Ulepszony protokół mikrodysekcji laserowej ludzkich wysp trzustkowych z próbek chirurgicznych
January 6th, 2013
Mikrodysekcja laserowa to technika, która pozwala na odzyskanie wybranych komórek z niewielkich ilości miąższu. W tym miejscu opisujemy protokół pozyskiwania ludzkich wysp trzustkowych z próbek chirurgicznych do wykorzystania w badaniach transkryptomicznych. Nasz protokół poprawia wewnętrzną autofluorescencję ludzkich komórek beta, ułatwiając w ten sposób ich pobieranie.
Cześć, nazywam się Dorte i pracuję w Instytucie Thea Hands na Uniwersytecie Technologicznym w Reen Laser. Mikrodysekcja to technika, która pozwala uzyskać specjalną populację komórek z bardzo małej ilości guza rodzicielskiego. Wypreparowane komórki mogą być wykorzystane do badań transkryptomicznych i proteomicznych, oceny DNA lub analizy chromosomów.
Tutaj przedstawiamy nasz protokół pozyskiwania ludzkich metakomórek trzustki z próbek chirurgicznych do wykorzystania do badań transkryptomicznych. Pokrój tkankę trzustki na małe kawałki. Umieść jeden kawałek na środku formy kriogenicznej i przykryj go schłodzoną masą do zatapiania.
Natychmiast zamrozić tkankę ze schłodzonymi dwoma materiałami Bhutan i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Segmentuj 40 szkiełek samoprzylepnych i wstępnie schładzaj je w Komnacie Chrzcicielskiej. Przymocuj zamrożoną tkankę do uchwytu próbki za pomocą związku OCT po przycięciu kriobloku.
Wytnij 40 odcinków o grubości 10 mikrometrów. Przenieś jedną sekcję na jeden szkiełko, dotykając palcem tylnej strony szkiełka, aby ogrzać tylko pozycję do umieszczenia sekcji na niej.Wypróbuj sekcje dwie do trzech minut w martwym krio, a następnie przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, przygotuj odczynniki Ation i schładzaj wszystkie płyny z wyjątkiem seline na lodzie. Zwiększy to wewnętrzną autofluorescencję komórek zwierząt domowych przed mikropreparacją.
Za każdym razem obniżana będzie wartość znamionowa czterech sekcji. Obsługuj dwie sekcje jednocześnie. Napraw je najpierw w 70% etanolu na 30 sekund.
Następnie umyj sekcje pięcioma do sześciu szybkimi zanurzeniami. W dalszej części DPC uzdatniona woda. Odwodnić tkankę przez minutę w 100% etanolu i powtórzyć Ten krok, inkubować szkiełka w selinie przez cztery minuty.
W międzyczasie rozpocznij odwadnianie kolejnej pary sekcji. Na koniec wysusz szkiełka na powietrzu przez trzy do pięciu minut w ciemności. Chroń tkankę przed wilgocią, a autofluorescencję przed wybielaniem, umieszczając dwa szkiełka tyłem do siebie w folii Owiń tubkę 50 ml Przed sekcją wyczyść mikroskop z RNA i zaciśnij samoprzylepną nasadkę w robo Mover.
Włóż suwak do stolika i przesuń nasadkę dokładnie po sekcji, nie dotykając jej. Zlokalizuj oczka, identyfikując lepsze obszary komórek autofluorescencyjnych. Wewnętrzna autofluorescencja ludzkich lepszych komórek wydaje się żółta w konfiguracji, podczas gdy przewody trzustkowe wykazują jasnozieloną autofluorescencję.
Wybierz lepsze obszary komórek za pomocą narzędzia do zaznaczania z wolnej ręki i przeanalizuj je mikro, uruchamiając laser. Rozciąć oczka czterech sekcji kriogenicznych o obniżonych wartościach znamionowych do jednej nasadki samoprzylepnej w ciągu 40 do 60 minut. W razie potrzeby sprawdź przechwyconą tkankę, przesuwając nasadkę do punktu kontrolnego mikroskopu.
Zdejmij nasadkę z robo movera i wyruruj ją. 10 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego do pokrywy Nasadki do rozbijania komórek. Inkubuj czapkę do góry nogami w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 minut.
Odwiruj lizat, oznacz probówkę i przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie można przeprowadzić ekstrakcję RNA. Wykonaj laser Ation, mikro rozwarstwienie i lizę ze wszystkimi 40 kriosekcjami. Następnie połącz 10 lizatów i kontynuuj izolację RNA za pomocą zestawu do izolacji UR PU RNA zgodnie z dostarczonym protokołem, aby uzyskać 11 mikrolitrów RNA.
Ogólnie rzecz biorąc, nie znaleźliśmy bezpośredniego związku między ilością tkanki mikrodysekcyjnej a wydajnością RNA Różnice w odstępie czasu między pobraniem przez chirurgów a zamrożeniem próbki trzustki po jej zbadaniu przez patologa, mogą częściowo odpowiadać za jakość i ilość odzyskanego RNA. Inne kluczowe czynniki, które należy wziąć pod uwagę, to energia lasera zastosowana do mikropreparacji o niższej energii, przy użyciu wyższej integralności RNA, a także ognisko lasera i odległość punktów wskazujących laserowej wycinarki ciśnieniowej. Dodatkowo ilość RNA można zoptymalizować, utrzymując odległość między nasadką kleju a jak najmniejszą.
Unikaj utraty mikro wypreparowanej tkanki podczas procesu przechwytywania, pod warunkiem, że dostępny jest laserowy mikroskop do mikropreparacji. Procedura ta może być wdrożona we wszystkich instytucjach badawczych wykonujących częściową ektomię trzustki, zwiększając w ten sposób dostęp do materiału powiek ludzkich zarówno u osób bez cukrzycy, jak i z cukrzycą.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół mikrodyssekcji laserowej w celu odzyskania ludzkich wysepek trzustkowych z próbek chirurgicznych. Technika ta poprawia gromadzenie komórek beta do badań transkryptomowych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Transkryptomyka
Tło
- Mikrodyssekcja laserowa pozwala na izolację określonych populacji komórek.
- Jest szczególnie przydatna dla małych próbek tkankowych.
- Technika ta może być stosowana w różnych badaniach, w tym analizach transkryptomowych i proteomicznych.
- Poprawa autofluorescencji pomaga w gromadzeniu docelowych komórek.
Cel badania
- Dostarczyć szczegółowy protokół pozyskiwania ludzkich wysepek trzustkowych.
- Ułatwić badanie komórek beta w badaniach transkryptomowych.
- Zwiększyć efektywność pobierania komórek z próbek chirurgicznych.
Stosowane metody
- Technika mikrodyssekcji laserowej zastosowana do tkanki trzustki.
- Przygotowanie próbek tkankowych poprzez krojenie na małe kawałki.
- Zanurzenie tkanki w schłodzonej substancji dla optymalnej dysekcji.
- Pobieranie komórek beta do dalszej analizy.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja ludzkich wysepek trzustkowych.
- Poprawiona autofluorescencja komórek beta zaobserwowana.
- Protokół wykazał skuteczność w badaniach transkryptomowych.
- Ułatwiło pobieranie docelowych populacji komórek z małych próbek.
Wnioski
- Protokół poprawia odzyskiwanie ludzkich wysepek trzustkowych.
- Mikrodyssekcja laserowa jest cennym narzędziem do analizy komórkowej.
- Ulepszone metody mogą prowadzić do lepszych wnikliwości w badaniach transkryptomowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Laser microdissection enables precise isolation of human pancreatic beta cells from limited surgical specimens, addressing a critical bottleneck in transcriptomic studies of diabetes-relevant tissues. By enhancing intrinsic autofluorescence through ice-cold reagent processing, the protocol reduces tissue handling time and improves RNA preservation, directly supporting target validation in metabolic disease research. This approach strengthens mechanistic de-risking by providing purified cell populations for downstream omics applications in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating pure beta cell populations for pathway analysis in type 2 diabetes models.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through rapid, accurate identification of target cells via enhanced autofluorescence, reducing false positives in target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for assay standardization by providing consistent, high-integrity RNA inputs from microdissected islets.
- Operational Value: Supports reproducible quantitative outputs essential for screening readiness and platform reuse in biomarker discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by enabling transcriptomic analysis of human pancreatic islets directly linked to diabetic pathophysiology.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by supplying defined cell populations for mechanistic follow-up studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis testing in early biology, supporting assay development through standardized inputs, and informing translational decisions via quantitative molecular profiling.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating beta cells for functional target validation in metabolic disease models.
- Screening: Delivers assay-ready samples with reproducible RNA yields, critical for screening compound effects on isolated islets.
- Analytics: Generates quantitative transcriptomic readouts that allow comparison between diabetic and non-diabetic states to inform lead identification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing human-relevant samples that bridge in vitro findings to disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for accessing primary human islets across multiple projects, reducing dependency on variable donor sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in beta cell-specific signaling pathways.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through controlled tissue processing and defined dissection parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of target engagement in human-relevant cells, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of diabetes targets based on validated human islet transcriptomic profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, cryosectioning, and laser microdissection instrumentation.
- Dependent on access to a PALM MicroBeam system or equivalent LMD platform with AutoLPC capability.
- Necessitates standardized reagent handling protocols to maintain autofluorescence and RNA integrity across users.
- Involves adaptation considerations for varying pancreatic specimen quality and ischemic time between harvest and freezing.
- Limited by RNA yield constraints, necessitating pooling of multiple microdissected samples for sufficient input to downstream kits.
