Name: Mysi model gojenia się ran (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: Poznaj model gojenia ran u myszy z wykorzystaniem silikonowej szyny zapobiegającej skurczowi rany. Ta metoda umożliwia testowanie związków terapeutycznych przyspieszających epitelizację i angiogenezę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować za wsparcie finansowe ze strony Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych (NHMRC) Australii (ID grantu projektu: 632512). Louise Dunn była wspierana przez NHMRC Early Career Fellowship, a Christina Bursill przez National Heart Foundation Career Development Fellowship.

1. Przygotowanie szyn i opatrunków okluzyjnych
<ol>
 <li>Obrysuj 10 mm kółka na folii silikonowej o grubości 0,5 mm i użyj nożyczek lub dziurkacza do biopsji, aby stworzyć silikonowe krążki.</li>
 <li>Wyśrodkuj stempel do biopsji o średnicy 5 mm w środku okręgu o średnicy 10 mm i mocno dociśnij, aby utworzyć otwór tworzący krążek przypominający "pączek", który będzie używany jako szyna.</li>
 <li>Obrysuj 10 mm kółka na przezroczystym opatrunku okluzyjnym, takim jak Opsite, i użyj nożyczek, aby stworzyć okrągłe opatrunki.</li>
</ol>
2. Zwierzęta doświadczalne
<ol>
 <li>Uzyskanie zgody Komisji Bioetycznej ds. Zwierząt na wszystkie eksperymenty, które zostaną przeprowadzone.</li>
 <li>Użyj 8-tygodniowych (22-26 gramów) samców myszy C57BL/6J od komercyjnego hodowcy (np. The Jackson Laboratories).</li>
 <li>Trzymaj myszy w standardowych warunkach 21 °C i 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym ze swobodnym dostępem do jedzenia i wody.</li>
 <li>(Opcjonalnie): Cukrzycę można wywołać u myszy w wieku od 6 do 7 tygodni za pomocą wstrzyknięcia dootrzewnowego w bolusie 165 mg/kg streptozotocyny (w buforze cytrynianowym, pH 4,5), z hiperglikemią potwierdzoną przez regularne monitorowanie stężenia glukozy we krwi (glukometr AccuChek). Myszy z cukrzycą mogą mieć wielomocz, dlatego ich ściółka może wymagać częstszej zmiany w celu wyeliminowania wilgoci, a ich waga powinna być ściśle monitorowana.</li>
</ol>
3. Znieczulenie i przygotowanie operacyjne
<ol>
 <li>Wywołaj znieczulenie ogólne za pomocą 5% izofluranu w 100% tlenu (szybkość przepływu 1 l/min) i utrzymuj znieczulenie za pomocą 1-3% izofluranu.</li>
 <li>Upewnij się, że głębokie odruchy pedałowania myszy są stłumione i umieść mysz w pozycji leżącej.</li>
 <li>Przygotuj obszar operacyjny, usuwając sierść za pomocą maszynki do strzyżenia od podstawy szyi do 3 cm dalej w dół pleców i między dwiema łopatkami.</li>
 <li>Lekką aplikację kremu do depilacji można nakładać nie dłużej niż 2 minuty. Można użyć wacików z gazy, aby upewnić się, że cały krem i pozostała sierść zostały usunięte.</li>
 <li>Przetrzyj skórę wacikiem nasączonym alkoholem i dwiema aplikacjami 10% jodu powidonu (Betadine) i udrapuj mysz.</li>
</ol>
4. Wycięcie i unieruchomienie rany
<ol>
 <li>Schematyczne przedstawienie mysiego modelu gojenia się ran przedstawiono na rysunku 1.</li>
 <li>Użyj sterylnego dziurkacza do biopsji o średnicy 4 mm, aby obrysować dwa okrągłe wzory rany po obu stronach linii środkowej myszy na poziomie ramion (patrz ryc. 2a-2b).</li>
 <li>Użyj ząbkowanych kleszczy, aby podnieść skórę w środku konturu i nożyczek do tęczówki, aby utworzyć ranę o pełnej grubości, która rozciąga się przez tkankę podskórną (ryc. 2c-2d), w tym panniculus carnosus (ryc. 2e), i wyciąć okrągły kawałek tkanki.</li>
 <li>Powtórz ten proces dla rany po drugiej stronie linii środkowej (Rysunek 2f).</li>
 <li>Usuń plastikową powłokę ochronną z każdej strony silikonowej szyny.</li>
 <li>Nałóż klej cyjanoakrylowy (np. Super Glue lub Krazy Glue) na jedną stronę szyny silikonowej.</li>
 <li>Wyśrodkuj szynę nad raną (ryc. 2g) i zakotwicz szynę za pomocą przerywanych szwów nylonowych 6-0, aby zapewnić ułożenie (ryc. 2h).</li>
 <li>Powtórz proces szynowania na drugiej ranie.</li>
 <li>Jeśli jest to wymagane w tym momencie, należy nałożyć badany związek terapeutyczny (do 100 μl) na jedną ranę (rysunek 2i), a kontrolę nośnika na drugą.</li>
 <li>Przykryj ranę przezroczystym opatrunkiem okluzyjnym (na przykład OpSite) (ryc. 2j-2k).</li>
 <li>Pod szynami umieszcza się linijkę i wykonuje się mikrofotografię (ryc. 2l).</li>
</ol>
6. Postępowanie pooperacyjne
<ol>
 <li>Karprofen (5 mg/kg) podaje się raz na dobę we wstrzyknięciu podskórnym w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego.</li>
 <li>Po operacji zwierzęta są indywidualnie umieszczane w klatkach i trzymane na matach grzewczych do czasu całkowitego wyzdrowienia.</li>
 <li>Monitoruj zwierzęta dwa razy dziennie pod kątem objawów bólu i utraty wagi. Nie zaobserwowaliśmy żadnych rażących przejawów bólu lub utraty wagi.</li>
</ol>
7. Pomiar i leczenie ran
<ol>
 <li>Rana może być mierzona codziennie.</li>
 <li>Wywołaj znieczulenie ogólne za pomocą 5% izofluranu (szybkość przepływu 1 l/min), a następnie upewnij się, że głębokie odruchy czuciowe myszy są tłumione za pomocą 1-3% izofluranu.</li>
 <li>Delikatnie odklej opatrunek okluzyjny za pomocą kleszczy.</li>
 <li>Użyj suwmiarki chirurgicznej, aby zmierzyć średnicę rany. Pobieramy średnią z trzech pomiarów wzdłuż osi X, Y i Z (rysunki 2m-2o) oraz mikrofotografię do wykorzystania w przyszłości (Rysunek 2p).</li>
 <li>Opcjonalnie: W tym czasie zwierzę można ocenić pod kątem perfuzji krwi za pomocą laserowego obrazowania dopplerowskiego (ryc. 2q).</li>
 <li>W tym momencie można ponownie zastosować związek terapeutyczny i przeprowadzić kontrolę pojazdu.</li>
 <li>Następnie ponownie nakłada się czysty, przezroczysty opatrunek okluzyjny, a zwierzęta trzyma się w cieple aż do całkowitego wyzdrowienia.</li>
 <li>Uwaga: jeśli szyny nie są odpowiednio zabezpieczone, rana łatwo się kurczy (ryc. 2r).</li>
</ol>
8. Analiza histologiczna
<ol>
 <li>Myszy należy poddać eutanazji po 10 dniach za pomocą przedawkowania znieczulenia.</li>
 <li>Za pomocą kleszczyków i ostrza skalpela usuń szwy i ostrożnie oderwij szynę.</li>
 <li>Za pomocą nożyczek do tęczówki wykonać szerokie, pełne wycięcie wokół i pod raną i inkubować tkankę w 4% paraformaldehydzie w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
 <li>Przenieść tkankę do 17% sacharozy w roztworze PBS na kolejne 24 godziny w temperaturze 4 °C, a następnie usunąć nadmiar roztworu, ostrożnie wklepując w tkankę i umieścić w związku OCT i zamrozić w temperaturze -80 °C.</li>
 <li>Barwienie hematoksyliną i eozyną można wykorzystać do wizualizacji struktury rany i szczeliny nabłonkowej. Neowaskularyzację można ocenić za pomocą analiz immunohistochemicznych w celu określenia liczby naczyń włosowatych (przy użyciu czynnika von Willebranda).</li>
</ol>

<ol><li>Sen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skin+wounds%3A+a+major+and+snowballing+threat+to+public+health+and+the+economy%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair%22%5BJournal%5D)">Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy.</a> Wound Repair. 17, 763-771 (2009).</li>
<li>Sen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+essentials%3A+let+there+be+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Wound healing essentials: let there be oxygen.</a> Wound Repair Regen. 17, 1-18 (2009).</li>
<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li>
<li>Lindblad, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+selecting+the+correct+animal+model+for+dermal+wound-healing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomater.+Sci.+Polym.+Ed%22%5BJournal%5D)">Considerations for selecting the correct animal model for dermal wound-healing studies.</a> J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 1087-1096 (2008).</li>
<li>Grose, R., Werner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound-healing+studies+in+transgenic+and+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Wound-healing studies in transgenic and knockout mice.</a> Mol. Biotechnol. 28, 147-166 (2004).</li>
<li>Reid, R. R., Said, H. K., Mogford, J. E., Mustoe, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+wound+healing%3A+pursuing+surgical+models+in+transgenic+and+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Surg%22%5BJournal%5D)">The future of wound healing: pursuing surgical models in transgenic and knockout mice.</a> J. Am. Coll. Surg. 199, 578-585 (2004).</li>
<li>Fang, R. C., Mustoe, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+wound+healing%3A+utility+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomater.+Sci.+Polym.+Ed%22%5BJournal%5D)">Animal models of wound healing: utility in transgenic mice.</a> J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 989-1005 (2008).</li>
<li>Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+approaches+to+create+murine+models+of+human+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Surgical approaches to create murine models of human wound healing.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2011, 969618(2011).</li>
<li>Galiano, R. D., Michaels, J. t, Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+reproducible+murine+model+of+excisional+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair%22%5BJournal%5D)">Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing.</a> Wound Repair. 12, 485-492 (2004).</li>
<li>Galiano, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+vascular+endothelial+growth+factor+accelerates+diabetic+wound+healing+through+increased+angiogenesis+and+by+mobilizing+and+recruiting+bone+marrow-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Topical vascular endothelial growth factor accelerates diabetic wound healing through increased angiogenesis and by mobilizing and recruiting bone marrow-derived cells.</a> The American Journal of Pathology. 164, 1935-1947 (2004).</li>
<li>Thangarajah, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+for+impaired+hypoxia-induced+VEGF+expression+in+diabetic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The molecular basis for impaired hypoxia-induced VEGF expression in diabetic tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13505-13510 (2009).</li>
<li>Raza, A., Bayles, C., Biebel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+Bacterial+Growth+and+Moisture+Handling+Properties+of+Transparent+Dressings%3A+3M+Tegaderm+Transparent+Dressing%2C+3M+Tegaderm+HP+Transparent+Dressing%2C+and+Opsite+IV3000+Transparent+Dressing%5BTitle%5D)+AND+%22Smith+and+Nephew+Report%22%5BJournal%5D)">Investigation of Bacterial Growth and Moisture Handling Properties of Transparent Dressings: 3M Tegaderm Transparent Dressing, 3M Tegaderm HP Transparent Dressing, and Opsite IV3000 Transparent Dressing.</a> Smith and Nephew Report. , (1998).</li>
<li>Chung, T. Y., Peplow, P. V., Baxter, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+photobiomodulatory+effects+of+laser+irradiation+on+wound+healing%3A+development+of+an+improved+model+for+dressing+wounds+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Photomed.+Laser+Surg%22%5BJournal%5D)">Testing photobiomodulatory effects of laser irradiation on wound healing: development of an improved model for dressing wounds in mice.</a> Photomed. Laser Surg. 28, 589-596 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jest to eksperymentalny mysi model gojenia się ran skórnych. Istotną cechą tego modelu jest zastosowanie szyn silikonowych zapobiegających kurczeniu się rany, dzięki czemu może dojść do ponownego nabłonkowania i tworzenia się nowych tkanek, co upodabnia go do procesu zachodzącego u ludzi. Model ten jest wszechstronny i może być używany do oceny gojenia się ran zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patofizjologicznych (np. cukrzyca). Model może być również wykorzystany do oceny potencjalnego gojenia się ran ...

Upośledzone gojenie się ran jest odpowiedzialne za znaczną zachorowalność i śmiertelność na całym świecie; dotyczy to szczególnie osób cierpiących na cukrzycę1,2. U ludzi gojenie się ran jest kontinuum procesów, w których w znacznym stopniu nakładają sięna siebie 3. Bezpośrednio po zranieniu inicjowane są procesy zapalne. Komórki zapalne uwalniają czynniki, które pobudzają procesy proliferacji, migracji i angiogenezy komórek. Po reepitelializacji i utworzeniu nowej tkanki następuje faza przebudowy, która pociąga za sobą zarówno apoptozę, jak i reorganizację białek macierzy, takich jak kolagen.
Złożoność gojenia ran nie może być obecnie odtworzona in vitro, co wymaga użycia modeli zwierzęcych. Do tej pory badania nad gojeniem się ran ograniczały się do dużych modeli zwierzęcych, takich jak świnie, aby zapewnić, że procesy gojenia są równoważne i porównywalne z procesami u ludzi. Jednak wykorzystanie dużych zwierząt do takich badań może być trudne do utrzymania w domu i nie zawsze jest praktyczne4. Mysz laboratoryjna reprezentuje ekonomiczny model zwierzęcy, który można łatwo manipulować genetycznie w celu przeprowadzenia badań mechanistycznych5-7. Jednak rany mysie goją się inaczej niż u ludzi, przede wszystkim ze względu na proces skurczu8. Wynika to częściowo z rozległej podskórnej warstwy mięśni prążkowanych zwanej panniculus carnosus, która jest w dużej mierze nieobecna u ludzi. U myszy ta warstwa mięśniowa umożliwia ruch skóry niezależnie od głębszych mięśni i jest odpowiedzialna za szybki skurcz skóry po zranieniu.
Aby przezwyciężyć to ograniczenie, mysie gojenie ran może być dostosowane do replikowania gojenia się ran u ludzi za pomocą szyny (Rysunek 1)8,9. W tym filmie pokazujemy szynowany model rany mysjej, który eliminuje skurcz rany i bardziej zbliża się do ludzkich procesów reepitelializacji i tworzenia nowych tkanek. W tym modelu na grzbiecie tworzone są dwa wycięcia o pełnej grubości, które obejmują panniculus carnosus, po jednym z każdej strony linii środkowej myszy. Wokół rany za pomocą kleju zakłada się szynę silikonową, a następnie zabezpiecza się ją przerwanymi szwami. Każda mysz działa jak osobna kontrola, przy czym jedna rana jest leczona, a druga kontrolowana pojazdem, zmniejszając w ten sposób liczbę zwierząt. Po zastosowaniu miejscowym nakładany jest przezroczysty opatrunek okluzyjny. Opatrunek można zdjąć w razie potrzeby do dalszych zastosowań miejscowych i/lub pomiaru powierzchni rany10,11. Po zakończeniu eksperymentów zamknięcie rany, architekturę morfologiczną i stopień neowaskularyzacji można ocenić za pomocą immunohistochemii. Ten ekonomiczny i łatwy do wykonania model może być również wykorzystany do oceny gojenia się ran w kontekście cukrzycy lub innych patofizjologii.

<table><tbody><tr><td>Folia silikonowa Press-to-seal o grubości 0,5 mm</td><td>Invitrogen</td><td>P18178</td><td>Pokroić w "pączki" o średnicy zewnętrznej 1 cm zewnętrznej, 0,5 cm średnicy wewnętrznej</td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji 5 mm</td><td>Steifel</td><td>BC-B1-0500</td><td>Do obrysowania obszaru rany do wycięcia</td></tr><tr><td>Nożyczki Vannas 8,5 cm zakrzywione</td><td>World Precision Instruments </td><td>501232</td><td>Do nacinania i wycinania ran</td></tr><tr><td>Dumonte #7b kleszcze, 11 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>501302</td><td>Do chwytania skóry podczas wykonywania nacięć i wycinania skóry </td></tr><tr><td>Kleszcze Graefe, ząbkowane 10 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>14142</td><td>Do pomocy w mocowaniu szyny silikonowej do skóry</td></tr><tr><td>Uchwyt igły, szczęki gładkie, zakrzywiony, 12,5 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>14132</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Malis, gładkie, proste, 12 cm</td><td>Codman and Shurtleff, Inc (J& Amp; J)</td><td>80-1500</td><td>Do przyszywania pierścieni silikonowych do skóry</td></tr><tr><td>Linijka, gradacja 0,5 mm</td><td>nie dotyczy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suwmiarki Gradacja 0,25 mm</td><td>Duckworth i Kent</td><td>9-653</td><td>Do pomiaru obszaru rany</td></tr><tr><td>Opsite FlexiFix przezroczysta folia samoprzylepna. 10 cm x 1 m</td><td>Smith & Siostrzeniec</td><td>66030570</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl (Carprofen)</td> <td>Pfizer</td><td>462986</td><td></td></tr></tbody></table>

mysi model gojenia się ran

Murine Model of Wound Healing

Gojenie i gojenie ran to najbardziej złożone procesy biologiczne, które zachodzą w życiu człowieka. Po urazie aktywuje się wiele szlaków biologicznych. Upośledzone gojenie się ran, które występuje na przykład u pacjentów z cukrzycą, może prowadzić do poważnych niekorzystnych wyników, takich jak amputacja. W związku z tym istnieje coraz większy impuls do opracowywania nowych środków, które wspomagają gojenie się ran. Ich testowanie ograniczyło się do dużych modeli zwierzęcych, takich jak świnie, które często są niepraktyczne. Myszy stanowią idealny model przedkliniczny, ponieważ są ekonomiczne i podatne na manipulacje genetyczne, co pozwala na badania mechanistyczne. Jednak gojenie się ran u myszy zasadniczo różni się od gojenia się ludzi, ponieważ zachodzi głównie poprzez skurcz. Nasz mysi model radzi sobie z tym problemem, umieszczając szynę wokół rany. Poprzez szynowanie rany, proces gojenia jest następnie zależny od nabłonkowania, proliferacji komórkowej i angiogenezy, które ściśle odzwierciedlają biologiczne procesy gojenia się ran u ludzi. Chociaż wymaga spójności i staranności, ten mysi model nie obejmuje skomplikowanych technik chirurgicznych i pozwala na solidne testowanie obiecujących środków, które mogą, na przykład, promować angiogenezę lub hamować stan zapalny. Co więcej, każda mysz pełni rolę własnej grupy kontrolnej, gdy przygotowywane są dwie rany, co umożliwia zastosowanie zarówno badanego związku, jak i kontroli nośnika na tym samym zwierzęciu. Podsumowując, demonstrujemy praktyczny, łatwy do opanowania i solidny model gojenia się ran, który jest porównywalny z modelem gojenia się ran.

Krzywą gojenia rany wyznacza się poprzez obliczenie średnicy rany i wyrażenie wyników w procentach, t.j. 100 - (średnica w dniu 0/średnica w dniu X). W tym doświadczeniu do rany codziennie aplikowano związek terapeutyczny (lub kontrolę nośnikiem). Związek terapeutyczny znacznie przyspieszył zamykanie się rany (Rysunek 3). Należy zauważyć, że szyny muszą być utrzymywane przez cały czas trwania eksperymentu, ponieważ ich usunięcie doprowadzi do szybkiego kurczenia się rany (Rysunek 2r</str...

Mysi model gojenia się ran skórnych, który może być używany do oceny związków terapeutycznych w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych.

Mysi model gojenia się ran

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Ogólnym celem tej procedury jest utworzenie rany, która następnie zostaje unieruchomiona szyną, aby zapobiec jej obkurczaniu się oraz wspomóc proliferację nabłonka i angiogenezę. W tym celu w pierwszej kolejności przygotowuje się grzbiet i wykonuje dwa pełnowarstwowe rany wycinane po obu stronach linii środkowej. Następnie nad ranami umieszcza się szynę i mocuje ją za pomocą szwów.Następnie mierzy się ranę i stosuje odpowiednie leczenie. Na koniec na ranę nakłada się opatrunek okluzyjny, a mysz pozostawia się do regeneracji. W ostateczności model gojenia rany wycinanej skóry jest wykorzystywany do oceny rany, epitelializacji oraz procesów towarzyszących, w tym proliferacji i angiogenezy.Główną zaletą tej techniki w stosunku do innych metod jest zapobieganie kurczeniu się rany. Sprzyja to proliferacji nabłonka i angiogenezie, co w większym stopniu odwzorowuje proces gojenia ran. U ludzi metoda ta jest szczególnie użyteczna przy ocenie skuteczności związków terapeutycznych, a ponieważ każda mysz służy jako własna kontrola, minimalizuje ona liczbę zwierząt niezbędnych do przeprowadzenia badania.Zacznij od przygotowania szyn i opatrunków okluzyjnych w celu wykonania szyny. Najpierw wyrysuj koło o średnicy 10 mm na arkuszu silikonu, a następnie za pomocą nożyczek lub wycinaka do biopsji wytnij krążki silikonowe. Następnie wycentruj wycinak do biopsji o średnicy 5 mm na środku krążka o średnicy 10 mm i dociśnij go mocno, aby utworzyć pierścień w kształcie pączka, który posłuży jako szyna.Przygotuj okrągłe opatrunki tej samej wielkości, używając przezroczystego opatrunku okluzyjnego, takiego jak Opsite. Na początek potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia u znieczulonej myszy. Po usunięciu wszystkich włosów z obszaru operacyjnego oczyść skórę, wielokrotnie aplikując Betadynę i alkohol.Po przygotowaniu, za pomocą sterylnego pięciomilimetrowego wycinaka do biopsji, wykonaj obrys dwóch kolistych wzorów po obu stronach linii środkowej myszy na poziomie barków. Następnie użyj pęsety z ząbkami, aby unieść skórę wewnątrz obrysu, a nożyczek irydologicznych, aby stworzyć ranę. Należy upewnić się, że nacięcie przechodzi przez tkankę podskórną, w tym powięź.Wyciąć tkankę z obu stron, aby odsłonić dwie okrągłe rany. Usunąć plastikową powłokę ochronną z każdej strony szyny silikonowej i nałożyć klej cyjanoakrylowy na jedną stronę.Wyśrodkuj szynę nad raną i przymocuj ją szwami przerywanymi z nylonu 6-0. Powtórz proces szynowania na drugiej ranie. Na tym etapie do jednej rany można zastosować związek terapeutyczny, wykorzystując drugą jako kontrolę.W celu uzyskania kontroli nośnika, umieść linijkę pod szynami i wykonaj mikrofotografię. Przykryj ranę jednym z wcześniej przygotowanych okrągłych fragmentów opatrunku. Po podaniu leku przeciwbólowego pozwól zwierzęciu dojść do siebie w ogrzewanej klatce.Zwierzęta są monitorowane dwa razy dziennie pod kątem objawów bólu i utraty masy ciała. Aby zmierzyć ranę, znieczul zwierzę zgodnie z wcześniejszą instrukcją i ostrożnie odklej opatrunek okluzyjny za pomocą pęsety. Użyj suwmiarki chirurgicznej, aby zmierzyć średnicę rany w kilku punktach w celu wyznaczenia średniej, a następnie wykonaj mikrofotografię do późniejszej analizy.W tym momencie można ocenić perfuzję krwi u zwierzęcia. Używając obrazowania dopplerowskiego laserem, nałóż czysty, przezroczysty opatrunek okluzyjny na ranę i utrzymuj zwierzę w cieple do czasu pełnego wybudzenia. Należy zauważyć, że jeśli szyny nie zostaną odpowiednio zabezpieczone, rana łatwo się obkurczy po eutanazji poprzez przedawkowanie środka znieczulającego; użyj pęsety i ostrza skalpela, aby usunąć szwy i ostrożnie oddzielić szynę od ran.Używając nożyczek irydowych, wykonaj szerokie i pełne wycięcie wokół i pod obszarem rany. Po usunięciu utrwal tkankę zgodnie ze standardowymi procedurami. Do wizualizacji struktury rany i przerwy w nabłonku można zastosować barwienie hematoksyliną i eozyną.Ponadto neowaskularyzację można ocenić za pomocą analiz immunohistochemicznych w celu określenia liczby naczyń włosowatych. Krzywą zamykania rany wyznacza się poprzez obliczenie średnicy rany i wyrażenie wyników w procentach. W tym przykładzie związek terapeutyczny znacznie przyspieszył zamykanie rany w porównaniu z grupami kontrolnymi.Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zająć 30 minut. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby stabilnie przymocować szynę za pomocą równomiernie rozmieszczonych szwów, aby zachować spójność pomiędzy eksperymentami.

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Model mysiego gojenia ran

W tym filmie opisujemy procedurę izolowania łożyska rany wywołanego kolonoskopią w odpowiednim momencie do szczegółowej analizy molekularnej. Analiza ta pomaga zrozumieć proces gojenia się ran w stanach zapalnych przewodu pokarmowego.

Kolonoskopowy model rany mysiej sterowanej: metoda izolowania łożyska rany wywołanej biopsją od jelita grubego, aby zrozumieć proces gojenia

Opisujemy nieinwazyjny protokół obrazowania in vivo, który jest uproszczony i opłacalny, wykorzystując L-012, chemiluminescencyjny analog luminolu, do wizualizacji i ilościowego określenia reaktywnych form tlenu (ROS) generowanych w mysim modelu rany wycinającej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie reaktywnych form tlenu w mysim modelu rany

Tutaj prezentujemy protokół dla testu in vitro z użyciem pierwotnych fibroblastów oraz dla testu in vivo gojenia ran skóry na myszach. Oba testy są prostymi metodami oceny gojenia się ran in vitro i in vivo.

Test migracji zadrapań i komora grzbietowego fałdu skórnego do analizy gojenia się ran in vitro i in vivo

Tutaj opisane są dwa modele gojenia ran u myszy, jeden przeznaczony do oceny reakcji na gojenie się ran komórkowych i cytokinowych, a drugi do ilościowego określania szybkości zamykania ran. Metody te mogą być stosowane w złożonych modelach chorób, takich jak cukrzyca, w celu określenia mechanizmów różnych aspektów złego gojenia się ran.

Ocena ostrego gojenia się ran za pomocą grzbietowej podskórnej implantacji gąbki z polialkoholu winylowego i wycinających raki skóry ogona.

Celem tego badania było opracowanie mysiego modelu gojenia się ran po oparzeniach. Oparzenie termiczne wywołano na skórze grzbietowej myszy za pomocą podgrzanego mosiężnego szablonu. Spaloną tkankę oczyszczono i pokryto przeszczepem skóry pobranym z ogona genetycznie podobnej myszy dawcy.

Mysi model rany oparzeniowej zrekonstruowany za pomocą allogenicznego przeszczepu skóry

Ten protokół opisuje, jak generować obustronne rany wycinające o pełnej grubości u myszy oraz jak następnie monitorować, zbierać i przygotowywać rany do analizy morfometrycznej. Dołączono szczegółowy opis sposobu wykorzystania seryjnych odcinków histologicznych do definiowania, precyzyjnego określania ilościowego i wykrywania wad morfometrycznych.

Mysi model gojenia ran wycinających i histologiczna morfometryczna analiza ran

Tutaj demonstrujemy zoptymalizowaną technikę oceny gojenia ran za pomocą ludzkiej skóry ex vivo w połączeniu z podejściem polegającym na barwieniu całego wierzchowania. Metodologia ta stanowi przedkliniczną platformę do oceny potencjalnych terapii ran.

Ludzki model ran ex vivo i barwienie całej góry w celu dokładnej oceny naprawy skóry

To badanie przedstawia dwie kluczowe techniki eksperymentalne: budowę mysiego modelu rany do oceny zamknięcia rany oraz przygotowanie zawiesin jednokomórkowych z mysiej skóry w celu zachowania żywotności komórek.

Modele ran u myszy i przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek

Przedstawiono uproszczony protokół do tworzenia modelu gojenia ran oparzeniowych u myszy za pomocą cyfrowego urządzenia grzewczego. Przypominające szachownicę miejsca eksperymentalne utworzone na skórze ułatwiają dalszą analizę funkcjonalną w teście gojenia się ran.

Szachownica gojącego rany po oparzeniach model myszy oparty na cyfrowym urządzeniu grzewczym

Rany stanowią globalne wyzwanie zdrowotne. W ramach tego badania opracowano standaryzowaną kabinę fotograficzną wykorzystującą planimetrię cyfrową w celu zminimalizowania zmienności pomiaru rany. Monitorowanie ran u myszy przez 14 dni wykazało początkowy wzrost powierzchni i obwodu rany, po którym następowało stopniowe zamykanie. Metodologia ta może pomóc w ocenie kinetyki zamykania ran w modelach przedklinicznych.

Planimetria cyfrowa do oceny kinetyki zamykania ran w modelu mysim

Opisano zostało szczurze modele rany skóry, które umożliwiają ocenę różnych środków terapeutycznych w warunkach fizjologicznych lub patologicznych na różnych etapach procesu gojenia. Ponadto szczegółowo opisano protokół do wykonywania manualnej planimetrji w celu monitorowania szybkości kurczenia się rany w trakcie naprawy tkanki.

Model szczurzych ran chirurgicznych: podejście do badań nad gojeniem się ran i oceną biomateriałów

Poznaj model gojenia ran u myszy z wykorzystaniem silikonowej szyny zapobiegającej skurczowi rany. Ta metoda umożliwia testowanie związków terapeutycznych przyspieszających epitelizację i angiogenezę.

Mysi model gojenia się ran

Przeglądaj więcej filmów