurgicznej powinien być czyszczony przed i po zabiegu 70% etanolem, z wyjątkiem igieł iniekcyjnych, które powinny być uprzednio przechowywane w warunkach sterylnych i być gotowe do użycia. Igły te należy wyrzucić po operacji i nie używać ich ponownie.</li>
 <li>Na koniec należy zassać roztwór do iniekcji zawierający pożądany zapakowany wektor wirusowy do terapii genowej lub komórki macierzyste. Można to zrobić, pobierając roztwór do sterylnego końcówki pipety, a następnie niszcząc roztwór na powierzchnię sterylnej szalki do hodowli komórek. Roztwór można teraz łatwo zassać do igły iniekcyjnej za pomocą strzykawki. Potrzebna ilość będzie zależeć od wieku myszy. W naszych celach używamy myszy w 5. dobie po urodzeniu, którym można wstrzyknąć 0,5-0,8 μl płynu. W przypadku młodszych myszy można stosować mniejsze ilości, 0,5 μl lub mniej, a w przypadku dorosłych myszy większe ilości, np. 1 μl. Miano wirusa lub liczba komórek muszą zostać określone na podstawie wstrzykiwanego wirusa/komórek oraz pożądanego tkanki docelowej, ponieważ zbyt wiele cząsteczek wirusa lub komórek w małej objętości może prowadzić do toksyczności dla komórek siatkówki. W filmie, w celach wizualizacyjnych, zastosowaliśmy 1,5 μl, czyli większą ilość barwnika niż jest to konieczne do iniekcji do oka.</li>
</ol>
2. Dostęp do przestrzeni podsiatkowej
<ol>
 <li>W sterylnej sali operacyjnej unieruchom lub znieczul mysz zgodnie z lokalnym, zatwierdzonym protokołem postępowania ze zwierzętami, który różni się w zależności od wieku myszy. Typowa anestezja myszy dorosłych obejmuje zastosowanie gazu izofluranowego lub wstrzyknięcie do jamy brzusznej 0,1 ml/10 g masy ciała ketaminy (100 mg/ml) i ksylazyny (20 mg/ml) w sterylnym roztworze soli fizjologicznej. W przypadku myszy perinatalnych typowe techniki znieczulania obejmują zastosowanie gazu izofluranowego lub krioanestezję (hipotermię). Wszystkie techniki znieczulenia muszą zostać zatwierdzone przez lokalny komitet IACUC przed zastosowaniem. Zazwyczaj używamy myszy w 5. dobie po urodzeniu (P5), choć podobne techniki można zastosować u myszy w wieku P0 lub u myszy dorosłych. Procedurę chirurgiczną można rozpocząć dopiero po ustaniu ruchów kończyn u myszy i braku reakcji na uciśnięcie palca u stopy. W przypadku myszy perinatalnych kolor ciała stanie się wyraźnie jaśniejszy, ponieważ przepływ krwi spowolnieje, co jest kolejnym kluczowym wskaźnikiem pełnego znieczulenia.</li>
 <li>U myszy perinatalnych należy użyć prostych nożyczek Vannasa, aby wykonać nacięcie o długości około 1,5 mm wzdłuż zamkniętej szczeliny powiekowej. Należy uważać, aby naciąć w zagłębieniu, w którym oko naturalnie otworzy się w przyszłości. Zapewnia to prawidłowe zagojenie i otwarcie powiek podczas rozwoju myszy. Do tego celu można użyć skalpela, choć preferujemy nożyczki Vannasa, ponieważ zmniejszają one ryzyko przebicia oka podczas tej procedury. Na filmie nożyczki zostały użyte do bezpośredniego przebicia i nacięcia wzdłuż brzegu powieki. Podczas nauki tej techniki należy użyć pęsety do uniesienia powieki przed nacięciem, aby zmniejszyć ryzyko uszkodzenia oka.</li>
 <li>Rozsunąć powieki za pomocą zakrzywionej pęsety opatrunkowej, aby doprowadzić do proptozy (wysunięcia) oka, a następnie lekko ucisnąć powieki poniżej oka, aby utrzymać je w tej pozycji do wstrzyknięcia. Jeśli nacięcie powieki wykonane w kroku drugim będzie zbyt duże, oko cofnie się pod powieki, co uniemożliwi odpowiednią ekspozycję podczas procedury iniekcji. W przypadku myszy dorosłych zastosowanie lekkiego nacisku wokół oka za pomocą pęsety opatrunkowej może utrzymać oko w proptozie do wstrzyknięcia.</li>
 <li>Wykonaj niewielkie nacięcie twardówki na wysokości równika gałki ocznej lub za nim, wydrapując powierzchnię skalpelem mikrochirurgicznym o kącie 15 stopni. Nacięcie powinno być na tyle duże, aby umożliwić przejście końcówki igły iniekcyjnej, ale nie większe. Jeśli preferowane jest inne rozwiązanie, zamiast skalpela mikrochirurgicznego do wykonania tego nacięcia w przestrzeni podsiatkowej można użyć małej, ostrej igły, np. igły do akupunktury. U zwierząt o ciemnej pigmentacji w miejscu nacięcia widoczna będzie ciemnobrązowa tkanka (nabłonek pigmentowy siatkówki i naczyniówka). U myszy o jaśniejszej pigmentacji lub myszy albinosów można nanieść chirurgiczny marker na końcówkę skalpela mikrochirurgicznego, aby pozostawić kropkę z atramentu wskazującą miejsce nacięcia. Jeśli z miejsca nacięcia cofnie się przezroczysty płyn (ciało szkliste), oznacza to, że skalpel został wprowadzony zbyt głęboko, wnikając do jamy ciała szklistego, co może spowodować przedostanie się terapeutycznego wirusa lub komórek do przestrzeni witrealej podczas iniekcji. W celach wizualizacji na filmie wykonaliśmy nacięcie do tego punktu. W takim przypadku nadal można przeprowadzić iniekcję podsiatkową, jednak odwarstwienie siatkówki spowodowane obecnością płynu iniekcyjnego może nie zagoić się całkowicie u tej myszy. Dlatego należy uważać, aby naciąć tylko zewnętrzną powierzchnię oka, a nie przebić się przez siatkówkę przed iniekcją.</li>
 <li>Ostrożnie wprowadź igłę iniekcyjną w miejsce nacięcia i przesuń ją równolegle do zewnętrznej ściany oka, aby wejść w przestrzeń podsiatkową. Wprowadzenie igły zbyt blisko zewnętrznej ściany lub zbyt głęboko do wnętrza oka skieruje iniekcję w niewłaściwe miejsce. Najlepszą metodą zrozumienia, czy igła znajduje się w prawidłowym miejscu, jest ćwiczenie tej techniki. Praktyka na myszach o jasnej pigmentacji lub albinosach może pomóc w wykonywaniu precyzyjnych i dokładnych iniekcji do przestrzeni podsiatkowej, ponieważ igła i płyn iniekcyjny są w tych oczach widoczne.</li>
 <li>Wywarć lekki nacisk na tłok strzykawki i rozpocząć wstrzykiwanie pożądanego płynu. Jeśli igła jest prawidłowo umieszczona w przestrzeni podsiatkowej, odczuwalny będzie umiarkowany opór wsteczny. Jeśli igła znajduje się w ciele szklistym, opór wsteczny będzie znacznie mniejszy i podczas iniekcji może wystąpić cofanie się płynu. W przypadku znacznego oporu wstecznego należy utrzymać igłę w miejscu przez co najmniej dodatkowe 15 sekund przed jej powolnym wyjęciem. Pozwoli to na wyrównanie wysokiego ciśnienia wewnątrzgałkowego zamiast cofania się wstrzykniętego wirusa lub komórek przez miejsce nacięcia. Ze względu na zwiększone ciśnienie wymagane podczas procedury iniekcji, do przestrzeni podsiatkowej może zostać wstrzyknięta część powietrza i soli fizjologicznej. Należy uważać, aby nie wstrzyknąć zbyt dużo powietrza lub soli fizjologicznej, ponieważ może to wypłukać wstrzykniętego wirusa lub komórki z oka. Istnieje również ryzyko spowodowania trwałego odwarstwienia siatkówki z powodu wstrzyknięcia zbyt dużej ilości płynu do przestrzeni podsiatkowej. W celach wizualizacji na filmie do przestrzeni podsiatkowej wstrzyknięto nadmiar barwnika i powietrza. Można wyraźnie zobaczyć, jak część barwnika zostaje wypłukana z przestrzeni podsiatkowej w przypadku wstrzyknięcia zbyt dużej ilości, ale także jak pęcherzyk powietrza pozostaje w przestrzeni podsiatkowej i nie znika w ciele szklistym. Zastosowano to, aby podkreślić, że wszystkie te iniekcje odbyły się w prawidłowym miejscu w oku, dzięki czemu można zwizualizować sposób wprowadzania igły w miejsce nacięcia. Wszystkie iniekcje do przestrzeni podsiatkowej powodują tymczasowe odwarstwienie siatkówki z powodu obecności płynu iniekcyjnego. Jeśli procedura iniekcji zostanie przeprowadzona prawidłowo, to tymczasowe odwarstwienie siatkówki zagoi się w ciągu 24 h i myszy będą mogły być wykorzystane we wszystkich dalszych eksperymentach. Oko może pozostać miękkie przez około tydzień z powodu zabiegu chirurgicznego, dlatego w tym okresie należy unikać drugiej iniekcji.</li>
 <li>U myszy noworodkowych należy użyć zakrzywionej pęsety opatrunkowej, aby delikatnie odepchnąć oko z powrotem za powieki i do oczodołu. Warto odczekać minutę, aby wirus osiadł w przestrzeni podsiatkowej i nie został wypłukany z miejsca nacięcia podczas delikatnego odpychania oka do oczodołu. Po zabiegu w miejscu iniekcji można podać jedną kroplę 0,5% bupiwakainy (markainy) rozcieńczonej do 0,25% w sterylnym roztworze soli fizjologicznej za pomocą igły 25G. Myszy nie wykazują jawnych oznak stresu po operacji podsiatkowej, a stosowanie bupiwakainy jako długo działającego miejscowego środka przeciwbólowego było wystarczające przez ostatnie trzy lata. Po zabiegu chirurgicznym należy zawsze monitorować myszy pod kątem wszelkich oznak stresu, takich jak infekcja, obrzęk lub spadek typowej dziennej aktywności myszy. Jeśli takie objawy wystąpią, należy powiadomić lekarza weterynarii; można wówczas podać dodatkowe leki przeciwbólowe, np. buprenorfinę (0,05 mg/kg) w formie iniekcji doprzewnowej.</li>
 <li>Wybudzić mysz z narkozy zgodnie z lokalnym, zatwierdzonym protokołem postępowania ze zwierzętami. Podczas wybudzania mysz powinna znajdować się na poduszce grzewczej w celu utrzymania normalnej temperatury ciała. Procedura chirurgiczna powinna zająć mniej niż pięć minut, nie licząc czasu znieczulania myszy. Dlatego poduszka grzewcza nie jest konieczna podczas samego zabiegu, ale może być potrzebna podczas nauki techniki, gdyż procedura może trwać dłużej. Myszy nie należy przenosić z powrotem do czystej klatki, dopóki nie zacznie samodzielnie się poruszać. W przypadku noworodków delikatne uciskanie palców u stóp pomoże im w pełni dojść do siebie po znieczuleniu; powinny one odzyskać różowy kolor i zdolność poruszania się przed powrotem do matki. Myszy należy monitorować w czasie pod kątem wszelkich oznak stresu wymienionych wcześniej.</li>
</ol>

<ol><li>Prevalence of Blindness Data Tables [NEI Statistics and Data]. , National Eye Insitute. Available from: 
		
 <a target="_blank" href="http://www.nei.nih.gov/eyedata/pbd_tables.asp">http://www.nei.nih.gov/eyedata/pbd_tables.asp</a> (2011).</li>
<li>Abe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+retina+using+pigment+epithelial+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nihon+Ganka+Gakkai+Zasshi%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation.</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).</li>
<li>Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E., Schwartz, S. B., Roman, A. J., Peden, M. C., Aleman, T. S., Boye, S. L., Sumaroka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+Leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations%3A+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for Leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch. Ophthalmol. 130, 9-24 (2011).</li>
<li>Schwartz, S. D., Hubschman, J. P., Heilwell, G., Franco-Cardenas, V., Pan, C. K., Ostrick, R. M., Mickunas, E., Gay, R., Klimanskaya, I., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379, 713-720 (2012).</li>
<li>Wang, N. K., Tosi, J., Kasanuki, J. M., Chou, C. L., Kong, J., Parmalee, N., Wert, K. J., Allikmets, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa.</a> Transplantation. 89, 911-919 (2010).</li>
<li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).</li>
<li>Tosi, J., Sancho-Pelluz, J., Davis, R. J., Hsu, C. W., Wolpert, K. V., Sengillo, J. D., Lin, C. S., Tsang, S. H. Lentivirus-mediated expression of cDNA and shRNA slows degeneration in retinitis pigmentosa. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTosi%2C+J+%22Exp.+Biol.+Med%22">Exp. Biol. Med</a>. 236, 1211-1217 (2011).</li>
<li>Tucker, B. A., Park, I. H., Qi, S. D., Klassen, H. J., Jiang, C., Yao, J., Redenti, S., Daley, G. Q., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+adult+mouse+iPS+cell-derived+photoreceptor+precursors+restores+retinal+structure+and+function+in+degenerative+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice.</a> PLoS One. 6, e189992(2011).</li>
<li>Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMahajan%2C+VB+%22A+high-throughput+Mouse+Eye+Phenomics+System%22">A high-throughput Mouse Eye Phenomics System</a>. , Cold Spring Harbor Laboratories. (2010).</li>
<li>Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42, 517-525 (2002).</li>
<li>Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+fundus+photography+and+angiography%3A+a+catalogue+of+normal+and+mutant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes.</a> Mol. Vis. 5, 22(1999).</li>
<li>Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+resources+for+vision+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Mouse model resources for vision research.</a> J. Ophthalmol. 2011, 391384(2011).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Niniejsza technika wideo przedstawia instrukcje dotyczące prawidłowego przeprowadzenia zabiegu chirurgicznego polegającego na iniekcji podsiatkówkowej, zapewniając umieszczenie wektora terapii genowej lub komórek macierzystych w miejscu niezbędnym do efektywnego leczenia choroby okulistycznej. Technika ta umożliwia celowanie w komórki siatkówki, takie jak RPE lub fotoreceptory, ponieważ wprowadza wektory terapii genowej lub tkanki pochodzące z komórek macierzystych w bezpośrednie sąsiedztwo tych komórek. Wcześniejsze met...

<table><tbody><tr><td>Kapilara szklana 0,8-1,10 x 100 mm</td><td>Kimble Glass, Inc.</td><td>34502 99</td><td></td></tr><tr><td>Wytwornica mikropipet (puller) Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>Można zastosować mikrokuźnię Narishige. Katalog nr MF-900</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2-25ML</td><td>Silikon</td></tr><tr><td>Fosforanowy bufor solny Dubecco z chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do pobierania krwi Safety-Lok 25 3/4G x 12&quot;</td><td>B-D Vacutainer</td><td>367298</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka podskórna 1 ml 26 5/8G z końcówką typu slip-tip</td><td>Becton-Dickinson</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta o regulowanym zakresie 0,5-10 &amp;mu;l Finnpipette II</td><td>Fisherbrand</td><td>21-377-815</td><td></td></tr><tr><td>Naturalne końcówki ścięte 1-200 &amp;mu;l</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1111-1700</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop Discovery.V8</td><td>Zeiss</td><td>MC1500</td><td></td></tr><tr><td>Przetraktowana polistyrenowa płytka do hodowli komórkowych 60 mm x 15 mm</td><td>Corning Incorporated</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Nożyce proste Vannasa</td><td>Storz Ophthalmics</td><td>E3383 S</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione pęsety opatrunkowe z delikatnym karbowaniem</td><td>Storz Ophthalmics</td><td>E1408</td><td></td></tr><tr><td>Nóż mikrochirurgiczny 15 stopni</td><td>Wilson Ophthalmic Corp.</td><td>091204</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Ketaset III</td><td>NADA #45-290</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>NADA #139-236</td><td></td></tr><tr><td>Bupiwakaina (Marcaine)</td><td>AstraZeneca</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9275</td><td></td></tr></tbody></table>

podsiatkówkowe wstrzykiwanie wektorów terapii genowej i komórek macierzystych do oka myszy w okresie okołodniowym

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Utrata wzroku dotyka około 3,4 miliona osób w Stanach Zjednoczonych i przewiduje się, że liczba ta wzrośnie w nadchodzących latach.1 W ostatnim czasie terapia genowa i przeszczepy komórek macierzystych stały się kluczowymi narzędziami terapeutycznymi w leczeniu ślepoty wynikającej z chorób degeneracyjnych siatkówki. Kilka form transplantacji autologicznej w przebiegu związanej z wiekiem degeneracji plamki żółtej (AMD), takich jak przeszczep komórek nabłonka pigmentowego tęczówki, przyniosło obiecujące wyniki, a rozpoczęły się badania kliniczne u ludzi nad innymi formami terapii genowych i komórkami macierzystymi.2 Obejmują one terapię zastępczą genu RPE65 u pacjentów z wrodzoną amaurozą Lebera oraz przeszczep komórek RPE z wykorzystaniem ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (ES) w chorobie Stargardta.3-4 Obecnie, gdy dostępne są wektory terapii genowej i komórki macierzyste do leczenia pacjentów z chorobami siatkówki, istotne jest zweryfikowanie tych potencjalnych terapii na modelach zwierzęcych przed ich zastosowaniem w badaniach na ludziach. Mysz stała się ważnym modelem naukowym do testowania skuteczności terapeutycznej wektorów terapii genowej i transplantacji komórek macierzystych w oku.5-8 W niniejszym artykule wideo przedstawiamy technikę wstrzykiwania wektorów terapii genowej lub komórek macierzystych do przestrzeni podsiatkówkowej oka myszy przy jednoczesnym zminimalizowaniu uszkodzeń otaczających tkanek.

Przedstawiono rysunek oka myszy z oznaczonymi głównymi strukturami w celach referencyjnych, ze strzałkami wskazującymi miejsca wykonywania zabiegów chirurgicznych polegających na iniekcji doplastycznej oraz podsiatkówkowej (groty strzałek, Rysunek 1). W tych miejscach można wstrzyknąć wektory terapii genowej, takie jak lentiwirusowy wektor lacZ (Rysunek 2). Ponadto w tych obszarach oka myszy można przeszczepiać komórki macierzyste, na przykład embrionalne komórki macierzyste mys...

Niniejsza technika chirurgiczna przedstawia wstrzykiwanie wektorów terapii genowej oraz komórek macierzystych do przestrzeni podsiatkówkowej oka myszy.

Podsiatkówkowe wstrzykiwanie wektorów terapii genowej i komórek macierzystych do oka myszy w okresie okołodniowym

Utrata wzroku dotyczy około 3,4 miliona osób w Stanach Zjednoczonych i przewiduje się, że liczba ta wzrośnie w nadchodzących latach.1 Niedawno terapia genowa ...

Pierwszym krokiem jest złożenie urządzenia z zestawu do pobierania krwi. Odetnij igłę o rozmiarze 25 3/4 G od tego ośmiocentymetrowego odcinka sterylnej rurki. Za pomocą połączenia luer-lock można zakupić szklaną igłę kapilarną o średnicy 100 µm lub wykonać ją samodzielnie za pomocą wyciągacza pipet Sutter P 97, a następnie zassać sterylną sól fizjologiczną, aby wypełnić przestrzeń martwą w rurce.Przymocuj szklaną rurkę kapilarną do końca sterylnej plastikowej rurki, a następnie wypchnij niewielką ilość soli fizjologicznej przez igłę, aby upewnić się, że jest ona prawidłowo zamocowana i nie występują żadne wycieki. Obserwując pod mikroskopem, sprawdź wartość przyłożonego ciśnienia oraz szybkość wypływu cieczy przez cienką końcówkę; użyjemy kolorowego roztworu, aby reprezentować wektor wirusowy lub komórki macierzyste. Umieść rurkę w sterylnej szalce Petriego, odessij niewielką ilość powietrza, a następnie roztwór do iniekcji.Na potrzeby naszego badania wykorzystujemy pięć myszy P. Na tym obrazie widoczny jest pysk. Oko jest przykryte powieką.Linie przerywane wskazują brzeg powieki oraz fałd powiekowy, w którym wykonane zostanie nacięcie. Do wykonania nacięcia o długości 1,5 mm wzdłuż zamkniętej powieki używa się prostych nożyczek typu Vanis. Pinceta do rozszerzania szczeliny służy do rozsuniecia powiek i odsłonięcia oka, tak aby brzeg powieki znajdował się nieco za gałką oczną.Aby wykonać sklerotomię, ważne jest zidentyfikowanie kilku punktów orientacyjnych. Przejście z przezroczystej rogówki do twardówki wyznacza limbus. Bezpośrednio za twardówką znajduje się nabłonek pigmentowy siatkówki, następnie siatkówka, a potem ciało szkliste. Matomia jest przeprowadzana w połowie dystansu z tyłu lub na równiku gałki ocznej poprzez nacięcie powierzchni za pomocą 15-stopniowego skalpela mikrochirurgicznego u zwierząt o ciemnym pigmencie.W miejscu ncięcia widoczna stanie się ciemnobrązowa, pigmentowana tkanka. Jeśli nacięcie zostanie wykonane zbyt głęboko, pojawi się ciecz. Jest to ciało szkliste, co oznacza, że nacięcie zostało wykonane zbyt głęboko.Przejście przez nabłonek pigmentowy siatkówki (RPE). To nacięcie można wykorzystać do iniekcji dowitralnej. Teraz należy przygotować własne zwierzę.Nacięcie w tym punkcie jest zakończone. Dodatkowe nacięcie i zadrapania uwolnią ciało szkliste dla zastrzyku podsiatkówkowego; celem jest umieszczenie szklanej mikrokapilary w przestrzeni podsiatkówkowej, dokładnie pomiędzy siatkówką a RPE. Jeśli nacięcie było zbyt głębokie, igła może przejść przez siatkówkę do ciała szklistego. Wprowadź igłę równolegle do zewnętrznej ściany oka.Aby dostać się do przestrzeni podsiatkowej, należy lekko nacisnąć tłok i rozpocząć wstrzykiwanie płynu. Jeśli igła została umieszczona prawidłowo, wyczuwalny będzie umiarkowany opór wsteczny, a w przestrzeni podsiatkowej utworzy się BLE.Jeśli igła znajduje się w ciele szklistym, ciśnienie wsteczne jest znacznie mniejsze. Aby uniknąć istotnego cofania się płynu, należy przytrzymać tłok przez dodatkowe 15 sekund przed wyjęciem igły. Pozwoli to na ustabilizowanie ciśnienia wewnątrzgałkowego.Delikatnie odsuń gałkę oczną za powieki do oczodołu, używając zakrzywionych pęsety chirurgicznej. Oto kolejny przykład wstrzyknięcia podsiatkówkowego, w którym barwnik wypełnia przestrzeń podsiatkówkową i jest wyraźnie widoczny u zwierzęcia albinosa. Menisk powietrzny pozwala zauważyć moment zakończenia wstrzykiwania.Iniekcje płynów do oka o ciemnej pigmentacji są nieco bardziej wymagające. Staranne wprowadzenie igły pozwoli na osiągnięcie doskonałych rezultatów.

subretinal-injection-gene-therapy-vectors-stem-cells-perinatal-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Wstrzyknięcie do siatkówki wektorów terapii genowej i komórek macierzystych w oku mysiego w okresie okołoporodowym

W niniejszej pracy przedstawiamy dwie techniki manipulowania ekspresją genów w komórkach zwojowych siatkówki (RGCs) myszy za pomocą elektroporacji in utero oraz ex vivo. Techniki te pozwalają badać, w jaki sposób zmiany w ekspresji genów wpływają na rozwój RGCs, prowadzenie aksonów oraz właściwości funkcjonalne.

Elektroporacja in utero oraz ex vivo w celu ekspresji genów w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Przedstawiono metodę wprowadzania plazmidowego DNA do komórek siatkówki myszy w celu przeprowadzenia badań nad przyrostem lub utratą funkcji in vivo. Metoda ta wykorzystuje przejściowy wzrost przepuszczalności błon plazmatycznych komórek wywołany przyłożeniem zewnętrznego pola elektrycznego.

In vivo elektroporacja rozwijającej się siatkówki myszy

Źródło: Park, S. W., et al. Podejście rąbkowe - podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do terapii genowej u myszy nabłonek barwnikowy siatkówki. J. Vis. Exp. (2015)Film opisuje metodę podsiatkówkowego wstrzykiwania wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) w modelu mysim. Szczegółowo opisano w nim procedurę, od znieczulenia i przygotowania oka po precyzyjne dostarczenie wektora lentiwirusowego, zapewniając integrację i ekspresję genów w RPE.

Podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki w modelu mysim

Tutaj prezentujemy akceptowany przez społeczność protokół w formacie multimedialnym do podsiatkówkowego wstrzykiwania bolusa komórek RPE szczurom i myszom. Podejście to można wykorzystać do określenia potencjałów ratunkowych, profili bezpieczeństwa i zdolności przeżycia przeszczepionych komórek RPE po implantacji w zwierzęcych modelach zwyrodnienia siatkówki.

Wykonywanie iniekcji podsiatkówkowych u gryzoni w celu dostarczenia komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w zawiesinie

Wstrzyknięcie podsiatkówkowe to technika chirurgiczna służąca skutecznemu dostarczaniu genów do nabłonka barwnikowego siatkówki w oku myszy.  Tutaj opisujemy łatwą i powtarzalną metodę subretinalnego wstrzykiwania wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki u myszy eksperymentalnych.

Podejście rąbkowe - podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do terapii genowej u myszy Nabłonek barwnikowy siatkówki

Zastrzyki podsiatkówkowe są najczęstszą techniką dostarczania dużych środków terapeutycznych, takich jak białka i wektory wirusowe, do fotoreceptorów i nabłonka barwnikowego siatkówki. Alternatywna metoda u myszy, która z powodzeniem celuje w przestrzeń podsiatkówkową z minimalnymi uszkodzeniami ubocznymi i krótkim czasem rekonwalescencji, jest opisana tutaj.

Alternatywna i zwalidowana metoda iniekcji umożliwiająca dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej przez przeztwardówkowy dostęp tylny

Tutaj demonstrujemy nowatorskie podejście do wykorzystania wysokiej rozdzielczości optycznej koherentnej tomografii spektralnej (HR-SD-OCT) do wspomagania dostarczania środków terapii genowej do przestrzeni podsiatkówkowej, oceny jej zasięgu powierzchniowego i charakteryzowania żywotności fotoreceptorów.

Optyczna koherentna tomografia myszy o ultrawysokiej rozdzielczości wspomagająca wstrzyknięcie do gałki ocznej w badaniach nad terapią genową siatkówki

Ten protokół przedstawia przezźrenicowe, sterowane widzeniem podejście przeztwardówkowe do bezpiecznego i precyzyjnego dostarczania przeszczepów komórkowych podsiatkówkowych, z niskim wskaźnikiem powikłań chirurgicznych, u myszy, biorców ze zwyrodnieniem siatkówki lub bez.

Przezźrenicowe przeszczepienie przeztwardówkowe przeszczepów podsiatkówkowych w mysim modelu zwyrodnienia siatkówki

Opisujemy szczegółowy protokół przygotowania komórek progenitorowych fotoreceptorów pochodzących z kriokonserwacji hESC oraz dostarczania tych komórek do tkanki podsiatkówkowej u myszy rd10.

Podsiatkówkowe dostarczanie progenitorów fotoreceptorów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych u myszy rd10

Ten artykuł zawiera protokół i towarzyszący mu film dotyczący iniekcji do zatoki zagałkowej o całkowitej objętości 150 μL dla dorosłych myszy po porodzie, młodych osobnikach i biegach. Procedura ta szczególnie dobrze nadaje się do wstrzykiwania małych myszy (15 g), gdy wstrzyknięcie do żyły ogonowej nie jest możliwe.

Leczenie ogólnoustrojowe dorosłych myszy po porodzie, młodych i biegowych przez wstrzyknięcie do zatoki zagałkowej

Iniekcje podsiatkówkowe są nieodzowną techniką w przedklinicznym rozwoju terapii chorób fotoreceptorowych i RPE. Opisujemy zoptymalizowaną technikę przeztwardówkowego wstrzykiwania podsiatkówkowego u myszy, która poprawia wskaźniki powodzenia śródoperacyjnego i minimalizuje uszkodzenie siatkówki.

Zoptymalizowana minimalnie inwazyjna technika przeztwardówkowego wstrzykiwania podsiatkówkowego u myszy

Poznaj technikę chirurgiczną podsiatkówkowego wstrzyknięcia wektorów terapii genowej i komórek macierzystych do oka myszy. Metoda umożliwia precyzyjne dostarczanie terapeutyków w badaniach nad chorobami siatkówki.

Podsiatkówkowe wstrzykiwanie wektorów terapii genowej i komórek macierzystych do oka myszy w okresie okołodniowym

Przeglądaj więcej filmów