Name: Celowane znakowanie neuronów w specyficznej funkcjonalnej mikrodomenie kory nowej poprzez połączenie sygnału wewnętrznego i obrazowania dwufotonowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-12T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Poznaj metodę znakowania neuronów w mikrodomenach kory nowej przy użyciu obrazowania sygnału wewnętrznego i mikroskopii dwufotonowej. Technika umożliwia badanie struktury i funkcji neuronów w wysokiej rozdzielczości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez granty z National Eye Institute R01EY017925 i R21EY020985 oraz fundusze z Fundacji Dana & Whitehall dla P.K. Dziękujemy również Mateuszowi Petrelli za pomoc w zabiegach chirurgicznych; Grace Dion za śledzenie dendrytów pokazanych na rysunku 5A; oraz Pratikowi Chhatbarowi za komentarze do rękopisu.

1. Przygotowanie chirurgiczne
<ol>
	<li>Wywołaj znieczulenie i stale monitoruj tętno, koniec oddechowego CO2, EEG i temperaturę. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Południowej Karolinie i były oparte na tych, które opublikowaliśmy wcześniej9,15.</li>
	<li>Odsłoń grzbietową powierzchnię czaszki, przecinając skórę ostrzem skalpela. Wypreparuj tkanki łączne pokrywające kość za pomocą kirety Brudon. Oczyść kość za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką i bawełnianej gazy. Nałóż wosk kostny (w razie potrzeby) na czaszkę, aby zatrzymać sporadyczne krwawienie przez małe żyły emisariusza.</li>
	<li>Przymocuj tytanową lub stalową płytkę głowy do czaszki (nad obszarem zainteresowania, w którym zostanie wykonana kraniotomia) za pomocą cementu dentystycznego zmieszanego z czarną farbą (patrz Materiały). Prostokątny otwór pośrodku płyty głowy zapewnia dostęp do kraniotomii i obrazowania optycznego. Zamocuj metalową komorę na górze płyty czołowej. Komora ta będzie służyć jako zbiornik płynu do obrazowania za pomocą soczewki obiektywowej zanurzonej w wodzie.</li>
	<li>Przymocuj płytę czołową do stolika xy za pomocą metalowych słupków.</li>
	<li>Rozrzedzić duży obszar kości w prostokątnym otworze płyty głowy za pomocą wiertła dentystycznego. Obszar, który ma zostać przerzedzony, musi wykraczać daleko poza granice planowanej kraniotomii. Grube czaszki ssaków innych niż gryzonie muszą zostać przerzedzone, jeśli mają być uzyskane obrazy o wysokiej rozdzielczości z kory nowej, ponieważ w miejscu kraniotomii grubość kości będzie dyktować grubość agarozy między szkłem nakrywkowym a powierzchnią kory nowej (patrz poniżej).</li>
	<li>Wywierć kwadratowy kontur o wymiarach 2 x 2 mm w kości do kraniotomii. Okresowo płukaj komorę świeżym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (ACSF), aby usunąć odłamki kości i zminimalizować rozpraszanie ciepła do leżącej poniżej kory. W razie potrzeby nałóż wosk kostny, aby zatrzymać sporadyczne krwawienie.</li>
	<li>Podnieś płat kostny za pomocą kleszczy #3.</li>
	<li>Usuń całą warstwę opony twardej oprócz dolnej za pomocą cienkich kleszczyków (#5CO) i nożyczek sprężynowych Vannas. Opona twarda u ssaków innych niż gryzonie jest gruba i nieprzezroczysta, ale można ją usunąć w odrębnych warstwach. Krwawienie występuje rzadko, ale można je zatamować za pomocą pianki żelowej, a wszelkie pozostałości krwi należy delikatnie usunąć z pozostałej warstwy opony twardej za pomocą kleszczy i spłukać ACSF. Ostatnia warstwa opony twardej jest przezroczysta i naczynia opony twardej powinny być przez nią wyraźnie widoczne. Pozostawienie tej ostatniej warstwy opony twardej nienaruszonej podczas obrazowania sygnału wewnętrznego zwiększy wskaźnik sukcesu masowego ładowania fluorescencyjnych wskaźników wapnia w kolejnej fazie obrazowania dwufotonowego eksperymentu (patrz Dyskusja).</li>
	<li>Nałóż kroplę ciepłej 2% agarozy (rozpuszczonej w ACSF) i natychmiast umieść szklankę nakrywkową na kraniotomii. Sprawdź kraniotomię, aby upewnić się, że pulsacje oddechowe i sercowo-naczyniowe są minimalne, używając chirurgicznego mikroskopu preparacyjnego lub okularów mikroskopu dwufotonowego w trybie jasnego pola.</li>
</ol>
2. Obrazowanie optyczne sygnału wewnętrznego
<ol>
	<li>Dodaj żelową piankę nasączoną ACSF wokół zewnętrznej strony szkła nakrywkowego, aby zapobiec wysychaniu agarozy podczas obrazowania sygnału wewnętrznego.</li>
	<li>Podłącz kamerę CCD do obrazowania sygnału wewnętrznego do standardowego portu C-mount na górze mikroskopu dwufotonowego (Rysunek 1). Umieść oświetlające źródło światła na stole powietrznym w pobliżu xy stage (Rysunek 1A). Umieść i zabezpiecz światłowody nad kraniotomią i płytą główną/komorą (Rysunek 1B). Cofnij główny dichroik i lustro poniżej portu C-mount, tak aby odbite czerwone światło potrzebne do sygnałów wewnętrznych przeszło bezpośrednio z kraniotomii do kamery CCD (rysunek 1C-D). Za pomocą obiektywu pneumatycznego 4x (0,13 NA, 17 mm WD) dostępne jest pole widzenia 2 x 2 mm do obrazowania sygnału wewnętrznego.</li>
	<li>Umieść filtr ciepła w ścieżce światła, aby zapobiec nagrzewaniu się kory. Użyj filtra, który przepuszcza zielone światło (546 nm w środku λ) i zapisz cyfrowy obraz referencyjny naczyń krwionośnych na powierzchni kory mózgowej.</li>
	<li>Przesuń ostrość z na 500 μm poniżej powierzchni kory mózgowej. Użyj czerwonego filtra (630 nm w środku λ), aby oświetlić korę mózgową do pomiaru sygnałów wewnętrznych. Umieść światłowody w taki sposób, aby powierzchnia kory mózgowej była równomiernie oświetlona. Osłoń kraniotomię przed światłem wytwarzanym przez bodźce wzrokowe. Przedstaw sekwencję bodźców wizualnych i zapisz obrazy danych odbicia. Aby w ciągu 10 minut wygenerować mapę orientacyjną, należy zebrać dane odpowiadające 4 powtórzeniom sekwencji 8 bodźców (4 orientacje i dwa kierunki dla każdej orientacji).</li>
	<li>Przeanalizuj dane sygnału wewnętrznego, aby wygenerować mapę orientacji w fałszywych kolorach. Wybierz potencjalne regiony docelowe do dwufotonowego znakowania neuronów, np. osobliwości wiatraczka orientacji - punkty na mapie, w których zbiegają się wszystkie preferowane orientacje (Rysunek 2A). Nałóż mapę orientacyjną i obraz unaczynienia powierzchni kory mózgowej (ryc. 2B-C). Użyj układu domen funkcjonalnych i lokalizacji dużych naczyń powierzchniowych, aby wybrać cel, unikając miejsc z dużymi naczyniami krwionośnymi i tętniczkami15.</li>
</ol>
3. Masowe ładowanie fluorescencyjnych wskaźników wapnia
<ol>
	<li>Przygotować roztwór 20% Pluronic/DMSO, dodając 1 g Pluronic w 5 μl DMSO. Podgrzewać mieszaninę w temperaturze 60 °C przez 10 minut, aby całkowicie rozpuścić Pluronic. Pozwól mieszaninie ostygnąć do temperatury pokojowej. Dodać 4 μl mieszaniny Pluronic/DMSO do 50 μg fiolki fluorescencyjnego wskaźnika wapnia Oregon Green 488 Bapta-1 AM (OGB-1 AM). Następnie dodać 1 μl czerwonego barwnika (Alexa Fluor 594, 2 mM roztwór podstawowy) i 35 μl roztworu pipet (patrz Materiały) do uzyskania końcowego stężenia 1 mM OGB-1 AM. Sonikować roztwór przez 1/2 godziny w łaźni wodnej ze schłodzonym stanem, a następnie odwirować z filtrem 0,45 μm w celu usunięcia zanieczyszczeń.</li>
	<li>Wyciągnąć długą pipetę stożkową o zewnętrznej średnicy końcówki 2,0-2,5 μm. Załadować do niej 5 μl mieszaniny barwników.</li>
	<li>Usuń ostatnią warstwę opony twardej, aby ułatwić wprowadzenie pipety i uzyskać najwyższej jakości obrazy dwufotonowe.</li>
	<li>Określ dokładne miejsce na powierzchni kory mózgowej, w którym należy umieścić pipetę, aby dotrzeć do celu w warstwie korowej 2/3. Naszym z góry określonym celem korowym jest osobliwość wiatraczka na mapie orientacji (ryc. 2). Pipeta musi być wprowadzona do kory pod kątem 30°, aby przejść między ścianą komory a obiektywem. Tak więc, aby oznaczyć obszar docelowy znajdujący się 200 μm poniżej powierzchni kory mózgowej, pozycja wejściowa pipety na powierzchni kory będzie znajdować się około 350 μm w bok od pozycji docelowej (rysunek 3 A-B).</li>
	<li>Przesunąć stolik xy (na którym umieszczone jest zwierzę i mikromanipulator pipety), aby wyśrodkować pozycję wejścia powierzchni kory mózgowej pod obiektywem (Rysunek 3C). Użyj obiektywu 20x lub 40x z odległością roboczą (WD) co najmniej 3 mm (patrz Materiały), aby upewnić się, że pipeta łatwo dostanie się do kory mózgowej bez dotykania obiektywu lub kości wzdłuż ściany kraniotomii. Gdy pozycja wejściowa zostanie wyśrodkowana pod obiektywem, podnieś pozycję Z obiektywu o 2 mm (Rysunek 3D). Przy włączonym zielonym świetle epifluorescencyjnym w celu wizualizacji czerwonego barwnika Alexa w pipecie, użyj osi przekątnej mikromanipulatora, aby przesunąć pipetę, aż jej końcówka zostanie wyśrodkowana (i skupiona) pod obiektywem bezpośrednio nad pozycją wejścia na powierzchnię kory mózgowej (rysunek 3E).</li>
	<li>Opuść pipetę pionowo (wzdłuż osi z), aż dotrze do powierzchni kory mózgowej (Rysunek 3F), cały czas obserwując końcówkę pipety przez okulary mikroskopu. Dzięki oświetleniu jasnym polem naczynia krwionośne na powierzchni kory mózgowej i pozostałe błony oponowe (pia i pajęczynówka) są łatwo widoczne, gdy pipeta zbliża się do powierzchni kory. Jeśli pipeta nie osiągnie żądanej pozycji wejściowej, podnieś pipetę i ponownie skalibruj celowanie na podstawie punktów orientacyjnych naczyń krwionośnych na powierzchni kory mózgowej.</li>
	<li>Usuń obiektyw, odsuń nadmiar płynu mózgowo-rdzeniowego z kraniotomii i osusz sąsiednią kość za pomocą niestrzępiących się włóczni absorpcyjnych. Zastosuj kroplę ciepłej 3% agarozy (rozpuszczonej w ACSF), aby ustabilizować korę widoczną przez kraniotomię (ryc. 3G). U zwierząt niebędących gryzoniami 3% agaroza jest niezbędna do tłumienia pulsacji w celu pomyślnego wychwytu barwników fluorescencyjnych przez neurony. Do obrazowania optycznego sygnału wewnętrznego potrzebne jest tylko 2% agarozy, ponieważ połączenie 2% agarozy i szkła nakrywkowego zapewnia niezbędną stabilność. W tym przypadku do etapu ładowania barwnika nie jest używane szkło nakrywkowe, więc konieczne jest 3% agarozy. Po zastygnięciu agarozy włóż obiektyw 40x (0,8 NA, 3,3 mm WD) i ponownie napełnij komorę ACSF.</li>
	<li>Przełącz się z patrzenia w jasnym polu na widok dwóch fotonów i znajdź końcówkę pipety. Używając osi ukośnej mikromanipulatora, przesuwaj pipetę, aż jej końcówka osiągnie żądaną głębokość w korze mózgowej (ryc. 3H). Sporadyczne zaciągnięcia mieszaniny barwników (kilka psi, każdy impuls 0,1 sekundy) pomogą zapobiec zatykaniu się końcówki pipety. Ponieważ OGB-1 AM staje się widoczny dopiero po wejściu do komórek, czerwony barwnik Alexa ma kluczowe znaczenie dla wizualizacji końcówki pipety wewnątrz kory</li> mózgowej.
	<li>Przed próbą załadowania neuronów w warstwie korowej 2/3 pełną dawką barwnika, ponownie ustaw ostrość obiektyw na powierzchni kory mózgowej, aby potwierdzić głębokość końcówki pipety i upewnić się, że końcówka znajduje się w docelowym miejscu w oparciu o układ powierzchniowych naczyń krwionośnych. Jeśli pipeta znajduje się w warstwie 2/3, małe zaciągnięcia mieszaniny barwników powinny oświetlić przestrzeń zewnątrzkomórkową i ujawnić gęste zgromadzenie okrągłych ciał komórkowych jako ciemne cienie.</li>
	<li>Aby załadować ciała komórek nerwowych w kulę o średnicy kory 300-600 μm, wstrzyknij mieszaninę barwników do przestrzeni zewnątrzkomórkowej za pomocą 30-90 impulsów, każdy impuls 1,0 sek., 2-10 psi. Impulsy ciśnienia nie powinny być tak silne, aby tkanka się poruszała. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy odczekać kilka minut, a następnie wyjąć pipetę i obiektyw. Odczekaj 1 godzinę, aby OGB-1 AM został w pełni wchłonięty przez neurony.</li>
	<li>Usuń agarozę użytą do nałożenia barwnika i wypłucz komorę nagrywania. Nałóż małą kroplę 2-3% agarozy na powierzchnię i szybko umieść szkło nakrywkowe na kraniotomii. Ponieważ barwniki fluorescencyjne są wrażliwe na światło, unikaj nadmiernego wystawiania kory na działanie jasnego pola lub światła epifluorescencyjnego. Włóż obiektyw o wysokim NA (1,0) 20x do uchwytu obiektywu i ponownie wyśrodkuj oznaczony obszar korowy pod obiektywem za pomocą stolika xy. Osłoń kraniotomię przed zewnętrznymi źródłami światła, np. wyświetlaniem bodźców wizualnych, używając wielu warstw materiału zaciemniającego.</li>
</ol>
4. Jednoogniwowa elektroporacja barwników fluorescencyjnych
<ol>
	<li>Do badania morfologii dendrytycznej należy przygotować roztwór 100 μM Alexa Fluor 594 (rozcieńczenie 1:20 w ACSF 2 mM Alexa Fluor 594 stock). Do funkcjonalnego obrazowania dendrytów można użyć soli OGB16,17.</li>
	<li>Wyciągnąć długą pipetę stożkową z końcówką o rozmiarze 1 μm i wsypać do niej 5 μl barwnika. Wszystkie inne etapy kierowania na domenę funkcjonalną są identyczne z metodą ładowania zbiorczego (rysunki 1-3). Aby ustawić końcówkę pipety w pobliżu błony ciała komórki neuronalnej, monitoruj wzrost impedancji elektrody i zastosuj ciśnieniowe wciągnięcia barwnika, aby oświetlić przestrzeń zewnątrzkomórkową i zobaczyć ciała komórek jako cienie podczas obrazowania dwufotonowego.</li>
	<li>Gdy końcówka pipety przylega do błony ciała komórki neuronalnej, użyj Axoporator 800A, aby zastosować 1-3 impulsy (od -8 do -10 V, impuls 10 ms). Natychmiastowe wypełnienie neuronu barwnikiem można łatwo uwidocznić za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Wyjmij pipetę i zbierz obrazy dendrytów i aksonów w wysokiej rozdzielczości in vivo.</li>
</ol>

<ol><li>Blasdel, G. G., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+dyes+reveal+a+modular+organization+in+monkey+striate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex.</a> Nature. 321, 579-585 (1986).</li>
<li>Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+cortex+revealed+by+optical+imaging+of+intrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals.</a> Nature. 324, 361-364 (1986).</li>
<li>Bonhoeffer, T., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iso-orientation+domains+in+cat+visual+cortex+are+arranged+in+pinwheel-like+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns.</a> Nature. 353, 429-431 (1991).</li>
<li>Ohki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+ordered+arrangement+of+single+neurons+in+orientation+pinwheels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels.</a> Nature. 442, 925-928 (2006).</li>
<li>Shmuel, A., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+for+direction+of+motion+and+its+relationship+to+orientation+maps+in+cat+area+18%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18.</a> J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).</li>
<li>Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+with+cellular+resolution+reveals+precise+micro-architecture+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex.</a> Nature. 433, 597-603 (2005).</li>
<li>Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience+with+moving+visual+stimuli+drives+the+early+development+of+cortical+direction+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity.</a> Nature. 456, 952-956 (2008).</li>
<li>Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+layout+of+functional+domains+in+area+17+and+across+the+area+17%2F18+border+in+cat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex.</a> Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).</li>
<li>Kara, P., Boyd, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+micro-architecture+for+binocular+disparity+and+ocular+dominance+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex.</a> Nature. 458, 627-631 (2009).</li>
<li>da Costa, N. M., Martin, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whose+Cortical+Column+Would+that+Be%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Whose Cortical Column Would that Be.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16(2010).</li>
<li>Kaschube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universality+in+the+evolution+of+orientation+columns+in+the+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex.</a> Science. 330, 1113-1116 (2010).</li>
<li>Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+organization+in+area+21a+of+the+cat+revealed+by+optical+imaging%3A+comparison+with+the+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex.</a> Neuroscience. 164, 1320-1333 (2009).</li>
<li>Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+mapping+of+single+spines+in+cortical+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo.</a> Nature. 475, 501-505 (2011).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).</li>
<li>Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+artery-specific+fluorescent+dye+for+studying+neurovascular+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling.</a> Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).</li>
<li>Nevian, T., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+indicator+loading+of+neurons+using+single-cell+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%22%5BJournal%5D)">Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation.</a> Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).</li>
<li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+patch-clamp+recordings+and+single-cell+electroporation+of+unlabeled+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).</li>
<li>Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+valproic+acid+exposure+alters+functional+organization+in+the+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex.</a> Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).</li>
<li>Bock, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+anatomy+and+in+vivo+physiology+of+visual+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons.</a> Nature. 471, 177-182 (2011).</li>
<li>Rochefort, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+direction+selectivity+in+mouse+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of direction selectivity in mouse cortical neurons.</a> Neuron. 71, 425-432 (2011).</li>
<li>Mrsic-Flogel, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+regulation+of+eye-specific+responses+in+visual+cortex+during+ocular+dominance+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity.</a> Neuron. 54, 961-972 (2007).</li>
<li>Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Optical Imaging Based on Intrinsic Signals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonhoeffer%2C+T+%22Brain+mapping%3A+The+Methods%22">Brain mapping: The Methods</a>. Toga, A. W., Mazziotta, J. C. , Academic Press. San Diego. 55-97 (1996).</li>
<li>Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+input+and+output+of+neocortical+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Imaging input and output of neocortical networks in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).</li>
<li>Hofer, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+connectivity+and+response+dynamics+of+excitatory+and+inhibitory+neurons+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex.</a> Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Przedstawiamy metodę celowania w znakowanie ciał komórek neuronalnych (lub dendrytów i aksonów) w określonych wcześniej funkcjonalnych mikrodomenach kory nowej. Połączenie obrazowania optycznego sygnału wewnętrznego z mikroskopią dwufotonową daje możliwość określenia, które synapsy i komórki przyczyniają się do mikrodomeny dowolnej mapy funkcjonalnej, czy selektywność neuronalna koreluje z lokalizacją neuronu na mapie funkcjonalnej oraz jakie składniki obwodu neuronalnego zmieniają się wraz z doświadczeniem wzrokowym<su...

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silny>1. Przygotowanie do podtrzymywania życia/eksperymentu</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Webster Vet</td><td>NDC 57319-474-05</td><td></td></tr><tr><td>Waporyzator izofluranowy</td><td>Midmark</td><td>VIP 3000</td><td></td></tr><tr><td>Koc grzewczy regulowany sprzężeniem zwrotnym</td><td>Harvard Apparatus</td><td>50-7079F</td><td></td></tr><tr><td>Monitor EKG</td><td>Digicare Biomedical</td><td>LifeWindow Lite</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz EEG</td><td>A-M Systems</td><td>1800</td><td></td></tr><tr><td>Monitor EEG</td><td>Hewlett Packard</td><td>78304A</td><td></td></tr><tr><td>Monitor końca pływów CO2</td><td>Respironics</td><td>Novametrix Capnoguard 1265</td><td>Zoptymalizuj wentylację</td></tr><tr><td>Frezy z węglików spiekanych do wiercenia w kości</td><td>Henry Schein</td><td>drobne (końcówka 0,5 mm) i grube (końcówka 1,25 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Cement do płyty czołowej/komory</td><td>Dentsply</td><td>675571, 675572</td><td></td></tr><tr><td>farba temperowa proszkowa</td><td>Sargent Art Inc.</td><td>22-7185</td><td>Dodaj do cementu, aby poprawić osłonę światła i zmniejszyć odbicia</td></tr><tr><td>Agaroza - Typ III-A</td><td>Sigma</td><td>A9793</td><td>Do minimalizacji pulsacji podczas obrazowania sygnału wewnętrznego i dwufotonowego</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe: średnica 5 lub 8 mm, grubość 0,17 mm</td> World <td>Precision Instruments</td><td>502040, 502041</td><td>W celu zminimalizowania pulsacji podczas obrazowania, szkło nakrywcowe można przyciąć w razie potrzeby</td></tr><tr><td>Łyżeczki Brudon</td><td>George Tiemann</td><td>105-715-0, 105-715-3</td><td>Czyszczenie powierzchni czaszki</td></tr><tr><td>Wosk kostny</td><td>Ethicon</td><td>W31G</td><td>Szybko zatrzymuje krwawienie</td></tr><tr><td>Aplikator z bawełnianą końcówką</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>Nauki 72308-05</td><td>Czysta i sucha powierzchnia kości</td></tr><tr><td>Dumont #5CO Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11295-20</td><td>Chwyć pojedyncze warstwy opony twardej lub pia</td></tr><tr><td>Vannas Nożyczki sprężynowe</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>15000-03</td><td>Cut</td></tr><tr><td>dura Gelfoam</td><td>Pfizer</td><td>09-0396-05</td><td>Aby zatrzymać krwawienie na oponie twardej</td></tr><tr><td>Włócznie absorpcyjne</td><td>Fine Science Tools</td><td>18105-01</td><td>Ultraszybkie i niestrzępiące się odprowadzanie płynu słuchowego</td></tr><tr><td>Materiał zaciemniający</td><td>Thorlabs</td><td>BK5</td><td>Kraniotomia tarczowa</td></tr><tr><td colspan="4">2. Przygotowanie / wtrysk barwnika</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulphoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 Bapta-1 AM</td><td>Invitrogen</td><td>O6807</td><td>Wskaźnik wapnia</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A10438</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy (0,45 &mu; m wielkość porów)</td><td>Millipore</td><td>UFC30HV00</td><td>Do usuwania zanieczyszczeń przed wstrzyknięciem</td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet</td><td>szklanych Sutter Instruments</td><td>P97</td><td></td></tr><tr><td>Kapilara z włókna ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna 1,5 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td>Pipeta do wyrzucania barwnika</td></tr><tr><td></td><td>Mikroładowarka Eppendorf</td><td>5242 956 003</td><td>Do ładowania barwnika do pipety</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td>Do pozycjonowania pipety</td></tr><tr><td>Regulator impulsów ciśnienia</td><td>Parker Hannifin</td><td>PicoSpritzer III</td><td>Do wtryskiwania barwnika pod ciśnieniem</td></tr><tr><td>Elektroporator jednoogniwowy</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Axoporator 800A</td><td>Do elektroporacji barwnika</td></tr><tr><td colspan="4">3. Obrazowanie wewnętrzne</mocny></td></tr><tr><td>4-krotny obiektyw (0,13 NA, 17 mm WD)</td><td>Olympus</td><td>UPLFLN4X</td><td></td></tr><tr><td>Wewnętrzny sprzęt / oprogramowanie</td><td>Optical Imaging Inc.</td><td>Imager 3001 / VDAQ</td><td>Oprogramowanie VDAQ służy do obrazowania epizodycznego</td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Adimec</td><td>Adimec-1000</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła Zasilacz</td><td>KEPCO</td><td>ATE 15-15M</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła</td><td>Optical Imaging Inc.</td><td>HAL 100</td><td>Natężenie światła na powierzchni kory wynosi 3-5 mW</td></tr><tr><td>Zielony filtr (do obrazu naczyniowego)</td><td>Optical Imaging Inc.</td><td>&#955; = 546 nm (pasmo przepustowe 30 nm)</td><td>Dla obrazu referencyjnego unaczynienia powierzchniowego</td></tr><tr><td>Filtr czerwony (dla sygnału wewnętrznego)</td><td>Optical Imaging Inc.</td><td>&#955; = 630 nm (pasmo przepustowe 30 nm)</td><td>Do zbierania sygnałów wewnętrznych</td></tr><tr><td>Filtr ciepła</td><td>Optical Imaging Inc.</td><td>KG-1</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silny>4. Dwufotonowy aparat/obrazowanie</td></tr><tr><td>Mikroskop dwufotonowy i oprogramowanie</td><td>Prairie Technologies</td><td></td><td>Zobacz Shen et al. 2012 dla ścieżki światła, filtrów i mocy lasera</td></tr><tr><td>Ti:Szafirowy laser</td><td>Spectra-Physics</td><td>Mai Tai XF</td><td></td></tr><tr><td>20x (0,5 NA; 3,5 mm WD)</td><td>Obiektyw Olympus</td><td>UMPLFLN20X</td><td>0,5 NA służy tylko do ustawiania pipety nad kraniotomią (nie do obrazowania dwufotonowego)</td></tr><tr><td>20x (1.0 NA; 2.0 mm WD)</td><td>Olympus</td><td>XLUMPLFLN20X</td><td></td></tr><tr><td>40x (0.8 NA; 3.3 mm WD)</td>Stół powietrzny <td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40X/IR</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Newport</td><td>ST-200</td><td>Izoluje przygotowanie od wibracji zewnętrznych</td></tr><tr><td>xy stage</td><td>Mike&#8217; s Machine Co. (Attleboro, MA)</td><td></td><td>Obiekt eksperymentalny i mikromanipulator Sutter umieszczony na xy stage</td></tr><tr><td colspan="4"> <table border="1"> <tbody> <tr> <td colspan="2">Recipes</td> </tr> <tr> <td>Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy</td> <td>NaCl (135 mM), KCl (5,4 mM), MgCl2 (1,0 mM), CaCl2 (1,8 mM), HEPES (5 mM), pH 7,4</td> </tr> <tr> <td>Pipeta Solution14</td> <td>NaCl (150 mM), KCl (2,5 mM), HEPES (10 mM), pH 7,4</td> </tr> </tbody> </stół> </td></tr></tbody></table>

celowane znakowanie neuronów w specyficznej funkcjonalnej mikrodomenie kory nowej poprzez połączenie sygnału wewnętrznego i obrazowania dwufotonowego

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

W głównej korze wzrokowej ssaków innych niż gryzonie, neurony są grupowane zgodnie z ich preferencjami dla cech bodźców, takich jak orientacja1-4, kierunek5-7, dominacja oka8,9 i różnica obuoczna9. Selektywność orientacji jest najczęściej badaną cechą, a ciągła mapa z quasi-okresowym układem preferowanej orientacji jest obecna w całej pierwszorzędowej korze wzrokowej10,11. Zintegrowanie wkładów synaptycznych, komórkowych i sieciowych, które prowadzą do selektywnych odpowiedzi na bodźce w tych mapach funkcjonalnych, wymaga hybrydyzacji technik obrazowania, które obejmują skale przestrzenne od submikronów do milimetrów. Dzięki konwencjonalnemu obrazowaniu optycznemu sygnału wewnętrznego można określić ogólny układ map funkcjonalnych na całej powierzchni kory wzrokowej12. Opracowanie mikroskopii dwufotonowej in vivo z wykorzystaniem barwników wrażliwych na wapń umożliwia określenie danych synaptycznych docierających do poszczególnych kolców dendrytycznych13 lub jednoczesne rejestrowanie aktywności z setek pojedynczych ciał komórek nerwowych6,14. W związku z tym połączenie obrazowania sygnału wewnętrznego z submikronową rozdzielczością przestrzenną mikroskopii dwufotonowej daje możliwość dokładnego określenia, które segmenty i komórki dendrytyczne przyczyniają się do mikrodomeny dowolnej mapy funkcjonalnej w korze nowej. Tutaj demonstrujemy wysokowydajną metodę szybkiego uzyskiwania mapy orientacji kory mózgowej i celowania w określoną mikrodomenę w tej funkcjonalnej mapie do znakowania neuronów barwnikami fluorescencyjnymi u ssaków innych niż gryzonie. Za pomocą tego samego mikroskopu, który jest używany do obrazowania dwufotonowego, najpierw generujemy mapę orientacji za pomocą obrazowania optycznego sygnału wewnętrznego. Następnie pokazujemy, jak celować w mikrodomenę zainteresowania za pomocą mikropipety wypełnionej barwnikiem, aby oznaczyć populację ciał komórek nerwowych lub oznaczyć pojedynczy neuron tak, aby dendryty, kolce i aksony były widoczne in vivo. Nasze udoskonalenia w stosunku do poprzednich metod ułatwiają badanie relacji struktura-funkcja neuronów z rozdzielczością subkomórkową w ramach funkcjonalnych architektur kory nowej.

Aby zilustrować precyzję naszych metod znakowania barwnikiem, obraliśmy za cel najmniejszą mikrodomenę z jakiejkolwiek znanej mapy funkcjonalnej w neocortexie zwierząt niedobbyronich. W mapie orientacji w pierwotnej korze wzrokowej rzadko rozmieszczone są tzw. osobliwości. Występują one w punktach, w których zbiegają się wszystkie preferowane orientacje, tak że na mapach preferowanej orientacji w fałszywych barwach obszary wokół osobliwości przypominają „młynki” (Rysunek 2A-B). Do znakowania barwnikiem w...

Opisano metodę znakowania neuronów barwnikami fluorescencyjnymi w określonych funkcjonalnych mikrodomenach kory nowej. Po pierwsze, obrazowanie optyczne sygnału wewnętrznego służy do uzyskania mapy funkcjonalnej. Następnie mikroskopia dwufotonowa jest używana do oznaczania i obrazowania neuronów w mikrodomenie mapy.

Celowane znakowanie neuronów w specyficznej funkcjonalnej mikrodomenie kory nowej poprzez połączenie sygnału wewnętrznego i obrazowania dwufotonowego

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

Ogólnym celem tej procedury jest precyzyjne celowanie w mikrodomeny na mapie funkcjonalnej w celu zbadania struktury i funkcji neuronów w wysokiej rozdzielczości. Osiąga się to poprzez wykonanie najpierw obrazowania sygnału wewnętrznego na dużym obszarze kory mózgowej w celu uzyskania mapy interesującej nas cechy bodźca. Drugim krokiem jest określenie dokładnej lokalizacji na mapie, która ma być celem obrazowania fotonowego w wysokiej rozdzielczości.Następnie, po dokładnym ustawieniu pipety załadowanej barwnikiem fluorescencyjnym, neurony są znakowane markerem fluorescencyjnym. Na koniec zbierane są obrazy o wysokiej rozdzielczości do fotonów odpowiedzi lub struktur neuronalnych. Ostatecznie, mapa cech sygnału wewnętrznego może być wykorzystana do znalezienia obszaru zainteresowania, takiego jak osobliwość wiatraczka o orientacji, która może być następnie skierowana do badania w rozdzielczości pojedynczego neuronu.Główną zaletą tego protokołu jest to, że można obrazować korę mózgową w różnych skalach przestrzennych przy użyciu tej samej konfiguracji mikroskopu przy użyciu tylko kilku szybkich korekt systemu. Pozwala to na połączenie tych technik w celu wykorzystania mapy sygnału we

targeted-labeling-neurons-specific-functional-micro-domain-neocortex

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Celowe oznakowanie neuronów w określonym funkcjonalnym mikrodomenie neokorteksu poprzez łączenie obrazowania sygnału intrinsycznego i dwufotonowego

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neocortex, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. Dwufotonowy obrazowanie wapnia in-vivo jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy

Niniejszy artykuł przedstawia podejście łączące fotostymulację za pomocą skanowania laserowego z rejestracją z całej komórki u myszy transgenicznych wykazujących ekspresję GFP w ograniczonych populacjach neuronów hamujących. Technika ta umożliwia szerokie mapowanie i analizę ilościową lokalnych obwodów synaptycznych specyficznych hamujących neuronów kory mózgowej.

Mapowanie hamujących obwodów neuronalnych za pomocą fotostymulacji skanującej laserowo

Transport retrogradny barwnika fluorescencyjnego pozwala na oznakowanie subpopulacji neuronów na podstawie projekcji anatomicznej. Oznakowane aksony mogą być celowane wizualnie in vivo, co umożliwia rejestrację pozakomórkową z zidentyfikowanych aksonów. Technika ta ułatwia rejestrację w przypadkach, gdy neurony nie mogą zostać oznakowane poprzez manipulacje genetyczne lub gdy ich izolacja za pomocą „ślepych” metod in vivo jest utrudniona.

Retrogradne znakowanie fluorescencyjne umożliwia ukierunkowaną zewnątrzkomórkową rejestrację pojedynczych jednostek z zidentyfikowanych neuronów in vivo

Zależne od doświadczenia zmiany molekularne w neuronach są niezbędne dla zdolności mózgu do adaptacji w odpowiedzi na wyzwania behawioralne.  Opisano tutaj metodę obrazowania dwufotonowego in vivo, która umożliwia śledzenie takich zmian molekularnych w poszczególnych neuronach korowych za pomocą genetycznie kodowanych reporterów.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie zależnych od doświadczenia zmian molekularnych w neuronach korowych

Obrazowanie poklatkowe u żywego zwierzęcia dostarcza cennych informacji na temat reorganizacji strukturalnej w nienaruszonym mózgu. Tutaj wprowadzamy preparat z rozcieńczoną czaszką, który umożliwia przezczaszkowe obrazowanie znakowanych fluorescencyjnie struktur synaptycznych w żywej korze myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Dwufotonowe obrazowanie in vivo kolców dendrytycznych w korze myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką

Opisujemy połączenie ogniskowej fotoaktywacji związków neuroaktywnych wywołanej promieniowaniem UV z całokomórkowym patch-clampem i wielofotonowym obrazowaniem wewnątrzkomórkowych tranustów sodu w dendrytach i kolcach neuronów hipokampa w ostrych wycinkach tkanki mózgu myszy.

Wielofotonowe wewnątrzkomórkowe obrazowanie sodu w połączeniu z ogniskowym rozpakowywaniem glutaminianu za pośrednictwem promieniowania UV w neuronach piramidowych CA1

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Prezentujemy metodę łączącą zapisy z całokomórkowego patch-clampu i obrazowania dwufotonowego w celu zarejestrowania stanów przejściowych Ca2+ w dendrytach neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia w dendrytach neuronalnych w wycinkach mózgu

Tutaj opisujemy procedurę oczyszczania tkanek, znakowania fluorescencyjnego i wielkoskalowego obrazowania tkanki mózgowej myszy, która umożliwia wizualizację trójwymiarowej organizacji typów komórek w korze nowej.

Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy

Po zintegrowaniu z płytą czołową i konstrukcją optyczną kompatybilną zarówno z mikroskopami jedno-, jak i dwufotonowymi, soczewka mikropryzmatyczna daje znaczącą przewagę w pomiarze odpowiedzi neuronalnych w pionowej kolumnie w różnych warunkach, w tym w dobrze kontrolowanych eksperymentach w stanach skupienia na głowie lub naturalnych zadaniach behawioralnych u swobodnie poruszających się zwierząt.

Długoterminowe obrazowanie zidentyfikowanych populacji neuronów za pomocą mikropryzmatów u zwierząt swobodnie poruszających się i z unieruchomioną głową

Ten protokół dostarcza kompleksowego opisu metody jednoczesnego rejestrowania sygnałów wapniowych z neuronów i astrocytów w wielu obszarach mózgu związanych z pamięcią i demonstruje jej zastosowanie w paradygmacie zachowania uczenia się i pamięci.

Metoda fotometrii światłowodowej dwukolorowej do rejestracji aktywności astrocytów-neuronów w wielu regionach mózgu podczas nauki i zachowań pamięciowych

Poznaj metodę znakowania neuronów w mikrodomenach kory nowej przy użyciu obrazowania sygnału wewnętrznego i mikroskopii dwufotonowej. Technika umożliwia badanie struktury i funkcji neuronów w wysokiej rozdzielczości.

Celowane znakowanie neuronów w specyficznej funkcjonalnej mikrodomenie kory nowej poprzez połączenie sygnału wewnętrznego i obrazowania dwufotonowego (Wideo) | JoVE Journal

Celowane znakowanie neuronów w specyficznej funkcjonalnej mikrodomenie kory nowej poprzez połączenie sygnału wewnętrznego i obrazowania dwufotonowego

Przeglądaj więcej filmów