Analiza fuzji błon zapośredniczonej przez białka SNARE z wykorzystaniem enzymatycznego testu fuzji komórek

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe określenie zdarzeń fuzji komórek pośredniczonej przez białka SNARE poprzez aktywowaną ekspresję beta-galaktozydazy. Jest to osiągane najpierw poprzez ektopową ekspresję białek v-SNARE i t-SNARE na powierzchni komórek COST7. Kolejnym krokiem procedury jest połączenie komórek wykazujących ekspresję białek v-SNARE z komórkami wykazującymi ekspresję białek t-SNARE.

Prowadzi to do fuzji komórek zapośredniczonej przez białka SNARE oraz aktywowanej ekspresji beta-galaktozydazy. Ostatecznie aktywność beta-galaktozydazy indukowana fuzją komórek jest mierzona za pomocą spektrofotometru. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopowy test regionu SAL, jest możliwość analizy wielu kombinacji białek SNARE.

Ilościowo, choć metoda ta może zostać zastosowana w celu zrozumienia mechanizmu i regulacji fuzji błon pośredniczonej przez białka SNARE, może ona również służyć do prowadzenia badań wysokoprzepustowych. Procedurę zademonstrują Doc Na Hassan, stażysta podoktorski, oraz David Humphrey, technik z mojego laboratorium, dzień przed ładowaniem transfekcji.

Przygotować płytki 24-dołkowe z szklanymi szkiełkami przedmiotowymi o średnicy 12 mm, przeznaczając dwa dołki dla każdej kombinacji komórek wykazujących ekspresję unikalnych plazmidów w eksperymencie na tych szkiełkach. Wysiać 30 000 komórek COST7 hodowanych w DMEM uzupełnionym o 4,5 g/L glukozy i 10% FBS do transfekcji. Do każdego dołka dodać 0,25 µg plazmidu TTA oraz jeden zestaw plazmidów ekspresyjnych.

Aby przeprowadzić transfekcję komórek T białkami docelowymi, w tym przypadku flipped vamps, dodać 0,25 µg plazmidu kodującego TRE lacks Z oraz komplementarny zestaw plazmidów kodujących białka docelowe. W tym przypadku są to snap 25, syntaxin 1 i syntaxin 4. Następnie przeprowadzić transfekcję komórek cos7 za pomocą lipfekcji zgodnie z instrukcjami producenta i hodować komórki przez 24 h. Po 24 h od transfekcji utrwalić komórki w suplementowanym paraformaldehydzie przez 10 min. Po utrwaleniu wypłukać komórki trzykrotnie w PBS++, a następnie zablokować komórki w suplementowanym FBS przez 30 min.

Po blokowaniu inkubować komórki z przeciwciałem monoklonalnym anty-mic Nine E 10 przez 30 minut; po czterokrotnym przemyciu w PBS++ inkubować komórki przez godzinę z koniugowanymi przeciwciałami wtórnymi FITC w rozcieńczeniu 1:500. Po kolejnych czterech przemyciach w PBS++ zamontować znakowane komórki w dostępnym komercyjnie odczynniku przeciwko zanikaniu fluorescencji (anti-fade).

Komórki są teraz gotowe do mikroskopii konfokalnej. Dzień przed transfekcją wysieje się 1,2 mln komórek COS-7 do każdej 100 mm szalki hodowlanej oraz 200 000 komórek COS-7 do każdej studni płytek 6-dołkowych dla każdej analizowanej kombinacji plazmidów. Przygotuj jedną studnię i hoduj komórki przez 24 h. Następnego dnia dodaj plazmidy do transfekcji; w przypadku komórek V przeprowadź transfekcję plazmidem wykazującym ekspresję białka fuzyjnego z białkiem fluorescencyjnym oraz 5 µg pTet-Off do komórek w każdej 100 mm hodowli.

Komórki kontrolne w 100 milimetrowej szalce hodowlanej kotransfektuj pustym wektorem oraz P te off w tych samych stężeniach względnych co komórki V. Po dodaniu wszystkich plazmidów do komórek V i komórek kontrolnych, dodaj do tych studni tcom mycin, aby zapobiec N-glikozylacji vamps. W każdej studni płytek sześciodołkowych kotransfektuj komórki T jednym mikrogramem PBIG z komplementarnymi plazmidami eksprymującymi białka zainteresowania.

Następnie przeprowadź transfekcję komórek COST7 za pomocą lipofekcji zgodnie z instrukcjami producenta. Hoduj komórki przez 24 godziny; po tym czasie odłącz komórki V z naczyń hodowlanych, używając bezenzymatycznego buforu do dysocjacji komórek. Rozpocznij od jednokrotnego przemycia komórek 20 ml PBS.

Następnie należy dodać 5 mL buforu dysocjującego wolnego od enzymów. Po 10 minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej komórki zostaną oddzielone poprzez gwałtowne opukanie płytki; należy sprawdzić pod mikroskopem, czy uległy one odłączeniu. Jeśli odłączyło się mniej niż połowa komórek, należy odczekać kolejne pięć minut i ponownie opukać płytkę.

Kontynuować inkubację w buforze odrywającym do momentu, aż odłączy się ponad połowa komórek. Następnie policzyć komórki V za pomocą cytometru hemocytometrycznego. Potem zawiesić komórki V w stężeniu około 480 000 komórek na mililitr w uzupełnionym buforze Heis DMEM.

Teraz należy dodać jeden mililitr resuspendsowanych komórek V do każdej studni zawierającej komórki T i zwrócić płytki do inkubatora. Po sześciu, 12 lub 24 godzinach współhodowli komórek, należy je przemyć PBS i dodać bufor lizujący. Następnie komórki należy zebrać ze studni za pomocą skrobaka i przenieść do probówek w celu wirowania.

Po wirowaniu przenieś nadsącz do nowej probówki i zmierz ekspresję beta-galaktozy za pomocą dostępnego komercyjnie testu zgodnie z instrukcjami producenta; w trakcie tego protokołu należy pamiętać o zatrzymaniu reakcji kolorymetrycznej po 90 minutach poprzez dodanie jednomolarnego węglanu sodu w celu odczytania wyników. Zmierz absorbancję przy 420 nm za pomocą spektrofotometru. Po transfekcji komórek CO7 plazmidami flipped snare, białka flipped snare uległy ekspresji na powierzchni komórek.

Do pomiaru poziomów ekspresji białek SNARE na powierzchni komórek wykorzystano cytometrię przepływową. Aby móc porównać ich zdolności do fuzji błon, białka VAMP musiały być wyrażane na tym samym poziomie. W związku z tym stężenie każdego z odwróconych plazmidów SNARE użytych w transfekcji zostało mianowane i zoptymalizowane pod kątem transfekcji.

W takich warunkach vamp 1, 3, 4, 5, 7 i 8 oraz syntaxin 1 i 4 były wyrażane na tym samym poziomie na powierzchni komórki; neuronalne białka SNARE pośredniczące w egzocytozie synaptycznej zostały wykorzystane do przetestowania wykonalności analizy. Rzeczywiście, po połączeniu komórek V wykazujących ekspresję vamp 2 i komórek T wykazujących ekspresję SYNTAXIN 1 oraz snap 25, wykryto silną ekspresję beta-galaktozydazy. Jednakże, gdy vamp 2 lub SNAP 25 nie były wyrażane, wykryto jedynie bazową aktywność beta-galaktozydazy, co wskazuje, że fuzja komórek i ekspresja beta-galaktozydazy zależą od oddziaływań białek v-SNARE i t-SNARE; ogólnie SYNTAXIN 1, snap 25, vamp 1, vamp 3 i vamp 8 wykazywały porównywalną i najwyższą aktywność fuzyjną.

Z kolei bazowa aktywność beta GAL sugeruje, że kombinacja białek ta nie indukuje fuzji błon, w przeciwieństwie do przypadku białek vamp five i SYNTAXIN one oraz Snap 25. Podczas przeprowadzania enzymatycznego testu fuzji ważne jest, aby pamiętać o dodaniu tunicamycyny w celu zapobieżenia N-glikozylacji białek SNARE oraz dodaniu DTT, aby zapobiec tworzeniu się wiązań disulfurowych między białkami SNARE.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania testu fuzji komórek.