Ulepszony protokół mikrodysekcji laserowej ludzkich wysp trzustkowych z próbek chirurgicznych
6 stycznia 2013
Mikrodysekcja laserowa to technika, która pozwala na odzyskanie wybranych komórek z niewielkich ilości miąższu. W tym miejscu opisujemy protokół pozyskiwania ludzkich wysp trzustkowych z próbek chirurgicznych do wykorzystania w badaniach transkryptomicznych. Nasz protokół poprawia wewnętrzną autofluorescencję ludzkich komórek beta, ułatwiając w ten sposób ich pobieranie.
Cześć, nazywam się Dorte i pracuję w Instytucie Thea Hands na Uniwersytecie Technologicznym w Reen Laser. Mikrodysekcja to technika, która pozwala uzyskać specjalną populację komórek z bardzo małej ilości guza rodzicielskiego. Wypreparowane komórki mogą być wykorzystane do badań transkryptomicznych i proteomicznych, oceny DNA lub analizy chromosomów.
Tutaj przedstawiamy nasz protokół pozyskiwania ludzkich metakomórek trzustki z próbek chirurgicznych do wykorzystania do badań transkryptomicznych. Pokrój tkankę trzustki na małe kawałki. Umieść jeden kawałek na środku formy kriogenicznej i przykryj go schłodzoną masą do zatapiania.
Natychmiast zamrozić tkankę ze schłodzonymi dwoma materiałami Bhutan i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Segmentuj 40 szkiełek samoprzylepnych i wstępnie schładzaj je w Komnacie Chrzcicielskiej. Przymocuj zamrożoną tkankę do uchwytu próbki za pomocą związku OCT po przycięciu kriobloku.
Wytnij 40 odcinków o grubości 10 mikrometrów. Przenieś jedną sekcję na jeden szkiełko, dotykając palcem tylnej strony szkiełka, aby ogrzać tylko pozycję do umieszczenia sekcji na niej.Wypróbuj sekcje dwie do trzech minut w martwym krio, a następnie przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, przygotuj odczynniki Ation i schładzaj wszystkie płyny z wyjątkiem seline na lodzie. Zwiększy to wewnętrzną autofluorescencję komórek zwierząt domowych przed mikropreparacją.
Za każdym razem obniżana będzie wartość znamionowa czterech sekcji. Obsługuj dwie sekcje jednocześnie. Napraw je najpierw w 70% etanolu na 30 sekund.
Następnie umyj sekcje pięcioma do sześciu szybkimi zanurzeniami. W dalszej części DPC uzdatniona woda. Odwodnić tkankę przez minutę w 100% etanolu i powtórzyć Ten krok, inkubować szkiełka w selinie przez cztery minuty.
W międzyczasie rozpocznij odwadnianie kolejnej pary sekcji. Na koniec wysusz szkiełka na powietrzu przez trzy do pięciu minut w ciemności. Chroń tkankę przed wilgocią, a autofluorescencję przed wybielaniem, umieszczając dwa szkiełka tyłem do siebie w folii Owiń tubkę 50 ml Przed sekcją wyczyść mikroskop z RNA i zaciśnij samoprzylepną nasadkę w robo Mover.
Włóż suwak do stolika i przesuń nasadkę dokładnie po sekcji, nie dotykając jej. Zlokalizuj oczka, identyfikując lepsze obszary komórek autofluorescencyjnych. Wewnętrzna autofluorescencja ludzkich lepszych komórek wydaje się żółta w konfiguracji, podczas gdy przewody trzustkowe wykazują jasnozieloną autofluorescencję.
Wybierz lepsze obszary komórek za pomocą narzędzia do zaznaczania z wolnej ręki i przeanalizuj je mikro, uruchamiając laser. Rozciąć oczka czterech sekcji kriogenicznych o obniżonych wartościach znamionowych do jednej nasadki samoprzylepnej w ciągu 40 do 60 minut. W razie potrzeby sprawdź przechwyconą tkankę, przesuwając nasadkę do punktu kontrolnego mikroskopu.
Zdejmij nasadkę z robo movera i wyruruj ją. 10 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego do pokrywy Nasadki do rozbijania komórek. Inkubuj czapkę do góry nogami w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 minut.
Odwiruj lizat, oznacz probówkę i przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie można przeprowadzić ekstrakcję RNA. Wykonaj laser Ation, mikro rozwarstwienie i lizę ze wszystkimi 40 kriosekcjami. Następnie połącz 10 lizatów i kontynuuj izolację RNA za pomocą zestawu do izolacji UR PU RNA zgodnie z dostarczonym protokołem, aby uzyskać 11 mikrolitrów RNA.
Ogólnie rzecz biorąc, nie znaleźliśmy bezpośredniego związku między ilością tkanki mikrodysekcyjnej a wydajnością RNA Różnice w odstępie czasu między pobraniem przez chirurgów a zamrożeniem próbki trzustki po jej zbadaniu przez patologa, mogą częściowo odpowiadać za jakość i ilość odzyskanego RNA. Inne kluczowe czynniki, które należy wziąć pod uwagę, to energia lasera zastosowana do mikropreparacji o niższej energii, przy użyciu wyższej integralności RNA, a także ognisko lasera i odległość punktów wskazujących laserowej wycinarki ciśnieniowej. Dodatkowo ilość RNA można zoptymalizować, utrzymując odległość między nasadką kleju a jak najmniejszą.
Unikaj utraty mikro wypreparowanej tkanki podczas procesu przechwytywania, pod warunkiem, że dostępny jest laserowy mikroskop do mikropreparacji. Procedura ta może być wdrożona we wszystkich instytucjach badawczych wykonujących częściową ektomię trzustki, zwiększając w ten sposób dostęp do materiału powiek ludzkich zarówno u osób bez cukrzycy, jak i z cukrzycą.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół mikrosekcji laserowej w celu odzyskania ludzkich wysepek trzustkowych z materiału chirurgicznego. Technika ta usprawnia gromadzenie komórek beta do badań transkryptomicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- biologia komórki
- transkryptomika
Wstęp
- Mikrosekcja laserowa umożliwia izolację specyficznych populacji komórek.
- Jest ona szczególnie użyteczna w przypadku małych próbek tkanek.
- Technikę tę można zastosować w różnych badaniach, w tym w analizach transkrypcyjnych i proteomicznych.
- Poprawa autofluorescencji wspomaga zbieranie docelowych komórek.
Cel badania
- Aby przedstawić szczegółowy protokół pozyskiwania ludzkich wysepek trzustkowych.
- Aby ułatwić badanie komórek beta w badaniach transkrypcyjnych.
- Aby zwiększyć efektywność gromadzenia komórek z preparatów chirurgicznych.
Zastosowane metody
- Technika mikrosekcji laserowej zastosowana w tkance trzustki.
- Przygotowanie próbek tkanki poprzez pocięcie ich na małe fragmenty.
- Zatopienie tkanki w schłodzonym związku w celu optymalnej sekcji.
- Zbiór komórek beta do dalszej analizy.
Główne wyniki
- Pomyślna izolacja ludzkich wysepek trzustkowych.
- Obserwowana poprawa autofluorescencji komórek beta.
- Protokół wykazał skuteczność w badaniach transkrypomicznych.
- Ułatwienie pozyskiwania docelowych populacji komórek z niewielkich próbek.
Wnioski
- Protokół ten zwiększa odzyskiwanie ludzkich wysepek trzustkowych.
- Mikrosekcja laserowa jest cennym narzędziem do analizy komórkowej.
- Udoskonalone metody mogą prowadzić do lepszego zrozumienia w badaniach transkrypcyjnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mikrosekcja laserowa umożliwia precyzyjną izolację ludzkich komórek beta trzustki z ograniczonych próbek chirurgicznych, co eliminuje krytyczne wąskie gardło w badaniach transkrypomicznych tkanek istotnych dla cukrzycy. Poprzez wzmocnienie naturalnej autofluorescencji dzięki przetwarzaniu odczynników w temperaturze lodowej, protokół ten skraca czas manipulacji tkanką i poprawia konserwację RNA, bezpośrednio wspierając walidację celów w badaniach nad chorobami metabolicznymi. Podejście to wzmacnia proces ograniczania ryzyka mechanistycznego (mechanistic de-risking), dostarczając oczyszczone populacje komórek do późniejszych zastosowań omicznych w początkowych etapach procesów odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez izolację czystych populacji komórek beta do analizy szlaków sygnałowych w modelach cukrzycy typu 2.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki szybkiej i precyzyjnej identyfikacji komórek docelowych za pomocą wzmocnionej autofluorescencji, co redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich podczas selekcji celu.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do standaryzacji analizy, zapewniając spójne, wysokiej jakości wejścia RNA z mikrodysekcyjnie wyizolowanych wysepek.
- Wartość operacyjna: Wspiera powtarzalne wyniki ilościowe, niezbędne do przygotowania do screeningu oraz ponownego wykorzystania platformy w procesach odkrywania biomarkerów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zachowuje istotność w kontekście choroby, umożliwiając analizę transkryptomiczną ludzkich wysepek trzustkowych bezpośrednio powiązanych z patofizjologią cukrzycy.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez dostarczanie określonych populacji komórek do dalszych badań nad mechanizmami działania.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w ciąg procesów badawczych, umożliwiając weryfikację hipotez na wczesnym etapie badań biologicznych, wspierając opracowywanie testów dzięki standaryzacji parametrów wejściowych oraz dostarczając danych do decyzji translacyjnych poprzez ilościowe profilowanie molekularne.
- Biologia odkryć: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez izolację komórek beta w celu funkcjonalnej walidacji celów w modelach chorób metabolicznych.
- Przesiewy: Dostarcza próbek gotowych do analizy z powtarzalną wydajnością RNA, co jest kluczowe dla badania wpływu związków na izolowane wysepki.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty transkryptomiczne, które umożliwiają porównanie stanu cukrzycowego i niecukrzycowego w celu wsparcia identyfikacji wiodących kandydatów.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez dostarczanie próbek istotnych dla człowieka, które łączą wyniki in vitro z mechanizmami choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego dostępu do pierwotnych ludzkich wysepek w ramach wielu projektów, zmniejszając zależność od zmiennych źródeł donatorskich.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach sygnalizacyjnych specyficznych dla komórek beta.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność dzięki kontrolowanemu przetwarzaniu tkanek oraz określonym parametrom sekcji.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go, umożliwiając wczesną ocenę oddziaływania na cel w komórkach istotnych dla człowieka, co redukuje biologiczne ryzyko na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów w cukrzycy z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowane profile transkrypcyjne ludzkich wysepek.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie histologii, kriosekcjonowania oraz obsługi aparatury do mikrodysekcji laserowej.
- Zależne od dostępu do systemu PALM MicroBeam lub równoważnej platformy LMD z funkcjonalnością AutoLPC.
- Wymaga ustandaryzowanych protokołów postępowania z odczynnikami w celu zachowania integralności RNA oraz zminimalizowania autofluorescencji u wszystkich użytkowników.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania procedur do różnej jakości próbek trzustki oraz czasu niedokrwienia między pobraniem a zamrożeniem.
- Ograniczone przez niską wydajność RNA, co wymaga łączenia wielu próbek poddanych mikrodysekcji w celu uzyskania ilości materiału wystarczającej dla zestawów do dalszych analiz.
