Name: Zastosowanie macierzy białkowych z odwróconą fazą (RPPA) do badania zmienności ekspresji białek w poszczególnych nowotworach nerkowokomórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Poznaj zastosowanie macierzy białkowych z odwróconą fazą (RPPA) do analizy zmienności ekspresji białek w nowotworach nerkowokomórkowych. Ta metoda pozwala identyfikować biomarkery odpowiedzi na leczenie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca autorów FCO, DF, JN, DJH i GDS wymienionych powyżej jest finansowana przez Biuro Głównego Naukowca, numer grantu: ETM37 i wspierana przez Cancer Research UK Experimental Cancer Medicine Centre. Praca AL jest finansowana przez Royal College of Surgeons of Edinburgh Robertson Trust, Melville Trust for the care and cure of cancer oraz Medical Research Council. IO jest wspierany przez stypendium Królewskiego Towarzystwa Rządu Szkockiego w Edynburgu, współfinansowane przez działania Marie Curie i Brytyjską Radę ds. Badań Medycznych. Autorzy pragną podziękować współwnioskodawcom i współpracownikom SCOTRRCC za ich użyteczne dyskusje na niektóre z tematów omawianych w tym artykule.

1. Identyfikacja morfologicznej i molekularnej heterogeniczności guza
<ol>
 <li>Guzy usunięto z zamrażarki w temperaturze -80 °C i przechowywano na suchym lodzie.</li>
 <li>Podziel guzy na odcinki o długości około 1 cm3. Odwzoruj pierwotne położenie każdej sekcji guza względem siebie i oznacz ją unikalną nazwą. Przechowywać próbki w oddzielnych kriowiach w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą gotowe do użycia.</li>
 <li>Próbki należy pokryć w OCT i rozciąć w kriosacie w temperaturze -22 °C.</li>
 <li>Próbki barwione metodą przeciwbarwienia Hematoksyliny i Eozyny.</li>
 <li>Analiza mikroskopowa zamrożonych skrawków w celu upewnienia się, że mają one charakter ccRCC, żywotnego guza i do oceny (niski stopień, wysoki stopień lub mieszany niski/wysoki stopień trudności, trudne do rozróżnienia stopnie Fuhrmana od 1 do 4 na zamrożonym skrawku). Rysunek 1 a&b (barwienie H&E o wysokim niskim i mieszanym stopniu).</li>
 <li>Wybierz do 4 próbek z każdego morfologicznie różniącego się regionu w każdym guzie do ekstrakcji białka.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja białka z próbek guza
<ol>
 <li>Wytnij próbkę guza z OCT.</li>
 <li>Umieścić 50-75 mg tkanki w probówkach o pojemności 2 ml z 990 μl buforu do lizy [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EGTA (pH 8,5), 150 mM NaCl] uzupełnionym aprotyniną (Sigma A6279) (10 mg / ml), koktajlem inhibitora fosfatazy 2 (Sigma, P5716), koktajlem inhibitora fosfatazy 3 (Sigma, P0044) i koktajlem inhibitora proteazy (Roche, 11836153001).</li>
 <li>Dodać pojedynczą stalową kulkę o średnicy 5 mm do każdej probówki i dwukrotnie homogenizować pod częstotliwością 50 Hz przez 5 minut za pomocą TissueLyser, sprawdzając poziom homogenizacji po każdym okresie 5 minut.</li>
 <li>Przenieść homogenizowaną próbkę do nowej probówki o pojemności 2 ml za pomocą pipety, pozostawiając stalową kulkę.</li>
 <li>Dodać 10 μl Triton X-100 do każdej próbki przed odwirowaniem w temperaturze 13 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Przenieść supernatanty do świeżych probówek do mikrowirówek.</li>
 <li>Określ stężenie białka za pomocą testu BCA (ryc. 2).</li>
 <li>Normalizować stężenie białka na poziomie 1 mg/ml.</li>
</ol>
3. Walidacja przeciwciał
<ol>
 <li>Przygotuj próbki białek (wyekstrahowane z odpowiednich linii komórkowych lub tkanek) do western blot i uruchom na 10% żelu SDS-PAGE.</li>
 <li>Przenieść próbki na membranę nitrocelulozową przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Zablokuj membranę w buforze blokującym Li-Cor Odyssey (rozcieńczonym w stosunku 50:50 w PBS) na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała w buforze blokującym Li-Cor Odyssey (rozcieńczonym w stosunku 50:50 w PBS) w zalecanym przez producenta rozcieńczeniu, zwykle 1 na 1,000.</li>
 <li>Inkubować błonę w przeciwciałach pierwszorzędowych przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Uzupełnić 0,1% PBS-Tween20 (PBS-T; 1 ml Tween20 /1L PBS).</li>
 <li>Membranę myć w PBS-T w temperaturze pokojowej przez 5 min (x3).</li>
 <li>Rozcieńczyć znakowane fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowe w buforze blokującym Odyssey (rozcieńczonym 50:50 w PBS) 0,01% SDS w rozcieńczeniu 1:10 000 (1,5 μl/15 ml).</li>
 <li>Inkubować błonę w przeciwciałach drugorzędowych w temperaturze pokojowej przez 45 minut, delikatnie wstrząsając - ważne jest, aby chronić membranę przed światłem do czasu, gdy zostanie ostatecznie zeskanowana.</li>
 <li>Umyj membranę w PBS-T w temperaturze pokojowej przez 5 minut (x3), trzymając membranę w ciemności.</li>
 <li>Umyj membranę w PBS w temperaturze pokojowej przez 5 minut (x3), aby usunąć resztki Tween20, ponownie utrzymując membranę w ciemności.</li>
 <li>Połóż membranę płasko na kawałku bibuły filtracyjnej w ciemności i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu - pozwolenie membranie na wyschnięcie może wzmocnić sygnał i zmniejszyć tło, ale uczynić ją bezużyteczną do usuwania i ponownego sondowania.</li>
 <li>Zeskanuj membranę za pomocą skanera LiCor Odyssey. Trzymaj membranę w ciemności do czasu, gdy zostanie zeskanowana.</li>
 <li>Wybieraj tylko przeciwciała, które generują pojedynczy dominujący prążek o odpowiedniej masie cząsteczkowej. Rycina 3 przedstawia przykłady dopuszczalnych i niedopuszczalnych przeciwciał do stosowania z RPPA.</li>
</ol>
4. Drukowanie RPPA
<ol>
 <li>Lizaty białkowe naniesiono na szkiełka pokryte nitrocelulozą (Fastslides-Whatman) za pomocą robota spottera MicroGrid II. Użyte preparaty zawierały 2 podkładki, na których nanoszono próbki. Na każdej klocku wykryto identyczne próbki, w tym przypadku 100 próbek. Inne dostępne formaty to prowadnice z 1, 8 i 16 padami. Im większa liczba padów, tym mniejsza liczba próbek, które można dostrzec na każdej</li> z nich.
 <li>Z każdej próbki wykonano serię pięciu 2-krotnych rozcieńczeń, a następnie każdą z nich nakrapiano w trzech egzemplarzach (co dało w sumie 15 plamek na próbkę).</li>
</ol>
5. Wykrywanie białek RPPA
<ol>
 <li>Mokre szkiełka w nadmiarze buforu blokującego LiCor (rozcieńczonego 50:50 w PBS). Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na platformie bujanej.</li>
 <li>Przygotować 800 μl przeciwciał pierwszorzędowych w buforze blokującym LiCor (rozcieńczonym w stosunku 50:50 w PBS) w pożądanych stężeniach i przechowywać na lodzie.</li>
 <li>Zamontuj szkiełka w (i) pojedynczym ramie Chip Clip lub (ii) czterokomorowym uchwycie prowadnicy "FastFrame" tak, aby między szkiełkiem a komorą inkubacyjną powstało szczelne uszczelnienie.</li>
 <li>Usunąć resztkowy bufor z dołków i dodać 600 μl przeciwciała pierwszorzędowego do odpowiednich studzienek.</li>
 <li>Umieścić szkiełko i komorę w szczelnie zamkniętym mokrym pojemniku i inkubować na platformie bujanej przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Uzupełnić 0,1% PBS-Tween20 (PBS-T; 100 μl Tween 20 /100 ml PBS).</li>
 <li>Wyjmij szkiełka z chłodni i ostrożnie usuń pierwotne przeciwciała z każdej studzienki.</li>
 <li>Dodaj 600 μl PBS-T i myj szkiełka na platformie bujanej w temperaturze RT przez 5 minut (X3).</li>
 <li>Przygotować znakowane fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowe, najpierw rozcieńczając w buforze blokującym Odyssey (rozcieńczonym 50:50 w PBS) 0,01% SDS w rozcieńczeniu 1:2,000 (1 μl/2 ml).</li>
 <li>Usunąć bufor z dołków i dodać 600 μl znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał drugorzędowych do odpowiednich studzienek. Inkubować przeciwciała drugorzędowe w temperaturze pokojowej przez 45 minut, delikatnie potrząsając - ważne jest, aby chronić membranę przed światłem do czasu, gdy zostanie ostatecznie zeskanowana.</li>
 <li>Usunąć przeciwciała drugorzędowe ze studzienki i krótko przemyć (x3) w 600 μl PBS-T w temperaturze pokojowej. Wyjąć szkiełko z nośnika, przenieść do odpowiedniego pojemnika i myć nadmiar PBS-T przez 15 minut, trzymając membranę w ciemności.</li>
 <li>Usuń PBS-T i dalej myj membranę PBS w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby usunąć resztki Tween-20, ponownie utrzymując membranę w ciemności.</li>
 <li>Suszyć Fastslide w piekarniku w temperaturze 50 °C przez 10 minut, a następnie zeskanować na skanerze Li-Cor Odyssey. Trzymaj slajd w ciemności, dopóki nie zostanie zeskanowany.</li>
 <li>Zeskanuj szkiełko przy długości fali 680 nm i/lub 800 nm, w zależności od użytego przeciwciała lub przeciwciał drugorzędowych. Do wykrywania dwukolorowego zawsze używaj wysoce zaadsorbowanych przeciwciał drugorzędowych, aby zminimalizować reaktywność krzyżową. Staranny dobór przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych jest konieczny do wykrywania dwukolorowego. Zasadnicze znaczenie ma selekcja różnych gatunków żywicieli (np. królika i myszy) dla dwóch podstawowych przeciwciał. Pozwala to na dyskryminację za pomocą drugorzędowych przeciwciał anty-króliczych i anty-myszy, które są znakowane barwnikiem o łatwo rozróżnialnych widmach emisyjnych.</li>
 <li>Pliki obrazów są zapisywane jako pliki .tiff. Rysunek 4 (obraz zeskanowanych plików).</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
 <li>Uruchom oprogramowanie MicroVigene (VigeneTech, Carlisle, MA, USA).</li>
 <li>Otwórz plik obrazu .tiff zawierający skan slajdu RPPA.</li>
 <li>Wybierz predefiniowany plik szablonu, który będzie zawierał siatkę do nałożenia na obraz slajdu RPPA.</li>
 <li>Kliknij przycisk Zdefiniuj obszary zainteresowania (ROI), aby wyświetlić siatkę.</li>
 <li>Umieść siatkę nad miejscami RPPA. Rysunek 6a (obraz siatki nad obrazem).</li>
 <li>Kliknij przycisk Zaznacz WSZYSTKO, aby podświetlić cały zwrot z inwestycji.</li>
 <li>Kliknij przycisk Znajdź wszystko. MicroVigene automatycznie znajdzie zwrot z inwestycji, znajdzie plamy, odejmie tło, usunie kurz i określi ilościowo plamy.</li>
 <li>Kliknij przycisk Wyświetl krzywą rozcieńczenia, aby wyświetlić wyniki dla wszystkich próbek na slajdzie RPPA.</li>
 <li>Kliknij Zapisz dane rozcieńczenia.</li>
 <li>Ponieważ każda próbka jest drukowana w 5 punktach rozcieńczenia, z których każdy jest w trzech egzemplarzach, do analizy jest 15 punktów, co zmniejsza ryzyko błędów i poprawia jakość dopasowania krzywej. MicroVigene tworzy 4-parametrowy algorytm "Supercurve" modelu logarytmu logistycznego (Rysunek 6b), który obejmuje wszystkie plamki w celu wytworzenia sigmoidalnej krzywej kinetyki wiązania antygen-przeciwciało. Zakłada się, że ta sama kinetyka wiązania przeciwciało-antygen zachodzi w każdym miejscu próbki, nawet w różnych próbkach, więc biorąc wszystkie miejsca na tablicy w celu dopasowania do wspólnej krzywej odpowiedzi, można zwiększyć pewność krzywej pasującej10,11 
 Y=a+ ((b-a)/(1+e(c*d-ln(x)))) 
 gdzie x jest współczynnikiem rozcieńczenia, a Y jest natężeniem sygnału. 
 Próbki można analizować porównawczo przy użyciu wartości y0, która w naszej analizie odpowiadała wartości y w punkcie środkowym wartości x po odwzorowaniu ich na superkrzywej.</li>
 <li>Wyeksportuj dane do programu Microsoft Excel i wykreśl y0, jak na rysunku 7.</li>
 <li>Wariancja białka wewnątrznowotworowego została obliczona oddzielnie dla pacjentów nieleczonych i leczonych w ramach ANOVA. Rozkłady wariancji łączące dane ze wszystkich analizowanych białek porównano za pomocą testu Manna-Whitneya (MWT). Wariancje wewnątrznowotworowe dla poszczególnych białek porównano za pomocą testu F, w którym utrzymały się założenia normalności i homoskedastyczności, ocenione odpowiednio za pomocą testów Lillefoursa i Flignera; Zastosowano korektę współczynnika fałszywych wykryć (FDR)12. Zróżnicowaną ekspresję białek między próbkami pacjentów nieleczonych i leczonych badano dla każdego białka za pomocą testu t studenta, w którym spełnione były założenia normalności i homoskedastyczności, w przeciwnym razie przeprowadzono MWT; FDR zastosowano w połączonym teście t i wartościach MWT 12. Znaczenie korelacji Pearsona i ekspresji białek dla białek oszacowano przy użyciu standardowego podejścia [odniesienie R] i zastosowano FDR 12.</li>
</ol>

<ol><li>Stewart, G. D., O'Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+can+molecular+pathology+contribute+to+the+management+of+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma.</a> Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).</li>
<li>Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+and+biomarker+analysis+of+sunitinib+in+patients+with+bevacizumab-refractory+metastatic+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma.</a> J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).</li>
<li>Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+biomarker+discovery+through+the+parallel+integration+of+clinical+trial+and+functional+genomics+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets.</a> Genome Med. 2, 52(2010).</li>
<li>Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+BCR-ABL+kinase+domain+mutations+in+chronic+myeloid+leukemia+after+sequential+treatment+with+multiple+tyrosine+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors.</a> Blood. 110, 4005-4011 (2007).</li>
<li>Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).</li>
<li>Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter+and+intratumour+heterogeneity%3A+a+barrier+to+individualized+medical+therapy+in+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma.</a> Front. Oncol. 2, 49(2012).</li>
<li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li>
<li>O'Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+automated+quantitative+analysis+to+evaluate+epithelial-to-mesenchymal+transition+associated+proteins+in+clear+cell+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma.</a> PLoS One. 7, e31557(2012).</li>
<li>Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse-phase+protein+lysate+microarrays+for+cell+signaling+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis.</a> Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).</li>
<li>Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-parametric+quantification+of+protein+lysate+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Non-parametric quantification of protein lysate arrays.</a> Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).</li>
<li>Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+protein+arrays+for+quantitative+systems+analysis+of+the+dynamics+of+signaling+pathway+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions.</a> Proteome Sci. 9, 53(2011).</li>
<li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+False+Discovery+Rate%3A+A+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society+Series+B+%28Methodological%29%22%5BJournal%5D)">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Przedstawiona tutaj metoda RPPA stanowi wysokoprzepustową alternatywę dla szeroko stosowanej, ale stosunkowo niskoprzepustowej techniki analizy białek western blot. Metoda ta pozwala na półilościową analizę i jednoczesne porównywanie setek próbek, co pozwala na bezpośrednie porównanie kluczowych białek w szerokim wyborze linii komórkowych i próbek tkanek. Multipleksowanie z różnymi gatunkami przeciwciał dodatkowo zwiększa moc tej techniki, umożliwiając jednoczesne stosowanie wielu przeciwciał. Przedstawiony przykład podk...

<table><tbody><tr><td>aprotynina</td> Koktajl inhibitorów fosfatazy <td>Sigma</td><td>A6279</td><td></td></tr> 2 <tr><td>Koktajl inhibitorów fosfatazy</td><td></td><td></td> Sigma P5726 3 Koktajl inhibitorów proteazy Sigma P0044 <td></td></tr><tr><td></td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Triton-X</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Li-Cor Odyssey Bufor blokujący <td></td></tr><tr><td></td><td>Li-Cor</td><td>927-40000</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser</td><td>Qiagen</td><td>85600</td><td></td></tr><tr><td>MicroGrid II Spotter robotyczny</td><td>Biorobotics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FastFrame czterokieszeniowy uchwyt na prowadnice</td><td>Whatman</td><td>10486001</td><td></td></tr><tr><td>FAST Slide - 2-padowy</td><td>Whatman</td><td>10485317</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680LT Goat anty-mysi IgG Licor</td><td></td><td>926-68020</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Koza anty-królicza IgG Licor</td><td></td><td>926-32211</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie macierzy białkowych z odwróconą fazą (rppa) do badania zmienności ekspresji białek w poszczególnych nowotworach nerkowokomórkowych

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Obecnie nie ma leczenia przerzutowego raka jasnokomórkowego nerki, najczęstszego wariantu choroby. Uważa się, że kluczowym czynnikiem wpływającym na tę oporność na leczenie jest złożoność molekularna choroby 1. Stosowano terapię celowaną, taką jak inhibitor kinazy tyrozynowej (TKI)-sunitynib, ale tylko 40% pacjentów odpowie na leczenie, przy czym u przytłaczającej większości tych pacjentów nastąpi nawrót choroby w ciągu 1 roku 2. W związku z tym kwestia wewnętrznej i nabytej oporności u pacjentów z rakiem nerkowokomórkowym jest bardzo istotna 3.
Aby zbadać oporność na TKI, mając na celu opracowanie skutecznych, spersonalizowanych metod leczenia, wymagane jest sekwencyjne badanie tkanek po określonym okresie terapii celowanej, podejście, które okazało się skuteczne w przewlekłej białaczce szpikowej 4. Jednak zastosowanie takiej strategii w raku nerkowokomórkowym jest skomplikowane ze względu na wysoki poziom heterogeniczności zarówno między-, jak i wewnątrznowotworowej, co jest cechą raka nerkowokomórkowego5,6, a także innych guzów litych 7. Heterogeniczność międzynowotworowa wynikająca z różnic transkryptomicznych i genetycznych jest dobrze znana nawet u pacjentów z podobnym obrazem, stadium i stopniem guza. Ponadto oczywiste jest, że w RCC występuje duża heterogeniczność morfologiczna (wewnątrznowotworowa), co prawdopodobnie oznacza jeszcze większą heterogeniczność molekularną. Szczegółowe mapowanie i kategoryzacja nowotworów RCC za pomocą połączonej analizy morfologicznej i oceny Fuhrmana pozwala na wybór reprezentatywnych obszarów do analizy proteomicznej.
Analiza RCC8 oparta na białku jest atrakcyjna ze względu na jej powszechną dostępność w laboratoriach patologicznych; jednak jej zastosowanie może być problematyczne ze względu na ograniczoną dostępność specyficznych przeciwciał 9. Ze względu na punktowy charakter matryc białkowych odwróconej fazy (RPPA), swoistość przeciwciał musi być wstępnie zwalidowana; W związku z tym ścisła kontrola jakości stosowanych przeciwciał ma ogromne znaczenie. Pomimo tego ograniczenia, format igłów punktowych pozwala na miniaturyzację testu, co pozwala na drukowanie setek próbek na jednym szkiełku nitrocelulozowym. Wydrukowane preparaty mogą być następnie analizowane w podobny sposób jak analiza zachodnia przy użyciu docelowych specyficznych przeciwciał pierwszorzędowych i fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał drugorzędowych, co pozwala na multipleksowanie. Zróżnicowana ekspresja białek we wszystkich próbkach na szkiełku może być następnie analizowana jednocześnie, porównując względny poziom fluorescencji w sposób bardziej opłacalny i wysokoprzepustowy.

Przykład zeskanowanego slajdu RPPA można zobaczyć na Ryc. 4(i), gdzie przedstawiono kanały 680 i 800 nm. Dzięki rozdzieleniu obrazów według długości fali, Ryc. 4(ii) umożliwia analizę każdego pola na slajdzie RPPA i określenie ekspresji poszczególnych białek Ryc. 4(iii). Jak widać na Ryc. 4(iii), ekspresja poszczególnych białek w próbkach jest unikalna; Gelsolina wykazuje wysoki poziom ekspresji na całym slajdzie w porównaniu do cMYC, który ma znacznie n...

RPPA umożliwia jednoczesne badanie ekspresji białek setek próbek, wydrukowanych na szkiełkach nitrocelulozowych, przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał. Technika ta została zastosowana do zbadania wpływu heterogeniczności leczenia farmakologicznego w obrębie jasnokomórkowego raka nerki.

Zastosowanie macierzy białkowych z odwróconą fazą (RPPA) do badania zmienności ekspresji białek w poszczególnych nowotworach nerkowokomórkowych

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

Celem tej procedury jest zbadanie zmienności ekspresji proteomicznej w raku nerki przy użyciu macierzy białek z odwróconą fazą lub RPPA. Osiąga się to poprzez pierwsze mapowanie i selekcję heterogennych obszarów poszczególnych guzów. Drugim krokiem jest ekstrakcja białek z próbek.Następnie białka są normalizowane i drukowane na szkiełkach RPPA. Ostatnim krokiem jest analiza preparatów przy użyciu przeciwciał przeciwko interesującym nas białkom. Ostatecznie RPPA stosuje się w celu wykazania zróżnicowanej zmienności ekspresji proteomicznej w dwóch grupach leczonych rakiem nerkowokomórkowym.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na niektóre z kluczowych pytań w dziedzinie raka nerkowokomórkowego. Istnieje bowiem wielka niejednorodność białek. Implikacje dla tej techniki są takie, że może ona mieć pozytywny wpływ na leczenie pacjentów z rakiem nerkowokomórkowym, którzy są leczeni terapiami celowanymi.Dzieje się tak dlatego, że możemy badać zarówno niejednorodność przed, jak i po leczeniu w próbkach tkanek, a tym samym, miejmy nadzieję, zidentyfikować nowe cele terapeutyczne dla pacjentów, u których rozwija się nabyta oporność na te terapie. Demonstracją kriostatu i procedury kolana H będzie kierownik laboratorium badawczego Helen Caldwell, a technikę ekstrakcji białek zademonstruje technik badawczy z naszej grupy, Jo Nanda. Demonstracją druku OR PPA będzie nasz kolega z St.Andrews, Peter Mullen.Aby rozpocząć tę procedurę, usuń guzy z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i trzymaj na suchym lodzie. Podziel guzy na sekcje o długości około jednego centymetra sześciennego. Odwzoruj pierwotne położenie każdej sekcji guza względem siebie i oznacz ją unikalną nazwą.Próbki należy pokryć w OCT i pokroić w kriostatu o temperaturze minus 22 stopni Celsjusza po zabarwieniu próbek. Stosując metodę barwienia liczników hematów, toiny i DSN, przeanalizuj zamrożone skrawki za pomocą mikroskopii. Upewnij się, że skrawki są żywym guzem jasnokomórkowego raka nerkowokomórkowego i klasyfikuj je jako o wysokim stopniu złośliwości, niskim stopniu złośliwości lub mieszanym o niskim i wysokim stopniu.Wybierz do czterech próbek z każdego morfologicznie różniącego się regionu w obrębie każdego guza do ekstrakcji białka, która zostanie zademonstrowana obok ekstrakcji białka z próbek guza. Umieść od 50 do 75 miligramów tkanek. Pokrój z tomografu komputerowego na dwie mililitrowe rurki.Dodaj 990 mikrolitrów buforu do lizy, uzupełnionego białkiem oraz inhibitorami fosfatazy i proteazy. Dodaj pojedynczą pięciomilimetrową stalową kulkę do każdej probówki i homogenizuj w temperaturze 50 Hz przez pięć minut. Za pomocą lasera tkankowego.Sprawdź poziom homogenizacji, a następnie homogenizuj przez kolejne pięć minut. Za pomocą pipety przenieś homogenizowaną próbkę do nowej dwumililitrowej probówki, pozostawiając stalową kulkę za 10 mikrolitrami Triton X 100 do każdej próbki, a następnie odwiruj przy 13 000 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatanty S do świeżych mikroprobówek wirówkowych i oznaczyć stężenie białka za pomocą testu BCA.Znormalizowane stężenie białka do jednego miligrama na mililitr przed naszym drukowaniem PPA. Z każdej próbki wykonuje się serię pięciu dwukrotnych rozcieńczeń. Jednym z najbardziej czasochłonnych aspektów tej procedury jest uzyskanie pomyślnego wyniku setek rozcieńczeń, które można zapewnić poprzez dwukrotne sprawdzenie przed wydrukowaniem preparatów.Zrobotyzowany obserwator mikrosieci jest następnie używany do wykrywania lizatów białkowych na szkiełkach szklanych pokrytych nitrocelulozą. Każda próbka jest oznaczana w trzech egzemplarzach, co daje w sumie 15 plamek na próbkę. Szkiełka użyte w tym eksperymencie zawierały dwie podkładki, na których nanoszono próbki.Na każdym klocku wykryto identyczne próbki, w tym przypadku 100 próbek. Inne dostępne formaty to jedna, ośmio- i 16-padowa szkiełka. Im większa liczba elektrodów, tym mniejsza liczba próbek, które mogą znajdować się na każdej z nich.Aby rozpocząć procedurę wykrywania białek, mokre szkiełka, nadmiar buforu blokującego i inkubować w temperaturze pokojowej Przez godzinę na platformie bujanej przygotuj 800 mikrolitrów przeciwciał pierwszorzędowych w buforze blokującym w pożądanych stężeniach i trzymaj na lodzie. Po godzinnej inkubacji. W przypadku blokowania mocowania bufora prowadnice w klipsie chipowym z pojedynczą ramą lub z czterema uchwytami prowadnic podstawy z szybką ramą, tak aby między suwakiem a komorą inkubacyjną powstało szczelne uszczelnienie.Usuń pozostały bufor z dołków i dodaj 600 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego do odpowiednich studzienek. Umieść szkiełka i komorę w szczelnie zamkniętym mokrym pudełku i inkubuj na bujanej platformie przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza następnego ranka. Usuń szkiełka z chłodni.Ostrożnie usuń przeciwciała pierwszorzędowe z każdego z nich. Dobrze dodaj 600 mikro uwolnień 0,1% PBS między 20 a PBST i myj szkiełka na bujanej platformie w temperaturze pokojowej przez pięć minut. W ten sposób zastąp PBST świeżym PBST.Umyj szkiełka w sumie trzy razy. Usunąć bufor z dołków i dodać 600 mikrolitrów znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał drugorzędowych w odpowiednim rozcieńczeniu do odpowiednich studzienek. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze pokojowej przez 45 minut, delikatnie potrząsając, ważne jest, aby chronić membranę przed światłem do czasu jej skanowania.Po 45 minutach usunąć przeciwciała drugorzędowe ze studzienek i krótko przemyć trzy razy w 600 mikrolitrach PBST w temperaturze pokojowej. Wyjąć szkiełka z nośnika, przenieść do odpowiedniego pojemnika i myć nadmiar PBST przez 15 minut. Utrzymywanie membrany w ciemności.Usuń PBST i umyj membranę PBS w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby ponownie usunąć resztki napięcia 20, utrzymując membranę w ciemności. Wypróbuj szybkie slajdy w piekarniku o temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 10 minut. Na koniec zeskanuj szkiełka jako 680 nanometrów i/lub 800 nanometrów, w zależności od użytych przeciwciał drugorzędowych.Upewnij się, że slajdy są w ciemności, dopóki nie zostaną zeskanowane. Zapisuj obrazy jako pliki T. Przykład zeskanowanego slajdu RPPA można zobaczyć na tym rysunku z pokazanymi kanałami 680 i 800 nanometrów.Rozdzielenie obrazów według długości fali umożliwia analizę każdej podkładki na szkiełku RPPA i określenie indywidualnej ekspresji białka, jak pokazano tutaj. Ekspresja poszczególnych białek w próbkach jest wyjątkowa, przy czym soina żelowa ma wysoki poziom ekspresji na szkiełku w porównaniu z cmic, który ma znacznie niższą ekspresję białka, ale nadal ulega uniwersalnej ekspresji we wszystkich badanych próbkach. W przeciwieństwie do tego, CD 10 dawał zmienną ekspresję, przy czym niektóre próbki dawały wysoki poziom ekspresji, mimo że inne próbki miały niewielką lub żadną wykrywalną ekspresję.Wreszcie, p JK dwa nie wytworzył żadnej wykrywalnej ekspresji białka powyżej poziomu tła. Kolejny rysunek podkreśla brak reaktywności krzyżowej między przeciwciałami drugorzędowymi a przeciwciałami pierwszorzędowymi innego gatunku. Obraz w lewym dolnym rogu przedstawia detekcję ekspresji białka za pomocą przeciwciał drugorzędowych skanowanych na odpowiedniej długości fali 680 nanometrów.Ekspresja białka nie jest wykrywana na obrazie po prawej stronie, skanowanym na niewłaściwej długości fali 800 nanometrów. Przykład super krzywej używanej do analizy porównawczej wszystkich próbek na slajdzie RPPA jest pokazany tutaj. Zielone punkty reprezentują dopuszczalne punkty, a czerwone punkty reprezentują wartości odstające oparte na wstępnie zdefiniowanych limitach w oprogramowaniu analitycznym.Super krzywa służy do generowania względnych danych dotyczących ekspresji opartej na białkach. Rysunek ten przedstawia poziomy ekspresji reprezentatywnego białka mlh jeden na trzech slajdach RPPA, podkreślając, w jaki sposób RPPA może wykrywać różnice między próbkami poddanymi działaniu substancji i nietraktowanymi. Każda próbka odpowiada tutaj podregionowi guza.Następny rysunek przedstawia zróżnicowaną ekspresję białka dla mlh one po pogrupowaniu próbek na podstawie traktowania. Wyższą ekspresję MLH one stwierdzono w grupie przed leczeniem, gdy oblicza się wariancję wewnątrznowotworową w ekspresji mlh one między próbkami przed i po leczeniu. Po pogrupowaniu próbek na podstawie poddania działaniu substancji, zaobserwowano większą wariancję w próbkach po poddaniu działaniu substancji.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykorzystać PPA do badania heterogeniczności białek.

the-use-reverse-phase-protein-arrays-rppa-to-explore-protein

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Zastosowanie odwróconych mikroarrayów białkowych fazy (RPPA) do badania różnic w ekspresji białek w pojedynczych rakach komórek nerczycowych

Zaprezentujemy konfigurację i analizę tablic 96-dołkowych pre-microRNA do QPCR, przeprowadzonych zarówno przy użyciu robota, jak i ręcznie za pomocą wielokanałowej pipety Thermo Scientific Matrix.

Profilowanie pre-microRNA i microRNA z wykorzystaniem matryc ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Ten film demonstruje metodologię wykonywania Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) w celu zbadania wzorców ekspresji białek z lizatu komórkowego. W RPPA, lizat zawierający mieszaninę białek jest drukowany na szkiełkach nitrocelulozowych, a interesujące białka są analizowane za pomocą fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał.

Analiza ekspresji białek oparta na macierzach białek w odwróconej fazie: procedura jednoczesnej kwantyfikacji ekspresji wielu białek z lizatu komórkowego

Implementacja ortotopowego modelu raka nerkowokomórkowego u myszy immunokompetentnych daje badaczowi klinicznie istotny system zdefiniowany przez obecność pierwotnego guza nerki i przerzutów do płuc u tego samego zwierzęcia. System ten może być stosowany do przedklinicznego testowania różnych metod leczenia in vivo.

Syngeniczny mysi model przerzutowego raka nerkowokomórkowego do ilościowej i podłużnej oceny terapii przedklinicznych

Ten manuskrypt opisuje analizę zmienności liczby kopii przeprowadzoną w DNA surowicy lub osocza przy użyciu metody PCR w czasie rzeczywistym. Metoda ta jest odpowiednia do przewidywania oporności na leki u pacjentów z rakiem gruczołu krokowego opornym na kastrację, ale może być również pouczająca w przypadku innych chorób.

Wykrywanie liczby kopii w surowicy i osoczu za pomocą PCR w czasie rzeczywistym

Tutaj prezentujemy protokół dla macierzy przeciwciał do identyfikacji zmian w szlakach sygnałowych w różnych modelach komórkowych. Zmiany te, spowodowane przez leki/niedotlenienie/światło ultrafioletowe/promieniowanie lub przez nadekspresję/regulację w dół/nokauty, są ważne dla różnych modeli choroby i mogą wskazywać, czy terapia będzie skuteczna lub czy mogą zidentyfikować mechanizmy oporności na leki.

Ocena oporności na inhibitory kinazy tyrozynowej poprzez badanie szlaków transdukcji sygnału przez macierze przeciwciał

Przedstawiono szczegółowy protokół generowania samodzielnie składających się mikromacierzy białek ludzkich do badań przesiewowych inhibitorów kinaz.

Badania przesiewowe inhibitorów kinaz w samoorganizujących się mikromacierzach białek ludzkich

Rak jasnokomórkowy nerki z przerzutami jest chorobą, która nie posiada kompleksowego modelu zwierzęcego do dokładnych badań przedklinicznych. Protokół ten ilustruje dwa nowatorskie modele zwierzęce choroby: ortotopowo wszczepiony model myszy i model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka, z których oba wykazują przerzuty do płuc przypominające przypadki kliniczne.

Porównanie modelu przerzutowego raka jasnokomórkowego nerki ustalonej w nerce myszy i na błonie kosmówkowo-omoczniowej kurczaka

Tutaj prezentujemy protokoły, które szczegółowo opisują instrukcje dotyczące wdrażania hodowli komórkowych 3D przy użyciu matryc kolagenowych i kolagenowo-agarozowych w systemie mikrofizjologicznym. Protokoły te wspierają kogenerację kanalików proksymalnych nerek i sferoidów raka nerkowokomórkowego, symulując warunki in vivo i umożliwiając zaawansowane badania interakcji komórek raka nerki.

Kohodowla mikroprzepływowa zdrowych nerek i nabłonka guza w celu modelowania progresji raka nerki

Dane proteomiczne oparte na spektrometrii mas są dostępne w otwartych bazach danych i dostępne za pomocą bezpłatnych narzędzi. Biorąc pod uwagę złożoność przeszukiwania i opisywania baz danych, wielu biologom brakuje wiedzy, aby wykorzystać te zestawy danych. W tym miejscu przedstawiamy przewodnik dotyczący korzystania z bezpłatnych narzędzi do podstawowego wyszukiwania danych proteomicznych.

Poruszanie się po danych proteomicznych opartych na spektrometrii mas przy użyciu bezpłatnych narzędzi obliczeniowych

Precyzyjny mysi model ostrego uszkodzenia nerek (AKI) wywołanego niedokrwieniem jest ważnym narzędziem do badania ostrego uszkodzenia nerek i potencjalnego poszukiwania środków terapeutycznych do leczenia uszkodzeń nerek. System obciążników wiszących zapewnia narzędzie do natychmiastowej i niezawodnej okluzji oraz reperfuzji tętnicy nerkowej bez powodowania zastoju nerkowego.

Zastosowanie systemu obciążeń wiszących do izolowanej okluzji tętnicy nerkowej

Poznaj zastosowanie macierzy białkowych z odwróconą fazą (RPPA) do analizy zmienności ekspresji białek w nowotworach nerkowokomórkowych. Ta metoda pozwala identyfikować biomarkery odpowiedzi na leczenie.

Zastosowanie macierzy białkowych z odwróconą fazą (RPPA) do badania zmienności ekspresji białek w poszczególnych nowotworach nerkowokomórkowych (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie macierzy białkowych z odwróconą fazą (RPPA) do badania zmienności ekspresji białek w poszczególnych nowotworach nerkowokomórkowych

Przeglądaj więcej filmów