Name: Analiza fuzji błonowej za pośrednictwem SNARE przy użyciu enzymatycznego testu fuzji komórkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Poznaj enzymatyczny test fuzji komórkowej do ilościowej analizy fuzji błonowej zależnej od SNARE przy użyciu β-galaktozydazy. Metoda umożliwia badanie wielu kombinacji białkowych w komórkach COS-7.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca jest finansowana ze środków startowych University of Louisville oraz z grantu CA135123 National Institutes of Health (przyznanego C.H.).

1. Hodowla komórek i transfekcja
<ol>
 <li>Komórki COS-7 hoduje się w medium DMEM (Dulbecco Modified Eagle's Medium) uzupełnionym o 4,5 g/l glukozy oraz 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).</li>
 <li>Transfekcję plazmidową przeprowadza się za pomocą Lipofectamine zgodnie z instrukcjami producenta (Invitrogen).</li>
</ol>
2. Analiza mikroskopowa fluorescencyjna ekspresji białek SNARE na powierzchni komórek
<ol>
 <li>Dzień przed transfekcją 3×104 komórek COS-7 wysiewa się na sterylne szklane laminki o średnicy 12 mm (Fisher Scientific) umieszczone w płytkach 24-dołkowych.</li>
 <li>W przypadku komórek v w każdym dołku 0,25 μg plazmidu kodującego tTA (pTet-Off, CLONTECH) współtransfekuje się z 0,25 μg plazmidów eksprymujących odwrócone VAMPy.</li>
 <li>W przypadku komórek t w każdym dołku 0,25 μg plazmidu kodującego TRE-LacZ (pBI-G, CLONTECH) współtransfekuje się z 0,25 μg każdego z plazmidów eksprymujących odwrócone SNAP-25 oraz syntaksyny 1 lub 4.</li>
 <li>24 h po transfekcji komórki utrwala się 4% paraformaldehydem w PBS++ (PBS uzupełniony o 0,1 g/l CaCl2 i 0,1 g/l MgCl2) przez 10 min, a następnie blokuje w 10% FBS w PBS++ przez 30 min.</li>
 <li>Komórki inkubuje się przez 1,5 h z przeciwciałem monoklonalnym anty-Myc 9E10 (czysty nadsącz z hodowli hybridoma).</li>
 <li>Po czterokrotnym przemyciu PBS++, komórki inkubuje się przez 1 h z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z FITC (Jackson Immunoresearch Laboratories) w rozcieńczeniu 1:500.</li>
 <li>Po czterokrotnym przemyciu PBS++, znakowane komórki zamyka się w odczynniku antyblaknącym Prolong Gold (Invitrogen).</li>
 <li>Obrazy konfokalne pozyskuje się za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego Olympus. Obrazy przetwarza się w programie Adobe Photoshop.</li>
</ol>
3. Analiza FACS ekspresji białek SNARE na powierzchni komórek
<ol>
 <li>Dzień przed transfekcją w każdej studzience płytek 6-dołkowych wysiewa się 2×105 komórek COS-7.</li>
 <li>24 h po transfekcji plazmidami flipped SNARE, pTet-Off i pBI-G, komórki utrwala się 1% paraformaldehydem w PBS++ przez 15 min, a następnie blokuje w 10% FBS w PBS++ przez 15 min.</li>
 <li>Komórki inkubuje się z przeciwciałem monoklonalnym anty-Myc 9E10 przez 60 min.</li>
 <li>Po trzykrotnym przemyciu PBS++, komórki znakuje się przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z FITC (rozcieńczenie 1:200) przez 45 min.</li>
 <li>Po trzykrotnym przemyciu PBS++, komórki zdejmuje się z płytek za pomocą skrobaka do komórek.</li>
 <li>15 000 komórek analizuje się za pomocą cytometru przepływowego FACSCalibur (BD Biosciences). Średnią intensywność fluorescencji dla każdej próbki wyznacza się przy użyciu oprogramowania CellQuest Pro.</li>
</ol>
4. Enzymatyczny test fuzji komórek
<ol>
 <li>Dzień przed transfekcją do każdej 100-milimetrowej szalki hodowlanej wysiewa się 1,2×106 komórek COS-7, a do każdego dołka płytek 6-dołkowych wysiewa się 2×105 komórek COS-7.</li>
 <li>W przypadku komórek v, do komórek w każdej 100-milimetrowej szalce hodowlanej kotransfekuje się po 0,5 - 5 μg plazmidu flipped VAMP wraz z 5 μg pTet-Off. Komórki kontrolne są kotransfekowane pustym wektorem pcDNA3.1(+) oraz pTet-Off. Aby zapobiec N-glikozylacji VAMP 1, 4, 5, 7 i 8, do pożywki hodowlanej podczas transfekcji dodaje się tunicamycynę (10 μg/ml).</li>
 <li>W przypadku komórek t w każdym dołku płytek 6-dołkowych, 1 μg plazmidu flipped SNAP-25 oraz pBI-G są kotransfekowane z 0,5 μg plazmidu flipped syntaxin1 lub 0,05 μg plazmidu flipped syntaxin4.</li>
 <li>24 h po transfekcji komórki v są odrywane od szalek hodowlanych za pomocą bezenzymatycznego buforu do dysocjacji komórek Enzyme-free Cell Dissociation Buffer (Invitrogen). Odrywane komórki są liczone za pomocą hemocytometru i resuspendowane w DMEM buforowanym HEPES, uzupełnionym o 10% FBS, 6,7 μg/ml tunicamycyny oraz 0,67 mM DTT.</li>
 <li>Do każdego dołka zawierającego już komórki t dodaje się 4,8×105 resuspendowanych komórek v.</li>
 <li>Po 6, 12 lub 24 h inkubacji w 37 °C w 5% CO2, ekspresję β-galaktozydazy mierzy się za pomocą zestawu β-Galactosidase Enzyme Assay System z użyciem Reporter Lysis Buffer zgodnie z instrukcjami producenta (Promega). W skrócie: komórki przemywa się dwukrotnie PBS, a następnie lizuje w Reporter Lysis Buffer. Lizaty komórkowe miesza się z równą objętością Assay 2× Buffer. Jako kontrolę ślepą Reporter Lysis Buffer miesza się z Assay 2× Buffer.</li>
 <li>Po 90 min reakcję kolorymetryczną zatrzymuje się poprzez dodanie 1 M węglanu sodu.</li>
 <li>Absorbancję przy 420 nm mierzy się za pomocą spektrofotometru HITACHI 100-40.</li>
</ol>

<ol><li>Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+intracellular+protein+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of intracellular protein transport.</a> Nature. 372, 55-63 (1994).</li>
<li>Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion.</a> Cell. 112, 519-533 (2003).</li>
<li>Bonifacino, J. S., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+vesicle+budding+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of vesicle budding and fusion.</a> Cell. 116, 153-166 (2004).</li>
<li>Jahn, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAREs--engines+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SNAREs--engines for membrane fusion.</a> Nature. 7, 631-643 (2006).</li>
<li>Weber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAREpins%3A+minimal+machinery+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion.</a> Cell. 92, 759-772 (1998).</li>
<li>Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).</li>
<li>Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion+by+VAMP3+and+plasma+membrane+t-SNAREs%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs.</a> Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).</li>
<li>Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusogenic+Pairings+of+Vesicle-Associated+Membrane+Proteins+%28VAMPs%29+and+Plasma+Membrane+t-SNAREs+-+VAMP5+as+the+Exception%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception.</a> PloS one. 5, e14238(2010).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).</li>
<li>Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+release+-+four+years+of+SNARE+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes.</a> Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).</li>
<li>McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellubrevin+is+a+ubiquitous+tetanus-toxin+substrate+homologous+to+a+putative+synaptic+vesicle+fusion+protein.+%5Bsee+comments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments.</a> Nature. 364, 346-349 (1993).</li>
<li>Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle-associated+membrane+protein+4+is+implicated+in+trans-Golgi+network+vesicle+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking.</a> Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).</li>
<li>Zeng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+synaptobrevin%2FVAMP+homologous+protein+%28VAMP5%29+is+increased+during+in+vitro+myogenesis+and+present+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane.</a> Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).</li>
<li>Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+tetanus+neurotoxin-insensitive+vesicle-associated+membrane+protein+in+SNARE+complexes+of+the+apical+plasma+membrane+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).</li>
<li>Wong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endobrevin%2C+a+novel+synaptobrevin%2FVAMP-like+protein+preferentially+associated+with+the+early+endosome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Oryginalny test fuzji komórek6 określa zdarzenia fuzji komórek pośredniczone przez białka SNARE za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W niniejszym opracowaniu opisujemy innowacyjny test, który kwantyfikuje zdarzenia fuzji komórek pośredniczone przez SNARE poprzez aktywowaną ekspresję β-galaktozydazy i pomiar spektrometryczny. Korzystając z tego testu, rutynowo analizujemy 15–20 kombinacji v- i t-SNARE w jednym doświadczeniu. Wykorzystując cytometrię przepływową do pomiaru ekspresji SNARE na powierzchni komór...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>komórki COS-7</td><td>ATCC</td><td>CRL-1651</td><td></td></tr><tr><td>tunicamycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7765-5MG</td><td></td></tr><tr><td>pTet-Off</td><td>Clontech</td><td>K1620-A</td><td></td></tr><tr><td>pBI-G</td><td>Clontech</td><td>6150-1</td><td></td></tr><tr><td>lipofektamina</td><td>Invitrogen</td><td>18324-012</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do dysocjacji komórek bez enzymów</td><td>Invitrogen</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Królicze poliklonalne przeciwciało przeciwko represorowi TET</td><td>Millipore</td><td>AB3541</td><td></td></tr><tr><td>Koniugowany z FITC osiołkowe przeciwciało anty-mysie IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-150</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny mikroskop skaningowy</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do analizy enzymatycznej &amp;#946;-galaktozydazy z buforem do lizy reporterowej</td><td>Promega</td><td>E2000</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-VIS Model 100-40</td><td>Hitachi</td><td>C740843</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza fuzji błon zapośredniczonej przez białka snare z wykorzystaniem enzymatycznego testu fuzji komórek

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Oddziaływania białek SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) na pęcherzykach (v-SNARE) i na błonach docelowych (t-SNARE) katalizują wewnątrzkomórkową fuzję pęcherzyków1-4. Testy rekonstytucji są niezbędne do analizy mechanizmu i regulacji fuzji błon zapośredniczonej przez białka SNARE5. W teście fuzji komórek6,7 białka SNARE są ekspresjonowane ektopowo na powierzchni komórki. Te „odwrócone” białka SNARE indukują fuzję komórka-komórka, co dowodzi, że białka SNARE są wystarczające do fuzji błon komórkowych. Ponieważ test fuzji komórek opiera się na analizie mikroskopowej, jest on mniej wydajny w ilościowej analizie wielu oddziaływań między v- oraz t-SNARE.
Opisujemy tutaj nową metodę analityczną8, która ilościowo określa liczbę zdarzeń fuzji komórek pośredniczonej przez białka SNARE poprzez aktywowaną ekspresję β-galaktozydazy. Jako układ odczytu wykorzystano dwa komponenty systemu ekspresji genów Tet-Off9: tetracyklinowy transaktywator (tTA) oraz plazmid reporterowy kodujący gen LacZ pod kontrolą elementu odpowiedzi na tetracyklinę (TRE-LacZ). tTA transfekujemy do komórek COS-7, które wykazują ekspresję odwróconych białek v-SNARE na powierzchni komórki (komórki v), natomiast TRE-LacZ transfekujemy do komórek COS-7, które wykazują ekspresję odwróconych białek t-SNARE na powierzchni komórki (komórki t). Zależna od SNARE fuzja komórek v i t prowadzi do wiązania tTA z TRE, aktywacji transkrypcyjnej LacZ i ekspresji β-galaktozydazy. Aktywność β-galaktozydazy jest określana ilościowo metodą kolorymetryczną poprzez pomiar absorbancji przy 420 nm.
Białka błonowe związane z pęcherzykami (VAMPs) są v-SNAREs, które znajdują się w różnych pęcherzykowych przedziałach post-Golgi10-15. Poprzez ekspresję VAMPs 1, 3, 4, 5, 7 i 8 na tym samym poziomie, porównujemy ich aktywność fuzji błon za pomocą enzymatycznego testu fuzji komórek. W oparciu o pomiar spektrometryczny, test ten oferuje ilościowe podejście do analizy fuzji błon pośredniczonej przez SNARE oraz do badań wysokoprzepustowych.

Aby opracować ilościowy test fuzji komórkowej, wykorzystujemy silną aktywację transkrypcyjną następującą po wiązaniu tTA do TRE. W przypadku braku tTA transkrypcja genu LacZ w TRE-LacZ nie zachodzi. Obecność tTA powoduje jego wiązanie z TRE i aktywację transkrypcji LacZ. Rysunek 1 przedstawia schemat enzymatycznego testu fuzji komórkowej. tTA jest transfekowane do komórek v (v-cells), które wykazują ekspresję białek v-SNARE na powierzchni komórki, natomiast TRE-LacZ je...

Opracowaliśmy test fuzji komórek, który pozwala na ilościowe określenie zdarzeń fuzji błon zapośredniczonej przez białka SNARE poprzez aktywowaną ekspresję β-galaktozydazy.

Analiza fuzji błon zapośredniczonej przez białka SNARE z wykorzystaniem enzymatycznego testu fuzji komórek

Interakcje białek SNARE (rozpuszczalnych receptorów białek przyłączonych do czynnika N-etylo-maleimidu) na pęcherzykach (v-SNARE) oraz na błonach docelowych...

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie zdarzeń fuzji komórkowej opśredniczonej przez białka SNARE poprzez aktywowaną ekspresję beta-galaktozydazy. Osiąga się to poprzez uprzednią ektopową ekspresję białek v-SNARE i t-SNARE na powierzchni komórek cos-7. Kolejnym krokiem procedury jest połączenie komórek wykazujących ekspresję białek v-SNARE z komórkami wykazującymi ekspresję białek t-SNARE.Prowadzi to do pośredniczonej przez białka SNARE fuzji komórek i aktywowanej ekspresji beta-galaktozydazy. Ostatecznie aktywność beta-galaktozydazy indukowaną fuzją komórek mierzy się za pomocą spektrofotometru. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopowy test regionu SAL, jest możliwość analizy wielu kombinacji białek SNARE.Ilościowo, choć metoda ta może zostać zastosowana do zrozumienia mechanizmu i regulacji fuzji błon pośredniczonej przez białka SNARE, może ona również służyć do prowadzenia badań wysokoprzepustowych. Procedurę zademonstrują dr Na Hassan, pracownik post-doc oraz David Humphrey, technik z mojego laboratorium, w dniu poprzedzającym obciążenie transfekcyjne.Płytki 24-dołkowe z szklanymi zakryciami o średnicy 12 mm; przygotuj dwa dołki dla każdej kombinacji komórek wykazujących ekspresję unikalnych plazmidów w eksperymencie na tych zakryciach. Wysiej 30 000 komórek COST7 hodowanych w DMEM uzupełnionym o 4,5 g/l glukozy oraz 10% FBS do transfekcji. Do każdego dołka dodaj 0,25 µg plazmidu TTA oraz jeden zestaw plazmidów ekspresyjnych.Odwrócone białka zainteresowania, w tym przypadku odwrócone białka vamps, aby przetransformować limfocyty T, dodajemy jedną czwartą mikrograma plazmidu kodującego TRE lacks Z oraz uzupełniający zestaw plazmidów kodujących odwrócone białka zainteresowania. W tym przypadku są to snap 25, syntaxina 1 oraz syntaxina 4. Następnie transformujemy cost 7 za pomocą lipfekcji zgodnie z instrukcją producenta i hodujemy komórki przez 24 godziny. 24 godziny po transformacji utrwalamy komórki w suplementowanym parafomaldehydzie przez 10 minut. Po utrwaleniu płuczemy komórki trzykrotnie w PBS++, a następnie blokujemy komórki w suplementowanym FBS przez 30 minut.Po blokowaniu inkubuj komórki z przeciwciałem monoklonalnym anty-mic Nine E 10 przez 30 minut. Po czterokrotnym przemyciu PBS++ inkubuj komórki przez godzinę z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z FITC w rozcieńczeniu 1:500. Po kolejnych czterech przemyciach PBS++ zamontuj znakowane komórki w dostępnym komercyjnie medium anty-fade.Komórki są teraz gotowe do mikroskopii konfokalnej. Dzień przed transfekcją wysiać 1,2 miliona komórek Cos-7 do każdej 100-milimetrowej płytki do hodowli tkanek oraz 200 000 komórek Cos-7 do każdej studzienki płytek 6-dołkowych dla każdej analizowanej kombinacji plazmidów. Przygotować jedną studzienkę kontrolną. Hodować komórki przez 24 godziny. Następnego dnia dodać plazmidy do transfekcji; w przypadku komórek Cos-7 do komórek w każdej 100-milimetrowej hodowli wprowadzić plazmid wykazujący ekspresję białka zainteresowania z fuzją FLIP oraz 5 µg pTet-Off.W 100 mm naczyniu hodowlanym przeprowadź kotransfekcję komórek kontrolnych za pomocą pustego wektora oraz P te off w tych samych stężeniach względnych co w komórkach V. Po dodaniu wszystkich plazmidów do komórek V i komórek kontrolnych, dodaj tcom mycin do tych studni, aby zapobiec N-glikozylacji vamps. W każdej studni płytek sześcio-dołkowych przeprowadź kotransfekcję komórek T za pomocą 1 µg PBIG z komplementarnymi plazmidami wykazującymi ekspresję białek zainteresowania.Następnie przeprowadź transfekcję komórek Cost7 za pomocą lipofektaminy zgodnie z instrukcją producenta. Hoduj komórki przez 24 godziny. Po 24 godzinach od transfekcji odklej komórki V z naczyń hodowlanych, używając bezenzymowego buforu do dysocjacji komórek. Rozpocznij od jednorazowego przemycia komórek 20 ml PBS.Następnie należy dodać 5 mL buforu dysocjującego wolnego od enzymów. Po 10 minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej komórki zostaną uwolnione poprzez energiczne opukanie płytki; należy sprawdzić pod mikroskopem, czy odłączyły się one od podłoża. Jeśli odłączyło się mniej niż połowa komórek, należy odczekać kolejne 5 minut i ponownie opukać płytkę.Kontynuuj inkubację w buforze odrywającym, aż odłączy się ponad połowa komórek. Następnie policz komórki V za pomocą cytometru hematologicznego. Potem resuspenduj komórki V do stężenia około 480 000 komórek na mililitr w uzupełnionym buforze DMEM.Następnie dodaj jeden mililitr resuspendTimeowanych komórek V do każdej studni zawierającej komórki T i wprowadź płytki z powrotem do inkubatora. Po sześciu, 12 lub 24 godzinach współhodowli komórek przemyj je roztworem PBS i dodaj bufor do lizy. Następnie zeskrob komórki ze studni i przenieś je do probówek w celu odwirowania.Po wirowaniu przenieś nadsącz do nowej probówki i zmierz ekspresję beta-galaktozydamidazy za pomocą dostępnego komercyjnie testu zgodnie z instrukcjami producenta; podczas realizacji protokołu należy pamiętać o zatrzymaniu reakcji kolorymetrycznej po 90 minutach poprzez dodanie jednomolowego węglanu sodu w celu oceny wyników. Zmierz absorbancję przy 420 nm za pomocą spektrofotometru. Gdy komórki CO7 zostały transfektowane plazmidami flipped snare, białka flipped snare uległy ekspresji na powierzchni komórek.Do pomiaru poziomów ekspresji białek SNARE na powierzchni komórek wykorzystano cytometrię przepływową. Aby porównać ich zdolności do fuzji błon, białka VAMP muszą być eksponowane na tym samym poziomie. W związku z tym stężenie każdego z odwróconych plazmidów SNARE użytych do transfekcji zostało poddane miareczkowaniu i zoptymalizowane pod kątem procesu transfekcji.W takich warunkach białka vamp 1, 3, 4, 5, 7 i 8 oraz syntaxin 1 i 4 były wyrażane na tym samym poziomie odpowiednio na powierzchni komórek; neuronalne białka SNARE pośredniczące w egzocytozie synaptycznej zostały wykorzystane do przetestowania wykonalności analizy. Rzeczywiście, po połączeniu komórek V wyrażających vamp 2 i komórek T wyrażających SYNTAXIN 1 oraz snap 25, wykryto silną ekspresję beta-galaktozydazy. Jednakże, gdy vamp 2 lub SNAP 25 nie były wyrażane, wykryto jedynie podstawową aktywność beta-galaktozydazy, co wskazuje, że fuzja komórek i ekspresja beta-galaktozydazy zależą od oddziaływań białek v-SNARE i t-SNARE; ogólnie SYNTAXIN 1, snap 25, vamp 1, vamp 3 i vamp 8 wykazały porównywalną i najwyższą aktywność fuzyjną.W przeciwieństwie do tego, bazowa aktywność beta GAL sugeruje, że kombinacja białek nie indukuje fuzji błon, co ma miejsce w przypadku vamp five i SYNTAXIN one. Snap 25. Podczas przeprowadzania enzymatycznego testu fuzji ważne jest, aby pamiętać o dodaniu unikamycyny w celu zapobiegania glikozylacji białek esna oraz dodaniu DTT, aby zapobiec tworzeniu się wiązań dwusiarczkowych między białkami esna.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić test fuzji komórek.

analysis-snare-mediated-membrane-fusion-using-an-enzymatic-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza fuzji błon pośredniczonej przez SNARE z wykorzystaniem enzymatycznego testu fuzji komórkowej

Przedstawiamy dwukolorowy test fluorescencyjny in vitro, służący do wizualizacji fuzji pojedynczych cząsteczek wirusa z płynną dwuwarstwą docelową. Poprzez znakowanie cząsteczek wirusowych fluoroforami, które różnicowo barwią błonę wirusa oraz jego wnętrze, jesteśmy w stanie monitorować kinetykę hemifuzji i tworzenia się porów.

Metoda pomiaru kinetyki fuzji wirusowej na poziomie pojedynczych cząsteczek

W niniejszym filmie prezentujemy efektywną elektrofuzję komórek in vitro za pomocą zmodyfikowanej metody adhezyjnej z wykorzystaniem elektroporacji oraz późniejszą detekcję i wizualizację sfuzowanych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Wizualizacja elektrofuzyjnej fuzji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Fuzję mitochondriów mierzono poprzez śledzenie wyrównywania rozkładu fotokonwertowanego GFP skierowanego do macierzy w całej sieci mitochondrialnej w czasie. Do tej pory jednorazowo analizie kinetycznej trwającej godzinę mogła zostać poddana tylko jedna komórka. Przedstawiamy metodę, która umożliwia jednoczesny pomiar w wielu komórkach, co przyspiesza proces gromadzenia danych.

Szybszy test fuzji mitochondrialnej o wysokiej rozdzielczości, oparty na mtPA-GFP, umożliwiający równoległe pozyskiwanie danych kinetycznych z wielu komórek przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Techniki mikroskopii świetlnej w połączeniu z testami biochemicznymi wyjaśniają udział egzocytozy za pośrednictwem SNARE w zależnym od netryny rozgałęzianiu aksonów. Ta kombinacja technik pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych kontrolujących rozgałęzianie się aksonów i zmianę kształtu komórki.

Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania pojedynczych, zapośredniczonych przez SNARE zdarzeń fuzji między liposomami a wspieranymi dwuwarstwami w kanałach mikroprzepływowych za pomocą spolaryzowanego TIRFM, z czułością pojedynczej cząsteczki i rozdzielczością czasową ~15 ms. Uwalnianie lipidów i rozpuszczalnego ładunku może być wykrywane jednocześnie. Mierzy się wielkość liposomów, dyfuzyjność lipidów i właściwości porów fuzyjnych.

Fuzja pojedynczych proteoliposomów za pośrednictwem SNARE z dwuwarstwami na uwięzi w mikroprzepływowej komórce przepływowej monitorowanej za pomocą spolaryzowanej mikroskopii TIRF

Ten protokół opisuje nową metodę pozwalającą na ilościową wizualizację złożonego tworzenia białek SNARE, opartą na transferze energii rezonansu Förstera i mikroskopii obrazowania życia fluorescencji.

Wizualizacja wewnątrzkomórkowego transportu SNARE za pomocą mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Tutaj prezentujemy szczegółową procedurę niedawno opracowanej platformy do testowania proteazy, wykorzystującej N-końcowe białko wiążące heksahistydynę/maltozę oraz rekombinowane substraty z fluorescencyjną fuzją białek przyczepione do powierzchni magnetycznych kulek agarozy kwasu niklowo-nitrylotrioctowego. Przedstawiono również późniejszą analizę w żelu próbek testowych oddzielonych elektroforezą w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu.

Zastosowanie rekombinowanych białek fuzyjnych w fluorescencyjnej platformie testowej proteazy i ich renaturacja w żelu

Biologiczna fuzja błonowa jest katalizowana przez wyspecjalizowane białka fuzyjne. Pomiar właściwości fuzogennych białek można osiągnąć za pomocą testów mieszania lipidów. Przedstawiamy metodę oczyszczania rekombinowanej atlastyny Drosophila, białka pośredniczącego w homotypowej fuzji ER, odtwarzaniu go do wstępnie uformowanych liposomów i testowaniu zdolności fuzyjnej.

Rekonstytucja rekombinowanej Drosophila Atlastin w liposomach wspomagana detergentami do testów mieszających lipidy

Ten protokół opisuje technikę obrazowania konfokalnego do wykrywania trzech trybów fuzji w komórkach chromochłonnych nadnerczy bydlęcych. Te tryby fuzji obejmują: 1) fuzję bliską (zwaną również pocałunkiem i ucieczką), polegającą na otwieraniu i zamykaniu porów fuzyjnych, 2) fuzję pozostawaną, polegającą na otwieraniu porów fuzyjnych i utrzymywaniu otwartych porów, oraz 3) fuzję termokurczliwą, polegającą na kurczeniu się stopionych pęcherzyków.

Mikroskopia konfokalna do pomiaru trzech trybów dynamiki porów fuzyjnych w komórkach chromochłonnych nadnerczy

Poznaj enzymatyczny test fuzji komórkowej do ilościowej analizy fuzji błonowej zależnej od SNARE przy użyciu β-galaktozydazy. Metoda umożliwia badanie wielu kombinacji białkowych w komórkach COS-7.

Analiza fuzji błon zapośredniczonej przez białka SNARE z wykorzystaniem enzymatycznego testu fuzji komórek

Przeglądaj więcej filmów