Name: Ortotopowy model raka pęcherza moczowego do badań nad dostarczaniem genów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-01T22:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Poznaj metodę implantacji komórek raka pęcherza moczowego MB49 u myszy poprzez cewnikowanie oraz dostarczanie adenowirusów z genem reporterowym lucyferazy. Ten protokół umożliwia badanie terapii przeciwnowotworowych in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez NIH R21 CA143505 do Christiny Voelkel-Johnson.

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Medycznym Południowej Karoliny. Protokół został zatwierdzony w kategorii D USDA dla bólu. 
1. Implantacja komórek
<ol>
	<li>Dwa dni przed wykonaniem zabiegu należy umieścić 1 x 106 komórek MB49 w kolbach T-25. Stosuj DMEM o wysokim poziomie glukozy uzupełniony 10% FBS (i antybiotykami, jeśli jest to pożądane). Jedna kolba wystarcza na każdą grupę do pięciu myszy, które zostaną znieczulone i wszczepione równolegle.</li>
	<li>W dniu zabiegu należy przygotować trypsynę do infuzji, rozcieńczając sterylną 0,25% trypsynę klasy tkankowej do 0,125% sterylną pożywką bazową DMEM (rozcieńczenie 1:2). 1,2 ml wystarcza na 10 myszy. Umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C w celu zrównoważenia.</li>
	<li>Rozgrzej poduszkę grzewczą i umieść ją pod noskami systemu anestezjologicznego, który będzie używany do dostarczania izofluranu. Umieść czystą wkładkę chłonną na poduszce grzewczej.</li>
	<li>Umieść myszy w komorze indukcyjnej systemu anestezjologicznego i wywołaj znieczulenie 3% izofluranem. Gdy myszy stracą przytomność, co jest weryfikowane przez utratę odruchu szczypania palców u stóp, przenieś je do nosów. Upewnij się, że każde zwierzę znajduje się w pozycji leżącej na plecach i jest prawidłowo umieszczone na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała.</li>
	<li>Zmniejszyć stężenie izofluranu do 2%, aby utrzymać znieczulenie.</li>
	<li>Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
	<li>Opcjonalny krok: Usuń włosy na brzuchu. Włosy na dolnej części brzucha muszą zostać usunięte, jeśli ma być wykonane obrazowanie bioluminescencyjne in vivo.
	<ol>
		<li>Nałóż obfitą warstwę kremu do depilacji, takiego jak Veet, na najniższy 1 cal kwadratowy futra na brzuchu, uważając, aby nie dotykać zewnętrznych narządów płciowych. Poczekaj 3 min.</li>
		<li>Usuń włosy, pocierając obszar suchą gąbką, a następnie użyj wilgotnej gąbki, aby oczyścić skórę. W razie potrzeby powtórz raz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cewnikowanie pęcherza moczowego
	<ol>
		<li>Nasmaruj nowy, sterylny cewnik dożylny pediatryczny 24 G niedrażniącym żelem nawilżającym, takim jak KY. Wyjąć igłę i wyrzucić. Jeśli wyciek płynu wokół cewnika jest częstym problemem, tj. występuje częściej niż u jednej z dziesięciu myszy, można zastosować cewniki o większym otworze (20 G). Może to być ważna kwestia u myszy starszych niż 8 tygodni.</li>
		<li>Trzymając piastę cewnika, użyj kciuka i palca wskazującego drugiej ręki, aby rozłożyć tylne nogi myszy i odsłonić ujście cewki moczowej. Delikatnie wprowadź cewnik do cewki moczowej pod kątem 45°, zmieniając kąt na równoległy do ławki, aby wprowadzić go całkowicie.</li>
		<li>Po pełnym wprowadzeniu delikatnie podnieś cewnik, trzymając go równolegle do ławki i wizualnie potwierdź, że jest umieszczony w cewce moczowej, a nie w pochwie, która znajduje się poniżej. W przypadku prawidłowego umieszczenia cewnik będzie można wprowadzić w całości, ponieważ pochwa jest krótsza niż cewka moczowa.</li>
		<li>Zmniejszyć stężenie izofluranu do 1%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przymocuj końcówkę do pipetora P200 i usuń mocz z pęcherza, przysysając do zewnętrznego końca cewnika. Usuń pozostały mocz z piasty cewnika. Wylej mocz i pozostaw cewnik na miejscu.</li>
	<li>Ostrożnie odpipetować 80 μl 0,125% roztworu trypsyny do piasty cewnika, unikając pęcherzyków powietrza. Podłączyć strzykawkę wypełnioną powietrzem o pojemności 1 ml do piasty cewnika i powoli wciskać tłok o 0,1-0,2 ml, aby dostarczyć trypsynę do pęcherza.</li>
	<li>Pozostaw zespół strzykawki i cewnika na miejscu na 15 minut. Powtórz kroki 1.8-1.11 dla każdej z pozostałych znieczulonych myszy (do 4). Przejdź do następnego kroku w okresie oczekiwania. WSKAZÓWKA: Na początku pomocne może być poproszenie kogoś innego o przygotowanie komórek (krok 1.12).</li>
	<li>Przygotuj komórki MB49 do implantacji. Komórki posiano w proporcji 1 x 10,6 na kolbę T-25 na 48 godzin przed implantacją (krok 1.1).
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę i dodać 500 μl 0,25% trypsyny do kolby. Gdy komórki się odłączą, dodaj 5 ml kompletnego DMEM, aby ponownie zawiesić komórki. Usunąć podwielokrotność 50 μl do policzenia, a pozostałą część odwirować z prędkością 1 000 obr./min przez 5 minut. Podczas etapu wirowania przejdź do kroków 1.12.2 i 1.12.3.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru. Oblicz komórki/ml. Następnie obliczyć objętość potrzebną do doprowadzenia osadu komórkowego do 4 x 106 komórek/ml (2 x 105 komórek na 50 μl).</li>
		<li>Odlać supernatant z odwirowanych komórek i ponownie zawiesić osad w podłożu bazowym DMEM, wykorzystując objętość wymaganą do zawieszenia komórek do 4 x 106 komórek/ml (jak obliczono w kroku 1.12.2). Utrzymuj komórki w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po osiągnięciu 15-minutowego czasu na leczenie pęcherzy trypsyną, należy odłączyć strzykawkę wypełnioną powietrzem od cewnika, pozostawiając cewnik na miejscu. Zużyta trypsyna zwykle wypływa z powrotem przez cewnik. Usunąć pozostałą trypsynę z pęcherza moczowego przez odsysanie pipetorem P200, jak w kroku 1.9 powyżej, i wyrzucić.</li>
	<li>Natychmiast odpipetować 50 μl zawiesiny komórek MB49 do piasty cewnika. Przymocować strzykawkę wypełnioną powietrzem o pojemności 1 ml do piasty cewnika i dostarczyć komórki do pęcherza moczowego, powoli wciskając tłok o 0,1-0,2 ml. Powtórz ten krok do czterech dodatkowych razy, aby wszczepić wszystkie pięć myszy. Wyrzuć wszystkie nieużywane komórki.</li>
	<li>Pozostawiając zestaw cewnik-strzykawka na miejscu, pozwól komórkom przebywać w pęcherzu moczowym przez 50 minut.</li>
	<li>Delikatnie wyjmij zestaw cewnik-strzykawka z cewki moczowej. Zmniejsz stężenie izofluranu do zera i odsuń każdą mysz o cal lub dwa od stożka na nos, aby odzyskać siły na poduszce grzewczej.</li>
	<li>Kiedy mysz odzyska odruch prostowania, przywróć ją do klatki.</li>
</ol>
2. Dopęcherzowe podanie adenowirusa (8 dni po implantacji komórek)
UWAGA: Ta część protokołu wykorzystuje adenowirusa, który jest czynnikiem zakaźnym i powinien być traktowany zgodnie ze ścisłymi wytycznymi BSL2 (http://oma.od.nih.gov/manualchapters/intramural/3035/).
Wszystkie procedury wykonywane z użyciem czynników zakaźnych zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu Medycznego Południowej Karoliny.
<ol>
	<li>Osiem dni po wszczepieniu myszom komórek MB49 sprawdź, czy nie ma krwiomoczu. Podnieś pojedyncze zwierzęta na białym kawałku chłonnego papieru i delikatnie dociśnij do brzucha, aby zetrzeć krople moczu na papier. Mocz w kolorze różowym do czerwonego wskazuje na krwiomocz i jest znakiem, że powstały guzy. Wskaźnik przyjmowania guza wynosi co najmniej 80%, a przy doskonałej technice może sięgać nawet 100%.</li>
	<li>Rozmrozić materiał adenowirusowy na lodzie i rozcieńczyć do 109 PFU/50 μl (2 x10 10 PFU/ml) w sterylnym PBS o temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Znieczulij myszy zgodnie z opisem w krokach 1.3-1.6 powyżej.</li>
	<li>Cewnikować myszy zgodnie z opisem w krokach 1.8 i usunąć mocz jak w kroku 1.9</li>
	<li>Po usunięciu moczu należy natychmiast pobrać pipetą 50 μl zawiesiny wirusa do piasty cewnika. Przymocować strzykawkę wypełnioną powietrzem o pojemności 1 ml do piasty cewnika i dostarczyć wirusa do pęcherza, powoli wciskając tłok o 0,1-0,2 ml.</li>
	<li>Pozostawiając zestaw cewnik-strzykawka na miejscu, pozwól wirusowi przebywać w pęcherzu moczowym przez 40 minut.</li>
	<li>Delikatnie wyjmij zestaw cewnik-strzykawka z cewki moczowej i wyrzuć do 10% roztworu wybielacza, aby dezaktywować pozostałego wirusa.</li>
	<li>Zmniejsz stężenie izofluranu do zera i odsuń każdą mysz o cal lub dwa od stożka na nos, aby odzyskać siły na poduszce grzewczej.</li>
	<li>Kiedy mysz odzyska odruch prostowania, przywróć ją do klatki.</li>
	<li>Zaznacz klatki, aby wskazać, że myszom zaszczepiono adenowirusa. Wirus będzie wydalany na ściółkę klatki przez kilka dni, a wszystkie klatki i ściółka muszą być odpowiednio obsługiwane i dezynfekowane.</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2012%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer.+J.+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2012.</a> CA Cancer. J. Clin. 62 (1), 10-29 (2012).</li>
<li>Seager, C. M., Puzio-Kuter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravesical+delivery+of+rapamycin+suppresses+tumorigenesis+in+a+mouse+model+of+progressive+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Prev.+Res%22%5BJournal%5D)">Intravesical delivery of rapamycin suppresses tumorigenesis in a mouse model of progressive bladder cancer.</a> Cancer Prev. Res. 2 (12), 1008-1014 (2009).</li>
<li>Chodak, G. W., Shing, Y., Borge, M., Judge, S. M., Klagsbrun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+heparin+binding+growth+factor+in+mouse+bladder+tumors+and+urine+from+mice+with+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Presence of heparin binding growth factor in mouse bladder tumors and urine from mice with bladder cancer.</a> Cancer Res. 46 (11), 5507-5510 (1986).</li>
<li>De Boer, E. C., Teppema, J. S., Steerenberg, P. A., De Jong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrovirus+type+C+in+the+mouse+bladder+carcinoma+cell+line+MBT-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Retrovirus type C in the mouse bladder carcinoma cell line MBT-2.</a> J. Urol. 163 (6), 1999-2001 (2000).</li>
<li>Lodillinsky, C., Rodriguez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+invasive+orthotopic+bladder+cancer+model+with+high+cathepsin+B+activity+resembling+human+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Novel invasive orthotopic bladder cancer model with high cathepsin B activity resembling human bladder cancer.</a> J. Urol. 182 (2), 749-755 (2009).</li>
<li>Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+to+monitor+bladder+cancer+cell+adhesion+in+vivo%3A+a+new+approach+to+optimize+a+syngeneic%2C+orthotopic%2C+murine+bladder+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model.</a> BJU Int. 101 (1), 120-124 (2008).</li>
<li>Brocks, C. P., Buttner, H., Bohle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+tumor+implantation+by+intravesical+gemcitabine+in+a+murine+model+of+superficial+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of tumor implantation by intravesical gemcitabine in a murine model of superficial bladder cancer.</a> J. Urol. 174 (3), 1115-1118 (2005).</li>
<li>Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+response+of+orthotopic+bladder+tumors+to+granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+therapy+using+the+prostate-specific+antigen+gene+as+a+reporter.+Clin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter. Clin.</a> Cancer Res. 10 (20), 6977-6984 (2004).</li>
<li>Wu, Q., Mahendran, R., Esuvaranathan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+cytokine+gene+therapy+on+an+orthotopic+bladder+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Nonviral cytokine gene therapy on an orthotopic bladder cancer model.</a> Clin. Cancer Res. 9 (12), 4522-4528 (2003).</li>
<li>Bonfil, R. D., Russo, D. M., Binda, M. M., Delgado, F. M., Vincenti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+antitumor+activity+of+vinflunine+than+vinorelbine+against+an+orthotopic+murine+model+of+transitional+cell+carcinoma+of+the+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Higher antitumor activity of vinflunine than vinorelbine against an orthotopic murine model of transitional cell carcinoma of the bladder.</a> Urol. Oncol. 7 (4), 159-166 (2002).</li>
<li>Bohle, A., Jurczok, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+bladder+carcinoma+cell+adhesion+by+oligopeptide+combinations+in+vitro+and+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Inhibition of bladder carcinoma cell adhesion by oligopeptide combinations in vitro and in.</a> 167 (1), 357-363 (2002).</li>
<li>Gunther, J. H., Jurczok, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+syngeneic+orthotopic+murine+bladder+cancer+%28MB49%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49).</a> Cancer Res. 59 (12), 2834-2837 (1999).</li>
<li>Gunther, J. H., Frambach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acetylic+salicylic+acid+and+pentoxifylline+on+the+efficacy+of+intravesical+BCG+therapy+in+orthotopic+murine+bladder+cancer+%28MB49%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Effects of acetylic salicylic acid and pentoxifylline on the efficacy of intravesical BCG therapy in orthotopic murine bladder cancer (MB49).</a> J. Urol. 161 (5), 1702-1706 (1999).</li>
<li>Dobek, G. L., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+model+of+murine+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An orthotopic model of murine bladder cancer.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li>
<li>Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+and+microenvironment+modification+during+progression+of+murine+orthotopic+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Dev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor and microenvironment modification during progression of murine orthotopic bladder cancer.</a> Clin. Dev. Immunol. 2011, 865684(2011).</li>
<li>Seow, S. W., Cai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactobacillus+rhamnosus+GG+induces+tumor+regression+in+mice+bearing+orthotopic+bladder+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Lactobacillus rhamnosus GG induces tumor regression in mice bearing orthotopic bladder tumors.</a> Cancer Sci. 101 (3), 751-758 (2009).</li>
<li>Mangsbo, S. M., Ninalga, C., Essand, M., Loskog, A., Totterman, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+therapy+is+superior+to+BCG+in+an+orthotopic+bladder+cancer+model+and+generates+CD4%2B+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">CpG therapy is superior to BCG in an orthotopic bladder cancer model and generates CD4+ T-cell immunity.</a> J. Immunother. 31 (1), 34-42 (2008).</li>
<li>Loskog, A. S., Fransson, M. E., Totterman, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AdCD40L+gene+therapy+counteracts+T+regulatory+cells+and+cures+aggressive+tumors+in+an+orthotopic+bladder+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">AdCD40L gene therapy counteracts T regulatory cells and cures aggressive tumors in an orthotopic bladder cancer model.</a> Clin. Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8816-8821 (2005).</li>
<li>Loskog, A., Ninalga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+MB49+mouse+bladder+cancer+model+for+adenoviral+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Optimization of the MB49 mouse bladder cancer model for adenoviral gene therapy.</a> Lab Anim. 39 (4), 384-393 (2005).</li>
<li>Bockholt, N. A., Knudson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-Interleukin-10R1+Monoclonal+Antibody+Enhances+Bacillus+Calmette-Guerin+Induced+T-Helper+Type+1+Immune+Responses+and+Antitumor+Immunity+in+a+Mouse+Orthotopic+Model+of+Bladder+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Anti-Interleukin-10R1 Monoclonal Antibody Enhances Bacillus Calmette-Guerin Induced T-Helper Type 1 Immune Responses and Antitumor Immunity in a Mouse Orthotopic Model of Bladder Cancer.</a> J. Urol. 187 (6), 2228-2235 (2012).</li>
<li>Watanabe, F. T., Chade, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin%2C+but+not+Prima-1%2C+decreased+tumor+cell+proliferation+in+the+syngeneic+murine+orthotopic+bladder+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics%22%5BJournal%5D)">Curcumin, but not Prima-1, decreased tumor cell proliferation in the syngeneic murine orthotopic bladder tumor model.</a> Clinics. 66 (12), 2121-2124 (2011).</li>
<li>Chade, D. C., Andrade, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathological+characterization+of+a+syngeneic+orthotopic+murine+bladder+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Braz.+J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model.</a> Int. Braz. J. Urol. 34 (2), 220-226 (2008).</li>
<li>Luo, Y., Chen, X., O'Donnell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+prostate+specific+antigen+to+measure+bladder+tumor+growth+in+a+mouse+orthotopic+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model.</a> J. Urol. 172, 2414-2420 (2004).</li>
<li>Zhang, Z., Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+SA-sCD40L+in+the+orthotopic+model+of+superficial+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oncol%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of SA-sCD40L in the orthotopic model of superficial bladder cancer.</a> Acta Oncol. 50 (7), 1111-1118 (2011).</li>
<li>Kohno, S., Luo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+mutant+HF10+oncolytic+viral+therapy+for+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 mutant HF10 oncolytic viral therapy for bladder cancer.</a> Urology. 66 (5), 1116-1121 (2005).</li>
<li>Kikuchi, E., Menendez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+gene+delivery+for+bladder+cancers+by+intravesically+administered+replication-competent+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient gene delivery for bladder cancers by intravesically administered replication-competent retroviral vectors.</a> Clin. Cancer Res. 13 (15 Pt 1), 4511-4518 (2007).</li>
<li>Siemens, D. R., Austin, J. C., See, W. A., Tartaglia, J., Ratliff, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+gene+transfer+efficiency+by+viral+vectors+to+murine+bladder+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of gene transfer efficiency by viral vectors to murine bladder epithelium.</a> J. Urol. 165 (2), 667-671 (2001).</li>
<li>Siemens, D. R., Crist, S., Austin, J. C., Tartaglia, J., Ratliff, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+viral+vectors%3A+gene+transfer+efficiency+and+tissue+specificity+in+a+bladder+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Comparison of viral vectors: gene transfer efficiency and tissue specificity in a bladder cancer model.</a> J. Urol. 170 (3), 979-984 (2003).</li>
<li>Black, P. C., Shetty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validating+bladder+cancer+xenograft+bioluminescence+with+magnetic+resonance+imaging%3A+the+significance+of+hypoxia+and+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Validating bladder cancer xenograft bioluminescence with magnetic resonance imaging: the significance of hypoxia and necrosis.</a> BJU Int. 106 (11), 1799-1804 (2010).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podstawową metodologią opisaną w tym protokole jest cewnikowanie pęcherzy moczowych myszy, które ma szerokie zastosowanie do wkraplania komórek lub dowolnego środka przeznaczonego do miejscowego dostarczania do nabłonka pęcherza moczowego. Konkretny protokół opisany powyżej został zoptymalizowany pod kątem badań krótkoterminowych (~10 dni). Wszczepienie dokładnej liczby komórek ma kluczowe znaczenie, ponieważ wyższa liczba komórek spowoduje szybszy wzrost guza i prawdopodobnie utratę zwierząt z powodu dużego obciążenia g...

Rak pęcherza moczowego jest drugim najczęściej występującym nowotworem układu moczowo-płciowego, z prawie 75 000 nowych przypadków i 15 000 zgonów spodziewanych w 2012 roku1. Wysokie wskaźniki nawrotów wymagają obserwacji przez całe życie, co sprawia, że rak pęcherza moczowego jest jednym z najdroższych nowotworów w leczeniu. Rak pęcherza moczowego, który zaatakował warstwę mięśniową, może dawać przerzuty do wątroby, płuc lub kości przez układ limfatyczny. Multimodalna terapia zaawansowanych nowotworów daje tylko 20-40% przeżycia po 5 latach. Dlatego pilnie potrzebne są skuteczne strategie leczenia mające na celu ograniczenie nawrotów i progresji powierzchownego raka pęcherza moczowego, a także poprawę wyników leczenia u pacjentów z zaawansowaną chorobą.
Rozwój nowych terapii wymaga modeli przedklinicznych do oceny skuteczności po wstępnej ocenie in vitro. Mikrośrodowisko guza może znacząco wpływać na rozwój i reakcję nowotworu, co podkreśla potrzebę modeli przedklinicznych, w których guzy powstają lub mogą zostać ustalone w narządzie pochodzenia. Jednym z podejść jest opracowanie modeli transgenicznych, w których nowotwory powstają spontanicznie lub mogą być indukowane w sposób specyficzny dla narządu. Niedawno opublikowano doskonały protokół transgenicznego modelu raka pęcherza moczowego2. Wadą modeli transgenicznych jest to, że nowotwory mają tendencję do powolnego rozwoju i z mniejszą jednorodnością niż pożądana. Ponadto należy wziąć pod uwagę koszt utrzymania rodziny hodowlanej. Alternatywą dla modeli transgenicznych jest ortotopowa implantacja komórek nowotworowych, która ma tę zaletę, że zapewnia krótkie ramy czasowe dla ustalenia guza u dostępnych na rynku myszy. Podczas gdy niektóre linie komórkowe ludzkiego raka pęcherza moczowego mogą być hodowane ortotopowo (z powodzeniem zastosowaliśmy UM-UC-3), może być pożądane ustalenie guzów u myszy immunokompetentnych. Dwie linie komórkowe raka pęcherza moczowego, które rosną ortotopowo, to MBT-2 i MB493. Ponieważ komórki MBT-2 są zanieczyszczone replikującym się retrowirusem typuC 4, wybraliśmy komórki MB49 do naszych badań. Ważne jest, aby pamiętać, że komórki MB49 zostały wyizolowane od samca myszy, a implantacje ortotopowe są wykonywane ze względów anatomicznych u samic myszy. Ma to tę zaletę, że łatwo identyfikuje wszczepione komórki za pomocą markerów chromosomu Y, ale niedopasowanie płci może być wadą dla badań immunologicznych.
Nabłonek pęcherza moczowego jest wyściełany warstwą glikozaminoglikanu (GAG), która działa jako bariera dla infekcji mikroorganizmami. Bariera ta może również przeszkadzać w implantacji komórek nowotworowych i opracowano kilka metod, aby przezwyciężyć tę trudność (Tabela 1). Elektrokoagulacja jest szeroko stosowana jako fizyczny środek do rozbijania warstwy GAG 5-13, a protokół demonstrujący elektrokoagulację został niedawno opublikowany w JoVE14. Jeśli jednak urządzenie do elektrokoagulacji nie jest dostępne, można również zastosować środki chemiczne do zniszczenia warstwy GAG, takie jak azotan srebra lub poli-L-lizyna15-24. Guzy są skutecznie ustalane przez krótką ekspozycję pęcherza moczowego na niewielką objętość azotanu srebra (5-10 μl, 0,15-1,0 M, ~10 s) lub dłuższy kontakt z poli-L-lizyną (100 μl 0,1 mg/ml przez 20 min) (Tabela 1). Tutaj opisujemy metodę, która wykorzystuje trypsynę w celu ułatwienia implantacji komórek MB49.
W próbie ulepszenia metod leczenia raka pęcherza moczowego, terapia genowa przyciągnęła znaczną uwagę. Z klinicznego punktu widzenia rak pęcherza moczowego jest idealnym celem terapii genowej ze względu na łatwy dostęp do narządu i zdolność do miejscowego dostarczania ładunku. Wektory wirusowe, które zostały zbadane w terapii genowej raka pęcherza moczowego, obejmują onkolityczny wirus opryszczki pospolitej25, retrowirus26, wirus ospy kanaryjskiej27, wirus krowianki, AAV i adenowirus28. W drugiej części naszego protokołu opisujemy metodę dostarczania wirusa, która jest praktycznie identyczna z wkraplaniem komórek nowotworowych. Przedmiotem zainteresowania w naszym laboratorium jest rozwój nowatorskich podejść do dostarczania genów, które oceniamy za pomocą bioluminescencji przy użyciu wektora adenowirusowego, który wyraża transgen lucyferazy. Jednak metodologia cewnikowania pęcherza moczowego może być stosowana do dostarczania różnych środków i dlatego ma szerokie zastosowanie.

<table><tbody><tr><td> Nazwa odczynnika </td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td> Komentarze </td></tr><tr><td> 6-8 tygodniowe samice myszy </td><td>Jackson Laboratories</td><td>Nazwa szczepu: C57BL/6J Numer katalogowy: 000664</td><td> </td></tr><tr><td> Trypsin* </td><td>MediaTech</td><td>MT25-053-CI</td><td> Uzyskany za pośrednictwem Fisher </td></tr><tr><td> DMEM* </td><td></td><td>MediaTechMT10-017-CV</td><td> Uzyskany za pośrednictwem Fisher </td></tr><tr><td> FBS </td><td>Hyklon</td><td>SH30071.03</td><td> Inaktywowany termicznie </td></tr><tr><td> T25* </td><td>Corning Costar</td><td>Nr Corning: 3056 Fisher: 07-200-63</p</td><td>> Otrzymywany przez komórki Fisher </td></tr><tr><td> MB49 </td><td>N/A</td><td>N/A</td><td> Uzyskany od dr Boehle (patrz odniesienie11) </td></tr><tr><td> Puralube Vet Maść* </td><td>Pharmaderm</td><td>Henry Schein Company Nr p:036090-6050059 Fisher: NC9676869</td><td> Uzyskany za pośrednictwem Fisher </td></tr><tr><td> Krem do depilacji: Veet </td><td>lokalna apteka</td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Smar: K-Y Jelly </td><td>apteka lokalna</td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Cewniki* </td><td>Exel International</td><td>Exel International Nie:26751; Fisher: 14-841-21</p</td><td>> Uzyskany przez Fisher </td></tr><tr><td> Isoflurane </td><td>Terrell</td><td>NDC 66794-011-25</td><td> Uzyskany przez aptekę szpitalną </td></tr><tr><td> 1 ml strzykawki gruźlicy z końcówką ślizgową </td><td>Becton Dickinson</td><td>BD309659 Fisher:14-823-434</td><td> </td></tr><tr><td> D-Luciferin </td><td>Gold Biotechnologies</td><td>L-123-1</td><td> </td></tr><tr><td> Ad-CMV-Luc </td><td>VectorBiolabs</td><td>1000; Poproś o amplifikację na dużą skalę i oczyszczanie CsCl do stosowania in vivo </td><td> Czynnik zakaźny wymagający hermetyzacji BSL2 </td></tr><tr><td> Steady-Glo&nbsp; System testowy lucyferazy </td><td>Promega</td><td>E2510 (10 ml), E2520 (100 ml) lub E2550 (10 x 100 ml)</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">*dostępny u wielu dostawców</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td> system anestezjologiczny </td><td>E-Z Systems, Euthanex Corporation</td><td>System anestezjologiczny: 5-portowe urządzenie do oddychania myszą EZ7000 p: EZ109</td><td> Uzyskane przez Fisher </td></tr><tr><td> Xenogen IVIS 200 </td><td>Caliper Life Sciences</td><td>http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm</td><td> </td></tr><tr><td> FLUOstar Optima </td><td>BMG Labtech</td><td>http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2</td><td> </td></tr></tbody></table>

ortotopowy model raka pęcherza moczowego do badań nad dostarczaniem genów

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Rak pęcherza moczowego jest drugim najczęściej występującym nowotworem układu moczowo-płciowego i potrzebne są nowatorskie podejścia terapeutyczne, które mogą zmniejszyć nawroty i progresję. Mikrośrodowisko guza może znacząco wpływać na rozwój guza i odpowiedź na terapię. Dlatego często pożądane jest hodowanie komórek nowotworowych w narządzie, z którego pochodzą. Protokół ten opisuje ortotopowy model raka pęcherza moczowego, w którym komórki mysiego raka pęcherza moczowego MB49 są wkraplane do pęcherza moczowego poprzez cewnikowanie. Udana implantacja komórek nowotworowych w tym modelu wymaga przerwania ochronnej warstwy glikozaminoglikanu, co można osiągnąć za pomocą środków fizycznych lub chemicznych. W naszym protokole pęcherz moczowy jest leczony trypsyną przed wkropleniem komórek. Cewnikowanie pęcherza moczowego może być również stosowane do dostarczania leków po ustaleniu guzów. Protokół ten opisuje dostarczenie konstruktu adenowirusowego, który wyraża gen reporterowy lucyferazy. Chociaż nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem badań krótkoterminowych i koncentruje się na dostarczaniu genów, metodologia cewnikowania pęcherza moczowego u myszy ma szerokie zastosowanie.

Hematuria jest obserwowana u niemal wszystkich myszy w ciągu 8 dni po implantacji 200 000 komórek MB49. Jak pokazano na Rysunku 1, masa pęcherza zwiększa się ponad dwukrotnie – z 34,7±3,3 mg (zakres 31-37 mg, n=4) u myszy bez guzów do 87,5±19,2 mg (zakres 77-120 mg, n=10) u myszy z implantowanymi komórkami MB49. W odniesieniu do dostarczania genów stwierdzono, że obrazowanie myszy 24 h po instylacji wirusa daje silniejszy sygnał niż po 48 h (Rysunek 2). Dostarczanie adenowirusowe wykazuj...

Implantacja komórek nowotworowych do narządu pochodzenia może służyć jako użyteczny model przedkliniczny do oceny nowych terapii. Komórki raka pęcherza moczowego MB49 mogą być hodowane w pęcherzu moczowym po wkropleniu dopęcherzowym. Protokół ten demonstruje cewnikowanie pęcherza myszy w celu implantacji guza i dostarczenia adenowirusa.

Ortotopowy model raka pęcherza moczowego do badań nad dostarczaniem genów

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest spójne i szybkie wywoływanie nowotworów w pęcherzach moczowych myszy, które mogą być następnie wykorzystane do testowania terapii raka pęcherza moczowego. Osiąga się to poprzez wstępne wprowadzenie komórek nowotworowych do pęcherzy moczowych myszy za pomocą cewnikowania. Osiem dni później cewnikowanie jest powtarzane w celu wprowadzenia adenowirusa wykazującego reporterowy gen lucyferazy.Następnie po 24 godzinach mierzy się ekspresję genów wirusowych za pomocą testu lucyferazy. Uzyskane wyniki wskazują warunki, w których można osiągnąć optymalną ekspresję genów. Wizualna demonstracja tej techniki jest kluczowa, ponieważ etapy cewnikowania i wprowadzania substancji są trudne do opanowania, a istnieje ryzyko uszkodzenia pęcherza moczowego lub spowodowania wycieku wprowadzonego materiału.Na dwa dni przed wykonaniem implantacji komórek, wysiać 1 × 10⁶ komórek MB 49 do kolb T 25 zawierających wysokoglukozowe DMEM uzupełnione o 10% FBS. W dniu procedury przygotować trypsynę do pasażowania, rozcieńczając sterylną 0,25% trypsynę klasy hodowlaną w podłożu bazowym DMEM. Umieścić roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C w celu wyrównania temperatury,

an-orthotopic-bladder-cancer-model-for-gene-delivery-studies

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Model nowotworu ototopowego pęcherza moczowego do badań nad dostarczaniem genów

Guzy pęcherza moczowego u myszy żeńskich indukuje się w sposób małoinwazyjny poprzez cewnikowanie, lokalną kauteryzację oraz następującą po niej adhezję komórek raka do miejsc oparzeń.

Ortotopowy model mysiego raka pęcherza moczowego

Ustanowienie ortotopowego modelu nowotworu pęcherza moczowego w celu oceny efektów przeciwnowotworowych wewnątrz pęcherzowo podanego saRNA oraz monitorowanie wzrostu guza za pomocą ultradźwięków i obrazowania bioluminescencyjnego.

Ortotopowy model nowotworu pęcherza moczowego oraz ocena leczenia wewnątrz pęcherzowego za pomocą saRNA

W tym filmie opisujemy ortotopową transplantację hodowanych organoidów guza pęcherza moczowego do mysiego pęcherza moczowego, aby zbadać rolę środowiska narządu w rozwoju nowotworów.

Model organoidów guza pęcherza moczowego: metoda ortotopowego przeszczepu organoidów pęcherza moczowego do mysiego pęcherza biorcy

W tym filmie opisujemy dopęcherzową procedurę dostarczania komórek rakowych do pęcherza moczowego modelu mysiego. Procedura ta pomaga wygenerować ortotopowy model guza pęcherza moczowego, który można wykorzystać do opracowania strategii terapeutycznych.

Modelowanie ortotopowego guza pęcherza moczowego w modelu mysim: procedura dopęcherzowego podawania komórek rakowych do mysiego pęcherza moczowego

Sprawdzona technika szczepienia pierwotnych inwazyjnych ksenoprzeszczepów raka ortotopowego pęcherza moczowego wymaga laparotomii i mobilizacji pęcherza. Procedura ta powoduje znaczną zachorowalność u myszy, jest technicznie trudna i czasochłonna. W związku z tym opracowaliśmy wysoce precyzyjne, przezskórne podejście wykorzystujące kontrolę ultrasonograficzną.

Małoinwazyjne założenie mysich ortotopowych ksenoprzeszczepów pęcherza moczowego

Ten protokół opisuje powstawanie mysich ortotopowych guzów pęcherza moczowego u samic myszy C57BL/6J oraz monitorowanie wzrostu guza.

Mysi ortotopowy model guza pęcherza moczowego i system wykrywania guzów

Opisujemy nowatorską metodę dostarczania plazmidu DNA do komórek urotelialnych pęcherza myszy in vivo poprzez cewnikowanie cewki moczowej i elektroporację. Oferuje szybki i wygodny sposób generowania autochtonicznych mysich modeli chorób pęcherza moczowego.

Nowa metoda dostarczania plazmidowego DNA do nabłonka moczowego myszy za pomocą elektroporacji

Ten protokół opisuje generowanie modeli ortotopowych ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów poprzez dopęcherzowe wkraplanie komórek raka urotelialnego o wysokim stopniu złośliwości lub dodoodbytnicze wstrzykiwanie komórek raka jelita grubego do myszy z nieotyłym cukrzycą/ciężkim złożonym niedoborem odporności (NOD/SCID) w celu pierwotnego wzrostu guza i spontanicznych przerzutów pod wpływem komórek zrębu węzłów chłonnych, co naśladuje postęp ludzkich chorób przerzutowych.

Ortotopowe modele ksenoprzeszczepów pobrane od pacjentów dla ludzkiego raka urotelialnokomórkowego i raka jelita grubego, wzrostu guza i spontanicznych przerzutów

Ten protokół dostarcza szczegółowych kroków eksperymentalnych w celu ustanowienia trójwymiarowej hodowli in vitro organoidów guza pęcherza moczowego pochodzących z wywołanego przez czynnik rakotwórczy mysiego raka pęcherza moczowego. Opisano metody hodowli, w tym pasażowanie, inżynierię genetyczną i ortotopowe przeszczepianie organoidów nowotworowych.

Hodowla, manipulacja i ortotopowe przeszczepienie organoidów guza pęcherza moczowego myszy

Ten protokół opisuje proces generowania i charakterystyki mysich organoidów urotelialnych zawierających delecje w interesujących genach. Metody obejmują pobieranie mysich komórek urotelialnych, transdukcję ex vivo z adenowirusem napędzającym ekspresję Cre za pomocą promotora CMV oraz charakterystykę in vitro i in vivo.

Ex vivo Organoidalny model delecji genów za pośrednictwem adenowirusa-cre w mysich komórkach urotelialnych

Poznaj metodę implantacji komórek raka pęcherza moczowego MB49 u myszy poprzez cewnikowanie oraz dostarczanie adenowirusów z genem reporterowym lucyferazy. Ten protokół umożliwia badanie terapii przeciwnowotworowych in vivo.

Ortotopowy model raka pęcherza moczowego do badań nad dostarczaniem genów

Przeglądaj więcej filmów