Podsiatkówkowe wstrzykiwanie wektorów terapii genowej i komórek macierzystych do oka myszy w okresie okołodniowym
25 listopada 2012
Niniejsza technika chirurgiczna przedstawia wstrzykiwanie wektorów terapii genowej oraz komórek macierzystych do przestrzeni podsiatkówkowej oka myszy.
Pierwszym krokiem jest złożenie urządzenia z zestawu do pobierania krwi. Odetnij igłę o rozmiarze 25 3/4 G od tego ośmiocentymetrowego odcinka sterylnej rurki. Za pomocą połączenia luer-lock można zakupić szklaną igłę kapilarną o średnicy 100 µm lub wykonać ją samodzielnie za pomocą wyciągacza pipet Sutter P 97, a następnie zassać sterylną sól fizjologiczną, aby wypełnić przestrzeń martwą w rurce.
Przymocuj szklaną rurkę kapilarną do końca sterylnej plastikowej rurki, a następnie wypchnij niewielką ilość soli fizjologicznej przez igłę, aby upewnić się, że jest ona prawidłowo zamocowana i nie występują żadne wycieki. Obserwując pod mikroskopem, sprawdź wartość przyłożonego ciśnienia oraz szybkość wypływu cieczy przez cienką końcówkę; użyjemy kolorowego roztworu, aby reprezentować wektor wirusowy lub komórki macierzyste. Umieść rurkę w sterylnej szalce Petriego, odessij niewielką ilość powietrza, a następnie roztwór do iniekcji.
Na potrzeby naszego badania wykorzystujemy pięć myszy P. Na tym obrazie widoczny jest pysk. Oko jest przykryte powieką.
Linie przerywane wskazują brzeg powieki oraz fałd powiekowy, w którym wykonane zostanie nacięcie. Do wykonania nacięcia o długości 1,5 mm wzdłuż zamkniętej powieki używa się prostych nożyczek typu Vanis. Pinceta do rozszerzania szczeliny służy do rozsuniecia powiek i odsłonięcia oka, tak aby brzeg powieki znajdował się nieco za gałką oczną.
Aby wykonać sklerotomię, ważne jest zidentyfikowanie kilku punktów orientacyjnych. Przejście z przezroczystej rogówki do twardówki wyznacza limbus. Bezpośrednio za twardówką znajduje się nabłonek pigmentowy siatkówki, następnie siatkówka, a potem ciało szkliste. Matomia jest przeprowadzana w połowie dystansu z tyłu lub na równiku gałki ocznej poprzez nacięcie powierzchni za pomocą 15-stopniowego skalpela mikrochirurgicznego u zwierząt o ciemnym pigmencie.
W miejscu ncięcia widoczna stanie się ciemnobrązowa, pigmentowana tkanka. Jeśli nacięcie zostanie wykonane zbyt głęboko, pojawi się ciecz. Jest to ciało szkliste, co oznacza, że nacięcie zostało wykonane zbyt głęboko.
Przejście przez nabłonek pigmentowy siatkówki (RPE). To nacięcie można wykorzystać do iniekcji dowitralnej. Teraz należy przygotować własne zwierzę.
Nacięcie w tym punkcie jest zakończone. Dodatkowe nacięcie i zadrapania uwolnią ciało szkliste dla zastrzyku podsiatkówkowego; celem jest umieszczenie szklanej mikrokapilary w przestrzeni podsiatkówkowej, dokładnie pomiędzy siatkówką a RPE. Jeśli nacięcie było zbyt głębokie, igła może przejść przez siatkówkę do ciała szklistego. Wprowadź igłę równolegle do zewnętrznej ściany oka.
Aby dostać się do przestrzeni podsiatkowej, należy lekko nacisnąć tłok i rozpocząć wstrzykiwanie płynu. Jeśli igła została umieszczona prawidłowo, wyczuwalny będzie umiarkowany opór wsteczny, a w przestrzeni podsiatkowej utworzy się BLE.
Jeśli igła znajduje się w ciele szklistym, ciśnienie wsteczne jest znacznie mniejsze. Aby uniknąć istotnego cofania się płynu, należy przytrzymać tłok przez dodatkowe 15 sekund przed wyjęciem igły. Pozwoli to na ustabilizowanie ciśnienia wewnątrzgałkowego.
Delikatnie odsuń gałkę oczną za powieki do oczodołu, używając zakrzywionych pęsety chirurgicznej. Oto kolejny przykład wstrzyknięcia podsiatkówkowego, w którym barwnik wypełnia przestrzeń podsiatkówkową i jest wyraźnie widoczny u zwierzęcia albinosa. Menisk powietrzny pozwala zauważyć moment zakończenia wstrzykiwania.
Iniekcje płynów do oka o ciemnej pigmentacji są nieco bardziej wymagające. Staranne wprowadzenie igły pozwoli na osiągnięcie doskonałych rezultatów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ta technika chirurgiczna ilustruje wstrzykiwanie wektorów terapii genowej oraz komórek macierzystych do przestrzeni podsiatkowej oka myszy. Proces ten obejmuje staranne przygotowanie urządzenia do precyzyjnego podawania czynników terapeutycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Terapia genowa
- Badania nad komórkami macierzystymi
- Okulistyka
Wprowadzenie
- Terapia genowa ma na celu leczenie lub zapobieganie chorobom poprzez wprowadzanie materiału genetycznego do komórek.
- Komórki macierzyste mają potencjał do regeneracji uszkodzonych tkanek.
- Przestrzeń podsiatkówkowa jest krytycznym obszarem dla interwencji okulistycznych.
- Modele mysie są powszechnie stosowane w badaniach przedklinicznych w obszarze badań nad wzrokiem.
Cel badania
- Przedstawienie techniki chirurgicznej podawania wektorów terapii genowej.
- Zbadanie potencjału komórek macierzystych w leczeniu chorób siatkówki.
- Udoskonalenie metod precyzyjnych iniekcji do oka.
Zastosowane metody
- Montaż urządzenia z zestawu do pobierania krwi.
- Przygotowanie szklanej igły kapilarnej do iniekcji.
- Aspiracja sterylnej soli fizjologicznej w celu napełnienia urządzenia.
- Użycie kolorowego roztworu w celu reprezentowania wektora wirusowego lub komórek macierzystych podczas procedury.
Główne wyniki
- Urządzenie umożliwia kontrolowane wstrzykiwanie do przestrzeni podsiatkówkowej.
- Pomyślna wizualizacja wyrzutu płynu pod mikroskopem.
- Wykazanie wykonalności techniki w zastosowaniach terapii genowej.
- Potencjalne implikacje dla przyszłych metod leczenia chorób siatkówki.
Wnioski
- Technika ta zapewnia niezawodną metodę dostarczania genów w terapii genowej.
- Konieczne są dalsze badania w celu oceny długofalowych wyników.
- Otwiera ona możliwości wdrażania innowacyjnych metod leczenia schorzeń siatkówki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta technika chirurgiczna umożliwia precyzyjne dostarczanie wektorów terapii genowej oraz komórek macierzystych do przestrzeni podsiatkówkowej w oczach myszy w okresie okołonatalnym, co wspiera przedkliniczną walidację leków okulistycznych. Dzięki minimalizacji uszkodzeń tkanek i zapewnieniu dokładnego targetowania, metoda ta zwiększa powtarzalność w procesach wczesnego etapu odkrywania leków dla modeli chorób siatkówki. Stanowi ona skalowalną platformę do oceny kandydatów terapeutycznych przed przejściem do badań na większych zwierzętach lub badań umożliwiających złożenie wniosku o IND.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia funkcjonalną analizę konstruktów terapii genowej w mikrośrodowisku oka istotnym dla przebiegu choroby.
- Wartość operacyjna: Wspiera walidację celu poprzez potwierdzenie dostarczenia konstruktu do zamierzonych warstw komórek siatkówki.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie mierzalnych wyników dotyczących rozkładu wektora lub komórek poprzez wizualizację tworzenia się pęcherzyków (blebs) w przestrzeni podsiatkówkowej.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje parametry wstrzykiwania w celu zapewnienia powtarzalnego dawkowania związków lub komórek w obrębie kohort badawczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Umożliwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez pozwalanie na podłużną ocenę zaprawiania lub ekspresji w modelach okołoporodowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia przeprowadzanie testów zależności dawka-odpowiedź, które są kluczowe dla profilowania bezpieczeństwa i skuteczności w badaniach przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć, od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną, szczególnie w przypadku okulistycznych terapii genowych i komórkowych.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotez dotyczących tropizmu wektorów, aktywności promotorów lub zaprawiania komórek macierzystych w niszy siatkówkowej.
- Przesiewanie: Dostarczanie ustandaryzowanych objętości czynników terapeutycznych w celu umożliwienia porównawczego przesiewania kandydatów.
- Analityka: Zapewnienie wizualnych i przestrzennych odczytów (np. wielkość pęcherzyka, fluorescencja) w celu ilościowego określenia skuteczności dostarczania.
- Badania translacyjne: Łączenie fazy odkryć z badaniami przedklinicznymi poprzez walidację dostarczania w fizjologicznie istotnym modelu noworodkowego oka.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanowienie reużywalnej platformy chirurgicznej do iteracyjnego testowania wielu wektorów lub linii komórkowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie oddziaływania na cel poprzez potwierdzenie subkomórkowej lokalizacji dostarczonych czynników.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzacji montażu urządzenia i techniki wstrzykiwania.
- Wartość strategiczna: Redukuje opóźnienia związane z ograniczaniem ryzyka biologicznego poprzez umożliwienie wczesnej walidacji funkcjonalnej in vivo.
- Wpływ na portfolio: Wspiera decyzje go/no-go w oparciu o wskaźniki wydajności dostarczania i integralności tkanki.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w mikrochirurgii oraz znajomości anatomii oka noworodków.
- Zależne od precyzyjnego instrumentarium, w tym od ostrzy mikrochirurgicznych, pęset oraz narzędzi do przygotowania kapilar szklanych.
- Wymaga standaryzowanego przeszkolenia w celu zminimalizowania zmienności głębokości nacięcia i rozmieszczenia igły pomiędzy operatorami.
- Należy uwzględnić trudności z wizualizacją zależne od pigmentacji podczas adaptacji metody do różnych szczepów myszy.
- Ograniczone przez umiejętności techniczne niezbędne do uniknięcia penetracji ciała szklistego i zapewnienia umieszczenia podsiatkówkowego.
