Name: Przygotowanie dojrzałych komórek dendrytycznych obciążonych antygenem nowotworowym do immunoterapii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Poznaj metodę przygotowania dojrzałych komórek dendrytycznych do immunoterapii nowotworowej z wykorzystaniem cytokin GM-CSF i IL-4. Technika ta umożliwia generowanie klinicznych szczepionek komórkowych z monocytów pacjenta.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Andresowi Salazarowi (Oncovir, Inc.) za dar Poly-ICLC.

1. Izolacja i kriokonserwacja PBMC 4
<ol>
	<li>Aseptyczne nakłucie jednego z portów dostępowych w worku do leukaferezy za pomocą zestawu do transferu osocza. Za pomocą strzykawki o pojemności 60 ml przenieść otrzymaną od pacjentów leukaferezę do sterylnej butelki o pojemności 500 ml.</li>
	<li>Dostosuj objętość leukaferezy do 2x jej pierwotnej objętości za pomocą RPMI w temperaturze pokojowej. Dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj butelkę Ficoll-Paque PLUS. Dodać 12 ml Ficoll-Paque PLUS do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Delikatnie nałożyć 30 ml rozcieńczonego produktu do leukaferezy na każdą sterylną probówkę stożkową o pojemności 50 ml zawierającą Ficoll. Należy uważać, aby nie zakłócić interfejsu między Ficollem a zawiesiną komórkową.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 1.3 i 1.4, aż cała leukafereza zostanie nałożona warstwami.</li>
	<li>Odwirować stożkowe probówki o pojemności 50 ml o masie 1 000 × g przez 20 minut w temperaturze pokojowej bez hamowania.</li>
	<li>Ostrożnie zebrać mętną warstwę PBMC z każdej probówki i przenieść do nowych sterylnych probówek o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodaj RPMI do każdej probówki do końcowej objętości 50 ml. Delikatnie wymieszaj przez odwrócenie.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 500 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C z pełnym hamowaniem.</li>
	<li>Usunąć supernatanty z każdej probówki. Ponownie zawiesić granulki komórek z każdej probówki i dodać RPMI do końcowej objętości 50 ml. Delikatnie wymieszaj przez odwrócenie.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 500 × g przez 6 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatanty z każdej probówki. Zawiesić i połączyć zawiesiny komórek w jednej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Zwiększ objętość połączonych PBMC do 50 ml przy większej prędkości obrotowej. Delikatnie wymieszaj przez odwrócenie.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 300 × g przez 6 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 50 ml RPMI. Delikatnie wymieszaj, aby uzyskać równomierną zawiesinę komórek.</li>
	<li>Policz liczbę komórek i określ ich żywotność. Oblicz całkowitą liczbę żywotnych komórek.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 300 × g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Przygotować pożywkę do zamrażania. Pożywka do zamrażania składa się z 10% sulfotlenku dimetylu (DMSO; Miltenyi Biotec) w ludzkiej surowicy AB (Valley Biomedical).</li>
	<li>Usunąć supernatant. Zawiesić komórki w końcowym stężeniu 2 x 108 komórek/ml w zimnym roztworze do zamrażania.</li>
	<li>Przygotować 1 ml porcji w 1,8 ml kriowialiach.</li>
	<li>Przenieś kriowiale do zamrażarki o kontrolowanej szybkości i rozpocznij proces zamrażania, Program 1. Pod koniec cyklu należy natychmiast przenieść zamrożone kriowiale do fazy gazowej zamrażarki z ciekłym azotem.</li>
</ol>
2. Dzień 0: Różnicowanie komórek dendrytycznych od monocytów
<ol>
	<li>Dodać 30 ml RPMI/1% osocza autologicznego do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Rozmrozić podwielokrotności zamrożonych PBMC przez delikatne mieszanie w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Po całkowitym rozmrożeniu przenieść zawartość fiolek do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Odwirowywać komórki przez 6 minut w temperaturze 500 × g w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki w małej objętości plazmy autologicznej RPMI/1%. Następnie dodać więcej RPMI/1% osocza autologicznego do końcowej objętości 50 ml. Dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Ponownie odwirować komórki przez 6 minut w temperaturze 500 × g w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 50 ml RPMI/1% osocza autologicznego. Dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Policz liczbę komórek i określ ich żywotność. Oblicz całkowitą liczbę żywotnych komórek.</li>
	<li>Płytka 1,40 x 108 komórek w 40 ml RPMI/1% osocza autologicznego na 225 cm2 EasyFlask. Powtarzaj, aż wszystkie komórki zostaną pokryte.</li>
	<li>Inkubować kolby EasyFlask płasko na boku przez 1-2 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych zawierających 5% CO2 , aby monocyty mogły przylegać do kolby.</li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji wyjąć kolbę EasyFlask z inkubatora i umyć ją dwukrotnie, aby usunąć nieprzylegające komórki, używając 30 ml wstępnie podgrzanego RPMI.</li>
	<li>Po drugim przemyciu dodać 40 ml RPMI/1% osocza autologicznego z 400-1 000 IU/ml IL-4 i 100-1 000 IU/ml GM-CSF 5-8. W tym protokole używamy 400 j.m./ml IL-4 i 100 j.m./ml GM-CSF.</li>
	<li>Inkubować kolby EasyFlask przez 2 dni w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych zawierających 5% CO2 .</li>
</ol>
3. Dzień 2: Karmienie komórek dendrytycznych IL-4 i GM-CSF
<ol>
	<li>Dodać 4 ml RPMI/1% osocza autologicznego z 400-1 000 j.m./ml IL-4 i 100-1 000 j.m./ml GM-CSF do każdej kolby EasyFlask. Mieszaj, wirując i kołysząc na boku.</li>
	<li>Inkubować kolby EasyFlask jeszcze przez 3 dni (do dnia 5) w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych zawierających 5% CO2 .</li>
</ol>
4. Dzień 5: Pobieranie niedojrzałych komórek dendrytycznych
<ol>
	<li>Zebrać kultury, energicznie obracając kolbami i pipetując w górę i w dół, aby ponownie zawiesić nieprzylegające i luźno przylegające komórki. Pobrane komórki przenieść do nowych stożkowych probówek o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirować probówki o masie 500 × g przez 6 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatanty i ponownie zawiesić osad komórkowy w 50 ml RPMI/1% osocza autologicznego. Dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Policz liczbę komórek i określ ich żywotność. Oblicz całkowitą liczbę żywotnych komórek.</li>
	<li>Odwirować probówki o masie 500 × g przez 6 minut w temperaturze pokojowej. Płytka 1-2 x 106 komórek na basenik w 3 ml RPMI/1% osocza autologicznego z 400 j.m./ml IL-4 i 100 j.m./ml GM-CSF na 6-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych zawierających 5% CO2 przez noc.</li>
</ol>
5. Dzień 6: Dojrzewanie i ładowanie antygenem komórek dendrytycznych
<ol>
	<li>Dodać 10 μg/ml KLH do 1/3 studzienek w 6-dołkowych płytkach hodowlanych. Zakręć talerzami, aby wymieszać. KLH dodaje się tylko do 1/3 studzienek, ponieważ KLH jest używany tylko do pierwszej szczepionki DC. Kolejne szczepionki DC zawierają tylko peptydy antygenu nowotworowego.</li>
	<li>DC mogą być stymulowane do dojrzewania za pomocą różnych bodźców. Najczęstszym bodźcem dojrzewania, który był stosowany w badaniach klinicznych, był koktajl cytokin (IL-1 β, TNFα i IL-6) oraz prostaglandyny E2 (PGE2) 9,10. Ostatnio popularność zyskało stosowanie agonistów receptora Toll-podobnego (TLR) 11,12. W tym protokole dodaj 2 mg / ml kwasu poliinozyno-policytydylowego-poli-L-lizyny karboksymetylocelulozy (Poly-ICLC) do studzienek i dobrze wymieszaj. Poly-ICLC to kliniczny preparat Poly-IC, który jest stabilizowany poli-L-*-lizyną i karboksymetylocelulozą (wytwarzaną przez Oncovir, Inc.).</li>
	<li>Dodać 100 μg/ml długich antygenów peptydowych (NY-ESO-1 i/lub Melan-A/MART-1) do wyznaczonych dołków, przy czym każdy studzienka otrzymuje tylko jeden peptyd, aby uniknąć konkurencji krzyżowej 13.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych zawierających 5% CO2 O/N.</li>
</ol>
6. Dzień 7: Kriokonserwacja komórek dendrytycznych
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór do zamrażania DC przy użyciu autologicznego osocza i 10% DMSO. Odwirować roztwór do zamrażania prądu stałego o stężeniu 2 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia wszelkich cząstek stałych. Przenieść supernatant do nowej, oznakowanej probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji przez noc zbierz i połącz wszystkie studzienki zawierające DC pulsujące z peptydami w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirować probówki o stężeniu 500 × g przez 6 minut. Usunąć supernatanty. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml RPMI/1% osocza autologicznego. Zwiększ całkowitą objętość do 50 ml za pomocą RPMI/1% osocza autologicznego. Dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Policz liczbę komórek i określ ich żywotność. Oblicz całkowitą liczbę żywotnych komórek.</li>
	<li>Odwirować probówki o masie 500 × g przez 6 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatanty i ponownie zawiesić każdą osadkę w 5 ml sterylnego 0,9% NaCl, USP i przenieść do nowych stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Doprowadzić zawiesinę każdej komórki do 14 ml z bardziej sterylnym 0,9% NaCl, USP. Zakryj i wymieszaj przez odwrócenie.</li>
	<li>Powtórz poprzedni krok dwa razy. Po ostatnim odwirowaniu usunąć supernatanty, zbliżając się jak najbliżej granulek komórkowych bez naruszania osadów.</li>
	<li>Zawiesić granulki komórek w roztworze do zamrażania prądu stałego przy 4 - 20 x 106 komórek/ml i podać 1 ml na każdą fiolkę CryoTube o pojemności 1,8 ml.</li>
	<li>Użyj zamrażarki o kontrolowanej szybkości, Program 1, aby zamrozić porcje szczepionek DC i natychmiast przenieść do fazy gazowej zamrażarki z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>
7. Testowanie wydania partii
<ol>
	<li>Każda partia szczepionki DC musi zostać oceniona i spełnić określone kryteria zwolnienia serii (Tabela 1) przed dopuszczeniem do obrotu w celu wstrzyknięcia pacjentom biorącym udział w badaniu, zwykle 5 do 6 tygodni po przygotowaniu szczepionki.</li>
	<li>Żywotność: Oceń żywotność szczepionki DC za pomocą automatycznego licznika komórek. Minimalna akceptowalna specyfikacja żywotności wynosi >70%.</li>
	<li>Tożsamość: Oceń tożsamość dojrzałych DC (CD11c+CD14-CD83+) za pomocą cytometrii przepływowej. Odsetek komórek CD11c+ powinien wynosić >50%. Procent komórek CD11c+ i CD14+ powinien wynosić <30%, a procent komórek CD11c+, CD14- i CD83+ powinien wynosić >50%.</li>
	<li>Sterylność: Przetestuj szczepionkę DC na obecność bakterii i grzybów beztlenowych i tlenowych poprzez bezpośrednią hodowlę i barwienie metodą Grama. Oceń obecność mykoplazmy za pomocą systemu hodowli bezpośredniej i testu barwienia fluorochromu DNA ze wskaźnikową linią komórkową. W przypadku tych testów minimalny zestaw specyfikacji jest taki, że nie obserwuje się wzrostu we wszystkich kulturach.</li>
	<li>Endotoksyna: Ocenić zawartość endotoksyn za pomocą kinetycznego chromogennego testu LAL Kinetic-QCL i musi ona wynosić < 50 EU/ml, aby spełnić minimalne kryteria.</li>
	<li>Funkcja: Oceń funkcję DC w mieszanej reakcji limfocytów przez inkubację z allogenicznymi limfocytami T. Stwierdzono obecność proliferacji w porównaniu z niestymulowanymi DC (ryc. 3).</li>
</ol>

<ol><li>Lesterhuis, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+vaccines+in+melanoma%3A+from+promise+to+proof%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Oncol.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).</li>
<li>Sabado, R. L., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+dendritic+cell+immunotherapy+towards+successful+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment.</a> Immunotherapy. 2, 37-56 (2010).</li>
<li>Schumacher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keyhole+limpet+hemocyanin+%28KLH%29+conjugate+vaccines+as+novel+therapeutic+tools+in+malignant+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer.+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate vaccines as novel therapeutic tools in malignant disorders.</a> J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 127, Suppl 2. 1-2 (2001).</li>
<li>Jaatinen, T., Laine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+from+human+cord+blood+by+Ficoll-Paque+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. Chapter 2, Unit 2A 1(2007).</li>
<li>Eichler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+study+on+in+vitro+characterization+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Multicenter study on in vitro characterization of dendritic cells.</a> Cytotherapy. 10, 21-29 (2008).</li>
<li>Feuerstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+production+of+cryopreserved+aliquots+of+antigen-preloaded%2C+mature+dendritic+cells+ready+for+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for the production of cryopreserved aliquots of antigen-preloaded, mature dendritic cells ready for clinical use.</a> J. Immunol. Methods. 245, 15-29 (2000).</li>
<li>O'Neill, D., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+autologous+peptide-+and+protein-pulsed+dendritic+cells+for+patient-specific+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of autologous peptide- and protein-pulsed dendritic cells for patient-specific immunotherapy.</a> Methods Mol. Med. 109, 97-112 (2005).</li>
<li>de Vries, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypical+and+functional+characterization+of+clinical+grade+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Phenotypical and functional characterization of clinical grade dendritic cells.</a> J. Immunother. 25, 429-438 (2002).</li>
<li>Jonuleit, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+cytokines+and+prostaglandins+induce+maturation+of+potent+immunostimulatory+dendritic+cells+under+fetal+calf+serum-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions.</a> Eur. J. Immunol. 27, 3135-3142 (1997).</li>
<li>Lee, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+grade+cocktail+of+cytokines+and+PGE2+results+in+uniform+maturation+of+human+monocyte-derived+dendritic+cells%3A+implications+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">A clinical grade cocktail of cytokines and PGE2 results in uniform maturation of human monocyte-derived dendritic cells: implications for immunotherapy.</a> Vaccine. 20, Suppl 4. A8-A22 (2002).</li>
<li>Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+immune+system+to+treat+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Harnessing the immune system to treat cancer.</a> J. Clin. Invest. 117, 1130-1136 (2007).</li>
<li>Gnjatic, S., Sawhney, N. B., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+agonists%3A+are+they+good+adjuvants%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+J%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor agonists: are they good adjuvants?</a> Cancer J. 16, 382-391 (2010).</li>
<li>Kedl, R. M., Kappler, J. W., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+dominance%2C+competition+and+T+cell+affinity+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epitope dominance, competition and T cell affinity maturation.</a> Curr. Opin. Immunol. 15, 120-127 (2003).</li>
<li>Bogunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR4+engagement+during+TLR3-induced+proinflammatory+signaling+in+dendritic+cells+promotes+IL-10-mediated+suppression+of+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">TLR4 engagement during TLR3-induced proinflammatory signaling in dendritic cells promotes IL-10-mediated suppression of antitumor immunity.</a> Cancer Research. 71, 5467-5476 (2011).</li>
<li>Verdijk, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyriboinosinic+polyribocytidylic+acid+%28poly%28I%3AC%29%29+induces+stable+maturation+of+functionally+active+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Polyriboinosinic polyribocytidylic acid (poly(I:C)) induces stable maturation of functionally active human dendritic cells.</a> J. Immunol. 163, 57-61 (1999).</li>
<li>Rouas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28I%3AC%29+used+for+human+dendritic+cell+maturation+preserves+their+ability+to+secondarily+secrete+bioactive+IL-12%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Poly(I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive IL-12.</a> Int. Immunol. 16, 767-773 (2004).</li>
<li>Jongmans, W., Tiemessen, D. M., van Vlodrop, I. J., Mulders, P. F., Oosterwijk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th1-polarizing+capacity+of+clinical-grade+dendritic+cells+is+triggered+by+Ribomunyl+but+is+compromised+by+PGE2%3A+the+importance+of+maturation+cocktails%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Th1-polarizing capacity of clinical-grade dendritic cells is triggered by Ribomunyl but is compromised by PGE2: the importance of maturation cocktails.</a> J. Immunother. 28, 480-487 (2005).</li>
<li>Krause, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+is+a+key+factor+for+monocyte-derived+dendritic+cell+maturation%3A+enhanced+T+cell+stimulatory+capacity+despite+IDO%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 is a key factor for monocyte-derived dendritic cell maturation: enhanced T cell stimulatory capacity despite IDO.</a> J. Leukoc. Biol. 82, 1106-1114 (2007).</li>
<li>Morelli, A. E., Thomson, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+under+the+spell+of+prostaglandins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells under the spell of prostaglandins.</a> Trends Immunol. 24, 108-111 (2003).</li>
<li>Adams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+%28DC%29+based+therapy+for+cervical+cancer%3A+use+of+DC+pulsed+with+tumour+lysate+and+matured+with+a+novel+synthetic+clinically+non-toxic+double+stranded+RNA+analogue+poly+%5BI%5D%3Apoly+%5BC%2812%29U%5D+%28Ampligen+R%29%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell (DC) based therapy for cervical cancer: use of DC pulsed with tumour lysate and matured with a novel synthetic clinically non-toxic double stranded RNA analogue poly [I]:poly [C(12)U] (Ampligen R).</a> Vaccine. 21 (12), 787-790 (2003).</li>
<li>Colombo, M. P., Trinchieri, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-12+in+anti-tumor+immunity+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 13, 155-168 (2002).</li>
<li>Mayordomo, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+dendritic+cells+pulsed+with+synthetic+tumour+peptides+elicit+protective+and+therapeutic+antitumour+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity.</a> Nat Med. 1, 1297-1302 (1995).</li>
<li>Dhodapkar, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+broad+T-cell+immunity+in+humans+after+a+single+injection+of+mature+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of broad T-cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells.</a> J. Clin. Invest. 104, 173-180 (1999).</li>
<li>Schuler-Thurner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+induction+of+tumor-specific+type+1+T+helper+cells+in+metastatic+melanoma+patients+by+vaccination+with+mature%2C+cryopreserved%2C+peptide-loaded+monocyte-derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid induction of tumor-specific type 1 T helper cells in metastatic melanoma patients by vaccination with mature, cryopreserved, peptide-loaded monocyte-derived dendritic cells.</a> J. Exp. Med. 195, 1279-1288 (2002).</li>
</ol>

Autorzy otrzymali wsparcie finansowe od: NIH (AI061684, AI071078, AI044628 i K08 AI084578 (Miller)), Fundacji Billa i Melindy Gatesów, Fundacji Charytatywnej Doris Duke, Instytutu Badań nad Rakiem, Alliance for Lupus Research oraz Emerald Foundation. Nina Bhardwaj jest współtwórczynią patentów związanych z przygotowaniem i wykorzystaniem komórek dendrytycznych do manipulowania odpornością. Autorzy nie mają żadnych innych istotnych powiązań ani powiązań finansowych z żadną organizacją lub podmiotem mającym interes finansowy lub konflikt finansowy z tematyką lub materiałami omawianymi w manuskrypcie, poza tymi, które zostały ujawnione.

Badania kliniczne fazy I i II nad DC pochodzącymi z monocytów wykazały, że indukują one odpowiedź immunologiczną u pacjentów, jednak sukces kliniczny był ograniczony 1. Może to częściowo wynikać z braku konsensusu co do sposobu generowania optymalnych DC do stosowania w immunoterapii nowotworów. Chociaż istnieje wiele sposobów generowania DC stopnia klinicznego, metody te różnią się pod względem wykorzystania cytokin używanych do różnicowania monocytów, bodźców wykorzystywanych do indukowania dojrzewania oraz ...

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 pożywka z L-glutaminą</td><td>BioWhittaker</td><td>12-702F</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES buforowana sól fizjologiczna</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>BioWhittaker</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Albumina ludzka, 25% roztwór USP</td><td>Aventis Behring</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Hypaque PREMIUM</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka surowica AB</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna sól fizjologiczna USP</td><td>Hospira</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoMACS </td><td>DMSO Miltenyi Biotec</td><td>170-076-303</td><td></td></tr><tr><td>Leukine GM-CSF, 0,5 mg/ml</td><td>Berlex</td><td>A02266</td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP IL-4</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-101</td><td></td></tr><tr><td>Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml</td><td>Oncovir</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>VACMUNE KLH</td><td>Biosyn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>225 cm kwadratowych EasyFlask</td><td>Nalgene Nunc</td><td>159934</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>Becton Dickinson</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>1,8 ml Fiolki CryoTube</td><td>Nalgene Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>Thermo</td><td></td><td>CryoMed</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie dojrzałych komórek dendrytycznych obciążonych antygenem nowotworowym do immunoterapii

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Chociaż badania kliniczne wykazały, że szczepionki DC z ładunkiem antygenu są bezpieczną i obiecującą terapią nowotworów 1, ich skuteczność kliniczna nie została jeszcze ustalona. Opisana poniżej metoda, przygotowana zgodnie z wytycznymi Dobrego Procesu Wytwarzania (GMP), jest optymalizacją najpowszechniejszej metody przygotowania ex vivo do generowania dużej liczby DC do badań klinicznych 2.
Nasza metoda wykorzystuje syntetyczny agonista TLR 3 Polyinozyno-Polycytidylowo-Kwas-poli-L-lizyna Karboksymetyloceluloza (Poli-ICLC) do stymulacji DCs. Nasze poprzednie badanie wykazało, że Poly-ICLC jest najsilniejszym indywidualnym bodźcem dojrzewania dla ludzkich DC, co oceniano na podstawie regulacji w górę CD83 i CD86, indukcji interleukiny-12 (IL-12), czynnika martwicy nowotworu (TNF), białka 10 indukowanego interferonem gamma (IP-10), interleukminy 1 (IL-1) i interferonów typu I (IFN) oraz minimalnej produkcji interleukiny 10 (IL-10).
DC różnią się od zamrożonych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) uzyskanych w wyniku leukaferezy. PBMC są izolowane przez wirowanie w gradiacji Ficoll i zamrażane w podwielokrotnościach. W dniu 1 PBMC rozmraża się i posiewa na kolbach do hodowli tkankowych w celu wyselekcjonowania monocytów, które przylegają do powierzchni tworzywa sztucznego po 1-2 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych. Po inkubacji limfocyty są zmywane, a przylegające monocyty są hodowane przez 5 dni w obecności interleukiny-4 (IL-4) i czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF) w celu różnicowania się do niedojrzałych DC. W dniu 6 niedojrzałe DC są pulsowane białkiem hemocyjaniny przez dziurkę od klucza (KLH), które służy jako kontrola jakości szczepionki i może zwiększyć immunogenność szczepionki 3. DC są stymulowane do dojrzewania, ładowane antygenami peptydowymi i inkubowane przez noc. W dniu 7 komórki są myte i zamrażane w 1 ml podwielokrotnościach zawierających 4-20 x 106 komórek przy użyciu zamrażarki o kontrolowanej szybkości. Przeprowadza się testy uwalniania partii dla partii DC, które muszą spełniać minimalne specyfikacje przed wstrzyknięciem ich pacjentom.

Pod koniec okresu hodowli od 10 do 20% wyjściowych PBMC różnicuje się w komórki dendrytyczne (DC). Dojrzałe komórki DC są CD11c+, CD14-, CD83+, CD40+ oraz CCR7+ (Rysunek 1). Wykazują one wysoką ekspresję cząsteczek MHC klasy I i II oraz cząsteczek kostymulujących CD80 i CD86. Poly-ICLC indukuje również niższe poziomy PDL-1 w porównaniu do innych agonistów TLR 14. Ponadto te dojrzałe pod wpływem Poly-IC komórki DC wydzielają duże ilości IL-12 (Rysunek 2 oraz 15,16) i...

Opisano najczęściej używaną metodę generowania dużej liczby autologicznych komórek dendrytycznych (DC) do wykorzystania w immunoterapii nowotworów. Metoda wykorzystuje IL-4 i GM-CSF do różnicowania DC od monocytów. Niedojrzałe DC są stymulowane do dojrzewania, a następnie ładowane antygenami przed wstrzyknięciem z powrotem pacjentowi.

Przygotowanie dojrzałych komórek dendrytycznych obciążonych antygenem nowotworowym do immunoterapii

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie procesu przygotowania komórek dendrytycznych klasy klinicznej do immunoterapii. Jest to realizowane poprzez zamrożenie komórek mononuklearnych krwi obwodowej wyizolowanych podczas leukaferezy. W drugim kroku zamrożone alikwoty PBMC są rozmrażane, a monocyty są różnicowane w komórki dendrytyczne w obecności G-M-C-S-F oraz IL-4 przez pięć dni.Następnie komórki dendrytyczne są zbierane, pulsowane peptydami i dojrzewane przez noc z użyciem agonisty TLR3 poly ICLC. W ostatnim kroku dojrzałe komórki dendrytyczne są zbierane i mrożone w aliquotach. Te zamrożone aliquoty dojrzałych komórek dendrytycznych mogą być rozmrażane, przenoszone do strzykawek i wstrzykiwane z powrotem pacjentom w ramach ich immunoterapii.Procedurę zademonstrują Sedia i Farra Hassan, technicy badawczy w moim laboratorium. Używając zestawu do transferu plazmy, należy rozpocząć od aseptycznego nakłucia jednego z portów dostępowych w worku z leukaferezą. Następnie, za pomocą strzykawki 60 ml, należy przenieść leukaferezę do sterylnej butelki 500 ml. Następnie, używając medium RPMI w temperaturze pokojowej, należy dostosować objętość leukaferezy do dwukrotności jej objętości pierwotnej i dokładnie wymieszać. Po delikatnym wymieszaniu butelki z fial pack plus należy dodać 12 ml roztworu do sterylnych probówek stożkowych 50 ml, a następnie ostrożnie nalać 30 ml rozcieńczonego produktu leukaferezy do każdej probówki z fial.Należy uważać, aby nie zakłócić granicy między warstwą Ficoll a zawiesiną komórek. Wirować probówki przez 20 minut przy 1000 GS w temperaturze pokojowej, bez hamowania. Następnie ostrożnie zebrać zmętniałą warstwę pbmc z każdej probówki i przenieść ją do nowych sterylnych probówek o pojemności 50 ml.Następnie do każdej probówki dodaje się RPMI do uzyskania objętości końcowej 50 milliliters, a następnie delikatnie miesza zawiesiny komórkowe poprzez odwracanie probówek. Po wirowaniu komórek przez 10 minut przy 500 Gs i temperaturze czterech stopni Celsius, z każdej probówki usuwa się nadsącz, a osady komórkowe z każdej probówki resuspendsuje w RPMI do objętości końcowej 50 milliliters. Po delikatnym wymieszaniu zawartości probówek poprzez odwracanie, określa się liczbę i żywotność komórek.Następnie odwiruj komórki i resuspenduj osad w świeżo przygotowanym medium do zamrażania do końcowego stężenia 2 × 10⁸ komórek/ml. Przenieś 1 ml roztworu komórek do probówek kriowych o pojemności 1,8 ml. Następnie umieść probówki kriowe w zamrażarce o kontrolowanej szybkości chłodzenia i rozpocznij proces zamrażania. Po zakończeniu procesu natychmiast przenieś zamrożone probówki kriowe do fazy gazowej zamrażarki z ciekłym azotem.Następnego dnia rozmrozić alikwoty zamrożonych pBMC w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając naczyniami. Po całkowitym rozmrożeniu przenieść zawartość fiolek do sterylnych stożkowych probówek o pojemności 50 ml zawierających 30 ml RPMI i plazmy autologicznej, a następnie odwirować. Ostrożnie resuspendować osad komórkowy w niewielkiej objętości RPMI z dodatkiem plazmy autologicznej.Następnie należy dodać więcej medium RPMI z plazmą autologiczną do uzyskania końcowej objętości 50 ml. Po dokładnym wymieszaniu zawiesin, 1,4 × 10⁸ komórek w 40 ml medium RPMI z plazmą autologiczną należy wysiać do kolby Easy o powierzchni 225 cm². Kolbę Easy należy inkubować w pozycji poziomej przez 1–2 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych z zawartością 5% CO2, aby umożliwić przyleganie monocytów do ścianek kolby. Po zakończeniu inkubacji kolbę Easy należy dwukrotnie przemyć 30 ml podgrzanego medium RPMI w celu usunięcia komórek nieprzylegających.Po drugim przemyciu do komórek należy dodać 40 mililitrów pożywki RPMI z dodatkiem autologicznej osocza z IL 4 i G-M-C-S-F, a następnie inkubować kolbę EASI przez dwa dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Pięć dni później kolby należy energicznie zamieszać oraz pipetować zawartość w górę i w dół w celu resuspensji. Nieprzywierające i słabo przywierające komórki przenosi się do nowych probówek stożkowych o pojemności 50 mililitrów.Po odwirowaniu komórek, osady komórkowe resuspendujemy w 50 mililitrach pożywki RPMI z dodatkiem autologicznej plazmy. Po wymieszaniu i ponownym wypłukaniu zawiesin komórkowych, wysiewamy od 1 do 2 × 10⁶ komórek na dołek w trzech mililitrach pożywki RPMI z autologiczną plazmą, IL-4 i G-M-CSF, korzystając z sześciodołkowych płytek do hodowli tkankowych. Następnie płytki inkubujemy w temperaturze 37°C w inkubatorze do hodowli tkankowych z zawartością 5% CO2 przez noc. Następnego dnia do jednej trzeciej dołków w sześciodołkowych płytkach hodowlanych dodajemy KLH w stężeniu 10 µg/ml i mieszamy płytki poprzez delikatne kołysanie.Następnie do dołków należy dodać poly ICLC w stężeniu 2 µg/mL i dokładnie wymieszać. Kolejnym krokiem jest dodanie antygenów długich peptydów w stężeniu 100 µg/mL do wyznaczonych dołków, przy czym do każdego dołka należy dodać tylko jeden peptyd, aby uniknąć konkurencji krzyżowej. Następnie płytki należy inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych z zawartością 5% CO2. Siódmego dnia należy zebrać i połączyć zawartość wszystkich dołków zawierających komórki dendrytyczne.W szóstym dniu poddano komórki impulsom elektrycznym z peptydami w nowych stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Po odwirowaniu komórek, osady komórkowe pobrano i zawieszono w 5 ml pożywki RPMI z autologiczną plazmą, a następnie uzupełniono całkowitą objętość do 50 ml pożywką RPMI z autologiczną plazmą i dokładnie wymieszano zawiesiny komórkowe. Po obliczeniu całkowitej liczby żywych komórek, probówki odwirowano, a każdy osad zawieszono w 5 ml jałowego chlorku sodu, a następnie każdą zawiesinę komórkową przemyto dwukrotnie w 14 ml jałowego chlorku sodu.Po każdym przemyciu, po drugim cyklu, wymieszaj zawartość probówek. Resuspenduj osady komórkowe w roztworze do zamrażania komórek dendrytycznych w stężeniu od 4 do 20 × 10⁶ komórek na mililitr, a następnie rozdziel po 1 ml każdej zawiesiny komórkowej do fiolek krioprobówek o pojemności 1,8 ml. Na koniec, korzystając z zamrażarki z kontrolowaną szybkością chłodzenia, zamroź alikwoty szczepionek z komórek dendrytycznych, a następnie niezwłocznie przenieś je do fazy gazowej zamrażarki z ciekłym azotem w celu długoterminowego przechowywania.Od 10 do 20% początkowej liczby BMCs różnicuje się w komórki dendrytyczne pod koniec okresu hodowli. Dojrzewanie komórek dendrytycznych w odpowiedzi na poly ICLC, reprezentowane przez pogrubione linie, oceniano na podstawie ekspresji CD 83, CD 40 oraz CCR seven i porównywano z niepobudzonymi komórkami dendrytycznymi reprezentowanymi przez odcienie szarości, co przedstawiono na tych wykresach słupkowych; poly IIC doprowadził do dojrzewania komórek dendrytycznych w tym eksperymencie, które zostały wyróżnicowane od trzech zdrowych dawców i wydzielają duże ilości IL six, IL eight, IL 12 oraz TNF alpha. Komórki te, dojrzałe pod wpływem poly ICLC, indukują również allogeniczną proliferację limfocytów T, co potwierdzono ekspresją CFSE, a także produkcją interferonu gamma po ich rozwoju.Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny immunologii do zbadania możliwości wykorzystania komórek dendrytycznych w immunoterapii nowotworów oraz chorób zakaźnych.

preparation-tumor-antigen-loaded-mature-dendritic-cells-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przygotowanie dojrzałych komórek dendrytycznych obciążonych antygenem guzowym do immunoterapii

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę różnicowania myeloidnych komórek dendrytycznych z szpiku kostnego myszy. Zaprezentowano izolację kości piszczelowej i udowej myszy oraz przetwarzanie szpiku kostnego. Pokazano zdjęcia obrazujące morfologię komórek przed i po różnicowaniu, a także schematy przedstawiające fenotyp komórek oraz produkcję IL-12 po dojrzewaniu z użyciem CpG.

Hodowla mieloidalnych komórek dendrytycznych z prekursorów szpiku kostnego

Prezentacja antygenu w wtórnych narządach limfatycznych przez komórki dendrytyczne jest kluczowa dla inicjacji adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej pośredniczonej przez limfocyty T. W niniejszej pracy demonstrujemy hodowlę mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego, ich aktywację oraz znakowanie do obrazowania dwufotonowego.

Generowanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego do zastosowań w obrazowaniu dwufotonowym

Oceniane na syngenetycznych immunokompetentnych gospodarzach, szczepionka z komórek dendrytycznych (DC) na bazie nowotworowych komórek macierzystych (CSC) wykazała znacznie wyższą odporność przeciwnowotworową niż tradycyjne szczepionki DC pulsujące z heterogenicznymi komórkami nowotworowymi.

Opracowanie nowej szczepionki z komórek dendrytycznych z wykorzystaniem komórek macierzystych czerniaka i raka płaskonabłonkowego

Niedojrzałe komórki dendrytyczne mogą być selektywnie różnicowane w tolerogenne lub dojrzałe komórki dendrytyczne, aby regulować równowagę między odpornością a tolerancją. W pracy przedstawiono sposób generowania z niedojrzałych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (moDC), tolerogennych in vitro i dojrzałych moDC, które różnią się fenotypami metabolicznymi.

Wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych o różnych fenotypach metabolicznych

DC (MoDC) pochodzące z monocytów może wykrywać niewielkie ilości cząsteczek związanych z niebezpieczeństwem i dlatego jest łatwo zapoczątkowane. Przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji MoDC z krwi i nowotworów oraz ich aktywacji za pomocą kompleksów immunologicznych, podkreślając jednocześnie kluczowe środki ostrożności, które należy wziąć pod uwagę, aby uniknąć ich przedwczesnej aktywacji.

Protokół izolacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów myszy i ich późniejsza aktywacja in vitro za pomocą nowotworowych kompleksów immunologicznych

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i charakterystyki tolerogennych komórek dendrytycznych (TolDCs) oraz oceny ich immunoterapeutycznej użyteczności.

Rozwój i charakterystyka funkcjonalna mysich tolerogennych komórek dendrytycznych

Urządzenie lub płytka do transimmunizacji (TI) i związane z nim protokoły zostały opracowane w celu odtworzenia kluczowych cech pozaustrojowej fotochemoterapii (ECP), w warunkach eksperymentalnych, pozwalając na produkcję fizjologicznie aktywowanych, przestrajalnych komórek dendrytycznych (DC) do immunoterapii raka.

Nowy protokół generowania fizjologicznych immunogennych komórek dendrytycznych

Tutaj prezentujemy ekonomiczną i efektywną metodę izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego o wysokiej czystości od myszy po 7 dniach hodowli z 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Ekonomiczny i wydajny protokół izolacji i hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Protokół przedstawia model immunoterapii nowotworów za pomocą komórkowego szczepienia guza z ekspresją Flt3L czerniaka B16-F10. Protokół ten demonstruje procedury, w tym przygotowanie hodowanych komórek nowotworowych, implantację guza, napromienianie komórek, pomiar wzrostu guza, izolację wewnątrznowotworowych komórek odpornościowych i analizę cytometrii przepływowej.

Eksperymentalny model immunoterapii czerniaka z wykorzystaniem szczepienia przeciwnowotworowego cytokiną krwiotwórczą

Przedstawiono unikalny, kompleksowy protokół generowania de-sialylowanych ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (mo-DCs) z izolowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) za pomocą leczenia sialidazą. Ponadto opisano metody oceny charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej mo-DC oraz oceny, w jaki sposób leczenie sialidazą poprawia poziom dojrzewania mo-DC.

Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów o różnych fenotypach sjalowanych

Protokół ten opisuje przeprogramowanie in vivo mysich komórek rakowych na komórki dendrytyczne typu 1 w mikrośrodowisku guza poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych PU.1, IRF8 i BATF3.

Wykonalne przeprogramowanie in vivo komórek nowotworowych na konwencjonalne komórki dendrytyczne typu 1

Poznaj metodę przygotowania dojrzałych komórek dendrytycznych do immunoterapii nowotworowej z wykorzystaniem cytokin GM-CSF i IL-4. Technika ta umożliwia generowanie klinicznych szczepionek komórkowych z monocytów pacjenta.

Przygotowanie dojrzałych komórek dendrytycznych obciążonych antygenem nowotworowym do immunoterapii

Przeglądaj więcej filmów