Mysi model Citrobacter rodentium: badanie udziału patogenów i gospodarza w zakaźnym zapaleniu jelita grubego

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie zapalenia jelita grubego poprzez zakażenie myszy patogenem lustrzanym Gram-ujemnym, gryzoniem citrobacter, co pozwoli na badanie interakcji patogenu i gospodarza w przewodzie pokarmowym. Osiąga się to poprzez pierwsze zaszczepienie, kulturę zerowego odkupienia z dnia na dzień. W drugim etapie myszy są zarażane przez zgłębnik doustny z nocnym inokulum.

Następnie, w siódmym dniu po zakażeniu, podczas ostatniego etapu pobiera się jelito ślepe, okrężnicę i zawartość światła. Tkanki są platerowane, kolonie bakteryjne są liczone, a tkanki są immunologicznie wybarwiane dla interesujących białek gospodarza. Ostatecznie obciążenie patogenem, funkcję bariery, uszkodzenia histologiczne i zmiany w odpowiedzi gospodarza można ocenić za pomocą immunohistochemii.

Chociaż metoda ta oferuje solidny model zakaźnego zapalenia jelita grubego, pozwalający na badanie interakcji patogenów gospodarza i odpowiedzi immunologicznych, można ją również dostosować do badania wpływu infekcji bakteryjnej na ryzyko raka jelita grubego. Ogólnie rzecz biorąc, u osób nowych w tej metodzie naturalnie zmaga się z infekcją bakteryjną myszy, z lub z lub z grubością. Zacznij od użycia sterylnej pętli zaszczepiającej, aby rozprowadzić żywotne odkupienie C z zamrożonego glicerolu na galwankę LB.

Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza użyj pętli zaszczepiającej, aby przenieść kolonie z płytki LB do trzech mililitrów sterylnego bulionu lb. Następnie inkubuj kulturę ERO Dunum w tlenie w wytrząsarce stołowej z prędkością 200 obr./min przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego ranka zaszczepiony bulion lb powinien wydawać się mętny.

Delikatnie porusz kulturę, aby równomiernie rozprowadzić hodowlę komórek bakteryjnych, a następnie załaduj jednomililitrową strzykawkę bulionem i przymocuj ją do igły do żołądka. Wybierz mysz do zgłębnika, mocno chwytając luźną skórę na szyi i plecach za pomocą fem i palców. Następnie odciągnij głowę zwierzęcia palcem wskazującym, aby unieruchomić głowę zwierzęcia i wyprostuj przełyk do włożenia.

Utrzymując mysz w pozycji pionowej, skieruj końcówkę gruszki igły żołądkowej wzdłuż boku pyska zwierzęcia i nad jego językiem. Delikatnie przełóż igłę wzdłuż podniebienia zwierzęcia i przesuń igłę w dół przełyku. Na koniec za pomocą strzykawki powoli wstrzyknij 100 mikrolitrów inokulum bakteryjnego, a następnie delikatnie wyjmij igłębkę.

Monitoruj częstość oddechów i zachowanie myszy po jej zwróceniu, jej klatkę w dniu testu, szoruj mysz, jak właśnie pokazano, a następnie zgłębnik zwierzęcia 150 mikrolitrami świeżo przygotowanej fitzy dextryny. W tym czasie należy pobrać pokarm z klatki, cztery godziny po zgłębniku, a następnie uspokojenie zwierzęcia. Użyj nakłucia serca, aby pobrać jak najwięcej krwi od znieczulonego zwierzęcia.

Dodać krew do końcowego stężenia 3% kwaśnego dekstrozy cytrynianu w probówce z mikrowirówką, aby zahamować krzepnięcie. Następnie odwiruj próbki krwi przez 12 minut w temperaturze 1000 sera i czterech stopniach Celsjusza. Następnie zebrać surowicę i zmniejszyć ją do 1 do 10 i od jednego do 100 w PBS przy 100 mikrolitrach każdej próbki.

Przy tych dwóch rozcieńczeniach do 96-dołkowej płytki w dwóch egzemplarzach. Aby przygotować krzywą wzorcową, rozcieńczyć 100 mikrolitrów próbek z oryginalnych 80 miligramów na mililitr. Dekstryna Fitz służyła do zgłębnikowania myszy w PBS w ciemnych mikroprobówkach wirówkowych.

Następnie dodać próbki wzorcowe do płytki 96-dołkowej w trzech powtórzeniach. Następnie użyj fluorymetru, aby określić ilościowo fluorescencję każdej próbki i określić stężenie dekstryny FXI za pomocą techniki aseptycznej, rozpocznij ten krok od dodania jednego mililitra sterylnego PBS i metalowej kulki autoklawu do okrągłego dna do dwóch mililitrowych probówek wirówkowych. Następnie zważ każdą probówkę.

Następnie, po usunięciu seum i colon z myszy, oddziel seum od okrężnicy i rozetnij je wzdłużnie. Zebrać zawartość światła za pomocą kleszczy i dodać zawartość do probówki PBS. Umyj tkanki kontynuacji i okrężnicy sterylnym PBS przed umieszczeniem ich w oddzielnych probówkach.

Teraz zważyć probówki z tkanką i homogenizować próbki za pomocą ubijaka do kulek przez sześć minut. Przy 30 hercach dodaj 180 mikrolitrów sterylnego PBS na studzienkę do płytki 96-dołkowej. Następnie dodaj 20 mikrolitrów każdej homogenizowanej próbki do pierwszego dołka w każdym rzędzie i dobrze wymieszaj.

Próbki należy rozcieńczyć seryjnie, dodając 20 mikrolitrów z każdej poprzedniej studzienki, aby uzyskać rozcieńczenie od 10 do minus jeden w pierwszym dołku do 10 do minus sześciu. Następnie po całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza rozszczepić 10 mikrolitrów każdego rozcieńczenia z każdej próbki w trzech powtórzeniach na płytce LB z kwadratowym dnem i siatką. Policz jednostki tworzące kolonie na jednej płytce.

Uśrednić trzykrotnie dla każdej próbki, a następnie zanotować rozcieńczenie, w którym każda próbka została policzona. Pomnóż średnią jtk przez 50 i przez współczynnik rozcieńczenia, przy którym próbka została policzona, otrzymując jtk na mililitr. Na koniec podziel przez masę tkanki, aby określić CFU na gram po nocy, formalności i utrwaleniu wcześniej zapisanego 0,5-centymetrowego odcinka okrężnicy i sekcy.

Następnego ranka umyj tkanki 70% etanolem i umieść w kasecie, aby wysłać do zakładu histologicznego w celu zatopienia w parafinie i wybarwienia hematyną i eozyną w celu odparowania tkanek. Umieść szkiełka w słoiku do barwienia coplan w łaźni wodnej o temperaturze 65 stopni Celsjusza na 10 minut. Teraz umieść szkiełka w ksylenie na cztery prania po dwie minuty.

Każdy z nich ponownie nawodnij szkiełka dwoma pięciominutowymi płukaniami i 100% etanolem, a następnie jednym pięciominutowym myciem w każdym z poniższych. 95% etanolu, 75% etanolu i wody destylowanej. Umieść umyte szkiełka w słoiku coplan z ciepłym buforem cytrynianu sodu, a następnie umieść słoik w parowarze na 30 minut, po pozostawieniu słoika w temperaturze pokojowej na kolejne 30 minut, umyj szkiełka trzykrotnie PBS Zied przez pięć minut.

Gdy szkiełka wyschną, zaznacz obszar wokół tkanki pisakiem. Następnie zablokuj tkankę buforem blokującym w komorze wilgotnościowej barwiącej immunologicznie w temperaturze pokojowej. Po godzinie odlać bufor blokujący i inkubować tkanki w 50 do 100 mikrolitrach przeciwciała pierwszorzędowego w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Po okresie inkubacji przemyć tkanki trzykrotnie PBS Azi przez pięć minut. Następnie inkubować szkiełka w 50 do 100 mikrolitrach przeciwciała wtórnego w ciemności w temperaturze pokojowej po godzinie, przemyć szkiełka trzykrotnie wodą destylowaną przez pięć minut. Na koniec odwodnić tkanki, przykryć szkiełka dpi, przedłużonym złotym podłożem montażowym, a następnie nałożyć szkiełko nakrywkowe, oglądając szkiełka pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Ten pierwszy rysunek przedstawia dekstrynę Fitz mierzoną w surowicy sześciu czarnych myszy C 57, a także od receptora toll-podobnego do myszy z nokautem, u których wcześniej stwierdzono, że wykazują upośledzoną integralność bariery nabłonkowej podczas infekcji w obecności nienaruszonej bariery nabłonkowej jelit. Dekstryna ZI jest słabo przepuszczalna przez tę warstwę. Dlatego zwiększony poziom dekstryny Fitz w surowicy sugeruje upośledzenie integralności bariery nabłonkowej jelit podczas infekcji, umożliwiając tej cząsteczce przeciekanie jako poziom kontrolny w surowicy u niezakażonych myszy.

Przedstawiono również zgłębnik z dekstryną Fitz. Assent jest patogenem luminalnym, który może ściśle przylegać do komórek nabłonka jelitowego. Obciążenia bakteryjne w zawartości światła, tkankach kontynuacji i okrężnicy mogą wystąpić w siódmym dniu. Po zakażeniu.

Stwierdzono, że obciążenia bakteryjne w okrężnicy osiągają szczyt około 10 do dziewiątego CFU na gram. Większość patologii obserwowanej podczas infekcji C DUM u myszy C 57 PL sześć występuje w dystalnej dwucentymetrowej części okrężnicy makroskopowo do siódmego dnia po zakażeniu. Podczas infekcji zwykle obserwuje się pogrubienie błony śluzowej okrężnicy, a także skrócenie i długość okrężnicy.

C 57 PL sześć myszy cierpi tylko na umiarkowany stan zapalny i patologię, charakteryzując się histologicznie infiltracją komórek odpornościowych, wydłużeniem krypt okrężnicy i zubożeniem komórek coit. Aby dokładniej scharakteryzować reakcje gospodarza podczas infekcji z zerowym odkupieniem, barwienie immunofluorescencyjne można wykorzystać do zbadania zmian w białkach będących przedmiotem zainteresowania, takich jak markery proliferacji, lub do zbadania aspektów odpowiedzi bakteryjnej, takich jak jej lokalizacja w zakażonej tkance. Przykład tej techniki barwienia, badający białko gospodarza KI 67, marker proliferacji komórek, który pojawia się na czerwono, i zero de protein tear, który pojawia się na zielono w celu zbadania lokalizacji bakterii w 12 dniu po zakażeniu, jest zilustrowany na tym rysunku.

Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu kilku minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby technika pomiarowa była wykonana prawidłowo, aby upewnić się, że myszy są zainfekowane, a zdrowie zwierzęcia jest monitorowane przez cały czas trwania infekcji. W ciągu ostatnich 10 do 15 lat model gryzonia citrobacter stał się złotym standardem w badaniach nad przyczepianiem się do patogenów bakteryjnych, takich jak epec, do.

Co więcej, stał się dobrze uznanym modelem do badania odpowiedzi immunologicznych błony śluzowej na bakterie, takich jak rozwój odpowiedzi TH 17 w jelitach.