Name: Ortotopowy mysi model anaplastycznego raka tarczycy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Poznaj metodę tworzenia ortotopowego modelu ksenotransplantatu mysim raka tarczycy anaplastycznego poprzez chirurgiczne wszczepienie ludzkich komórek nowotworowych. Technika ta pozwala na badanie progresji choroby i testowanie terapii w warunkach klinicznie istotnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować doktorom Wenjun Li i Danielowi Kreiselowi (Washington University School of Medicine w St. Louis) za pomoc w szkoleniu chirurgicznym. R.Y.L. jest wspierany przez National Institutes of Health Grant R01 DK068057 oraz President's Research Fund of Saint Louis University.

1. Przygotowanie komórek
Uwagi: 1) kompletna receptura pożywki hodowlanej na bazie RPMI 1640 (500 ml) zawiera 435 ml RPMI 1640, 50 ml inaktywowanego termicznie FBS, 5 ml aminokwasów endogennych, 5 ml pirogronianu sodu, 5 ml antybiotyku przeciwgrzybiczego; 2) umieścić matrigel w temperaturze 4 °C na jeden dzień przed pobraniem komórek.
<ol>
	<li>Ludzka linia komórkowa ATC THJ-11T8 jest hodowana na 6-dołkowych płytkach hodowlanych i zbierana raz w 80-90% zlewa.</li>
	<li>Komórki osadu przez odwirowanie w temperaturze 200 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w pożywce RPMI 1640 [płytka 2 ml/6 dołków].</li>
	<li>Weź niewielką objętość zawiesiny komórek, dodaj ją do jednej objętości 0,4% niebieskiego barwnika trypanowego i określ gęstość komórek za pomocą automatycznego licznika komórek TC10.</li>
	<li>Oblicz objętość zawiesiny komórek potrzebną do uzyskania 5 x 105 komórek/myszy razy liczba wstrzykniętych myszy.</li>
</ol>
Uwaga: Aby zapewnić odpowiednią zawiesinę komórek do wstrzyknięcia, przygotuj komórki tak, jakbyś wstrzykiwał podwójną liczbę myszy (np. jeśli wstrzykujesz 5 myszy, a następnie przygotuj zawiesinę komórek tak, jakbyś wstrzykiwał 10 myszy).
<ol start="6">
	<li>Przenieść potrzebną objętość zawiesiny komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Komórki osadu przez odwirowanie w temperaturze 200 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zasysanie pożywki i ponowne zawieszanie komórek w kompletnych nośnikach RPMI 1640.</li>
	<li>Przenieść komórki do probówki o pojemności 1,6 ml, dodać 1 objętość matrigelu i delikatnie wymieszać, powoli pipetując do wewnątrz i na zewnątrz.</li>
</ol>
Uwaga: Każda mysz otrzyma 10 μl zawiesiny komórkowej/koktajlu matrygelowego. Ponieważ komórki 5 x 105 zawieszone w objętości iniekcyjnej 10 μl były z powodzeniem stosowane w poprzednich badaniach ortotopowych ATC9-10, użyliśmy tych parametrów w niniejszym raporcie.
<ol start="10">
	<li>Umieść zawiesinę komórek na lodzie, aż będzie gotowa do użycia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie myszy
<ol>
	<li>Oczyść strefę operacyjną, która obejmuje lunetę sekcyjną i okolicę, przecierając wszystkie powierzchnie 70% etanolem.</li>
	<li>Włącz lampy/podkładki grzewcze, w których zwierzęta będą wracać do zdrowia po operacji.</li>
	<li>Podawać 0,1 ml ketaminy/ksylazyny (koktajl lekowy składający się z ketaminy 9 mg/ml i ksylazyny 1 mg/ml) na 10 g masy ciała dootrzewnowo za pomocą strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 ml 27 g 1/2".</li>
	<li>Przygotuj mysz do operacji: 1) ogol obszar szyi myszy (od linii żuchwy do górnej części mostka i na zewnątrz), 2) trzykrotnie wyszoruj obszar chirurgiczny kwadratami gazy nasączonej chorheksadyną, 3) końcowy peeling wykonany gazą nasączoną betadyną, 4) delikatnie nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu.</li>
	<li>Sprawdź odruch pedału, aby upewnić się, że mysz jest odpowiednio uspokojona.</li>
	<li>Umieść zwierzę w pozycji grzbietowej na jednorazowej sterylnej barierze polowej pod lunetą sekcyjną i zabezpiecz zwierzę na miejscu taśmą z tkaniny.</li>
	<li>Szoruj dłonie i paznokcie, a następnie zakładaj sterylne rękawiczki chirurgiczne.</li>
	<li>W sterylny sposób otwórz opakowanie chirurgiczne i ułóż instrumenty.</li>
	<li>Umieść sterylną serwetę na zwierzęciu, pozostawiając odsłonięte tylko pole operacyjne.</li>
</ol>
3. Chirurgiczny dostęp do iniekcji tarczycy i komórek
<ol>
	<li>Za pomocą sterylnego, jednorazowego skalpela wykonaj podłużne nacięcie o długości od 1 do 1,5 cm wzdłuż linii środkowej gardła.</li>
</ol>
Uwaga: Odchylenie od linii środkowej komplikuje głębsze cięcie w celu uzyskania dostępu do tchawicy. Dość precyzyjne nacięcie linii środkowej pozwala na drażnienie i przecinanie tkanki błoniastej utrzymującej razem lewy i prawy gruczoł ślinowy oraz zmniejsza ryzyko nacięcia lub przecięcia dużych tętnic.
<ol start="2">
	<li>Wykonaj drugie nacięcie w mięśniach paska otaczających tchawicę, a następnie pociągnij prawą stronę naciętego mięśnia w bok, aby odsłonić prawą tarczycę.</li>
	<li>Hemostatyki mogą być używane w tym momencie, aby utrzymać warstwę mięśniową w celu łatwego dostępu do tarczycy (ryc. 1).</li>
</ol>
Uwaga: Alternatywnie, jeśli zabieg jest wykonywany przez dwóch pracowników chirurgicznych, warstwa mięśniowa może być po prostu przytrzymywana kleszczami, podczas gdy gotowy zastrzyk strzykawki jest podawany chirurgowi przez personel asystujący.
<ol start="4">
	<li>Powoli wstrzyknąć 10 μl zawiesiny komórkowej do prawej tarczycy za pomocą strzykawki insulinowej 31G 5/16", a następnie delikatnie usunąć igłę.</li>
</ol>
4. Zamknięcie miejsca operacji i rekonwalescencja myszy
<ol>
	<li>Zszyj warstwę mięśniową materiałem szwalniczym 6.0 przy użyciu ciągłego lub przerywanego stylu szycia.</li>
	<li>Zszyj skórę w ten sam sposób.</li>
	<li>Nałóż warstwę potrójnej maści z antybiotykiem bezpośrednio na miejsce nacięcia.</li>
	<li>Pozwól zwierzęciu dojść do siebie w pozycji leżącej grzbietowej na ciepłej poduszce grzewczej. Gdy zwierzę osiągnie leżący mostek bez pomocy, można je umieścić z powrotem z innymi myszami.</li>
</ol>
5. Monitorowanie pooperacyjne i pobieranie tkanek
<ol>
	<li>Sprawdzaj miejsce nacięcia i ogólny stan zdrowia zwierzęcia codziennie przez tydzień po operacji, a następnie sprawdzaj raz w tygodniu. Jeśli szwy są nadal nienaruszone po 14 dniach, są usuwane.</li>
</ol>
Uwaga: Zwierzęta wykazujące oznaki pogarszającego się stanu zdrowia (np. znaczna utrata wagi, niechlujna sierść, trudności w oddychaniu) powinny zostać poddane eutanazji i pobrane tkanki.
<ol start="2">
	<li>Gdy myszy osiągną z góry określony pooperacyjny punkt czasowy, podaj ketaminę/ksylazynę, jak opisano powyżej, aby uspokoić.</li>
	<li>Perfuzję zwierzęcia dosercowo i pobranie tarczycy/tchawicy oraz innych tkanek będących przedmiotem zainteresowania (nie opisanych szczegółowo tutaj).</li>
</ol>

<ol><li>Bibby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+models+of+cancer+for+preclinical+drug+evaluation%3A+advantages+and+disadvantages%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages.</a> Eur. J. Cancer. 40, 852-857 (2004).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+metastatic+mouse+models+for+anticancer+drug+discovery+and+evaluation%3A+a+bridge+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+New+Drugs%22%5BJournal%5D)">Orthotopic metastatic mouse models for anticancer drug discovery and evaluation: a bridge to the clinic.</a> Invest. New Drugs. 17, 343-359 (1999).</li>
<li>Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+models+are+necessary+to+predict+therapy+of+transplantable+tumors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice.</a> Cancer Metastasis Rev. 17, 279-284 (1998).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+model+of+anaplastic+thyroid+carcinoma+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An orthotopic model of anaplastic thyroid carcinoma in athymic nude mice.</a> Clin. Cancer Res. 11, 1713-1721 (2005).</li>
<li>Nucera, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+orthotopic+mouse+model+of+human+anaplastic+thyroid+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Thyroid%22%5BJournal%5D)">A novel orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid carcinoma.</a> Thyroid. 19, 1077-1084 (2009).</li>
<li>Todaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenic+and+metastatic+activity+of+human+thyroid+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumorigenic and metastatic activity of human thyroid cancer stem cells.</a> Cancer Res. 70, 8874-8885 (2010).</li>
<li>Tran Cao, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+tumor+progression+in+a+fluorescent+orthotopic+mouse+model+of+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of tumor progression in a fluorescent orthotopic mouse model of thyroid cancer.</a> Anticancer Res. 30, 4415-4422 (2010).</li>
<li>Marlow, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+molecular+fingerprinting+of+four+new+anaplastic+thyroid+carcinoma+cell+lines+and+their+use+for+verification+of+RhoB+as+a+molecular+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Detailed molecular fingerprinting of four new anaplastic thyroid carcinoma cell lines and their use for verification of RhoB as a molecular therapeutic target.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 95, 5338-5347 (2010).</li>
<li>Nehs, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+Intervention+with+anti-BRAF+%28V600E%29+therapy+induces+tumor+regression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+human+anaplastic+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Late Intervention with anti-BRAF (V600E) therapy induces tumor regression in an orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid cancer.</a> Endocrinology. 153, 985-994 (2012).</li>
<li>Nucera, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+BRAFV600E+with+PLX4720+displays+potent+antimigratory+and+anti-invasive+activity+in+preclinical+models+of+human+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncologist%22%5BJournal%5D)">Targeting BRAFV600E with PLX4720 displays potent antimigratory and anti-invasive activity in preclinical models of human thyroid cancer.</a> Oncologist. 16, 296-309 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W naszym modelu zwierzęta wykazywały przerzuty do guza tarczycy i związaną z chorobą kacheksję i niewydolność oddechową do 4 tygodni po wstrzyknięciu. Podobnie jak w przypadku większości innych modeli ortotopowych wykorzystujących wstrzykiwanie zawiesiny komórek, możliwe jest wstrzyknięcie do otaczających tkanek i wyciek po wstrzyknięciu, który rozprzestrzenia się poza cel. Mając to na uwadze, jedną z rozpoznawalnych potencjalnych niewiadomych spowodowanych tą procedurą jest efekt ekspozycji poza celem na przerzuty lub powikłania niezwiązane z chorobą. Jest to ogólny problem w przypadku większości przeszczepów ksenograficznych, niezależnie od badanej choroby. Niemniej jednak niezamierzone konsekwencje przerzutów można znacznie zminimalizować, upewniając się, że cały skos końcówki igły wniknął w błonę, ściśle pokrywając tarczycę i powoli wydalając zawiesinę komórkową. W przypadku zaobserwowania wycieku w trakcie lub po wstrzyknięciu, zwierzęta te mogą zostać pominięte w badaniu.
Istotne jest, aby zwierzęta były poddawane perfuzji przed pobraniem tarczycy/tchawicy i innych tkanek. Korzyści są dwojakie: 1) czerwone krwinki są oczyszczane i nie zaśmiecają próbek histologicznych oraz 2) morfologia i integralność tkanek są zachowane. Ponadto wycięta tarczyca/tchawica, która ma przyczepioną masę nowotworową lub jest w niej zanurzona, powinna zostać przecięta w taki sposób, aby można było zidentyfikować anatomiczne punkty orientacyjne przed osadzeniem w celu przygotowania histologicznego. To znacznie skróci czas przygotowania próbki.
W niniejszym raporcie opisano miejscowy wzrost i inwazję zaawansowanego guza tarczycy po ortotopowym wstrzyknięciu komórek ATC. Przerzuty ATC można badać, analizując preparaty histologiczne innych tkanek przy użyciu standardowych barwników histologicznych, takich jak hematoksylina i eozyna, lub przez immunohistochemię z wykorzystaniem markerów istotnych dla komórek lub patologii. System ten może być dalej rozwijany poprzez genetyczną modyfikację komórek raka tarczycy za pomocą reporterów fluorescencyjnych, tak aby obrazowanie na żywo mogło być wykorzystywane do monitorowania przerzutów i skuteczności leczenia terapeutycznego.

<table><tbody><tr><td>Pożywka do hodowli komórkowych RPMI 1640</td><td>Mediatech</td><td>10-041-CV</td><td>Stosowane podłoża i dodatki zależą od linii komórkowej</td></tr><tr><td>TC10 Automatyczny licznik komórek</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0001</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Kleszcze, ząbkowane; Lekka krzywa, 4"</td><td>Roboz</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy skalpel, nr 15</td><td>Feather</td><td>2975#15</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na igłę Olsen Hegar - 4 &frac12; " delikatny ząbkowany</td><td>gSource</td><td>gS 21.5400</td><td></td></tr><tr><td>6-0 nylonowy szew monofilamentowy</td><td>Surgical Specialties Corporation</td><td>1279B</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza, wielokrotnego użytku, 8 "x 12"</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Taśma tkaninowa, 1 "X 10 jardów</td><td>Medline</td><td>MIINON260101</td><td>Do krępowania znieczulonej myszy</td></tr><tr><td>Maszynka do strzyżenia/trymer do orzechów ziemnych</td><td>Wahl</td><td>8655</td><td>Do usuwania owłosienia z miejsca operowanego</td></tr><tr><td>ChlorHex-Q SCRUB 2%</td><td>Penn Veterinary Supply</td><td>VED1222</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Henry Schein Company</td><td>6906727</td><td></td></tr><tr><td>Wazelina maść oftalmiczna</td><td>Dechra Veterinary Products</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>2 x 2 gaza, 12-warstwowa</td><td>Butler Animal Health Supply</td><td>6936</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne pole, bariera, 18" x 26"</td><td>Busse</td><td>696</td><td></td></tr><tr><td>Zasłony (CSR Wrap)</td><td>Cardinal Health</td><td>AT 21 412</td><td></td></tr><tr><td>27G &frac12; " igła</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>igła 31G 5/16"</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>328438</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (9 mg/ml) / ksylazyna (1 mg/ml) roztwór</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maść z potrójnym antybiotykiem</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ortotopowy mysi model anaplastycznego raka tarczycy

An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

Ustalono kilka typów zwierzęcych modeli ludzkich nowotworów tarczycy, w tym ksenoprzeszczep podskórny i ortotopowe wszczepianie komórek rakowych myszom z niedoborem odporności. Podskórne modele ksenoprzeszczepów okazały się cenne dla przedklinicznych badań przesiewowych i oceny nowych metod leczenia. Korzystanie z modelu podskórnego ma wiele zalet; 1) szybkie, 2) powtarzalne i 3) powstawanie guza, wzrost i odpowiedź na środki terapeutyczne mogą być monitorowane za pomocą oględzin. Jednak istotne dowody rzuciły światło na wady modeli ksenoprzeszczepów podskórnych1-3. Na przykład terapie medyczne wykazujące właściwości lecznicze w podskórnych modelach ksenoprzeszczepów często nie mają znaczącego wpływu na chorobę u ludzi. U podstaw tej odmienności leży mikrośrodowisko miejsca przeszczepu lub iniekcji ksenograficznej.
Modele ksenoprzeszczepów ortotopowych guzów dostarczają bardziej biologicznie istotnego kontekstu, w którym można badać chorobę. Korzyści płynące z wszczepienia chorych komórek lub tkanek do ich anatomicznego odpowiednika u zwierzęcia gospodarza obejmują odpowiednie miejsce do interakcji guz-gospodarz, rozwój przerzutów związanych z chorobą oraz możliwość zbadania specyficznego dla miejsca wpływu na badane środki terapeutyczne. Dlatego ortotopowe modele ksenoprzeszczepów mają znacznie większą wartość kliniczną, ponieważ ściśle odtwarzają ludzką chorobę. Z tych powodów wiele grup wykorzystało ortotopowy model raka tarczycy jako narzędzie badawcze4-7.
Tutaj opisujemy podejście, które ustanawia model ortotopowy do badania anaplastycznego raka tarczycy (ATC), który jest wysoce inwazyjny, opiera się leczeniu i jest praktycznie śmiertelny u wszystkich zdiagnozowanych pacjentów. Hodowane komórki ATC są przygotowywane jako zdysocjowana zawiesina komórkowa w roztworze zawierającym macierz błony podstawnej. Niewielka objętość jest powoli wstrzykiwana do prawej tarczycy. Ogólny wygląd i stan zdrowia myszy są monitorowane w celu zapewnienia minimalnych powikłań pooperacyjnych i oceny patologicznej penetracji nowotworu. Myszy uśmierca się po 4 tygodniach, a tkankę pobiera się do analizy histologicznej. Zwierzęta mogą być pobierane w późniejszych terminach w celu zbadania bardziej zaawansowanego postępu choroby. Produkcja tego ortotopowego modelu myszy tworzy platformę, która spełnia dwa cele: 1) pogłębienie naszej wiedzy na temat patologii ATC oraz 2) przebadanie obecnych i przyszłych środków terapeutycznych pod kątem skuteczności w zwalczaniu ATC.

Po 4 tygodniach wykryto 19 inwazyjnych guzów tarczycy u łącznie 20 myszy, którym wstrzyknięto komórki ATC. Na przykładzie przedstawionym na Rysunku 2A, u myszy, które otrzymały ortotopowy wstrzyknięcie 5X105 komórek ATC hodowanych w warunkach adherentnych, stwierdzono znaczną infiltrację komórek nowotworowych do tarczycy w 4 tygodniu po iniekcji. Charakter inwazyjnych komórek ATC, wykazujących typową wrzecionowatą budowę oraz obecność komórek o średniej i ogromnej wielkości z eozynofilną cytoplazmą i dużymi jądrami, został potwierdzony barwieniem hematoksyliną i eozyną (H&amp;E). Dla porównania, na Rysunku 2B przedstawiono tarczycę i tchawicę zwierzęcia kontrolnego, któremu nie podano wstrzyknięcia. Pęcherzyki tarczycy u nieiniekcyjnego zwierzęcia wykazują ścisłe, choć luźne powiązanie i mają w zasadzie okrągłą morfologię.
Ze względu na niewielki rozmiar tarczycy oraz zastosowanie podania drogą wstrzyknięcia, mogą wystąpić niezamierzone skutki. Rycina 3A przedstawia najczęściej obserwowany przypadek, jakim jest rozwój masy guzowej poza tarczycą, lecz nie obejmującej jej. Jest to najprawdopodobniej spowodowane penetracją igły przez tarczycę i poza nią w momencie wypychania komórek. Okazyjnie wykrywane są myszy bez wzrostu guza, zarówno w badaniu makroskopowym, jak i histologicznym, co pokazano na Rycynie 3B. Brak wykrywalnego rozwoju guza może być spowodowany wypłynięciem zawiesiny komórkowej z miejsca wstrzyknięcia i jej rozprzestrzenieniem do sąsiednich tkanek i jam ciała.
<img src="/files/ftp_upload/50097/50097fig1.jpg" alt="Sekcja anatomiczna tarczycy przedstawiająca identyfikację lewego płata tarczycy, prawego płata tarczycy oraz tchawicy." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Odsłanianie tarczycy. Etykiety wskazują prawy i lewy płat tarczycy flankujące tchawicę.
<img src="/files/ftp_upload/50097/50097fig2.jpg" alt="Histology: tissue sections, labeled areas; comparative analysis, microscopy image, cellular structure." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
 Rysunek 2. Badanie histologiczne wzrostu i naciekania guza po pomyślnym wstrzyknięciu do tarczycy. Próbki tkanek pocięto w płaszczyźnie wieńcowej. A) Zdjęcie wykonane przy powiększeniu 200X, przedstawiające mysz z istotnym wzrostem guza z charakterystycznymi komórkami wrzecionowatymi oraz komórkami o rozmiarze od średniego do olbrzymiego z eozynofilną cytoplazmą i dużymi jądrami w barwieniu hematoksyliną i eozyną (H&E)&amp;E) barwienie. Tu wskazuje na pierwotną zmianę, z której komórki nowotworowe naciekają tarczycę. B) Tchawica i tarczyca zwierzęcia kontrolnego (obraz wykonany przy 100-krotnym powiększeniu). Guzy, Nowotwory; Smięśnie gładkie; Tr, tchawica; Thy, tarczyca.
<img src="/files/ftp_upload/50097/50097fig3.jpg" alt="Obraz histologiczny przedstawiający przekrój poprzeczny tkanki tarczycy; badanie mikroskopowe i szczegóły komórkowe." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Niezamierzone skutki wstrzykiwania ortotopowego. Próbki tkanek przekrojono w płaszczyźnie czołowej. A) Obwodowy wzrost guza przy braku widocznego wzrostu w tarczycy (czarna strzałka, obraz wykonany przy powiększeniu 100X). B) Brak wykrycia guza podczas badania makroskopowego (nie pokazano) lub histologicznego (obraz wykonany przy powiększeniu 50X). Thy, gruczoł tarczycy.

Generacja ortotopowego mysiego modelu anaplastycznego raka tarczycy jest opisana tutaj. Technika ta polega na chirurgicznym umieszczaniu ludzkich komórek anaplastycznego raka tarczycy w tarczycy myszy z niedoborem odporności, tworząc w ten sposób bardziej istotne klinicznie warunki do badania postępu choroby, a także do badań przesiewowych innowacyjnych interwencji terapeutycznych.

Ortotopowy mysi model anaplastycznego raka tarczycy

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykazanie chirurgicznego umieszczenia ludzkich komórek anaplastycznych, raka tarczycy lub komórek TC w tarczycy w celu ustalenia ortotopowego modelu myszy ksenoprzeszczepu. Osiąga się to poprzez pierwszą hodowlę i pobranie komórek TC. Po przygotowaniu myszy do zabiegu należy odsłonić tarczycę przez dwa kolejne podłużne nacięcia szyi i powoli wstrzyknąć komórki TC A do prawej tarczycy.Ostatnim krokiem jest zamknięcie nacięć szwami i umożliwienie myszy powrotu do zdrowia. Ostatecznie badanie histologiczne próbek z wyciętych tkanek służy do wykazania wzrostu i inwazji guza w różnych warunkach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak podskórny przeszczep ksenoprzeszczepu, jest to, że przeszczep ortotopowy umieszcza komórki TC w ich niszy biologicznej i ściśle odwzorowuje postęp choroby i patologię, tak jak ma to miejsce u ludzi.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania, takie jak określenie biologicznych mechanizmów agresywności raka tarczycy. Rozpocznij tę procedurę od hodowli ludzkiej linii komórkowej A TC TJ 11 T na sześciu płytkach hodowlanych przy użyciu kompletnych pożywek z dodatkiem RPMI 1640 na dzień przed pobraniem komórek, gdy komórki są w 70 do 80% zlewnym rozmrażaniu, 0,01 mililitra głównego żelu w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zbierz komórki za pomocą trypsyny, gdy staną się zlewające się w 80 do 90% po granulowaniu komórek, odessaj pożywkę i ponownie zawieś komórki w dwóch mililitrach uzupełnionej pożywki RPMI 1640 na każdą zebraną płytkę sześciodołkową.Następnie określ gęstość komórek, mieszając zawiesinę komórek jeden do jednego z 0,4% niebieskim barwnikiem Triam, określ gęstość komórek za pomocą automatycznego licznika komórek TC 10. Oblicz objętość zawiesiny komórek potrzebną do wstrzyknięcia 500 000 komórek na mysz. Upewnij się, że dostępne są odpowiednie komórki do implantacji, obliczając dwukrotność planowanej liczby implantów.Przenieś wymaganą objętość zawiesiny komórek do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Następnie wirować w temperaturze 200 g przez cztery minuty w temperaturze pokojowej. Następnie odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w ilości 100 milionów komórek na mililitr w kompletnych pożywkach uzupełnionych RPMI 1640.Następnie przenieś komórki do probówki o pojemności 1,6 mililitra. Dodaj jedną objętość żelu matri i delikatnie wymieszaj, powoli pipetując do wewnątrz i na zewnątrz. Zawiesinę komórkową umieścić na lodzie, aż będzie potrzebna.Najpierw wysterylizuj strefę operacyjną, która obejmuje lunetę sekcyjną i okolicę, przecierając wszystkie powierzchnie 70% etanolem. Następnie przygotuj obszar rekonwalescencji, włączając lampy grzewcze i odkładając sterylne podkładki. Znieczul mysz i przygotuj ją do operacji, najpierw goląc obszar szyi myszy od linii żuchwy do górnej części mostka i na zewnątrz do każdego ramienia.Następnie trzykrotnie przykręć pole operacyjne, naprzemiennie namaczając kwadraty gau nasączone chlorheksydyną i etanolem. Potem po raz ostatni z gazą nasączoną Betadine. Delikatnie nałóż również maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu.W tym momencie sprawdź odruch pedałowania, aby upewnić się, że mysz jest odpowiednio uspokojona. Następnie umieść leżącą część grzbietową myszy na jednorazowej sterylnej barierze polowej. Pod lunetą sekcyjną zabezpiecz mysz na miejscu taśmą z tkaniny.Następnie należy dokładnie wyszorować dłonie i paznokcie oraz w sterylny sposób założyć sterylne rękawiczki chirurgiczne, otworzyć pakiet chirurgiczny i ułożyć narzędzia. Na koniec umieść sterylną serwetkę na myszy, pozostawiając odsłonięte tylko pole operacyjne. Zacznij od wykonania podłużnego nacięcia o długości od jednego do 1,5 centymetra wzdłuż linii środkowej gardła za pomocą sterylnego jednorazowego skalpela.Nie zbaczaj z linii środkowej, ponieważ zwiększyłoby to ryzyko nacięcia lub przecięcia dużych tętnic. Wykonaj drugie nacięcie w mięśniach paska otaczających tchawicę. Następnie pociągnij prawą stronę naciętego mięśnia w bok, odsłaniając prawą tarczycę.Poproś asystenta, aby przekazał strzykawkę. Powoli wstrzyknij go do prawej tarczycy za pomocą strzykawki insulinowej o rozmiarze 31. Następnie delikatnie usuń szew igłowy wraz z warstwą mięśniową za pomocą sześcioma nylonowymi materiałami szyjącymi z monofilamentu OH, używając przerywanego stylu szycia.Na koniec zszyj skórę w ten sam sposób po operacji. Nałóż warstwę maści z potrójnym antybiotykiem bezpośrednio na miejsce nacięcia. Pozwól myszy odzyskać pozycję leżącą grzbietowo pod lampą.Gdy mysz osiągnie pozycję leżącą mostka bez pomocy, można ją umieścić z powrotem wraz z innymi myszami w klatce. Sprawdzaj miejsce nacięcia i ogólny stan zdrowia myszy codziennie przez tydzień po operacji. Następnie sprawdzaj go raz w tygodniu.Jeśli w dowolnym momencie mysz wykazuje oznaki pogarszającego się stanu zdrowia, powinna zostać poddana eutanazji, a jej tkanki pobrane. Gdy myszy osiągną wcześniej określony pooperacyjny punkt czasowy, znieczulij je ketaminą i ksylazyną, a następnie przetapiaj zwierzę buforem, a następnie utrwalaczem, a następnie zbieraj tkanki i przetwarzaj je do histologii. Tarczyca i tchawica zwierzęcia kontrolnego bez wstrzyknięć są tutaj pokazane z pęcherzykami barwiącymi hematynę i eozynę, wykazują ścisły, ale luźny związek i mają zasadniczo okrągłą morfologię.Natomiast myszy otrzymujące ortotopowe wstrzyknięcie 500 000 komórek TC A wykazują znaczną infiltrację komórek rakowych do tarczycy przez cztery tygodnie po wstrzyknięciu. Charakter inwazyjnych komórek wykazuje charakterystyczne komórki w kształcie wrzeciona oraz komórki średniej i gigantycznej wielkości z eozynofilową cytoplazmą i dużymi jądrami. Ze względu na mały rozmiar tarczycy i stosowanie podawania iniekcyjnego mogą wystąpić niezamierzone skutki, takie jak rozwój masy guza poza tarczycą, ale nie obejmującej.Wynika to z penetracji igły przez tarczycę, gdy komórki są wydalane Czasami wykrywa się myszy bez wzrostu guza, zarówno rażąco, jak i histologicznie, jak pokazano tutaj. Brak wykrywalnego rozwoju guza jest spowodowany wydaleniem zawiesiny komórkowej z miejsca wstrzyknięcia do sąsiednich tkanek i jam Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu 20 minut. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wygenerować własny model ortotopowy dla anaplastycznego raka tarczycy.Poprzez chirurgiczny dostęp do tarczycy i wstrzyknięcie hodowanych komórek C.

an-orthotopic-mouse-model-of-anaplastic-thyroid-carcinoma

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Model anoplastycznego raka tarczycy na myszym modelu ortotopowym

Do ustanowienia tego modelu można wykorzystać dwie techniki: wstrzyknięcie zawiesiny komórek nowotworowych w ścianę kątnicy lub przeszczepienie fragmentu guza podskórnego na kątnicę. Model ten jest przydatny do badania naturalnej progresji raka jelita grubego oraz testowania nowych środków terapeutycznych przeciwko rakowi jelita grubego.

Ortotopowy model raka jelita grubego u myszy

Aby zbadać wzrost guza oraz mikrośrodowisko nowotworowe in vivo, zastosowaliśmy syngeniczny i ortotopowy model raka jajnika u immunokompetentnych myszy. Przetransdukowaliśmy linię komórkową nowotworu mysiego (MOV1) białkiem fluorescencyjnym Katushka (MOV1KAT), a w niniejszej pracy przedstawiamy sposób jej ortotopowej implantacji do jajnika oraz obrazowanie in vivo.

Ortotopowy model surowiczego raka jajnika u immunokompetentnych myszy do obrazowania guzów in vivo i monitorowania odpowiedzi immunologicznych guza

Film demonstruje technikę ortotopowej inokulacji raka piersi na modelu mysim. Technika ta zapewnia wysoki wskaźnik nowotworzenia przy mniejszej zmienności wielkości i kształtu guza w porównaniu z wstrzyknięciem podskórnym lub niechirurgicznym.

Wstrzyknięcie ortotopowe: wszczepianie komórek rakowych specyficznych tkankowo dorosłej myszy

Ten film opisuje procedurę ortotopowej inokulacji komórek raka tarczycy do tarczycy mysich modeli, które mogą następnie służyć jako cenna platforma do oceny kancerogenezy i odkrywania potencjalnych strategii leczenia.

Ortotopowa inokulacja komórek raka tarczycy do mysiej tarczycy: procedura ustalania ortotopowego modelu myszy raka tarczycy

Opisany jest ortotopowy model pierwotnego guza raka piersi i chirurgiczne usunięcie pierwotnego guza w celu przedłużenia życia myszy w celu wytworzenia spontanicznych przerzutów. Wzrost i progresja guza są monitorowane i oznaczane ilościowo za pomocą obrazowania fluorescencyjnego lucyferazy.

Ortotopowy mysi model spontanicznych przerzutów raka piersi

Rak prostaty jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem w Stanach Zjednoczonych. Ortotopowy model raka stanowi użyteczne podejście do zrozumienia biologii raka prostaty i oceny skuteczności schematów terapeutycznych. Protokół ten opisuje szczegółowe kroki niezbędne do ustalenia ortotopowego modelu myszy raka prostaty.

Przedkliniczny ortotopowy mysi model ludzkiego raka prostaty

W kontekście klinicznym, pacjenci z zlokalizowanym rakiem trzustki zostaną poddani pankreatektomii, a następnie leczeniu uzupełniającemu. Przedstawiony tutaj protokół ma na celu ustanowienie bezpiecznej i skutecznej metody modelowania tego scenariusza klinicznego u nagich myszy, poprzez ortotopową implantację raka trzustki, a następnie dystalną pankreatektomię i splenektomię.

Ortotopowy resekcyjny mysi model raka trzustki

Tutaj prezentujemy standardowy potok do uzyskiwania mysich guzów ATC za pomocą spontanicznych genetycznie modyfikowanych modeli myszy. Ponadto przedstawiamy dynamikę guza i informacje patologiczne o zmianach pierwotnych i przerzutowych. Model ten pomoże naukowcom zrozumieć proces powstawania nowotworów i ułatwi odkrywanie leków.

Samoistny mysi model anaplastycznego raka tarczycy

Ustalono kilka typów zwierzęcych modeli zapalenia tarczycy Hashimoto, podobnie jak spontaniczne autoimmunologiczne zapalenie tarczycy u myszy NOD. Myszy H-2h4 to prosty i niezawodny model do indukcji HT. W tym artykule opisano to podejście i oceniono proces patologiczny w celu lepszego zrozumienia mysiego modelu SAT.

Generacja modelu spontanicznego autoimmunologicznego zapalenia tarczycy u myszy

Obecny protokół opisuje ultrasonografię wysokiej częstotliwości do wizualizacji całej tarczycy myszy i monitorowania wzrostu anaplastycznego raka tarczycy.

Ultrasonografia o wysokiej rozdzielczości do analizy ortotopowych guzów ATC w genetycznie zmodyfikowanym modelu myszy

Obecny protokół ustanawia i charakteryzuje model ksenoprzeszczepu (PDX) anaplastycznego raka tarczycy (ATC) oraz raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC) pochodzącego od pacjenta, ponieważ modele PDX szybko stają się standardem w dziedzinie onkologii translacyjnej.

Opracowanie i charakterystyka modeli ksenoprzeszczepów anaplastycznego raka tarczycy oraz raka płaskonabłonkowego głowy i szyi pochodzących od pacjentów

Poznaj metodę tworzenia ortotopowego modelu ksenotransplantatu mysim raka tarczycy anaplastycznego poprzez chirurgiczne wszczepienie ludzkich komórek nowotworowych. Technika ta pozwala na badanie progresji choroby i testowanie terapii w warunkach klinicznie istotnych.

Ortotopowy mysi model anaplastycznego raka tarczycy

Przeglądaj więcej filmów