Celowane znakowanie neuronów w specyficznej funkcjonalnej mikrodomenie kory nowej poprzez połączenie sygnału wewnętrznego i obrazowania dwufotonowego

Ogólnym celem tej procedury jest precyzyjne celowanie w mikrodomeny na mapie funkcjonalnej w celu zbadania struktury i funkcji neuronów w wysokiej rozdzielczości. Osiąga się to poprzez wykonanie najpierw obrazowania sygnału wewnętrznego na dużym obszarze kory mózgowej w celu uzyskania mapy interesującej nas cechy bodźca. Drugim krokiem jest określenie dokładnej lokalizacji na mapie, która ma być celem obrazowania fotonowego w wysokiej rozdzielczości.

Następnie, po dokładnym ustawieniu pipety załadowanej barwnikiem fluorescencyjnym, neurony są znakowane markerem fluorescencyjnym. Na koniec zbierane są obrazy o wysokiej rozdzielczości do fotonów odpowiedzi lub struktur neuronalnych. Ostatecznie, mapa cech sygnału wewnętrznego może być wykorzystana do znalezienia obszaru zainteresowania, takiego jak osobliwość wiatraczka o orientacji, która może być następnie skierowana do badania w rozdzielczości pojedynczego neuronu.

Główną zaletą tego protokołu jest to, że można obrazować korę mózgową w różnych skalach przestrzennych przy użyciu tej samej konfiguracji mikroskopu przy użyciu tylko kilku szybkich korekt systemu. Pozwala to na połączenie tych technik w celu wykorzystania mapy sygnału wewnętrznego o rozdzielczości kursu jako przewodnika przy wyborze regionu neuronów do oznaczenia za pomocą sond fluorescencyjnych w celu obrazowania o wysokiej rozdzielczości. Zwierzę zostało znieczulone zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami, a czaszka została odsłonięta i oczyszczona.

Mieszanka cementu dentystycznego została użyta do przymocowania płyty głowicy ze stali nierdzewnej z prostokątnym otworem pośrodku do czaszki. Metalowa komora na górze płyty głowicy służy jako zbiornik do obrazowania za pomocą soczewki obiektywu zanurzonego w wodzie. Płyta czołowa została zamocowana na stoliku XY za pomocą metalowych słupków.

Użyj wiertła dentystycznego, aby rozrzedzić duży obszar kości w prostokątnym otworze płyty głowy. Stosowanie wosków kostnych potrzebne do zatrzymania sporadycznych krwawień. Cienki obszar musi wystawać poza granice planowanej kraniotomii.

Następnie wywierć kwadratowy kontur o wymiarach dwa na dwa milimetry w kości do kraniotomii. Okresowo płukać komorę świeżym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, aby usunąć odłamki kości i zminimalizować rozpraszanie ciepła do leżącej poniżej kory. Teraz podnieś kość za pomocą kleszczy numer trzy.

Użyj kleszczy numer pięć i nożyczek sprężynowych Vana, aby usunąć górne warstwy opony twardej, pozostawiając dolną warstwę nienaruszoną. Ostatnia warstwa opony twardej jest przezroczysta, a naczynia skórne powinny być przez nią wyraźnie widoczne. Nałóż kroplę ciepłego 2%aeros rozpuszczonego w płynie mózgowo-rdzeniowym A i natychmiast umieść szklankę nakrywkową na kraniotomii.

Po pierwsze, pianka żelowa nasączona płynem rdzeniowym A na zewnątrz szkła nakrywkowego, aby zapobiec wysychaniu agros podczas wewnętrznego obrazowania sygnału. Następnie przymocuj kamerę CCG do obrazowania sygnału wewnętrznego do standardowego portu mocowania C na górze dwóch mikroskopów fotograficznych i umieść oświetlające źródło światła na stole powietrznym w pobliżu pozycji stolika XY i przymocuj światłowód do kraniotomii. Cofnij główny dichroik i zwierciadło poniżej portu podwodnego, tak aby odbite czerwone światło potrzebne do sygnałów wewnętrznych przeszło bezpośrednio z kraniotomii do kamery CCD.

Włóż filtr podczerwieni do ścieżki światła, aby zapobiec nagrzewaniu się kory. Następnie umieść filtr, który przepuszcza zielone światło i zapisz cyfrowy obraz referencyjny naczyń krwionośnych na powierzchni kory mózgowej. Następnie przesuń ognisko Z na 500 mikronów poniżej powierzchni kory mózgowej.

Zastąp zielony filtr czerwonym filtrem, aby oświetlić korę do pomiaru sygnałów wewnętrznych. Upewnij się, że kora jest równomiernie oświetlona. Osłoń kraniotomię przed światłem wytwarzanym przez wyświetlacz bodźca wzrokowego i przedstaw sekwencję bodźców wzrokowych oraz zapisz obrazy danych odbicia, aby wygenerować mapę orientacji W ciągu 10 minut zbierz dane odpowiadające czterem powtórzeniom sekwencji ośmiu bodźców o czterech orientacjach i dwóch kierunkach dla każdej orientacji.

Teraz przeanalizuj dane sygnału wewnętrznego, aby wygenerować mapę kolorów fałszywej orientacji, jak pokazano tutaj. Następnie wybierz potencjalne regiony docelowe do znakowania neuronów dwoma fotonami. Na przykład punkty orientacyjne osobliwości wiatraczka na mapie, w których zbiegają się wszystkie preferowane orientacje.

Następnie nałóż mapę orientacyjną i obraz unaczynienia powierzchni kory mózgowej i wykorzystaj układ domen funkcjonalnych oraz lokalizację dużych naczyń powierzchniowych, aby wybrać cel, unikając miejsc z dużymi naczyniami krwionośnymi i tętnicami. Przygotuj fluorescencyjne roztwory D i wyciągnij długą pipetę stożkową zgodnie z instrukcjami zawartymi w pisemnym protokole. Załaduj pięć mikrolitrów mieszaniny barwników do pipety.

Następnie usuń ostatnią warstwę opony twardej, aby ułatwić wprowadzenie pipety i uzyskać najwyższej jakości obrazy dwóch fotonów, jak pokazano na tym schemacie. Pipeta musi być wprowadzona do kory pod kątem 30 stopni, aby przejść między komorą a obiektywem. W związku z tym położenie na powierzchni kory mózgowej w miejscu wprowadzania pipety nie będzie znajdować się bezpośrednio nad docelowym obszarem zainteresowania.

Na przykład, aby oznaczyć obszar docelowy znajdujący się 200 mikronów poniżej powierzchni kory mózgowej, pozycja wejściowa pipety na powierzchni kory mózgowej będzie znajdować się około 350 mikronów w bok od pozycji docelowej. Przesuń stolik XY, aby wyśrodkować pozycję wejścia powierzchni korowej pod obiektywem 20 x lub 40 x. Gdy pozycja wejściowa zostanie wyśrodkowana pod celem, podnieś pozycję Z celu o dwa milimetry.

Następnie włącz zielone światło fluorescencyjne epi i wizualizuj czerwony barwnik Alexa w pipecie i przesuwaj pipetę, aż końcówka znajdzie się powyżej pozycji wejścia powierzchni korowej. Patrząc na końcówkę pipety przez okulary mikroskopu przy oświetleniu w jasnym polu, opuść pipetę, aż końcówka osiągnie żądane położenie wejściowe na powierzchni kory mózgowej. Następnie usuń obiektyw i użyj niestrzępiących się włóczni absorpcyjnych, aby usunąć nadmiar płynu mózgowo-rdzeniowego z kraniotomii i wysuszyć sąsiednią kość.

Następnie nałóż kroplę ciepłego 3% rose, rozpuszczonego w płynie mózgowo-rdzeniowym, aby ustabilizować korę. Gdy aros zastygnie, włóż obiektyw 40 x i ponownie napełnij komorę płynem mózgowo-rdzeniowym. Następnie użyj osi ukośnej mikromanipulatora, aby przesunąć pipetę, aż końcówka osiągnie żądaną głębokość w korze.

Sporadyczne zaciągnięcia mieszaniny DI z wyrzutem ciśnienia zmniejszą prawdopodobieństwo, że końcówka pipety zatka się, gdy pipeta dotrze do warstwy drugiej, trzy małe zaciągnięcia mieszaniny DI oświetlą dodatkową przestrzeń komórkową i ujawnią gęste zgrupowanie okrągłych ciał komórkowych jako ciemne cienie do ładowania ciał neuronalnych w kuli kory o średnicy od 300 do 600 mikronów. Wstrzyknij mieszaninę Dix do przestrzeni zewnątrzkomórkowej za pomocą 30 do 90 impulsów. Każdy impuls jedna sekunda, od dwóch do 10 PSI.

Po zakończeniu wstrzyknięcia należy odczekać kilka minut, a następnie wyjąć pipetę i obiektyw. Fluorescencyjny wskaźnik wapnia zostanie w pełni wchłonięty przez neurony w ciągu jednej godziny. Na koniec usuń aros używany do pobierania i przepłucz komorę nagrywania.

Umieść małą kroplę od dwóch do 3%powstała na powierzchni i szybko umieść szklankę nakrywkową na kraniotomii. Włóż obiektyw o wysokim NA 20 x do uchwytu celu i wyśrodkuj oznaczony obszar korowy pod obiektywem. Za pomocą stolika XY osłoń kraniotomię przed zewnętrznymi źródłami światła i zbierz obrazy o wysokiej rozdzielczości znakowanych neuronów in vivo.

Alternatywnie, elektroporacja pojedynczych komórek może być wykorzystana do badania morfologii dendrytycznej lub funkcjonalnego obrazowania dendrytów. W tej metodologii DI są przygotowywane zgodnie z pisemnym protokołem. Następnie, w odpowiednim momencie procedury, końcówka pipety jest umieszczana w sąsiedztwie błony ciała komórki neuronalnej, a akso, za pomocą akso, stosuje się od jednego do trzech impulsów.

Natychmiastowe wypełnienie neuronu barwnikiem można łatwo uwidocznić za pomocą mikroskopii fotonowej. Ten obraz pokazuje obszar obrazowany dwoma fotonami pokazujący ciała komórek oznaczone fluorescencyjnym wskaźnikiem wapnia OGB 1:00 AM w korze wzrokowej warstwa druga trzy, pasek skali reprezentuje 100 mikronów. Ten obraz pokazuje preferencje orientacyjne poszczególnych ciał komórek neuronalnych z tego samego miejsca, które pokazano na poprzednim obrazie.

Zorganizowana mapa preferowanej orientacji bodźca jest widoczna wokół osobliwości wiatraczka, która była wyśrodkowana w obrazowanym obszarze. Tutaj widzimy mapę orientacji uzyskaną za pomocą obrazowania sygnału wewnętrznego. kwadrat odpowiada obszarowi pokazanemu na poprzednim obrazie z dwoma fotonami.

Ten obraz pokazuje dendryty i ciało komórki pojedynczego neuronu pokryte mapą orientacji. Neuron został poddany elektroporacji za pomocą Alexa floor 5 94 pod przewodnictwem dwóch fotonów. Ponieważ stos Z został zebrany in vivo, a procesy dendrytyczne były śledzone w trybie offline za pomocą oprogramowania neuro lucid.

Mapę orientacji uzyskano za pomocą obrazowania sygnału wewnętrznego przed elektroporacją pojedynczej komórki. Pasek skali reprezentuje 100 mikronów. Ta 10-mikronowa projekcja Z z pierwszej warstwy korowej pokazuje dendryty wierzchołkowe.

Czerwone strzałki pokazują kolce wzdłuż dendrytów, podczas gdy te 10-mikronowe wypustki Z z warstwy korowej dwie trzy pokazują dendryty podstawowe z kolcami oznaczonymi czerwonymi strzałkami i aksonami oznaczonymi białymi strzałkami. Metoda ta jest przydatna do badania map funkcjonalnych w korze mózgowej w różnych skalach przestrzennych oraz do precyzyjnego celowania w neurony w określonej dziedzinie zainteresowania. Na mapie zademonstrowaliśmy zastosowanie metody badania selektywnych map orientacji, ale można ją rozszerzyć na inne mapy cech wizualnych, takie jak siatkówka, toppy, dominacja oka i kierunek, lub na inne modalności sensoryczne, które mają funkcjonalnie zorganizowane mapy, takie jak te, które kodują odczucie somato lub słuch.