Name: Opracowanie nowej szczepionki z komórek dendrytycznych z wykorzystaniem komórek macierzystych czerniaka i raka płaskonabłonkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Poznaj metodę szczepionki z komórek dendrytycznych opartej na komórkach macierzystych czerniaka i raka płaskonabłonkowego. Ta technika wzmacnia odpowiedź immunologiczną przeciwko nowotworom.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez The Will and Jeanne Caldwell Endowed Research Fund of the University of Michigan Comprehensive Cancer Center, a częściowo przez CA82529 grantowe NIH i Fundację Gillson Longenbaugh.

1. Barwienie ALDEFLUOR
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki komórkowej: Przygotować zawiesinę komórek nowotworowych z pojedynczych komórek, albo z hodowanych komórek nowotworowych, albo ze świeżo pobranych próbek guza. Policz komórki i dostosuj zawiesinę komórek do stężenia 1 x 106 komórek/ml w buforze do oznaczania ALDEFLUOR.</li>
	<li>Oznacz cztery probówki z polistyrenu o wymiarach 12 mm x 75 mm jako probówki kontrolne w następujący sposób: #1: Niebarwiony, #2: ALDEFLUOR, #3: ALDEFLUOR plus DEAB i #4: 7AAD.</li>
	<li>W przypadku tych probówek kontrolnych umieść 1 ml zawiesiny komórek w #1 i #4, ale 2 ml w probówce #2. Dodaj 5 μl DEAB (inhibitora ALDH) do probówki #3 i trzymaj na lodzie. Następnie dodać 10 μl aktywowanego substratu ALDEFLUOR do probówki #2, wymieszać i natychmiast przenieść 1 ml mieszaniny do probówki #3.</li>
	<li>W tym samym czasie dodać 2 μl aktywowanego substratu ALDEFLUOR na milion komórek do pozostałych komórek (probówek z próbkami) również w stężeniu 1 x 106 komórek/ml w buforze testowym ALDEFLUOR.</li>
	<li>Inkubować zarówno 4 probówki kontrolne, jak i probówki z próbkami przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po inkubacji dodać 5 μl 7AAD do probówki kontrolnej #4 i 1 μl 7AAD 1 x 106 komórek do probówki z próbką. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odwirować wszystkie probówki przez 5 minut przy 250 x g i usunąć supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w buforze testowym ALDEFLUOR.</li>
	<li>Wykonaj sortowanie oparte na cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Ustawić bramki sortujące za pomocą komórek barwionych ALDEFLUOREM potraktowanych DEAB jako kontrola ujemna i komórek barwionych jodkiem propidyny (PI) 7AAD w celu kontroli żywotności. Na podstawie tych kontroli ustalono bramkę w celu rozróżnienia komórek ALDEFLUOR+/ALDHhigh, D5 i SCC7. Bramki te zostaną następnie wykorzystane do posortowania wszystkich przygotowanych powyżej komórek próbek dla komórek ALDEFLUOR+/ALDHo wysokiej zawartości D5 i SCC7.</li>
</ol>
2. Przygotowanie szczepionki przeciwko lizatom i pulsacyjnym komórkom dendrytycznym (CSC-TPDC) przeciwko nowotworowym komórkom macierzystym
<ol>
	<li>Eutanazja myszy (odpowiednio syngeniczne B6 i C3H) za pomocą CO2 i wyizolowanie kości udowych i piszczelowych.</li>
	<li>Umieść kości w 75% etanolu na 1 minutę w temperaturze pokojowej. Następnie umyj kości za pomocą HBSS.</li>
	<li>Odetnij głowę od kości i użyj igły 21 G i strzykawki o pojemności 10 ml, aby wepchnąć komórki do naczynia.</li>
	<li>Odessać i przedmuchać komórki za pomocą strzykawki, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.</li>
	<li>Po odwirowaniu z prędkością 1 500 obr./min przez 5 minut, odrzucić supernatant. Następnie dodać 5 ml buforu do lizy RBC, aby lizować RBC przez 1 minutę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Policz liczbę komórek i dostosuj zawiesinę komórek do stężenia 1 miliona komórek/ml w kompletnym pożywce (CM) zawierającej 10 ng/ml GM-CSF i 10 ng/ml IL-4.</li>
	<li>Hoduj komórki i kompensuj CM oraz IL-4 i GM-CSF 3 dni później.</li>
	<li>W 5dniu należy zebrać niedojrzałe komórki dendrytyczne (DC) i przygotować pożywkę izolacyjną DC zawierającą 4,2 ml roztworu C oraz 1 ml pożywki o gradiencie gęstości OptiPrep.</li>
	<li>Zawiesić granulki komórek w 5 ml CM. Powoli dodawać zawiesinę komórek do podłoża izolacyjnego. Wirować z prędkością 2 000 obr./min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zbierz DC między CM a medium izolacyjnym. Policz liczbę komórek i dostosuj zawiesinę komórek do stężenia 1 miliona komórek/ml w pożywce hodowlanej zawierającej 10 ng/ml GM-CSF i 10 ng/ml IL-4.</li>
	<li>Przygotować lizaty nowotworowe, zawieszając wysoko lub niesortowane komórki D5 lub SCC7 owysokiej zawartości ALDH w pożywce hodowlanej i poddając szybkiej ekspozycji na zamrażanie i rozmrażanie czterokrotnie, a następnie wirowanie przy ∼100 x g przez 5 minut w celu zebrania części błonowej lizatów.</li>
	<li>Aby przygotować CSC-TPDC, pulsuj DC lizatem autologicznych komóreko wysokim poziomie ALDH. Aby przygotować H-TPDC, pulsuj DC niesortowanym heterogennym lizatem komórek nowotworowych. Stosunek DC do lizatu komórek nowotworowych jest taki sam.</li>
</ol>
3. Szczepienie i ocena skuteczności
<ol>
	<li>Zaszczep normalne myszy B6 odpowiednio 2,500 komórek nowotworowych D5 CSC-TPDC lub D5 H-TPDC podskórnie (s.c.). Zaszczepić normalne zwierzęta C3H s.c. odpowiednio 5,000 komórek nowotworowych SCC7 CSC-TPDC lub SCC7 H-TPDC. </li>
	<li>Po szczepieniu należy zmobilizować myszy B6 heterogenicznymi komórkami nowotworowymi D5 dożylnie. Myszy należy poddać eutanazji za pomocą CO2 20 dni później. Zbierz płuca i policz przerzuty do płuc.</li>
	<li>W modelu SCC7 należy rzucić wyzwanie myszom C3H z niesortowanymi komórkami nowotworowymi SCC7 s.c po przeciwnej stronie szczepionki DC. Monitoruj wielkość guza.</li>
	<li>Pod koniec eksperymentów należy poddać eutanazji myszy B6 i C3H za pomocą CO2 . W 34 dniu po pierwszej szczepionce należy poddać myszy eutanazji za pomocą CO2 i jednocześnie pobrać śledziony z każdej grupy za pomocą procedury aseptycznej. </li>
	<li>Aktywuj limfocyty T i/lub B śledziony za pomocą unieruchomionych mAb anty-CD3 plus anty-CD28 w CM zawierającym wodobrzusze mAb hrIL-2 lub LPS plus anty-CD40 (FGK45).</li>
	<li>Po aktywacji zebrać supernatanty i użyć do testu ELISA.</li>
	<li>W przypadku testu ELISA należy pokryć płytki przeciwciałami przeciwko IFNγ, GM-CSF i IgG w temperaturze 4 °C O/N.</li>
	<li>Po zastosowaniu buforu blokującego dodać próbki i wzorce i inkubować w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyć płytkę i dodać przeciwciało wykrywające HRP oraz substrat TMB do inkubacji.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję na czytniku płytek ELISA przy długości fali 450 nm w ciągu 30 minut po zatrzymaniu reakcji.</li>
</ol>

<ol><li>Shafee, N., Smith, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+contribute+to+cisplatin+resistance+in+Brca1%2Fp53-mediated+mouse+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells contribute to cisplatin resistance in Brca1/p53-mediated mouse mammary tumors.</a> Cancer Res. 68, 3243-3250 (2008).</li>
<li>Nandi, S., Ulasov, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+radiation+enhances+survivin-mediated+virotherapy+against+malignant+glioma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Low-dose radiation enhances survivin-mediated virotherapy against malignant glioma stem cells.</a> Cancer Res. 68, 5778-5784 (2008).</li>
<li>Dallas, N. A., Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoresistant+colorectal+cancer+cells%2C+the+cancer+stem+cell+phenotype%2C+and+increased+sensitivity+to+insulin-like+growth+factor-I+receptor+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition.</a> Cancer Res. 69, 1951-1957 (2009).</li>
<li>Yamauchi, K., Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cancer+metastasis+by+cyclophosphamide+pretreatment+of+host+mice%3A+an+opposite+effect+of+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of cancer metastasis by cyclophosphamide pretreatment of host mice: an opposite effect of chemotherapy.</a> Cancer Res. 68, 516-520 (2008).</li>
<li>Chang, A. E., Redman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+trial+of+tumor+lysate-pulsed+dendritic+cells+in+the+treatment+of+advanced+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer.</a> Clin. Cancer Res. 8, 1021-1032 (2002).</li>
<li>Ito, F., Li, Q., Shreiner, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-CD137+monoclonal+antibody+administration+augments+the+antitumor+efficacy+of+dendritic+cell-based+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Anti-CD137 monoclonal antibody administration augments the antitumor efficacy of dendritic cell-based vaccines.</a> Cancer Res. 64, 8411-8419 (2004).</li>
<li>Kirk, C. J., Hartigan-O'Connor, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-dependent+antitumor+immunity+mediated+by+secondary+lymphoid+tissue+chemokine%3A+augmentation+of+dendritic+cell-based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">T cell-dependent antitumor immunity mediated by secondary lymphoid tissue chemokine: augmentation of dendritic cell-based immunotherapy.</a> Cancer Res. 61, 2062-2070 (2001).</li>
<li>Ning, N., Pan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cell+vaccination+confers+significant+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity.</a> Cancer Res. 72, 1853-1864 (2012).</li>
<li>Ginestier, C., Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR1+blockade+selectively+targets+human+breast+cancer+stem+cells+in+vitro+and+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts.</a> J. Clin. Invest. 120, 485-497 (2010).</li>
<li>Carpentino, J. E., Hynes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase-expressing+colon+stem+cells+contribute+to+tumorigenesis+in+the+transition+from+colitis+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase-expressing colon stem cells contribute to tumorigenesis in the transition from colitis to cancer.</a> Cancer Res. 69, 8208-8215 (2009).</li>
<li>Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Res. 69, 1302-1313 (2009).</li>
</ol>

Firma STEMCELL Technologies wsparła opłaty za publikacje w otwartym dostępie.

Gospodarze z obniżoną odpornością, tacy jak myszy SCID, wykluczają ocenę immunologiczną CSC z powodu braku odporności adaptacyjnej w obrębie gospodarzy. W tym badaniu oceniliśmy immunogenność CSC u immunokompetentnych gospodarzy, którzy mogą bardziej naśladować warunki pacjenta. Wzbogacone CSC są immunogenne i mogą indukować skuteczniejszą odporność ochronną nowotworu, gdy ich lizaty są ładowane do DC jako szczepionka w porównaniu z niewybranymi DC pulsacyjnymi lizatami komórek nowotworowych. Mechanistycznie ochrona została zapewniona przez selektywną indukcję przeciwciał reaktywnych CSC i limfocytów T8 , a także produkcję cytokin typu 1, np. IFNγ i GM-CSF.
Większość obecnych immunoterapii, w tym szczepionki oparte na komórkach dendrytycznych i adoptywny transfer limfocytów T, jest ukierunkowana na antygeny zróżnicowane pod kątem nowotworu. CSC, które mogą nie wyrażać tych zróżnicowanych antygenów, mogą zatem uniknąć tego celowania immunologicznego. W przeciwieństwie do tego, szczepionka CSC zaprojektowana specjalnie do celowania w nowotworowe komórki macierzyste może zniszczyć tę specjalną populację komórek nowotworowych, a tym samym poprawić skuteczność terapeutyczną szczepionki poprzez zapobieganie nawrotom guza i przerzutom.
Zarówno w hodowanych komórkach nowotworowych, jak i świeżo pobranych guzach, zidentyfikowaliśmy populację wzbogaconą w CSC za pomocą cytometrii przepływowej opartej na wysokiej aktywności dehydrogenazy aldehydowej. Takie komórkio wysokim poziomie ALDH można wyizolować przez sortowanie przepływowe, aby wykorzystać je jako źródło antygenu do impulsowania prądem stałym w celu wytworzenia CSC-TPDC. Porównanie przy użyciukomórek o wysokim poziomie ALDH wyizolowanych z hodowanych komórek nowotworowych w porównaniu ze świeżo pobranymi nowotworami nie wykazało istotnej różnicy pod względem indukcji odporności anty-CSC8. Wyniki te ujawniły potencjał wykorzystania CSC wyizolowanych z hodowanych komórek nowotworowych lub ze świeżo pobranych guzów do zastosowań klinicznych.
Aby szczepionka była istotna klinicznie, musi zostać przebadana w warunkach terapeutycznych. Eksperymenty te są obecnie przeprowadzane w naszym laboratorium.

Nowotworowe komórki macierzyste są stosunkowo odporne na konwencjonalną chemioterapię i radioterapię1,2. Z drugiej strony, ta populacja komórek może być komórkami odpowiedzialnymi za nawrót i progresję nowotworów po tradycyjnych terapiach przeciwnowotworowych1-4. Ze względu na brak ekspresji zróżnicowanych antygenów nowotworowych na nowotworowych komórkach macierzystych, rakowe komórki macierzyste mogą unikać obecnych interwencji immunologicznych terapii raka, które są w większości zaprojektowane tak, aby celować w antygeny na zróżnicowane komórki nowotworowe. W związku z tym opracowanie nowych strategii ukierunkowanych na nowotworowe komórki macierzyste i ich niszczących może przynieść nadzieję na zwiększenie skuteczności terapeutycznej obecnego leczenia raka. W tym celu wyizolowaliśmy populacje wzbogacone w rakowe komórki macierzyste (CSC) z dwóch guzów zwierzęcych (czerniak D5 i rak płaskonabłonkowy SCC7) i wykorzystaliśmy je jako źródło antygenu do pulsacji komórek prezentujących antygen (komórki dendrytyczne, DC) w celu przygotowania szczepionki CSC-TPDC. Następnie oceniliśmy odporność przeciwnowotworową indukowaną przez szczepionkę CSC-TPDC u syngenicznych immunokompetentnych gospodarzy, myszy B6 i myszy C3H. Skuteczność przeciwnowotworową indukowaną przez CSC-TPDC porównano z tradycyjną szczepionką DC pulsacyjną z lizatem z niesortowanych heterogennych komórek nowotworowych (H-TPDC), która była wcześniej stosowana przez naszą grupę5,6, a także przez innych badaczy7 zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i klinicznych.

<table><tbody><tr><td>ALDHEFLOUR KIT</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IL-4</td><td>Pepro Tech</td><td>214-14</td><td></td></tr><tr><td>Mysz GM-CSF</td><td>Pepro Tech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>Mysz GM-CSF ELISA KIT</td><td>BD Biosciences</td><td>555167</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium</td><td>Sigma</td><td>Aldrich D1556</td><td></td></tr><tr><td>BD OptEIA TMB Substrated Reagent Zestaw</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria Cell Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>336834</td><td></td></tr><tr><td>Kcjunior</td><td>Bio-Tek Instruments</td><td>176058</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie nowej szczepionki z komórek dendrytycznych z wykorzystaniem komórek macierzystych czerniaka i raka płaskonabłonkowego

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Zidentyfikowaliśmy populacje wzbogacone w rakowe komórki macierzyste (CSC) od myszy syngenecznej czerniaka D5 do myszy C57BL/6 i raka płaskonabłonkowego SCC7 syngenicznego do myszy C3H, używając ALDEFLUOR/ALDH jako markera, i przetestowaliśmy ich immunogenność przy użyciu lizatu komórkowego jako źródła antygenów do pulsacyjnych komórek dendrytycznych (DC). DC pulsowane lizatami CSCo wysokim poziomie ALDH indukowały znacznie wyższą ochronną odporność przeciwnowotworową niż DC pulsowane lizatami niesortowanych całych komórek nowotworowych w obu modelach oraz odpowiednio w ustawieniu przerzutów do płuc i ustawieniu wzrostu guza SC. Zjawisko to było spowodowane humoralną, a także komórkową odpowiedzią anty-CSC wywołaną szczepionką CSC. W szczególności splenocyty wyizolowane od gospodarza poddanego szczepionce CSC-DC wytwarzały znacznie większą ilość IFNγ i GM-CSF niż splenocyty wyizolowane od gospodarza poddanego niesortowanej szczepionce pulsacyjnej DC z lizatem komórek nowotworowych. Wyniki te wspierają wysiłki zmierzające do opracowania autologicznej szczepionki terapeutycznej opartej na CSC do użytku klinicznego w warunkach adiuwantowych.

ALDEFLUOR/ALDH był wykorzystywany jako pojedynczy marker do izolowania komórek macierzystych w wielu nowotworach złośliwych8-11. Wykorzystując ALDEFLUOR jako marker, zidentyfikowaliśmy populacje wzbogacone w nowotworowe komórki macierzyste w dwóch modelach guzów: D5 i SCC7. Wykryliśmy komórki ALDEFLUOR+ w mysim czerniaku B16-D5 oraz w raku płaskonabłonkowym SCC7. Stwierdzono, że komórki ALDEFLUOR+ stanowią odpowiednio około 0,5% i 5,2% w hodowlach linii komórkowych nowotworów D5 i SCC7 (Rysunek 1). W celu potwierdzenia obecności komórek ALDEFLUOR+ przeanalizowano świeżo pobrane komórki z wytworzonych guzów. Jak pokazano również na Rysunku 1, komórki ALDEFLUOR+ stanowiły odpowiednio 2,5% i 4,2% w guzach D5 i SCC7 wytworzonych in vivo. Zdolność do tworzenia guzów oraz potencjał do samoodnawiania tych posortowanych populacji D5 i SCC7 ALDEFLUOR+/ALDHhigh oceniono odpowiednio w syngenicznych gospodarzach immunocompetentnych: myszach C57BL/6 oraz C3H8.
W badaniach na zwierzętach oraz w badaniach klinicznych wykorzystaliśmy lizat nieposortowanych heterogenicznych komórek nowotworowych do pulsowania komórek dendrytycznych (H-TPDC)5,6. Aby zbadać immunogenność CSC, wyizolowaliśmy CSC ALDHhigh i pulsowaliśmy komórki dendrytyczne lizatem CSC w celu wygenerowania CSC-TPDC (Rysunek 2), natomiast H-TPDC wykorzystaliśmy jako konwencjonalną kontrolną szczepionkę przeciwnowotworową, aby sprawdzić, czy CSC-TPDC wykazuje korzystny wpływ na hamowanie wzrostu guza.
Oceniliśmy immunogenność CSC, badając ochronną odporność przeciwnowotworową indukowaną przez CSC-TPDC. W modelu D5 naiwne myszy immunokompetentne szczepiono s.c CSC-TPDC lub H-TPDC (przy tym samym stosunku lizatu do DC). Grupy kontrolne otrzymały sól fizjologiczną (PBS). Tydzień po ostatnim szczepieniu myszy poddano wyzwaniu w postaci dożylnego (i.v.) podania nieposortowanych komórek nowotworowych D5, a po 3 tygodniach pobrano płuca w celu policzenia przerzutów płucnych. Jak pokazano w Table 1, myszy leczone H-TPDC rozwinęły mniej przerzutów płucnych w porównaniu z grupą PBS. Co istotne, myszy leczone CSC-TPDC miały znacznie mniej przerzutów płucnych niż grupa szczepiona H-TPDC w obu przeprowadzonych eksperymentach. W modelu SCC7 normalne zwierzęta C3H szczepiono s.c odpowiednio SCC7 CSC-TPDC lub H-TPDC w prawy bok, a następnie poddano wyzwaniu poprzez podskórne (s.c) podanie nieposortowanych komórek nowotworowych SCC7 w lewy bok. W porównaniu z grupą PBS, H-TPDC wywołało umiarkowaną odporność przeciwnowotworową przeciwko wzrostowi guza. Jednakże w myszach leczonych CSC-TPDC odnotowano istotne zahamowanie wzrostu guza w porównaniu zarówno z grupą kontrolną, jak i grupą H-TPDC (p&lt;0.05, Figure 3). Wyniki te wskazują, że CSC mogą być wykorzystane jako bardziej efektywne źródło antygenów do ładowania DC niż tradycyjne nieposortowane komórki nowotworowe w indukowaniu odporności ochronnej przeciwko wyzwaniu komórkami nowotworowymi.
Aby lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw obserwowanego indukowanego przez CSC ochronnego odporności przeciwnowotworowej, po zakończeniu eksperymentów pobrano śledziony od zwierząt poddanych szczepieniom DC. Komórki śledziony aktywowano następnie za pomocą anty-CD3/CD28/IL-2 lub anty-CD3/CD28/IL-2 + LPS/anty-CD40. Następnie zebrano nadsączki hodowlane, aby wykryć ekspresję cytokin i przeciwciał. Odnotowano znacznie wyższą produkcję IFNγ i GM-CSF przez komórki śledziony pochodzące od zwierząt szczepionych D5 CSC-TPDC lub SCC7 CSC-TPDC (Rysunek 4). Co więcej, w przypadku komórek śledziony aktywowanych LPS/anty-CD40 pobranych od zwierząt szczepionych D5 CSC-TPDC lub SCC7 CSC-TPDC, stwierdzono istotnie (p&lt;0,05) wyższą produkcję IgG w porównaniu z D5 H-TPDC lub SCC7 H-TPDC. Wykazano, że przeciwciała te wiążą się odpowiednio z CSC D5 i SCC7, a takie wiązanie może prowadzić do lizy CSC w obecności dopełniacza8.
<img alt="Wykres cytometrii przepływowej sortowania komórek, hodowane/świeże D5 SCC7 z/bez DEAB, pokazuje populację komórek." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Populacje ALDHFLUOR+/ALDHhigh wykryto zarówno w hodowanych, jak i świeżo pobranych mysich czerniakach D5 oraz guzach плоскоściennych SCC7. Komórki nowotworowe traktowane 50 mmol/L DEAB, specyficznego inhibitora ALDH, posłużyły jako kontrola negatywna.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.</a>
<img alt="Schemat sortowania komórek nowotworowych myszy i pulsowania komórek dendrytycznych w badaniach nad rakiem ALDH\(^\text{high}\)." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Generowanie szczepionek przeciwko komórkom macierzystym nowotworu opartych na komórkach dendrytycznych. W celu przygotowania CSC-TPDC i H-TPDC, komórki dendrytyczne pochodzące z szpiku kostnego zostały poddane pulsowaniu odpowiednio lizatami komórek ALDHhigh lub nieposortowanych komórek nowotworowych.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
<img alt="Wykres porównania wielkości guza; efekty leczenia PBS, H-TPDC, CSC-TPDC; istotność statystyczna." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Szczepionka z komórek dendrytycznych pulsowanych lizatem CSC (CSC-TPDC) może indukować skuteczniejszą ochronną odporność przeciwnowotworową w modelu guza SCC7 wszczepionego s.c. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
<img alt="Analiza produkcji cytokin w populacjach TPDC; wykresy słupkowe poziomów IFN-γ i GM-CSF w zależności od metody aktywacji." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Silniejsze systemowe odpowiedzi komórkowe u gospodarza immunokompetentnego szczepionego CSC-TPDC. Splenocyty pobrano od zwierząt poddanych szczepieniu H-TPDC lub CSC-TPDC i aktywowano zgodnie z opisem. Następnie zebrano nadsączki z kultur w celu wykrycia cytokin za pomocą testu ELISA.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>

Oceniane na syngenetycznych immunokompetentnych gospodarzach, szczepionka z komórek dendrytycznych (DC) na bazie nowotworowych komórek macierzystych (CSC) wykazała znacznie wyższą odporność przeciwnowotworową niż tradycyjne szczepionki DC pulsujące z heterogenicznymi komórkami nowotworowymi.

Opracowanie nowej szczepionki z komórek dendrytycznych z wykorzystaniem komórek macierzystych czerniaka i raka płaskonabłonkowego

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena odporności przeciwnowotworowej wywołanej szczepionką opartą na komórkach dendrytycznych (DC) pochodzących z komórek macierzystych nowotworu (CSC) u gospodarza z kompetentnym układem odpornościowym. Jest to realizowane poprzez wstępną izolację CSC wykazujących wysoką aktywność dehydrogenazy aldehydowej (ALDH high) z heterogennych komórek nowotworowych. W drugim kroku izolowane są DC pochodzące z CSC, które następnie poddaje się pulsacji lizatem w celu przygotowania szczepionki.Następnie szczepionkę Pulses DC lub TP DC z lizatem CSC podaje się normalnym syngenicznym gospodarzom immunokompetentnym. W ostatnim kroku ocenia się ochronną skuteczność przeciwnowotworową szczepionki C-S-C-T-P-D-C. Ostatecznie można przeprowadzić analizę ELI SA w celu oceny odporności przeciwko CSC indukowanej szczepionką C-S-C-T-P-D-C przez limfocyty T i przeciwciała gospodarza.Projekt ten łączy dwie z najbardziej obiecujących dziedzin badań nad nowotworami: obszar komórek macierzystych nowotworu oraz obszar immunoterapii guzów. Nasze laboratorium było jednym z pierwszych, które odkryło komórki macierzyste nowotworu w guzach litych. Są one „ziarnami” raka, które napędzają jego wzrost oraz przerzutowanie.W dzisiejszym materiale zaprezentujemy nowe podejście z wykorzystaniem immunoterapii do specyficznego celowania w te nowotworowe komórki macierzyste. Wykorzystujemy konkretny marker zwany dehydrogenazą aldehydową, który można wykryć za pomocą testu Alde fluoro. Zobaczą Państwo lekarzy Lin Liu i Huon Tau współpracujących z dr Chow Lee.Mamy nadzieję, że poprzez celowanie w te nowotworowe komórki macierzyste uda nam się poprawić rokowania pacjentów z wieloma rodzajami nowotworów. Należy rozpocząć od zawieszenia wybranych komórek nowotworowych w buforze do analizy ALOR w stężeniu 1×10⁶ komórek/ml. Następnie należy przenieść wszystkie komórki nowotworowe poza 3 ml do poszczególnych probówek z próbkami i oznakować cztery polistyrenowe probówki kontrolne o wymiarach 12×75 mm w następujący sposób: niebarwione, ALOR, ALOR plus DEAB oraz 7-AAD. Do probówek „niebarwione” oraz „7-AAD” należy odpipetować 1 ml zawiesiny komórkowej, a do probówki „ALOR” 2 ml.Następnie dodaj 5 µL DEAB do probówki z ALOR oraz DEAB. Umieść probówki w lodzie, a następnie wymieszaj 10 µL aktywowanego substratu alor w probówce z alor. Bezzwłocznie przenieś 1 mL roztworu substratu do probówki z ALOR oraz DEAB, a następnie dodaj 2 µL aktywowanego substratu alor na 1 milion komórek do każdej z probówek z próbkami.Inkubować wszystkie probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie dodać 5 µL 7-AAD do probówki z 7-AAD oraz 1 µL 7-AAD na 1 milion komórek do każdej probówki z próbką. Przechowywać te probówki w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Wirować wszystkie probówki przez 5 minut przy 250 ×g w temperaturze pokojowej, a następnie zawiesić osady w buforze do testu Aldefluor w celu przeprowadzenia sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.Aby ustawić bramki sortowania, należy wykorzystać komórki alde Fluor plus DEAB jako kontrolę negatywną oraz komórki barwione siedmioma A a D jako kontrolę żywotności. Na podstawie tych kontroli należy ustanowić bramkę pozwalającą odróżnić komórki alor pozytywne A LDH, high D five oraz SCC seven. Następnie należy ją wykorzystać do posortowania komórek z próbki na populacje alor pozytywne A LDH, high D five oraz SCC seven.Aby wygenerować komórki dendrytyczne, należy najpierw wyizolować kości udowe i piszczelowe z myszy C 57 black six oraz C3 H. Kości należy wysterylizować w 75% etanolu przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć w HBSS. Następnie odcina się końce kości i za pomocą strzykawki 10 ml z igłą 21 G wypłukuje szpik kostny do szalki Petriego, aspiruje i dozuje komórki kilkakrotnie w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek, a następnie wiruje komórki.Osad inkubować w pięciu mililitrach buforu do lizy erytrocytów przez jedną minutę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Po przeliczeniu komórek, dostosować ich stężenie do 1×10⁶ komórek na mililitr w pożywce hodowlanej uzupełnionej o G-M-C-S-F oraz IL-4. Następnie hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2, odświeżając pożywkę oraz cytokiny po trzech dniach.Piątego dnia należy zebrać niedojrzałe komórki dendrytyczne. Po odwirowaniu komórek, osad należy resuspendować w pięciu mililitrach pożywki hodowlanej, a następnie powoli nałożyć zawiesinę komórkową na świeżo przygotowaną pożywkę izolacyjną. Po ponownym odwirowaniu komórek, zebrać dcs znajdujące się pomiędzy warstwą pożywki hodowlanej a pożywki izolacyjnej.Następnie, po policzeniu komórek, dostosuj objętość do stężenia 1 × 10⁶ komórek na ml w pożywce hodowlanej uzupełnionej o G-M-C-S-F oraz IL-4. Teraz przygotuj lizaty guza, poddając posortowane komórki czterokrotnemu szybkiemu zamrażaniu i rozmrażaniu, a następnie odwirowaniu w celu zebrania frakcji błonowej lizatów. Następnie stymuluj DCS lizatem z posortowanych autologicznych komórek ALDH high, aby przygotować CSC TPCs.Aby przygotować puls H-T-P-D-C, komórki dcs z nieposortowanym lizatem heterogenicznych komórek nowotworowych wykorzystuje się do wakcynacji zwierząt biorców w grupie eksperymentalnej poprzez podskórny wtrysk 1 × 10⁶ zapulsowanych komórek, zawieszonych w 100 µL PBS, w lewy bok każdej myszy. Po wakcynacji, w celu wywołania odpowiedzi chorobowej u myszy biorców C 57 black six, podaje się dożylnie 1 × 10⁵ heterogenicznych komórek nowotworowych D5 w 100 µL PBS. W przypadku modelu SCC7, myszy biorców C3 H poddaje się wyzwaniu podskórnemu poprzez wstrzyknięcie 1 × 10⁶ nieposortowanych komórek nowotworowych SCC7 w 100 µL PBS po przeciwnej stronie niż podano szczepionkę DC.Przygotować zawiesinę pojedynczych komórek z śledion producentów myszy C3 H. Następnie aktywować limfocyty T i B ze śledziony za pomocą unieruchomionych przeciwciał monoklonalnych anty-CD3 i anty-CD28 w pożywce hodowlanej uzupełnionej o odpowiedni stymulator. Po czterech dniach zebrać nadsączone ciecze, a następnie pokryć płytki ELISA przeciwciałami przeciwko interferonowi gamma, G-M-CSF lub IgG w temperaturze 4°C przez noc. Następnego dnia zablokować wiązania nieswoiste na płytkach, nanieść wzorce oraz świeżo zebrane nadsączone ciecze, a następnie inkubować płytki w temperaturze pokojowej. Po przemyciu dodać przeciwciało detekcyjne HRP na jedną godzinę, a następnie dodać substrat TMB.Na koniec zmierz absorbancję za pomocą czytnika płytek ELISA przy 450 nanometrach w ciągu 30 minut od zatrzymania reakcji. Alor był stosowany jako marker do izolacji komórek macierzystych w wielu nowotworach złośliwych, w tym w dwóch populacjach wzbogaconych w nowotworowe komórki macierzyste D five oraz SCC seven; jak pokazano na tych wykresach kropkowych, komórki Alor-dodatnie stanowią odpowiednio około 0,5% i 5,2% hodowlanych linii komórkowych guza D five i SCC seven. Ustalono również, że świeżo wyizolowane komórki nowotworowe zawierają odpowiednio 2,5% i 4,2% komórek Alor-dodatnich w guzach D five i SCC seven wytworzonych in vivo.Jako kontrolę negatywną wykorzystano komórki nowotworowe traktowane specyficznym inhibitorem LDH D-E-A-B-A. Immunogenność komórek macierzystych nowotworu oceniono poprzez zbadanie ochronnej odporności przeciwnowotworowej indukowanej przez TPC z CSC, wykorzystując wcześniej przedstawiony model szczepień. Jak pokazano w tej tabeli, u myszy traktowanych H TPC rozwinęło się mniej przerzutów do płuc niż u myszy traktowanych samym PBS.Co istotne, myszy traktowane PC z CSC wykazywały jeszcze mniejszą liczbę przerzutów do płuc niż zwierzęta traktowane samymi H-T-P-D-C lub PBS. W modelu SCC seven normalne zwierzęta C3 H zaszczepiono w sposób przedstawiony powyżej w porównaniu z grupą kontrolną. H TPCs indukowali umiarkowaną odporność przeciwnowotworową, podczas gdy CSC TPCs indukowali znaczną inhibicję wzrostu guza. Wyniki te wskazują, że CSC mogą być wykorzystywane jako skuteczniejsze źródło antygenów do ładowania komórek dendrytycznych niż tradycyjne, nieposortowane komórki nowotworowe w celu indukowania odporności ochronnej przeciwko wyzwaniu komórkami nowotworowymi.Aby lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw zaobserwowanej, indukowanej przez CSC ochronnej odporności przeciwnowotworowej, aktywowano cyty z organizmów zwierząt szczepionych DC i zmierzono ich produkcję cytokin za pomocą EISA; jak właśnie wykazano, produkcja cytokin była znacząco wyższa w przypadku cytów pobranych od zwierząt szczepionych D five CSC TPCs lub S CCC seven CSC PCs, niż od zwierząt szczepionych D five H TPCs lub SCC seven HTCs. W dzisiejszym materiale zaprezentowano, jak wykorzystać test Alor do izolacji komórek macierzystych nowotworu.Te nowotworowe komórki macierzyste mogą następnie zostać wykorzystane do opracowania immunoterapii z wykorzystaniem komórek dendrytycznych. Mamy nadzieję, że immunoterapie te, stosowane samodzielnie lub w połączeniu z istniejącymi terapiami, poprawią rokowania pacjentów z wieloma typami nowotworów.

generation-novel-dendritic-cell-vaccine-using-melanoma-squamous

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wygenerowanie nowego szczepionki dendrytycznej z wykorzystaniem komórek macierzystych raka czerniakowego i rak komórk- kopulastych

Ten film demonstruje test szczepienia nowotworów na bazie komórek. Mysz, której śródskórnie wstrzyknięto komórki czerniaka B16-F10 w celu powstania guza, jest szczepiona komórkami B16-F10 wydzielającymi cytokinę Flt3L w pobliżu rozwiniętego guza. Wydzielany Flt3L ze szczepionki wspomaga dojrzewanie i proliferację komórek dendrytycznych, które następnie prezentują antygeny nowotworowe limfocytom T w węzłach chłonnych, wywołując ukierunkowaną przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną.

Implantacja guza i wstrzyknięcie szczepionki przeciwnowotworowej w modelu mysim

Opisano najczęściej używaną metodę generowania dużej liczby autologicznych komórek dendrytycznych (DC) do wykorzystania w immunoterapii nowotworów.  Metoda wykorzystuje IL-4 i GM-CSF do różnicowania DC od monocytów.  Niedojrzałe DC są stymulowane do dojrzewania, a następnie ładowane antygenami przed wstrzyknięciem z powrotem pacjentowi.

Przygotowanie dojrzałych komórek dendrytycznych obciążonych antygenem nowotworowym do immunoterapii

Ten artykuł opisuje przygotowanie świeżo uzyskanej tkanki czerniaka do pierwotnych hodowli komórkowych oraz sposób usuwania zanieczyszczeń erytrocytów i fibroblastów z komórek nowotworowych. Na koniec opisujemy, w jaki sposób domniemane komórki macierzyste czerniaka CD133 + są sortowane od masy CD133 za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS).

Hodowla komórkowa pochodząca od pacjenta i izolacja domniemanych komórek macierzystych raka CD133+ z czerniaka

Celem tego protokołu jest pokazanie protokołu przeprogramowania limfocytów naciekających guzy czerniaka na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich limfocytów naciekających nowotwór czerniaka

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę generowania indukowanych indukowanych pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z komórek macierzystych (iTE) za pomocą trójwymiarowego (3D) systemu hodowli grasicy. iTE to jednorodny podzbiór limfocytów T blisko spokrewniony z naiwnymi limfocytami T ze zdolnością do proliferacji, tworzenia pamięci i supresji guza.

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego

Urządzenie lub płytka do transimmunizacji (TI) i związane z nim protokoły zostały opracowane w celu odtworzenia kluczowych cech pozaustrojowej fotochemoterapii (ECP), w warunkach eksperymentalnych, pozwalając na produkcję fizjologicznie aktywowanych, przestrajalnych komórek dendrytycznych (DC) do immunoterapii raka.

Nowy protokół generowania fizjologicznych immunogennych komórek dendrytycznych

Ten artykuł opisuje metodę generowania funkcjonalnych, specyficznych dla antygenu nowotworowego, indukowanych, indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z CD8αβ+ dodatnich limfocytów T przy użyciu systemu kohodowli OP9/DLL1.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do wytwarzania limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego

Prezentowany tutaj jest protokół skutecznego tłumienia replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) u myszy poprzez wykorzystanie adoptywnego transferu komórek (ACT) limfocytów T specyficznych dla antygenu wirusowego (Ag) pochodzących z komórek macierzystych. Procedura ta może być dostosowana do potencjalnej immunoterapii zakażenia HBV opartej na ACT.

Limfocyty T specyficzne dla wirusa Ag pochodzące z komórek macierzystych hamują replikację HBV u myszy

Protokół przedstawia model immunoterapii nowotworów za pomocą komórkowego szczepienia guza z ekspresją Flt3L czerniaka B16-F10. Protokół ten demonstruje procedury, w tym przygotowanie hodowanych komórek nowotworowych, implantację guza, napromienianie komórek, pomiar wzrostu guza, izolację wewnątrznowotworowych komórek odpornościowych i analizę cytometrii przepływowej.

Eksperymentalny model immunoterapii czerniaka z wykorzystaniem szczepienia przeciwnowotworowego cytokiną krwiotwórczą

Przedstawiono unikalny, kompleksowy protokół generowania de-sialylowanych ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (mo-DCs) z izolowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) za pomocą leczenia sialidazą. Ponadto opisano metody oceny charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej mo-DC oraz oceny, w jaki sposób leczenie sialidazą poprawia poziom dojrzewania mo-DC.

Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów o różnych fenotypach sjalowanych

Protokół ten opisuje przeprogramowanie in vivo mysich komórek rakowych na komórki dendrytyczne typu 1 w mikrośrodowisku guza poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych PU.1, IRF8 i BATF3.

Wykonalne przeprogramowanie in vivo komórek nowotworowych na konwencjonalne komórki dendrytyczne typu 1

Poznaj metodę szczepionki z komórek dendrytycznych opartej na komórkach macierzystych czerniaka i raka płaskonabłonkowego. Ta technika wzmacnia odpowiedź immunologiczną przeciwko nowotworom.

Opracowanie nowej szczepionki z komórek dendrytycznych z wykorzystaniem komórek macierzystych czerniaka i raka płaskonabłonkowego (Wideo) | JoVE Journal

Opracowanie nowej szczepionki z komórek dendrytycznych z wykorzystaniem komórek macierzystych czerniaka i raka płaskonabłonkowego

Przeglądaj więcej filmów