Name: Mysi model Citrobacter rodentium: badanie udziału patogenów i gospodarza w zakaźnym zapaleniu jelita grubego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Poznaj metodę indukcji zapalenia jelita grubego u myszy za pomocą zakażenia Citrobacter rodentium. Protokół umożliwia badanie interakcji patogen-gospodarz oraz ocenę funkcji bariery jelitowej i odpowiedzi immunologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty operacyjne dla BAV od Crohn's and Colitis Foundation of Canada (CCFC) oraz Canadian Institutes for Health Research (CIHR). GB został sfinansowany ze stypendium podyplomowego CIHR. BAV to Katedra Badań nad Pediatrycznymi Nietrzeźwymi Jelitami i Wątrobą (CHILD) Fundacji Dzieci z Zaburzeniami Jelit i Wątroby oraz Kanadyjska Katedra Badań nad Gastroenterologią Dziecięcą.

1. Przygotowanie inokulum Citrobacter rodentium i zgłębnika jamy ustnej myszy
<ol>
 <li>Przygotuj i autoklaw bulionu Luria Bertani (LB).</li>
 <li>Uzyskać żywotną C. rodentium z zamrożonego wywaru glicerolowego i rozprowadzić na płytce agarowej LB za pomocą sterylnej pętli do zaszczepiania lub końcówki pipety. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Zaszczepić 3 ml sterylnego bulionu LB w probówce do hodowli sokoła koloniami z płytki LB za pomocą pętli do zaszczepiania lub końcówki pipety. Przygotowanie inokulum powinno odbywać się przy użyciu technik aseptycznych.</li>
 <li>Inkubować kulturę C. rodentium w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C przez noc w wytrząsarce stołowej z prędkością 200 obr./min. Zaszczepiony bulion LB powinien wydawać się mętny po całonocnej hodowli.</li>
 <li>Użyj igły do zgłębnika z końcówką gródki dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml, aby wstrzyknąć każdej myszy 100 μl nocnej kultury C. rodentium. Delikatnie potrząśnij myszą, mocno chwytając kciukiem i palcami luźną skórę na szyi i plecach. Odciągnij głowę zwierzęcia palcem wskazującym, aby unieruchomić głowę i wyprostować przełyk w celu wprowadzenia igły do zgłębnika.</li>
 <li>Utrzymuj mysz w pozycji pionowej i skieruj końcówkę gruszka igły do wbijania wzdłuż boku ust i nad językiem. Delikatnie przełóż igłę wzdłuż podniebienia i przesuń ją w dół przełyku. Jeśli podczas tej procedury odczuwalny jest jakikolwiek opór, wyjmij igłębkę i włóż ją ponownie.</li>
 <li>Powoli wstrzyknąć 100 μl inokulum bakteryjnego i delikatnie usunąć igłębkę. Monitoruj częstość oddechów i zachowanie myszy po powrocie do klatki.</li>
</ol>
Uwagi:
<ul>
 <li>W krokach 2 i 3 należy również przygotować probówkę do hodowli sokoła przy użyciu technik aseptycznych z 3 ml sterylnego bulionu LB do hodowli przez noc, aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczenia bakteryjnego samego bulionu. Rosół LB powinien wydawać się klarowny po całonocnej hodowli.</li>
 <li>Delikatnie wymieszaj kulturę w probówce Falcon przed załadowaniem strzykawek do zgłębnika, tak aby taka sama dawka bakterii została dostarczona do każdej myszy w kroku 4.</li>
 <li>Posiew pobrany przez noc należy wyrzucić, jeśli był zaszczepiany przez ponad 24 godziny.</li>
 <li>Wszystkie zakażenia C. rodentium i pomieszczenia z zakażonymi zwierzętami powinny być przeprowadzane w obiekcie o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2.</li>
</ul>
2. Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej okrężnicy u myszy zakażonych C. rodentium
<ol>
 <li>Zmierz integralność bariery w żądanym punkcie czasowym po infekcji. </li>
 <li>W dniu badania należy przygotować wystarczającą ilość izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-dekstranu o masie 4 kDa rozpuszczoną w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do stężenia 80 mg ml-1, aby podać każdej myszy 150 μl i przygotować krzywą wzorcową.</li>
 <li>Oczyścić mysz i przetrzeć ją 150 μl dekstranu FITC. W tym czasie wyjmij jedzenie z klatki.</li>
 <li>Znieczulenie myszy 4 godziny po znieczuleniu i pobranie jak największej ilości krwi (~450 μl) przez nakłucie serca. Dodać krew do końcowego stężenia 3% dekstrozy kwasowo-cytrynianowej w probówce mikrowirówkowej, aby zahamować krzepnięcie. Poddaj myszy eutanazji i zbierz tkanki okrężnicy w PBS w celu zliczenia bakterii (kroki 3.1 - 3.5) oraz w 10% formalinie w celu utrwalenia tkanek i ostatecznie barwienia immunofluorescencyjnego (kroki 4.1 - 4.8).</li>
 <li>Wirować próbki krwi w temperaturze 1 000 x g przez 12 minut w wirówce w temperaturze 4 °C. Zebrać surowicę i rozcieńczyć do 1/10 i 1/100 w PBS. Dodać 100 μl każdej próbki w tych dwóch rozcieńczeniach do 96-dołkowej płytki w kontrpróbach.</li>
 <li>Aby przygotować krzywą wzorcową, należy rozcieńczyć oryginalny 80 mg ml-1 FITC-dekstran użyty do zgłębnika myszy w PBS do następujących stężeń: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 i 0 μg/ml. Dodać 100 μl każdego stężenia do 96-dołkowej płytki w trzech powtórzeniach.</li>
 <li>Określić ilościowo fluorescencję każdej próbki za pomocą fluorometru przy długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 535 nm.</li>
 <li>Analizuj nieprzetworzone dane, wykreślając krzywą standardową. Wprowadzić surowe dane dla każdej próbki do równania linii wygenerowanej przez krzywą wzorcową w celu określenia stężenia dekstranu FITC-dekstranu w każdej próbce.</li>
</ol>
Uwagi:
<ul>
 <li>Począwszy od kroku 4, trzymaj próbki krwi na lodzie i zminimalizuj ekspozycję na światło.</li>
 <li>Podczas pomiaru integralności bariery nabłonkowej optymalny jest punkt czasowy przypadający na 7 dni po zakażeniu lub wcześniej, ponieważ po tym czasie dochodzi do poważnego uszkodzenia tkanek. Pomiar integralności bariery przed wystąpieniem poważnych uszkodzeń pozwala określić maksymalne różnice w przepuszczalności podczas infekcji C. rodentium między szczepami myszy.</li>
 <li>Upewnij się, że niezakażone myszy kontrolne są również testowane pod kątem integralności bariery nabłonkowej.</li>
</ul>
3. Pomiar obciążenia bakteryjnego w tkankach myszy zakażonych C. rodentium
<ol>
 <li>Dodać 1 ml sterylnego PBS i autoklawizowany metalowy koralik do okrągłej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml z okrągłym dnem, stosując technikę aseptyczną. Poszczególne tkanki pobrane od każdego zwierzęcia zostaną umieszczone w oddzielnych probówkach PBS. Zważyć probówki przed dodaniem tkanki.</li>
 <li>Usuń jelito ślepe i okrężnicę z myszy. Oddziel jelito ślepe od okrężnicy i wypchnij zawartość światła za pomocą kleszczy. Dodaj zawartość do probówki PBS. Po oddzieleniu 0,5 cm odcinków od dystalnej okrężnicy i jelita ślepego w celu 10% utrwalenia formaliny, należy rozciąć pozostałą okrężnicę i jelito ślepe wzdłużnie i przemyć sterylnym PBS przed umieszczeniem tkanek w probówkach.</li>
 <li>Zważyć probówki PBS z tkanką, a następnie homogenizować próbki za pomocą ubijaka do kulek przez 6 minut przy 30 Hz.</li>
 <li>Stosując techniki aseptyczne, dodać 180 μl sterylnego PBS na studzienkę do płytki 96-dołkowej. Dodać 20 μl każdej homogenizowanej próbki do pierwszego dołka w każdym rzędzie. Dobrze wymieszać i seryjnie rozcieńczyć, dodając 20 μl z każdego poprzedniego dołka, aby uzyskać rozcieńczenia od 10-1 (pierwszy dołek) do 10-6. Umieścić 10 μl każdego rozcieńczenia z każdej próbki w trzech egzemplarzach na kwadratowej płytce LB z siatką. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
 <li>Policz jednostki tworzące kolonie (CFU), a następnie uśrednij 3 zliczenia i zapisz rozcieńczenie, w którym policzono każdą próbkę. Pomnóż średnią jtk przez 50, ponieważ użyto 20 μl pierwotnej próbki o objętości 1 ml i przez współczynnik rozcieńczenia, przy którym próbka została policzona, co daje jtk/ml. Na koniec podziel przez masę tkanki, aby określić jtk/g.</li>
</ol>
4. Ocena histologiczna i barwienie immunofluorescencyjne zakażonych tkanek jelita grubego
<ol>
 <li>Pobrać tkanki jak w kroku 3.2. Przechowuj chusteczki w formalinie przez noc, a następnie umyj 70% etanolem. Zanurz tkanki w parafinie i wytnij odcinki 5 μm do barwienia. Wybarwić hematoksyliną i eozyną w celu oceny histologicznej i przejść do kolejnych etapów barwienia immunofluorescencyjnego.</li>
 <li>Aby odparafinować tkanki przed barwieniem, umieść szkiełka w słoiku do barwienia coplin i umieść w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C na 10 minut. Następnie umieść szkiełka w ksylenie na cztery prania po 2 minuty każde. Szkiełka należy następnie ponownie nawodnić dwoma 5-minutowymi płukaniami w 100% etanolu, a następnie jednym 5-minutowym myciem w każdym z poniższych: 95% etanolu, 75% etanolu i dH20. Mycie to powinno odbywać się w dygestorium, aby uniknąć narażenia na szkodliwe opary.</li>
 <li>Umieść szkiełka w słoiku z podgrzanym buforem cytrynianu sodu, a następnie wstaw do naczynia do gotowania na parze na 30 minut, a następnie odstaw na 30 minut. Proces ten zrywa wiązania krzyżowe białek utworzone przez wiązanie formaliny, pobierając potencjalne miejsca antygenowe.</li>
 <li>Płukać azydkiem PBS przez 5 minut, trzy razy. Wysuszyć szkiełka i oznaczyć obszar wokół tkanki pisakiem PAP, aby stworzyć hydrofobową barierę, utrzymując odczynniki barwiące zlokalizowane na tkance.</li>
 <li>Blokować tkankę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej za pomocą buforu blokującego (np. surowicy α-kozy) w komorze wilgotnościowej barwiącej immunologicznie.</li>
 <li>Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe do pożądanego stężenia za pomocą buforu rozcieńczającego przeciwciała. Odlać bufor blokujący i dodać 50-100 μl przeciwciała pierwszorzędowego do tkanek. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc lub w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
 <li>Płukać azydkiem PBS przez 5 minut, trzy razy. Dodać 50-100 μl przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w buforze rozcieńczającym przeciwciała do tkanek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności. Myć dH2O przez 5 minut, trzy razy.</li>
 <li>Odwodnić szkiełka, dodać podłoże mocujące DAPI Prolong Gold i nałożyć szkiełko nakrywkowe. Zobacz preparaty pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>
Uwagi:
<ul>
 <li>Azydek PBS można zastąpić świeżo przygotowanym PBS jako alternatywę, aby uniknąć rozwoju bakterii w podłożu myjącym począwszy od kroku 4.</li>
</ul>

<ol><li>Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microbiota+on+the+pathogenesis+of+IBD%3A+lessons+from+mouse+infection+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models.</a> Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).</li>
<li>Cario, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+Receptors+in+Inflammatory+Bowel+Diseases%3A+A+Decade+Later%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel Diseases: A Decade Later.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 16 (9), 1583-1597 (2010).</li>
<li>Eckmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Inflammatory Bowel Disease.</a> Annals New York Academy of Sciences. , 1027-38 (2006).</li>
<li>Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrobacter+rodentium+of+mice+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Citrobacter rodentium of mice and man.</a> Cellular Microbiology. 7, 1697-1706 (2005).</li>
<li>Luperchio, S., Schauer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathogenesis+of+Citrobacter+rodentium+and+transmissible+murine+colonic+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Molecular pathogenesis of Citrobacter rodentium and transmissible murine colonic hyperplasia.</a> Microbes and Infection. 3 (4), 333-340 (2001).</li>
<li>Bergstrom, K. S., Sham, H. P., Zarepour, M., Vallance, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+host+responses+to+enteric+bacterial+pathogens%3A+a+balancing+act+between+resistance+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Innate host responses to enteric bacterial pathogens: a balancing act between resistance and tolerance.</a> Cellular Microbiology. 14, 475-484 (2012).</li>
<li>MacDonald, T. T., Frankel, G., Dougan, G., Goncalves, N. S., Simmons, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+defences+to+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Host defences to Citrobacter rodentium.</a> International Journal of Medical Microbiology. 293, 87-93 (2003).</li>
<li>Borenshtein, D., McBee, M. E., Schauer, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+the+Citrobacter+rodentium+infection+model+in+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Utility of the Citrobacter rodentium infection model in laboratory mice.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 24, 32-37 (2008).</li>
<li>Gibson, D. L., Ma, C., Rosenberger, C. M., Bergstrom, K. S. B., Valdez, Y., Huang, J. T., Khan, M. A., Vallance, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+2+plays+a+critical+role+in+maintaining+mucosal+integrity+during+Citrobacter+rodentium-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 2 plays a critical role in maintaining mucosal integrity during Citrobacter rodentium-induced colitis.</a> Cellular Microbiology. 10, 388-403 (2008).</li>
<li>Dennis, A., Kudo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p50+subunit+of+NF-%CE%BAB+is+critical+for+in+vivo+clearance+of+the+non-invasive+enteric+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+%26+Immunity%22%5BJournal%5D)">The p50 subunit of NF-κB is critical for in vivo clearance of the non-invasive enteric pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infection & Immunity. 76 (11), 4978-4988 (2008).</li>
<li>Gibson, D. L., Ma, C., Bergstrom, K. S. B., Huang, J. T., Man, C., Vallance, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyD88+signalling+plays+a+critical+role+in+host+defence+by+controlling+pathogen+burden+and+promoting+epithelial+cell+homeostasis+during+Citrobacter+rodentium-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">MyD88 signalling plays a critical role in host defence by controlling pathogen burden and promoting epithelial cell homeostasis during Citrobacter rodentium-induced colitis.</a> Cellular Microbiology. 10 (3), 618-631 (2008).</li>
<li>Lebeis, S. L., Bommarius, B., Parkos, C. A., Sherman, M. A., Kalman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signaling+mediated+by+MyD88+is+required+for+a+protective+innate+immune+response+by+neutrophils+to+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">TLR signaling mediated by MyD88 is required for a protective innate immune response by neutrophils to Citrobacter rodentium.</a> Journal of Immunology. 179 (1), 566-577 (2007).</li>
<li>Bry, L., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+T+cell+dependent+serum+antibody%2C+but+not+the+gut-associated+lymphoid+tissue%2C+for+surviving+acute+mucosal+infection+with+Citrobacter+rodentium%2C+an+attaching+and+effacing+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Critical role of T cell dependent serum antibody, but not the gut-associated lymphoid tissue, for surviving acute mucosal infection with Citrobacter rodentium, an attaching and effacing pathogen.</a> Journal of Immunology. 172 (1), 433-441 (2004).</li>
<li>Simmons, C. P., Clare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+for+B+lymphocytes+and+CD4%2B+T+cells+in+immunity+to+infection+by+the+attaching+and+effacing+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+%26+Immunity%22%5BJournal%5D)">Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infection & Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).</li>
<li>Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+Roles+of+Notch+and+Wnt%2F%CE%B2-Catenin+Pathways+in+the+Regulation+of+Hyperplasia+and%2For+Colitis+in+Response+to+Bacterial+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+%26+Immunity%22%5BJournal%5D)">Critical Roles of Notch and Wnt/β-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection.</a> Infection & Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Zakażenie Citrobacter rodentium stanowi cenny model do badania zarówno chorób zakaźnych, jak i zapalenia jelita grubego u myszy. Ten unikalny model pozwala na scharakteryzowanie zarówno reakcji gospodarza, jak i właściwości patogennych bakterii. Kroki opisane w tym protokole szczegółowo opisują pomyślne użycie tego modelu.
W tym protokole jest kilka krytycznych kroków, o których należy pamiętać podczas wywoływania zapalenia jelita grubego i analizowania odpowiedzi. Po pierwsze, przygo...

Zakażenie patogenami bakteryjnymi jelit wywołuje zapalenie przewodu pokarmowego (GI), a także patologię i patofizjologię jelit, w tym biegunkę i dysfunkcję bariery nabłonkowej jelit. Mechanizmy wirulencji, za pomocą których patogeny bakteryjne kolonizują przewód pokarmowy swoich gospodarzy, a także specyficzne odpowiedzi gospodarza, które bronią się przed takimi infekcjami, są słabo poznane, jednak ostatnie postępy w modelowaniu infekcji bakteryjnych jelitowych zaczęły pomagać w zrozumieniu tych procesów. Bakterie jelitowe są również powiązane z chorobami zapalnymi jelit (IBD). Choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) i WZJG są złożonymi chorobami o nieznanej etiologii, charakteryzującymi się przewlekłym zapaleniem jelit i uszkodzeniem tkanek. Istnieje wiele mysich modeli zapalenia jelit, od spontanicznego zapalenia u genetycznie zmodyfikowanych szczepów, takich jak myszy IL10 -/-, po wyzwania chemiczne związane ze związkami, takimi jak siarczan sodu dekstranu (DSS) i kwas dinitrobenzenosulfonowy (DNBS)1. Postawiono hipotezę, że nieadaptacyjne przewlekłe reakcje zapalne obecne u pacjentów z IBD rozwijają się u osób podatnych genetycznie po nieprawidłowym narażeniu układu odpornościowego błony śluzowej jelit na bakterie jelitowe2, dlatego badanie modeli zakaźnego zapalenia jelita grubego oferuje również znaczny potencjał w określaniu potencjalnie patogennych odpowiedzi gospodarza na bakterie jelitowe. Zapalenie jelita grubego wywołane przez Citrobacter rodentium jest jednym z rzadkich modeli zakaźnego zapalenia jelita grubego, który został dobrze scharakteryzowany1,3, co pozwala na analizę odpowiedzi gospodarza na bakterie jelitowe i dalsze zrozumienie potencjalnych mechanizmów patogenezy IBD; Jest to istotny krok w kierunku opracowania nowatorskich metod leczenia zapobiegawczego i terapeutycznego.
C. rodentium to gram-ujemny patogen bakteryjny specyficzny dla myszy (A/E), który jest blisko spokrewniony z ważnymi ludzkimi patogenami enteropatogennymi E. coli (EPEC) i enterokrwotocznymi E. coli (EHEC)3-8. Rodzina patogenów A/E ściśle przyczepia się do wierzchołkowej błony komórkowej gospodarza nabłonka jelita ślepego i okrężnicy, tworząc nieinwazyjną strukturę przypominającą cokół na komórce gospodarza. Doustne prowokowanie C. rodentium 108-10 9 organizmów daje solidny model zakaźnego zapalenia jelita grubego charakteryzującego się przerostem okrężnicy lub wydłużeniem krypt, jednojądrzastym naciekiem komórek odpornościowych i zubożeniem komórek kubkowych3,4. Początkowe miejsce kolonizacji, kilka godzin po prowokacji, znajduje się w plamie jelita ślepego, po której następuje progresja do dystalnej okrężnicy 2 do 3 dni po zakażeniu3. W immunokompetentnych szczepach myszy klirens patogenu uzyskuje się 3 do 4 tygodni po zakażeniu1,3,4. Stwierdzono jednak, że wiele genetycznie zmodyfikowanych szczepów, tj. myszy z niedoborem genu lub myszy z nokautem (-/-), wykazuje zwiększoną podatność na infekcje, co skutkuje nadmiernymi uszkodzeniami i/lub przewlekłą infekcją i stanem zapalnym9-14. Zastosowanie tego modelu zakaźnego zapalenia jelita grubego w tych nokautujących szczepach, z których wiele nie ma wrodzonych białek sygnałowych, było niezbędne do ujawnienia kilku białek gospodarza integralnych dla ustąpienia infekcji jelitowej i stanu zapalnego.

<table><tbody><tr><td>Bulion Luria</td><td>ABM</td><td>G247</td><td>Dodaj 25 g proszku LB do 1L wody. Autoklaw przed użyciem.</td></tr><tr><td>Kwadratowa płyta dolna z siatką</td><td>Fisher</td><td>08-757-11A Rurka</td><td></td></tr><tr><td>hodowlana Falcon</td><td>Sarstedt</td><td>62.515.006</td><td></td></tr><tr><td>Igła do gastra gastric gagul z końcówką grusznika</td><td>Fine Science Tools</td><td>18060-20</td><td></td></tr> 1 <tr><td>ml strzykawka</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>4 kDa FITC-dekstran</td><td>Sigma</td><td>FD-4</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma</td><td>C7129</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Fisher</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Fisher</td><td>D16.1</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian kwaśny dekstroza</td><td></td><td></td><td>20 mM kwas tyrynowy, 110 mM cytrynian sodu, 5 mM dekstroza</td></tr><tr><td>płytka 96-dołkowa </td><td>Fisher</td><td>07-200-762</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki metalowe (5 mm)</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>10% formaliny</td><td>Fisher</td><td>5F93-4</td><td></td></tr><tr><td>5 ml fiolka</td><td>DiaMed</td><td>STK3205</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Fisher</td><td>H345-23</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Fisher</td><td>E511-100</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher</td><td>HC700-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Słoik do barwienia Coplin</td><td>VWR</td><td>47751-792</td><td></td></tr><tr><td>Bufor cytrynianu</td><td></td><td></td><td>sodu 10 mM cytrynian sodu, 0,05% Tween 20, pH 6,0</td></tr><tr><td>Pióro do cytologii</td><td>Cedarlane</td><td>Mu22</td><td></td></tr><tr><td>Kozia surowica</td><td>Sigma</td><td>G902-3</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma</td><td>SZ002</td><td></td></tr><tr><td>Bufor blokujący</td><td></td><td></td><td>2% surowica kozia, 1% BSA, 0,1% tryton X-100, 0,05% Tween 20, 0,05% azydek sodu, 0,01 M PBS, pH 7,2, wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 stopni C.</td></tr><tr>Bufor <td></td><td></td><td>do rozcieńczania przeciwciał</td><td>0,1% tryton X-100, 0,1% BSA, 0,05% azydek sodu, 0,04%</td></tr><tr><td>EDTA Bufor blokujący i Bufor do rozcieńczania przeciwciał dla tir</td><td></td><td></td><td>Te same przepisy co powyżej, ale bez dodatku detergentów (triton X-100 i tween 20)</td></tr><tr><td>Przedłuż złoty odczynnik Antifade z DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P-36931</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher</td><td>12.54SE</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka stołowa do inkubacji</td><td>Barnstead Lab Line</td><td>Max Q4000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometr</td><td>Perkin Elmer</td><td>Victor2D</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 22R</td><td></td></tr><tr><td>Parowiec</td><td>Black Decker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>Axio Image.Z1</td><td></td></tr></tbody></table>

mysi model citrobacter rodentium: badanie udziału patogenów i gospodarza w zakaźnym zapaleniu jelita grubego

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Ten protokół przedstawia kroki wymagane do stworzenia solidnego modelu choroby zakaźnej i zapalenia jelita grubego, a także metody używane do scharakteryzowania infekcji Citrobacter rodentium u myszy. C. Rodentium jest Gram-ujemnym, mysim patogenem bakteryjnym, który jest ściśle spokrewniony z klinicznie ważnymi ludzkimi patogenami enteropatogennymi E. coli i enterokrwotoczną E. coli. Po zakażeniu C. rodentium myszy immunokompetentne cierpią na niewielką i przejściową utratę masy ciała i biegunkę. Histologicznie obserwuje się wydłużenie krypty jelitowej, naciekanie komórek odpornościowych i zubożenie komórek kubkowych. Usunięcie infekcji uzyskuje się po 3 do 4 tygodniach. Pomiar integralności bariery nabłonkowej jelit, obciążenia bakteryjnego i uszkodzeń histologicznych w różnych punktach czasowych po zakażeniu pozwala na scharakteryzowanie szczepów myszy podatnych na infekcję.
Mechanizmy wirulencji, dzięki którym patogeny bakteryjne kolonizują przewód pokarmowy swoich gospodarzy, a także specyficzne reakcje gospodarzy, które bronią przed takimi infekcjami, są słabo poznane. Dlatego model infekcji bakteryjnej jelit C. rodentium służy jako cenne narzędzie pomagające nam w zrozumieniu tych procesów. Bakterie jelitowe są również powiązane z chorobami zapalnymi jelit (IBD). Postawiono hipotezę, że nieadaptacyjne przewlekłe reakcje zapalne obserwowane u pacjentów z IBD rozwijają się u osób podatnych genetycznie w wyniku nieprawidłowej ekspozycji układu odpornościowego błony śluzowej jelit na bakterie jelitowe. W związku z tym badanie modeli zakaźnego zapalenia jelita grubego oferuje znaczny potencjał w definiowaniu potencjalnie patogennych odpowiedzi gospodarza na bakterie jelitowe. Zapalenie jelita grubego wywołane przez C. rodentium jest jednym z takich rzadkich modeli, który pozwala na analizę odpowiedzi gospodarza na bakterie jelitowe, pogłębiając nasze zrozumienie potencjalnych mechanizmów patogenezy IBD; niezbędne w opracowywaniu nowatorskich metod leczenia zapobiegawczego i terapeutycznego.

Podczas standardowego eksperymentu infekcyjnego myszy są zakażane dawką około 2,5 x 108 CFU poprzez podanie przez zgłębnik (gavage) 100 μl nocnej kultury C. rodentium. Infekcja myszy C57BL/6 szczepem C. rodentium skutkuje umiarkowaną i przejściową utratą masy ciała oraz biegunką. Choć w przypadku myszy C57BL/6 zdarza się to rzadko, zwierzęta mogą zachorować i wymagać eutanazji. Dlatego należy monitorować stopień utraty masy ciała oraz objawy stresu, takie jak pilerekcja (jeżenie sierści) i zg...

Zakażenie gryzoniami Citrobacter stanowi cenny model do badania infekcji bakteryjnych jelit, jak również odpowiedzi immunologicznych gospodarza i zapalenia jelita grubego u myszy. Protokół ten określa pomiar integralności bariery, obciążenia patogenem i uszkodzeń histologicznych, co pozwala na dokładne scharakteryzowanie udziału patogenu i gospodarza w zakaźnym zapaleniu jelita grubego u myszy.

Mysi model Citrobacter rodentium: badanie udziału patogenów i gospodarza w zakaźnym zapaleniu jelita grubego

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie zapalenia jelit poprzez zakażenie myszy gram-ujemnym patogenem, citrobacter rodent, co umożliwia badanie interakcji między patogenem a gospodarzem w przewodzie pokarmowym. Osiąga się to poprzez uprzednie zaszczepienie hodowli zero redemption w celu inkubacji przez noc. W drugim kroku myszy są zakażane poprzez podanie doustne nocnego inokulum za pomocą zgłębnika.Następnie, w siódmym dniu po zakażeniu, w ostatnim kroku pobiera się kątnicę, okalicznicę oraz zawartość światła jelita. Tkanki poddaje się posiewowi, przelicza liczba kolonii bakteryjnych, a tkanki poddawane są barwieniu immunologicznemu w celu wykrycia białek gospodarza będących przedmiotem zainteresowania. Ostatecznie, za pomocą immunohistochemii można ocenić miano patogenu, funkcję bariery, uszkodzenia histologiczne oraz zmiany w odpowiedzi organizmu gospodarza.Chociaż metoda ta oferuje solidny model zakaźnego zapalenia jelit, umożliwiając badanie interakcji między patogenem a gospodarzem oraz odpowiedzi immunologicznych, może zostać ona również dostosowana do analizy wpływu infekcji bakteryjnej na ryzyko wystąpienia raka jelita grubego. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą

the-citrobacter-rodentium-mouse-model-studying-pathogen-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Model Citrobacter rodentium myszy: Badanie wkładu patogenu i żywiciela w rozwój zakaźnego zapalenia jelita grubego

Utworzenie chronicznego modelu mysiego z infekcją bakteryjną z trwałą kolonizacją jelit przez Salmonella typhimurium przez 27 tygodni.

Model myszy z przewlekłą infekcją Salmonella

Źródło: Winston, J. A. i in. Model myszy leczonem cefoperazonu klinicznie istotnego szczepu Clostridium difficile R20291.  J. Vis. Exp. (2016)Ten film pokazuje procedurę szczepienia myszy wcześniej leczonymi antybiotykiem zarodnikami Clostridium difficile , aby ustanowić model infekcji myszy do badania patogenezy i odpowiedzi gospodarza.

Ustanowienie mysiego modelu infekcji Clostridium difficile

Obrazowanie multimodalne jest cennym podejściem do badania kolonizacji bakteryjnej w małych modelach zwierzęcych. Protokół ten przedstawia zakażenie myszy bioluminescencyjnym Citrobacter rodentium i podłużne monitorowanie kolonizacji bakteryjnej za pomocą kompozytowej tomografii obrazowania 3D w świetle rozproszonym z obrazowaniem μCT w celu stworzenia filmu 4D infekcji C. rodentium.

Multimodalne obrazowanie 4D zakażeń Citrobacter rodentium u myszy

Modele zwierzęce okazały się nieocenionymi narzędziami w definiowaniu mechanizmów specyficznych dla gospodarza i patogenu, które przyczyniają się do rozwoju przewlekłego stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy mysi model zakażenia jamy ustnej ludzkim patogenem Porphyromonas gingivalis i szczegółowo opisujemy metodologie oceny postępu stanu zapalnego w miejscach miejscowych i ogólnoustrojowych.

Mysi model przewlekłego stanu zapalnego wywołanego przez patogeny w miejscach lokalnych i ogólnoustrojowych

Tutaj opisana jest procedura przeprowadzania infekcji ogólnoustrojowej u noworodka szczura za pomocą kultur Escherichia coli K1. Ten nieinwazyjny zabieg pozwala na kolonizację przewodu pokarmowego, translokację patogenu do krążenia ogólnoustrojowego oraz inwazję ośrodkowego układu nerwowego w splocie naczyniówkowym.

Nieinwazyjny model neuropatogennego zakażenia Escherichia coli u nowonarodzonego szczura

Zdolność do modelowania infekcji dróg moczowych (ZUM) jest kluczowa, aby móc zrozumieć patogenezę bakterii i zapoczątkować rozwój nowych terapii. Celem tej pracy jest zademonstrowanie mysich modeli eksperymentalnego ZUM i ZUM związanego z cewnikiem, które podsumowują i przewidują wyniki obserwowane u ludzi.

Ustalenie i charakterystyka UTI i CAUTI w modelu mysim

Ten protokół przedstawia mysi model zakażenia Clostridium difficile (CDI) cefoperazonu przy użyciu klinicznie istotnego i genetycznie podatnego szczepu, R20291. Nacisk na kliniczne monitorowanie choroby, liczenie bakterii C. difficile, cytotoksyczność toksyn i zmiany histopatologiczne w całym CDI w modelu mysim są szczegółowo opisane w protokole.

Mysi model szczepu Clostridium difficile R20291 leczony cefoperazonem

Przedstawiono szczegółowy protokół mysiego modelu kolonizacji enterokwotocznej E. coli (EHEC) przy użyciu bakterii znakowanych bioluminescencyjnie. Wykrycie tych bioluminescencyjnych bakterii za pomocą nieinwazyjnego systemu obrazowania in vivo u żywych zwierząt może poszerzyć naszą obecną wiedzę na temat kolonizacji EHEC.

Wykrywanie enterokrwotocznej kolonizacji Escherichia coli u mysiego gospodarza za pomocą nieinwazyjnego systemu bioluminescencji in vivo

Mysia kolostomia dystalna, nowy model dywersyjnego zapalenia jelita grubego u myszy C57BL / 6

W tym protokole opisany jest model adoptywnego transferowego zapalenia jelita grubego dla antygenu mikrobioty jelitowej z limfocytów T. Limfocyty T CD4 + izoluje się od myszy transgenicznych CBir1 TCR. Są one specyficzne dla immunodominującego antygenu mikrobioty jelitowej CBir1 flageliny, który jest przenoszony do myszy biorcy Rag1-/-, prowadząc do zapalenia jelit.

Indukcja zapalenia jelit przez adoptywny transfer transgenicznych limfocytów T CD4 + CBir1 TCR do myszy z niedoborem odporności

Poznaj metodę indukcji zapalenia jelita grubego u myszy za pomocą zakażenia Citrobacter rodentium. Protokół umożliwia badanie interakcji patogen-gospodarz oraz ocenę funkcji bariery jelitowej i odpowiedzi immunologicznej.

Mysi model Citrobacter rodentium: badanie udziału patogenów i gospodarza w zakaźnym zapaleniu jelita grubego

Przeglądaj więcej filmów