Zastosowanie macierzy białkowych z odwróconą fazą (RPPA) do badania zmienności ekspresji białek w poszczególnych nowotworach nerkowokomórkowych

Celem tej procedury jest zbadanie zmienności ekspresji proteomicznej w raku nerki przy użyciu macierzy białek z odwróconą fazą lub RPPA. Osiąga się to poprzez pierwsze mapowanie i selekcję heterogennych obszarów poszczególnych guzów. Drugim krokiem jest ekstrakcja białek z próbek.

Następnie białka są normalizowane i drukowane na szkiełkach RPPA. Ostatnim krokiem jest analiza preparatów przy użyciu przeciwciał przeciwko interesującym nas białkom. Ostatecznie RPPA stosuje się w celu wykazania zróżnicowanej zmienności ekspresji proteomicznej w dwóch grupach leczonych rakiem nerkowokomórkowym.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na niektóre z kluczowych pytań w dziedzinie raka nerkowokomórkowego. Istnieje bowiem wielka niejednorodność białek. Implikacje dla tej techniki są takie, że może ona mieć pozytywny wpływ na leczenie pacjentów z rakiem nerkowokomórkowym, którzy są leczeni terapiami celowanymi.

Dzieje się tak dlatego, że możemy badać zarówno niejednorodność przed, jak i po leczeniu w próbkach tkanek, a tym samym, miejmy nadzieję, zidentyfikować nowe cele terapeutyczne dla pacjentów, u których rozwija się nabyta oporność na te terapie. Demonstracją kriostatu i procedury kolana H będzie kierownik laboratorium badawczego Helen Caldwell, a technikę ekstrakcji białek zademonstruje technik badawczy z naszej grupy, Jo Nanda. Demonstracją druku OR PPA będzie nasz kolega z St.Andrews, Peter Mullen.

Aby rozpocząć tę procedurę, usuń guzy z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i trzymaj na suchym lodzie. Podziel guzy na sekcje o długości około jednego centymetra sześciennego. Odwzoruj pierwotne położenie każdej sekcji guza względem siebie i oznacz ją unikalną nazwą.

Próbki należy pokryć w OCT i pokroić w kriostatu o temperaturze minus 22 stopni Celsjusza po zabarwieniu próbek. Stosując metodę barwienia liczników hematów, toiny i DSN, przeanalizuj zamrożone skrawki za pomocą mikroskopii. Upewnij się, że skrawki są żywym guzem jasnokomórkowego raka nerkowokomórkowego i klasyfikuj je jako o wysokim stopniu złośliwości, niskim stopniu złośliwości lub mieszanym o niskim i wysokim stopniu.

Wybierz do czterech próbek z każdego morfologicznie różniącego się regionu w obrębie każdego guza do ekstrakcji białka, która zostanie zademonstrowana obok ekstrakcji białka z próbek guza. Umieść od 50 do 75 miligramów tkanek. Pokrój z tomografu komputerowego na dwie mililitrowe rurki.

Dodaj 990 mikrolitrów buforu do lizy, uzupełnionego białkiem oraz inhibitorami fosfatazy i proteazy. Dodaj pojedynczą pięciomilimetrową stalową kulkę do każdej probówki i homogenizuj w temperaturze 50 Hz przez pięć minut. Za pomocą lasera tkankowego.

Sprawdź poziom homogenizacji, a następnie homogenizuj przez kolejne pięć minut. Za pomocą pipety przenieś homogenizowaną próbkę do nowej dwumililitrowej probówki, pozostawiając stalową kulkę za 10 mikrolitrami Triton X 100 do każdej próbki, a następnie odwiruj przy 13 000 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatanty S do świeżych mikroprobówek wirówkowych i oznaczyć stężenie białka za pomocą testu BCA.

Znormalizowane stężenie białka do jednego miligrama na mililitr przed naszym drukowaniem PPA. Z każdej próbki wykonuje się serię pięciu dwukrotnych rozcieńczeń. Jednym z najbardziej czasochłonnych aspektów tej procedury jest uzyskanie pomyślnego wyniku setek rozcieńczeń, które można zapewnić poprzez dwukrotne sprawdzenie przed wydrukowaniem preparatów.

Zrobotyzowany obserwator mikrosieci jest następnie używany do wykrywania lizatów białkowych na szkiełkach szklanych pokrytych nitrocelulozą. Każda próbka jest oznaczana w trzech egzemplarzach, co daje w sumie 15 plamek na próbkę. Szkiełka użyte w tym eksperymencie zawierały dwie podkładki, na których nanoszono próbki.

Na każdym klocku wykryto identyczne próbki, w tym przypadku 100 próbek. Inne dostępne formaty to jedna, ośmio- i 16-padowa szkiełka. Im większa liczba elektrodów, tym mniejsza liczba próbek, które mogą znajdować się na każdej z nich.

Aby rozpocząć procedurę wykrywania białek, mokre szkiełka, nadmiar buforu blokującego i inkubować w temperaturze pokojowej Przez godzinę na platformie bujanej przygotuj 800 mikrolitrów przeciwciał pierwszorzędowych w buforze blokującym w pożądanych stężeniach i trzymaj na lodzie. Po godzinnej inkubacji. W przypadku blokowania mocowania bufora prowadnice w klipsie chipowym z pojedynczą ramą lub z czterema uchwytami prowadnic podstawy z szybką ramą, tak aby między suwakiem a komorą inkubacyjną powstało szczelne uszczelnienie.

Usuń pozostały bufor z dołków i dodaj 600 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego do odpowiednich studzienek. Umieść szkiełka i komorę w szczelnie zamkniętym mokrym pudełku i inkubuj na bujanej platformie przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza następnego ranka. Usuń szkiełka z chłodni.

Ostrożnie usuń przeciwciała pierwszorzędowe z każdego z nich. Dobrze dodaj 600 mikro uwolnień 0,1% PBS między 20 a PBST i myj szkiełka na bujanej platformie w temperaturze pokojowej przez pięć minut. W ten sposób zastąp PBST świeżym PBST.

Umyj szkiełka w sumie trzy razy. Usunąć bufor z dołków i dodać 600 mikrolitrów znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał drugorzędowych w odpowiednim rozcieńczeniu do odpowiednich studzienek. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze pokojowej przez 45 minut, delikatnie potrząsając, ważne jest, aby chronić membranę przed światłem do czasu jej skanowania.

Po 45 minutach usunąć przeciwciała drugorzędowe ze studzienek i krótko przemyć trzy razy w 600 mikrolitrach PBST w temperaturze pokojowej. Wyjąć szkiełka z nośnika, przenieść do odpowiedniego pojemnika i myć nadmiar PBST przez 15 minut. Utrzymywanie membrany w ciemności.

Usuń PBST i umyj membranę PBS w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby ponownie usunąć resztki napięcia 20, utrzymując membranę w ciemności. Wypróbuj szybkie slajdy w piekarniku o temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 10 minut. Na koniec zeskanuj szkiełka jako 680 nanometrów i/lub 800 nanometrów, w zależności od użytych przeciwciał drugorzędowych.

Upewnij się, że slajdy są w ciemności, dopóki nie zostaną zeskanowane. Zapisuj obrazy jako pliki T. Przykład zeskanowanego slajdu RPPA można zobaczyć na tym rysunku z pokazanymi kanałami 680 i 800 nanometrów.

Rozdzielenie obrazów według długości fali umożliwia analizę każdej podkładki na szkiełku RPPA i określenie indywidualnej ekspresji białka, jak pokazano tutaj. Ekspresja poszczególnych białek w próbkach jest wyjątkowa, przy czym soina żelowa ma wysoki poziom ekspresji na szkiełku w porównaniu z cmic, który ma znacznie niższą ekspresję białka, ale nadal ulega uniwersalnej ekspresji we wszystkich badanych próbkach. W przeciwieństwie do tego, CD 10 dawał zmienną ekspresję, przy czym niektóre próbki dawały wysoki poziom ekspresji, mimo że inne próbki miały niewielką lub żadną wykrywalną ekspresję.

Wreszcie, p JK dwa nie wytworzył żadnej wykrywalnej ekspresji białka powyżej poziomu tła. Kolejny rysunek podkreśla brak reaktywności krzyżowej między przeciwciałami drugorzędowymi a przeciwciałami pierwszorzędowymi innego gatunku. Obraz w lewym dolnym rogu przedstawia detekcję ekspresji białka za pomocą przeciwciał drugorzędowych skanowanych na odpowiedniej długości fali 680 nanometrów.

Ekspresja białka nie jest wykrywana na obrazie po prawej stronie, skanowanym na niewłaściwej długości fali 800 nanometrów. Przykład super krzywej używanej do analizy porównawczej wszystkich próbek na slajdzie RPPA jest pokazany tutaj. Zielone punkty reprezentują dopuszczalne punkty, a czerwone punkty reprezentują wartości odstające oparte na wstępnie zdefiniowanych limitach w oprogramowaniu analitycznym.

Super krzywa służy do generowania względnych danych dotyczących ekspresji opartej na białkach. Rysunek ten przedstawia poziomy ekspresji reprezentatywnego białka mlh jeden na trzech slajdach RPPA, podkreślając, w jaki sposób RPPA może wykrywać różnice między próbkami poddanymi działaniu substancji i nietraktowanymi. Każda próbka odpowiada tutaj podregionowi guza.

Następny rysunek przedstawia zróżnicowaną ekspresję białka dla mlh one po pogrupowaniu próbek na podstawie traktowania. Wyższą ekspresję MLH one stwierdzono w grupie przed leczeniem, gdy oblicza się wariancję wewnątrznowotworową w ekspresji mlh one między próbkami przed i po leczeniu. Po pogrupowaniu próbek na podstawie poddania działaniu substancji, zaobserwowano większą wariancję w próbkach po poddaniu działaniu substancji.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykorzystać PPA do badania heterogeniczności białek.