Name: Model niedrożności tętnicy środkowej mózgu indukowany endoteliną-1 dla udaru niedokrwiennego z laserową kontrolą przepływu dopplerowskiego u szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Poznaj model niedrożności tętnicy środkowej mózgu indukowany endoteliną-1 z laserową kontrolą przepływu dopplerowskiego u szczura. Ta metoda umożliwia badanie udaru niedokrwiennego z kontrolowanym zwężeniem naczynia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z American Heart Association Greater Southeast Affiliate (09GRNT2060421), American Medical Association oraz z University of Florida Clinical and Translational Science Institute. Adam Mecca jest stypendystą NIH/NINDS, NRSA (F30 NS-060335). Robert Regenhardt otrzymał stypendium przeddoktoranckie w ramach Multidyscyplinarnego Programu Szkoleniowego w zakresie Nadciśnienia Tętniczego Uniwersytetu Florydy (T32 HL-083810).

Ten protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Florydy i jest zgodny z "Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych" (ósme wydanie, National Academy of Sciences, 2011).
Materiały
<ol>
 <li>Zwierzęta: Ośmiotygodniowy samiec szczura Sprague Dawley (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) o wadze 250-300 g w momencie operacji.
 </li>
 <li>znieczulenie
 <ol class="lalpha">
 <li>System znieczulenia wziewnego (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA) </li>
 <li>Znieczulenie izofluranem (Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA)</li>
 </ol>
 </li>
 <li>System stereotaktyczny (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)
 <ol class="lalpha">
 <li>System stereotaktyczny dla małych zwierząt </li>
 <li>Niepękające nauszniki dla szczurów </li>
 <li>Uchwyt na głowicę do znieczulenia gazowego dla szczurów </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Regulacja temperatury
 <ol class="lalpha">
 <li>Termometr z mikrosondą BAT-12 (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, Floryda, USA) </li>
 <li>T/PUMP, koc termiczny TP600 (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA) </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Chirurgicznych 
 <ol class="lalpha">
 <li>Rękojeść skalpela i ostrze #11, kleszczyki do przysłony, kleszcze Graefe, zwijacze zacisków bulldog, śrubokręt, strzykawka 10 μl z igłą skośną o rozmiarze 26 (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA) 
 </li>
 <li>Wiertarka mikrosilnikowa i uchwyt stereotaktyczny, Quintessential Stereotaxic Injector (Stoelting, Wood Dale, IL, USA) </li>
 <li>Wiertło okrągłe 1,0 mm, wiertło z odwróconym stożkiem 1,0 mm (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA) </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Materiały chirurgiczne 
 <ol class="lalpha">
 <li>montażowe 0-80 X 3/32 o długości trzpienia 2,4 mm, kaniula prowadząca o rozmiarze 21 [długość 4 mm poniżej cokołu] i atrapa kaniuli (Plastics one, Roanoke, VA, USA)</li>
 <li>Proteza strumieniowa, akryl i płyn (Lang Dental Manufacturing Co., Inc., Wheeling, IL, USA) </li>
 <li>Szew nylonowy 3.0 (Oasis, Mettawa, IL, USA) </li>
 <li>Waciki, maść do oczu Puralube (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA)</li>
 <li>Elektryczne maszynki do strzyżenia włosów (Oster, Providence, RI, USA) </li>
 </ol>
 </li>
 <li>chemikalia
 <ol class="lalpha">
 <li>Endothelin-1 (amerykański peptyd, Sunnyvale, CA, USA) </li>
 <li>Chlorheksydyna 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA) </li>
 <li>Buprenorfina HCl (Hospira Inc., Lake Forest, IL, Stany Zjednoczone) </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Sprzęt do wizualizacji 
 <ol class="lalpha">
 <li>Mikroskop chirurgiczny (Seiler Instrument and Manufacturing; St. Louis, MO, USA) </li>
 <li>Oświetlacz światłowodowy (TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA)</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Laserowy system przepływomierza dopplerowskiego (ADInstruments, Inc., Colorado Springs, CO, USA) 
 <ol class="lalpha">
 <li>Standardowa sonda ołówkowa </li>
 <li>Uchwyt sondy</li>
 <li>Miernik przepływu krwi </li>
 <li>Powerlab 4/30 z wykresem LabChart 7</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Pomiar objętości zawału
 <ol class="lalpha">
 <li>Macierz mózgu szczura (Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, USA)</li>
 <li>Chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) rozcieńczony do 0,05% w PBS</li>
 <li>Skaner płaski (Epson Perfection V30, Epson America, Inc., Long Beach, CA, USA) </li>
 <li>Oprogramowanie Image J (oprogramowanie ImageJ 1.42q, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA) </li>
 </ol>
 </li>
</ol>
1. Kroki przedoperacyjne
<ol>
 <li>Przed zabiegiem szczury są trzymane w cyklu światło/ciemność 12:12 ze swobodnym dostępem do wody i karmy dla gryzoni.</li>
 <li>Znieczulenie indukuje się za pomocą 4% izofluranu w mieszaninie 100% gazówO2 w komorze indukcyjnej, aż szczur przestanie się wycofywać, aby uszczypnąć tylną łapę. </li>
 <li>Podczas tego zabiegu należy zachować technikę aseptyczną, w tym stosowanie sterylnych rękawiczek, sterylnych narzędzi chirurgicznych i sterylnej serwetychirurgicznej 11. </li>
 <li>Czubek głowy jest golony elektrycznymi maszynkami do strzyżenia włosów.</li>
 <li>Szczura umieszcza się w pozycji leżącej na podkładce chłonnej leżącej na powierzchni roboczej o kontrolowanej temperaturze (kocu termicznym).</li>
 <li>Głowę umieszcza się w aparacie stereotaktycznym, rozpoczynając od założenia maski znieczulającego gazem.</li>
 <li>Następnie wkładane i dokręcane są nauszniki. </li>
 <li>Podczas zabiegu znieczulenie jest utrzymywane 2% izofluranem w mieszaninie 100%O2 gazów.</li>
 <li>Smarującą maść okulistyczną nakłada się na oba oczy, a powieki są zamknięte, aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas zabiegu chirurgicznego. </li>
 <li>Sonda temperatury doodbytniczej jest wprowadzana w celu utrzymania stałej temperatury ciała zwierzęcia wynoszącej 37±0,5 °C.
 </li>
 <li>Przy mocno trzymanej głowie w urządzeniu stereotaktycznym, obszar operacyjny jest oczyszczany naprzemiennie 2% chlorheksydyną i trzykrotnym roztworem soli fizjologicznej. </li>
</ol>
2. Kroki chirurgiczne
<ol>
 <li>Za pomocą skalpela wykonuje się nacięcie w linii środkowej na skórze pokrywającej calvarium od najbardziej ogonowych aspektów oczu (nasion) do między uszami (linia karkowa górna). </li>
 <li>Skóra jest następnie cofana na boki za pomocą 3 zacisków buldoga. </li>
 <li>Tkanka łączna jest usuwana z czaszki za pomocą suchych wacików, dzięki czemu można wyraźnie zobaczyć wiele struktur. Należą do nich bregma, szew koronalny i prawy boczny grzbiet czaszki. Waciki bawełniane służą do usuwania krwi z pola operacyjnego.</li>
 <li>Za pomocą mikroskopu chirurgicznego lokalizuje się bregmę, a manipulatory stereotaktyczne są regulowane, aż okrągłe wiertło 1,0 mm zostanie wyzerowane w bregmie. </li>
 <li>Wiertło jest następnie przesuwane na 1,6 mm do przodu i 5,2 mm na bok do bregmy. </li>
 <li>Otwór na wiertło, który penetruje czaszkę, jest wiercony w celu umieszczenia kaniuli (ryc. 1). Nadmiar gruzu i krwi jest stale usuwany za pomocą bawełnianych wacików. </li>
</ol>
W tym momencie można wprowadzić kaniulę prowadzącą (krok 7) lub wykonać bezpośrednie wstrzyknięcie ET-1 przez otwór wiertła (przejdź bezpośrednio do kroku 16). 
<ol start="7"> 
 <li>Następnie wierci się otwory na 3 mocujące przez częściową grubość czaszki za pomocą wiertła z odwróconym stożkiem o średnicy 1,0 mm (rysunek 1). W każdej kości czołowej wierci się po jednym otworze około 1-2 mm przed szwem koronalnym i 1-2 mm bocznie do szwu strzałkowego. Jeden otwór wierci się w kości ciemieniowej około 2-3 mm za szwem koronalnym i 2-3 mm bocznie do szwu strzałkowego ipsilateralnie do otworu wiertła kaniuli prowadzącej. Trzy montażowe 0-80 x 3/32 są umieszczone w tych otworach na wiertła i zapewniają podparcie dla cementu utrzymującego się w kaniuli. należy przesuwać tylko o 2 lub 3 obroty, aby nie uszkodzić opony twardej.</li>
 <li>Kaniulę prowadzącą umieszcza się w stereotaktycznym uchwycie kaniuli i znajduje się bregma. </li>
 <li>Manipulatory stereotaktyczne są regulowane do momentu, aż kaniula prowadząca zostanie wyzerowana w punkcie bregma. Kaniulę przenosi się do otworu wiertła znajdującego się 1,6 mm z przodu i 5,2 mm z boku do bregmy. </li>
 <li>Na koniec kaniula prowadząca jest opuszczana do otworu wiertła z końcową pozycją końcówki 4,5 mm brzusznie do bregmy. </li>
 <li>Umieszczenie laserowej sondy przepływu Dopplera (opcjonalnie) 
 <ol class="lalpha">
 <li> W celu monitorowania przepływu krwi w mózgu za pomocą LDF, uchwyt sondy można umieścić w odpowiednim miejscu przed przymocowaniem kaniuli prowadzącej do cementu dentystycznego. </li>
 <li>Podstawa uchwytu sondy jest przycięta równo z cokołem, z wyjątkiem małej wypustki w kształcie klina. </li>
 <li> Uchwyt sondy jest następnie umieszczany z tyłu kaniuli prowadzącej i tylko przyśrodkowo do bocznego grzbietu czaszki z zakładką skierowaną przyśrodkowo (ryc. 1). </li>
 <li>Uchwyt sondy i kaniula prowadząca są mocowane razem za pomocą cementu dentystycznego. </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Cement dentystyczny jest następnie używany do zabezpieczenia kaniuli na miejscu. Cement styka się ze wszystkimi trzema i otacza całą podstawę kaniuli. </li>
 <li>Cement powinien być całkowicie suchy przed usunięciem uchwytu kaniuli. Trwa to około 5 minut. </li>
</ol>
Po tych krokach, nacięcie chirurgiczne może zostać zamknięte, a manekin kaniuli może zostać wkręcony w kaniulę prowadzącą. Alternatywnie, MCAO indukowane ET-1 można wykonać na szczurze po okresie rekonwalescencji po operacji implantacji kaniuli. W przypadku tej metody krok 19 należy wykonać jako następny, a kroki 14-18 można wykonać w późniejszym czasie. Aby wykonać implantację kaniuli prowadzącej i wstrzyknięcie ET-1 podczas tego samego zabiegu, należy wykonać krok 14. 
<ol start="14">
<li>Strzykawkę infuzyjną napełnia się ET-1 (rozcieńczonym do 80 μM w PBS), a następnie umieszcza w wstrzykiwaczu stereotaktycznym. </li>
<li>Manipulatory stereotaktyczne są regulowane do momentu, aż końcówka igły zostanie wyzerowana na krawędzi kaniuli prowadzącej.</li>
<li>Końcówka igły jest opuszczana przez kaniulę prowadzącą do pozycji 17,2 mm brzusznej do krawędzi kaniuli prowadzącej. Jeśli kaniula prowadząca nie jest używana, końcówka igły jest zerowana w bregma i opuszczana przez otwór wiertła do pozycji 8,7 mm brzusznej do bregma. </li>
<li>3 μl 80 μM ET1 podaje się w infuzji z szybkością 1 μl na minutę.</li>
<li>Strzykawkę pozostawia się na miejscu przez 3 minuty po zakończeniu infuzji, a następnie powoli wyjmuje. </li>
<li>Nacięcie zamyka się nylonowym szwem 3,0, a manekin kaniuli wkręca się w kaniulę.</li>
<li>Po zabiegu należy zastosować odpowiednią dawkę leku przeciwbólowego (tj. buprenorfiny w dawce 0,05-0,1 mg/kg), aby zminimalizować ból i dyskomfort w okresie rekonwalescencji.</li>
<li>Szczur jest usuwany z sali operacyjnej i umieszczany w ciepłym, suchym miejscu do rekonwalescencji, aby zapobiec hipotermii, z bezpłatnym, łatwym dostępem do miękkiego pokarmu i wody.</li>
</ol>

<ol><li>Stroke--1989. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+on+stroke+prevention%2C+diagnosis%2C+and+therapy.+Report+of+the+WHO+Task+Force+on+Stroke+and+other+Cerebrovascular+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders.</a> Stroke. 20, 1407-1431 (1989).</li>
<li>Lloyd-Jones, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2009+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association+Statistics+Committee+and+Stroke+Statistics+Subcommittee%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee.</a> Circulation. 119, 480-486 (2009).</li>
<li>Mohr, J. P., Gautier, J. C., Hier, D., Stein, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMohr%2C+JP+%22Stroke%3A+pathophysiology%2C+diagnosis%2C+and+management%22">Stroke: pathophysiology, diagnosis, and management</a>. Barnett, H. J. M., Stein, B. M., Mohr, J. P., Yatsu, F. M. , Churchill Livingstone. New York. 377-450 (1986).</li>
<li>Robinson, M. J., Macrae, I. M., Todd, M., Reid, J. L., McCulloch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+local+cerebral+blood+flow+to+pathological+levels+by+endothelin-1+applied+to+the+middle+cerebral+artery+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Reduction of local cerebral blood flow to pathological levels by endothelin-1 applied to the middle cerebral artery in the rat.</a> Neurosci. Lett. 118, 269-272 (1990).</li>
<li>Sharkey, J., Ritchie, I. M., Kelly, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+microapplication+of+endothelin-1%3A+a+new+model+of+focal+cerebral+ischaemia+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Perivascular microapplication of endothelin-1: a new model of focal cerebral ischaemia in the rat.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 13, 865-871 (1993).</li>
<li>O'Neill, M. J., Clemens, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rodent models of focal cerebral ischemia.</a> Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 9 (Unit 9), (2001).</li>
<li>Mecca, A. P., O'Connor, T. E., Katovich, M. J., Sumners, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candesartan+pretreatment+is+cerebroprotective+in+a+rat+model+of+endothelin-1-induced+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Candesartan pretreatment is cerebroprotective in a rat model of endothelin-1-induced middle cerebral artery occlusion.</a> Exp. Physiol. 94, 937-946 (2009).</li>
<li>Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+focal+cerebral+ischemia%3A+procedural+pitfalls+and+translational+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Transl.+Stroke+Med%22%5BJournal%5D)">Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems.</a> Exp. Transl. Stroke Med. 1, 8(2009).</li>
<li>Tomsick, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+thrombolysis+for+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vasc.+Interv.+Radiol%22%5BJournal%5D)">Intravenous thrombolysis for acute ischemic stroke.</a> J. Vasc. Interv. Radiol. 15, 67-76 (2004).</li>
<li>Olsen, T. S., Lassen, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+concept+of+middle+cerebral+artery+occlusion+and+cerebral+infarction+in+the+acute+state+based+on+interpreting+severe+hyperemia+as+a+sign+of+embolic+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">A dynamic concept of middle cerebral artery occlusion and cerebral infarction in the acute state based on interpreting severe hyperemia as a sign of embolic migration.</a> Stroke. 15, 458-468 (1984).</li>
<li>Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+rodent+surgery+for+the+new+surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Principles of rodent surgery for the new surgeon.</a> J. Vis. Exp. (47), e2586(2011).</li>
<li>Gonzalez, C. L., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+different+models+of+stroke+on+behaviour+and+brain+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A comparison of different models of stroke on behaviour and brain morphology.</a> Eur. J. Neurosci. 18, 1950-1962 (2003).</li>
<li>Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+middle+cerebral+artery+occlusion+%28MCAO%29+model+for+ischemic+stroke+with+laser+doppler+flowmetry+guidance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser doppler flowmetry guidance in mice.</a> J. Vis. Exp. (51), e2879(2011).</li>
<li>Sharkey, J., Butcher, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+an+experimental+model+of+stroke+produced+by+intracerebral+microinjection+of+endothelin-1+adjacent+to+the+rat+middle+cerebral+artery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterisation of an experimental model of stroke produced by intracerebral microinjection of endothelin-1 adjacent to the rat middle cerebral artery.</a> J. Neurosci. Methods. 60, 125-131 (1995).</li>
<li>Macrae, I. M., Robinson, M. J., Graham, D. I., Reid, J. L., McCulloch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-1-induced+reductions+in+cerebral+blood+flow%3A+dose+dependency%2C+time+course%2C+and+neuropathological+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Endothelin-1-induced reductions in cerebral blood flow: dose dependency, time course, and neuropathological consequences.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 13, 276-284 (1993).</li>
<li>Mecca, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebroprotection+by+angiotensin-%281-7%29+in+endothelin-1-induced+ischaemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cerebroprotection by angiotensin-(1-7) in endothelin-1-induced ischaemic stroke.</a> Exp. Physiol. 96 (1-7), 1084-1096 (2011).</li>
<li>Fisher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+of+the+stroke+therapy+academic+industry+roundtable+preclinical+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Update of the stroke therapy academic industry roundtable preclinical recommendations.</a> Stroke. 40, 2244-2250 (2009).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

MCAO indukowany przez ET-1 jest uznanym modelem eksperymentalnego udaru niedokrwiennego, który jest regularnie stosowany w wielu szczepach szczurów. Wiele zmiennych, takich jak szczep szczura, wiek zwierzęcia, temperatura ciała, metoda znieczulenia i doświadczenie operatora, może prowadzić do zwiększonej zmienności objętości zawału podczas korzystania z tego modelu5, 14. Jednak kilku badaczy wykazało, że zalety tego modelu obejmują stosunkowo nieinwazyjne podejście, reakcję na dawkę przepływu krwi w mózgu na ...

<table><tbody><tr><td colspan="4"> <ol> <li>Zwierzęta: Ośmiotygodniowe, samce, szczury rasy Sprague Dawley (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) o wadze 250-300 g w momencie operacji. </li> <li>Anestezja: <ol class="lalpha"> <li>System znieczulenia wziewnego (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA) </li> <li>Isoflurane anestezjologiczne (Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA)</li> </ol> </li> <li>System stereotaktyczny (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA): <ol class="lalpha"> <li>System stereotaktyczny dla małych zwierząt </li> <li>Niepękające nauszniki dla szczurów </li> <li>Uchwyt na głowicę do znieczulenia gazowego dla szczurów </li> </ol> </li> <li class="lalpha" > Regulacja temperatury: <ol class="lalpha"> <li>BAT-12 termometr z mikrosondą (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA) </li> <li>T/PUMP, koc termiczny TP600 (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA) </li> </ol> </li> <li>Instrumenty chirurgiczne <ol class="lalpha"> <li>Rękojeść skalpela i ostrze #11, kleszczyki do tęczówki, kleszcze Graefe, zwijacze zacisków bulldog, śrubokręt, 10 &mu; l strzykawka z igłą skośną o rozmiarze 26 (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA) Wiertarka </li> <li>Micromotor i uchwyt stereotaktyczny, Quintessential Stereotaxic Injector (St&#8211; lting, Wood Dale, IL, USA) </li> <li>1,0 mm okrągłe wiertło wiertarskie, 1,0 mm wiertło z odwróconym stożkiem (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA) </li> </ol> </li> <li>Materiały chirurgiczne <ol class="lalpha"> <li>montażowe 0-80 X 3/32 o długości trzonka 2,4 mm, Kaniula prowadząca o rozmiarze 21 [4 mm długości poniżej cokołu] i manekin kaniuli (Plastics one, Roanoke, VA, USA) </li> <li>Jet proteza akrylowa i płynna (Lang Dental Manufacturing Co., Inc., Wheeling, IL, USA) Szew nylonowy </li> <li>3.0 (Oasis, Mettawa, IL, USA) </li> <li>Waciki bawełniane, Maść do oczu Puralube (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA)</li> <li>Elektryczne maszynki do strzyżenia włosów (Oster, Providence, RI, USA) </li> </ol> </li> <li>Chemikalia: <ol class="lalpha"> <li>Endothelin-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA) </li> <li>Chlorheksydyna 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA) </li> <li>Buprenorphine HCl (Hospira Inc., Lake Forest, IL, USA) </li> </ol> </li> <li>Sprzęt do wizualizacji <ol class="lalpha"> <li>Mikroskop chirurgiczny (Seiler Instrument and Manufacturing; St. Louis, MO, USA) </li> <li>Oświetlacz światłowodowy (TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA)</li> </ol> </li> <li>Laserowy system przepływowo-dopplerowski (ADInstruments, Inc., Colorado Springs, CO, USA) <ol class="lalpha"> <li>Standard Pencil Probe </li> <li>Uchwyt sondy</li> <li>Blood FlowMeter </li> <li>Powerlab 4/30 z LabChart 7</li> </ol> </li> < li>Pomiar objętości zawału: <ol class="lalpha"> <li>Rat brain matrix (Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, USA)</li> <li>2,3,5-trifenylotetrazolowy chlorek (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) rozcieńczony do 0,05% w płaskim skanerze PBS</li> <li>Flat (Epson Perfection V30, Epson America, Inc., Long Beach, CA, Stany Zjednoczone) </li> <li>Image J (oprogramowanie ImageJ 1.42q, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA) </li> </ol> </li> </ol> </td></tr></tbody></table>

model niedrożności tętnicy środkowej mózgu indukowany endoteliną-1 dla udaru niedokrwiennego z laserową kontrolą przepływu dopplerowskiego u szczura

Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Rat

Udar mózgu jest główną przyczyną niepełnosprawności i trzecią najczęstszą przyczyną zgonów na świecie, kosztując szacunkowo 70 miliardów dolarów w Stanach Zjednoczonych w 2009 roku1, 2. Opracowano kilka modeli niedokrwienia mózgu, aby naśladować ludzki stan udaru. Sugeruje się, że do 80% wszystkich udarów wynika z uszkodzenia niedokrwiennego w obszarze tętnicy środkowej mózgu (MCA)3. Na początku lat dziewięćdziesiątych XX wieku endotelina-1 (ET-1) 4 była stosowana do wywoływania niedokrwienia poprzez nakładanie jej bezpośrednio przylegającej do powierzchni MCA po kraniotomii. Później model ten został zmodyfikowany 5 poprzez użycie stereotaktycznego wstrzyknięcia ET-1 w sąsiedztwie MCA w celu wytworzenia ogniskowego niedokrwienia mózgu. Do głównych zalet tego modelu należy możliwość szybkiego wykonania zabiegu, możliwość kontrolowania zwężenia tętnicy poprzez zmianę dawki dostarczanego ET-1, brak konieczności manipulowania naczyniami pozaczaszkowymi dostarczającymi krew do mózgu, a także stopniowe tempo reperfuzji, które bardziej naśladuje reperfuzję u ludzi5-7. Z drugiej strony model ET-1 ma wady, do których należy konieczność wykonania kraniotomii, a także większa zmienność objętości wyrzutu8. Zmienność tę można zmniejszyć za pomocą laserowej przepływomierzy dopplerowskiej (LDF) w celu weryfikacji niedokrwienia mózgu podczas infuzji ET-1. Czynniki wpływające na zmienność udaru obejmują precyzję infuzji i partię użytego ET-16. Inną ważną kwestią jest to, że chociaż reperfuzja jest częstym zjawiskiem w udarze mózgu, czas trwania okluzji dla MCAO indukowanego przez ET-1 może nie naśladować ściśle udaru ludzkiego, w którym wielu pacjentów ma częściową reperfuzję w okresie od kilku godzin do dni po okluzji9, 10. Protokół ten szczegółowo oopisuje model MCAO indukowany ET-1 dla udaru niedokrwiennego u szczurów. Zwróci również uwagę na szczególne względy i potencjalne wady w trakcie całej procedury.

1. Pooperacyjna ocena neurologiczna
Po odzyskaniu przez zwierzę przytomności można zastosować szeroką gamę testów w celu oceny deficytów neurologicznych, w tym równowagi, siły chwytu, ustawiania łap, asymetrii postawy oraz wchodzenia po schodach. Test z nasionami słonecznika jest ogólną oceną funkcji motorycznych i sensorycznych, która wykazuje istotną korelację z objętością zawału7, 12. Podczas tego zadania mierzy się czas, w jakim szczury otwierają i zjadają 5 nasion słonecznika. Pię...

Kilka zwierzęcych modeli niedokrwienia mózgu zostało opracowanych w celu symulacji ludzkiego stanu udaru. Protokół ten opisuje model niedrożności środkowej tętnicy mózgowej indukowanej endoteliną-1 (ET-1) (MCAO) dla udaru niedokrwiennego u szczurów. Ponadto omówiono ważne względy, zalety i wady tego modelu.

Model niedrożności tętnicy środkowej mózgu indukowany endoteliną-1 dla udaru niedokrwiennego z laserową kontrolą przepływu dopplerowskiego u szczura

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in ...

Ten protokół wideo opisuje model niedrożności tętnicy środkowej mózgu indukowany śródbłonkiem dla udaru niedokrwiennego z laserowym dopplerowskim nadzorem zapalnym u szczurów. Osiąga się to poprzez obserwację kilku punktów orientacyjnych, jak pokazano, i wstrzyknięcie śródbłonka przez otwór zadziorowy z użyciem lub bez użycia kaniuli prowadzącej. Opracowano wiele metod niedokrwienia mózgu w celu modelowania stanu ludzkiego udaru.Jeden z modeli polega na wstrzyknięciu silnego środka zwężającego naczynia krwionośne lub 81 do mózgu przylegającego do środkowej tętnicy mózgowej po guzie czaszki. Głównymi zaletami modelu ET one stroke jest to, że operację można przeprowadzić szybko i jest mniej inwazyjna w porównaniu z innymi modelami, takimi jak śródświatełkowa, indukowana włóknami niedrożność tętnicy środkowej mózgu. Jednak model ET z jednym udarem ma pewne wady, w tym konieczność kraniotomii, a także większą zmienność objętości wyrzutowej.Ten film zademonstruje krok po kroku model jednego udaru ET dla udaru niedokrwiennego u szczurów. Omówimy również kilka specjalnych względów, a także typowe pułapki tej procedury. Więc zacznijmy.Znieczulenie jest indukowane za pomocą 4% fluoru ISO w tlenie w komorze indukcyjnej i jest utrzymywane podczas operacji na poziomie 2% Po znieczuleniu szczura włosy są usuwane z czubka głowy za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia włosów. Szczur jest następnie umieszczany w pozycji leżącej na gaziku leżącym na powierzchni operacyjnej o kontrolowanej temperaturze, z głową osadzoną w aparacie stereotaktycznym. Pręty uszne są następnie dokręcane i regulowane.Smarującą maść okulistyczną nakłada się na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu oczu. Podczas zabiegu chirurgicznego skóra głowy jest następnie czyszczona roztworem chlorheksydyny i sterylną solą fizjologiczną. Nacięcie w linii środkowej wykonuje się na skórze pokrywającej calvarium od miejsca pomiędzy najbardziej rozpieszczonymi aspektami oczu do przestrzeni między uszami.Następnie skóra jest cofana na boki. Suche waciki bawełniane służą do bocznego przesuwania tkanki łącznej, dzięki czemu można zaobserwować kostne punkty orientacyjne, jak pokazano tutaj. Wiertło jest następnie przesuwane na 1,6 milimetra do przodu i 5,2 milimetra bocznego torema względnego.Następnie w tym miejscu wierci się mały otwór na wiertar, który powinien przebić czaszkę bez uszkadzania opony twardej. Następnie wiertło jest przesuwane na odległość około trzech do czterech milimetrów, aby wywiercić trzy płytkie otwory rozmieszczone w odstępach. Będzie to służyć jako miejsce na Trzy kotwiące do montażu, częściowo wkręcone trzy montażowe, które zapewnią podparcie dla cementu trzymającego w kaniuli prowadzącej.Prowadnica ze stali nierdzewnej o rozmiarze 21. Kaniula jest następnie wprowadzana do otworu wiertła 4,5 milimetra poniżej bgma. Uchwyt laserowej sondy fotometrycznej dopplerowskiej jest następnie umieszczany tuż za kaniulą prowadzącą i przyśrodkowo do bocznej części czaszki.Cement dentystyczny grzbietowy służy do zabezpieczenia kaniuli i uchwytu sondy na miejscu. Ważne jest, aby ukształtować cement w taki sposób, aby stykał się ze wszystkimi trzema, omijając skórę. Stereotaktyczne mocowanie ramienia jest następnie usuwane po całkowitym wyschnięciu cementu.Aby zarejestrować przepływ krwi w tętnicy środkowej mózgu. Laserowa dopplerowska sonda zapalna jest następnie umieszczana w uchwycie sondy. Strzykawka Hamiltona o rozmiarze 26 jest ładowana świeżą strzykawką śródbłonka o średnicy 80 mikromolów i ładowana do automatycznej pompy iniekcyjnej.Korzystając z ataków stereo, igła strzykawki Hamiltona jest opuszczana, aż dotknie krawędzi kaniuli prowadzącej. Igła jest następnie opuszczana brzusznie na 17,2 milimetra przez kaniulę prowadzącą i trzy mikrolitry śródbłonka. Jeden z nich jest wstrzykiwany z szybkością jednego mikrolitra na minutę za pomocą laserowej fotometrii dopplerowskiej.Można zauważyć, że przepływ krwi zmniejsza się o ponad 50% w stosunku do wartości wyjściowej. Po kilku minutach z czasem stopniowo wraca do wartości wyjściowej. Kilka minut po zakończeniu wstrzyknięcia igłę delikatnie wyjmuje się z kaniuli prowadzącej.Na koniec ranę zamyka się szwem, a kaniulę zakrywa się. Aby ocenić stopień deficytu udaru, można przeprowadzić różne badania neurologiczne. To jest przykład zadania jedzenia nasion słonecznika.Szczury są oceniane zarówno pod kątem czasu potrzebnego na spożycie pięciu nasion, jak i liczby pozostawionych kawałków skorupy. Szczury z większym deficytem udaru będą spożywać nasiona wolniej i pozostawiać więcej kawałków skorupy. Oprócz badań neurologicznych, objętość zawału można również ocenić za pomocą barwienia TTC, jak szczegółowo opisano w osobnym protokole wideo, który można znaleźć pod adresem na ekranie.Niedrożność tętnicy środkowej mózgu wywołana przez ET one jest modelem udaru niedokrwiennego, który jest regularnie stosowany u gatunków myszy. Metoda ta pozwala na kontrolowanie zwężenia tętnic poprzez zmianę dawki ET dostarczanej i stopniowej, w przeciwieństwie do nagłej reperfuzji, która bardziej naśladuje tę u ludzi. Chociaż reperfuzja jest częstym zjawiskiem w udarze mózgu, reperfuzja w przypadku niedrożności tętnicy środkowej mózgu wywołanej ET One może nie naśladować ściśle udaru ludzkiego, w którym większość pacjentów ma co najmniej częściową reperfuzję, ale w okresie od kilku godzin do dni po okluzji.Inną wadą metody ET One Stroke jest to, że wiele zmiennych, takich jak szczep szczura, wiek, waga, a także wiedza operatora, może prowadzić do niespójności i objętości zawału. Zmienność tę można jednak zmniejszyć za pomocą laserowego drzewa przepływu dopplerowskiego w celu weryfikacji niedokrwienia mózgu podczas infuzji ET one. Wreszcie, szybkie zwężenie i stopniowa reperfuzja podczas niedrożności tętnicy środkowej mózgu wywołanej ET one może ściśle naśladować skurcz naczyń obserwowany po krwotoku podpajęczynówkowym.Dlatego model ten może być również przydatnym narzędziem do badania niedokrwienia, które występuje podczas skurczu naczyń krwionośnych. Mamy nadzieję, że ten film okazał się przydatny i życzymy powodzenia w eksperymentach.

endothelin-1-induced-middle-cerebral-artery-occlusion-model-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Model okluzji środkowego tętnika mózgu wywołanej endotelinkiem-1 do badania udaru niedokrwiennego z wykorzystaniem pomiaru przepływu laserowego dopplerowskiego u szczurów

Chirurgiczne wywołanie niedokrwiennego uszkodzenia mózgu u szczura jest powszechnie stosowanym modelem w badaniach nad udarem. W niniejszej pracy demonstrujemy indukcję ogniskowego niedokrwienia mózgu poprzez zamknięcie tętnicy środkowej mózgu. Przedstawiono również wizualizację powstałego zawału za pomocą barwienia histologicznego oraz obrazowania rezonansem magnetycznym.

Model ogniskowego niedokrwienia mózgu poprzez endowaskularną okluzję tętnicy środkowej mózgu u szczura za pomocą szwu

Model intraluminalnego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) jest najczęściej stosowanym modelem wśród eksperymentalnych modeli udaru niedokrwiennego. W niniejszym materiale szczegółowo zaprezentujemy cały model z wykorzystaniem laserowej flowmetrii dopplerowskiej oraz przedstawimy reprezentatywne wyniki.

Model wewnątrznaczyniowego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) w udarze niedokrwiennym u myszy z prowadzeniem za pomocą laserowej dopplerometrii przepływu

Ten artykuł opisuje metodę wizualizacji tętnic mózgowych szczurów przez okno czaszki za pomocą kraniektomii skroniowej w celu obejrzenia proksymalnych części środkowej tętnicy mózgowej (Rysunek 1). Ta wszechstronna metoda może być łączona z różnymi technikami dostarczania leków w celu pomiaru reaktywności tętnic mózgowych in vivo.

Wykorzystanie okna czaszkowego do wizualizacji tętnicy środkowej mózgu podczas niedrożności tętnicy środkowej mózgu wywołanej endoteliną-1

Wykazano, że monitorowanie perfuzji mózgowej poprawia dokładność modeli udaru niedokrwiennego. Trudności techniczne często ograniczają wykorzystanie tego niezbędnego narzędzia do badań naczyń mózgowych. W tym filmie pokazano zoptymalizowany system do uzyskania jedno- lub wielomiejscowego monitorowania hemodynamicznego podczas śródświetlnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu u szczurów.

Zoptymalizowany system do monitorowania perfuzji mózgowej w modelu udaru szczura wewnątrzświetlnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu

Tutaj opisujemy mysi model niedokrwienia siatkówki poprzez przejściowe obustronne zamknięcie tętnicy szyjnej za pomocą prostych szwów i zacisku. Model ten może być przydatny do zrozumienia patologicznych mechanizmów niedokrwienia siatkówki spowodowanego nieprawidłowościami sercowo-naczyniowymi.

Mysi model niedokrwiennego uszkodzenia siatkówki wywołanego przejściowym obustronnym zamknięciem tętnicy szyjnej wspólnej

Ten protokół opisuje model przejściowego ogniskowego niedokrwienia mózgu u myszy poprzez śródświetlne zamknięcie środkowej tętnicy mózgowej. Dodatkowo przedstawiono przykłady oceny wyników z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego i testów behawioralnych.

Przejściowy model niedrożności tętnicy środkowej mózgu

Obecny protokół opisuje szczurzy model okluzji/reperfuzji tętnicy środkowej mózgu, który zachowuje anatomiczną strukturę naczyń mózgowych bez powodowania uszkodzeń.

Szczurzy model niedrożności/reperfuzji tętnicy środkowej mózgu bez uszkadzania struktury anatomicznej naczyń mózgowych

Ten protokół przedstawia przewodnik krok po kroku dla badaczy, jak przeprowadzić procedurę zamknięcia tętnicy środkowej mózgu na myszach przy użyciu zmodyfikowanej metody Longa tętnicy szyjnej zewnętrznej. Modyfikacje przedstawione w artykule mają na celu zwiększenie dokładności niedrożności tętnicy środkowej mózgu i zapewnienie pełnej reperfuzji.

Optymalizacja metody zamykania tętnic środkowych Longa w celu uzyskania pełnej reperfuzji

Pokazano tutaj minimalnie inwazyjną procedurę chirurgiczną, która polega na umieszczeniu laserowej sondy dopplerowskiej na czaszce nad dystalnym obszarem środkowej tętnicy mózgowej (MCA), miejscem okołooczodołowym odpowiednim dla szczurów i myszy, w celu oceny przepływu krwi podczas przejściowej okluzji MCA.

Okołooczodołowe umieszczenie laserowej sondy dopplerowskiej do monitorowania przepływu krwi w mózgu przed niedrożnością tętnicy środkowej mózgu w modelach gryzoni

Ten protokół opisuje proces przygotowania do reperfuzji niedrożności tętnicy środkowej mózgu przez tętnicę szyjną wspólną.

Zmodyfikowany model preparatu do reperfuzji niedrożności tętnicy środkowej mózgu

Poznaj model niedrożności tętnicy środkowej mózgu indukowany endoteliną-1 z laserową kontrolą przepływu dopplerowskiego u szczura. Ta metoda umożliwia badanie udaru niedokrwiennego z kontrolowanym zwężeniem naczynia.

Model niedrożności tętnicy środkowej mózgu indukowany endoteliną-1 dla udaru niedokrwiennego z laserową kontrolą przepływu dopplerowskiego u szczura (Wideo) | JoVE Journal

Model niedrożności tętnicy środkowej mózgu indukowany endoteliną-1 dla udaru niedokrwiennego z laserową kontrolą przepływu dopplerowskiego u szczura

Przeglądaj więcej filmów