Opracowanie nowej szczepionki z komórek dendrytycznych z wykorzystaniem komórek macierzystych czerniaka i raka płaskonabłonkowego

Ogólnym celem tej procedury jest ocena odporności przeciwnowotworowej wywołanej szczepionką opartą na komórkach dendrytycznych (DC) pochodzących z komórek macierzystych nowotworu (CSC) u gospodarza z kompetentnym układem odpornościowym. Jest to realizowane poprzez wstępną izolację CSC wykazujących wysoką aktywność dehydrogenazy aldehydowej (ALDH high) z heterogennych komórek nowotworowych. W drugim kroku izolowane są DC pochodzące z CSC, które następnie poddaje się pulsacji lizatem w celu przygotowania szczepionki.

Następnie szczepionkę Pulses DC lub TP DC z lizatem CSC podaje się normalnym syngenicznym gospodarzom immunokompetentnym. W ostatnim kroku ocenia się ochronną skuteczność przeciwnowotworową szczepionki C-S-C-T-P-D-C. Ostatecznie można przeprowadzić analizę ELI SA w celu oceny odporności przeciwko CSC indukowanej szczepionką C-S-C-T-P-D-C przez limfocyty T i przeciwciała gospodarza.

Projekt ten łączy dwie z najbardziej obiecujących dziedzin badań nad nowotworami: obszar komórek macierzystych nowotworu oraz obszar immunoterapii guzów. Nasze laboratorium było jednym z pierwszych, które odkryło komórki macierzyste nowotworu w guzach litych. Są one „ziarnami” raka, które napędzają jego wzrost oraz przerzutowanie.

W dzisiejszym materiale zaprezentujemy nowe podejście z wykorzystaniem immunoterapii do specyficznego celowania w te nowotworowe komórki macierzyste. Wykorzystujemy konkretny marker zwany dehydrogenazą aldehydową, który można wykryć za pomocą testu Alde fluoro. Zobaczą Państwo lekarzy Lin Liu i Huon Tau współpracujących z dr Chow Lee.

Mamy nadzieję, że poprzez celowanie w te nowotworowe komórki macierzyste uda nam się poprawić rokowania pacjentów z wieloma rodzajami nowotworów. Należy rozpocząć od zawieszenia wybranych komórek nowotworowych w buforze do analizy ALOR w stężeniu 1×10⁶ komórek/ml. Następnie należy przenieść wszystkie komórki nowotworowe poza 3 ml do poszczególnych probówek z próbkami i oznakować cztery polistyrenowe probówki kontrolne o wymiarach 12×75 mm w następujący sposób: niebarwione, ALOR, ALOR plus DEAB oraz 7-AAD. Do probówek „niebarwione” oraz „7-AAD” należy odpipetować 1 ml zawiesiny komórkowej, a do probówki „ALOR” 2 ml.

Następnie dodaj 5 µL DEAB do probówki z ALOR oraz DEAB. Umieść probówki w lodzie, a następnie wymieszaj 10 µL aktywowanego substratu alor w probówce z alor. Bezzwłocznie przenieś 1 mL roztworu substratu do probówki z ALOR oraz DEAB, a następnie dodaj 2 µL aktywowanego substratu alor na 1 milion komórek do każdej z probówek z próbkami.

Inkubować wszystkie probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie dodać 5 µL 7-AAD do probówki z 7-AAD oraz 1 µL 7-AAD na 1 milion komórek do każdej probówki z próbką. Przechowywać te probówki w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Wirować wszystkie probówki przez 5 minut przy 250 ×g w temperaturze pokojowej, a następnie zawiesić osady w buforze do testu Aldefluor w celu przeprowadzenia sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.

Aby ustawić bramki sortowania, należy wykorzystać komórki alde Fluor plus DEAB jako kontrolę negatywną oraz komórki barwione siedmioma A a D jako kontrolę żywotności. Na podstawie tych kontroli należy ustanowić bramkę pozwalającą odróżnić komórki alor pozytywne A LDH, high D five oraz SCC seven. Następnie należy ją wykorzystać do posortowania komórek z próbki na populacje alor pozytywne A LDH, high D five oraz SCC seven.

Aby wygenerować komórki dendrytyczne, należy najpierw wyizolować kości udowe i piszczelowe z myszy C 57 black six oraz C3 H. Kości należy wysterylizować w 75% etanolu przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć w HBSS. Następnie odcina się końce kości i za pomocą strzykawki 10 ml z igłą 21 G wypłukuje szpik kostny do szalki Petriego, aspiruje i dozuje komórki kilkakrotnie w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek, a następnie wiruje komórki.

Osad inkubować w pięciu mililitrach buforu do lizy erytrocytów przez jedną minutę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Po przeliczeniu komórek, dostosować ich stężenie do 1×10⁶ komórek na mililitr w pożywce hodowlanej uzupełnionej o G-M-C-S-F oraz IL-4. Następnie hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2, odświeżając pożywkę oraz cytokiny po trzech dniach.

Piątego dnia należy zebrać niedojrzałe komórki dendrytyczne. Po odwirowaniu komórek, osad należy resuspendować w pięciu mililitrach pożywki hodowlanej, a następnie powoli nałożyć zawiesinę komórkową na świeżo przygotowaną pożywkę izolacyjną. Po ponownym odwirowaniu komórek, zebrać dcs znajdujące się pomiędzy warstwą pożywki hodowlanej a pożywki izolacyjnej.

Następnie, po policzeniu komórek, dostosuj objętość do stężenia 1 × 10⁶ komórek na ml w pożywce hodowlanej uzupełnionej o G-M-C-S-F oraz IL-4. Teraz przygotuj lizaty guza, poddając posortowane komórki czterokrotnemu szybkiemu zamrażaniu i rozmrażaniu, a następnie odwirowaniu w celu zebrania frakcji błonowej lizatów. Następnie stymuluj DCS lizatem z posortowanych autologicznych komórek ALDH high, aby przygotować CSC TPCs.

Aby przygotować puls H-T-P-D-C, komórki dcs z nieposortowanym lizatem heterogenicznych komórek nowotworowych wykorzystuje się do wakcynacji zwierząt biorców w grupie eksperymentalnej poprzez podskórny wtrysk 1 × 10⁶ zapulsowanych komórek, zawieszonych w 100 µL PBS, w lewy bok każdej myszy. Po wakcynacji, w celu wywołania odpowiedzi chorobowej u myszy biorców C 57 black six, podaje się dożylnie 1 × 10⁵ heterogenicznych komórek nowotworowych D5 w 100 µL PBS. W przypadku modelu SCC7, myszy biorców C3 H poddaje się wyzwaniu podskórnemu poprzez wstrzyknięcie 1 × 10⁶ nieposortowanych komórek nowotworowych SCC7 w 100 µL PBS po przeciwnej stronie niż podano szczepionkę DC.

Przygotować zawiesinę pojedynczych komórek z śledion producentów myszy C3 H. Następnie aktywować limfocyty T i B ze śledziony za pomocą unieruchomionych przeciwciał monoklonalnych anty-CD3 i anty-CD28 w pożywce hodowlanej uzupełnionej o odpowiedni stymulator. Po czterech dniach zebrać nadsączone ciecze, a następnie pokryć płytki ELISA przeciwciałami przeciwko interferonowi gamma, G-M-CSF lub IgG w temperaturze 4°C przez noc. Następnego dnia zablokować wiązania nieswoiste na płytkach, nanieść wzorce oraz świeżo zebrane nadsączone ciecze, a następnie inkubować płytki w temperaturze pokojowej. Po przemyciu dodać przeciwciało detekcyjne HRP na jedną godzinę, a następnie dodać substrat TMB.

Na koniec zmierz absorbancję za pomocą czytnika płytek ELISA przy 450 nanometrach w ciągu 30 minut od zatrzymania reakcji. Alor był stosowany jako marker do izolacji komórek macierzystych w wielu nowotworach złośliwych, w tym w dwóch populacjach wzbogaconych w nowotworowe komórki macierzyste D five oraz SCC seven; jak pokazano na tych wykresach kropkowych, komórki Alor-dodatnie stanowią odpowiednio około 0,5% i 5,2% hodowlanych linii komórkowych guza D five i SCC seven. Ustalono również, że świeżo wyizolowane komórki nowotworowe zawierają odpowiednio 2,5% i 4,2% komórek Alor-dodatnich w guzach D five i SCC seven wytworzonych in vivo.

Jako kontrolę negatywną wykorzystano komórki nowotworowe traktowane specyficznym inhibitorem LDH D-E-A-B-A. Immunogenność komórek macierzystych nowotworu oceniono poprzez zbadanie ochronnej odporności przeciwnowotworowej indukowanej przez TPC z CSC, wykorzystując wcześniej przedstawiony model szczepień. Jak pokazano w tej tabeli, u myszy traktowanych H TPC rozwinęło się mniej przerzutów do płuc niż u myszy traktowanych samym PBS.

Co istotne, myszy traktowane PC z CSC wykazywały jeszcze mniejszą liczbę przerzutów do płuc niż zwierzęta traktowane samymi H-T-P-D-C lub PBS. W modelu SCC seven normalne zwierzęta C3 H zaszczepiono w sposób przedstawiony powyżej w porównaniu z grupą kontrolną. H TPCs indukowali umiarkowaną odporność przeciwnowotworową, podczas gdy CSC TPCs indukowali znaczną inhibicję wzrostu guza. Wyniki te wskazują, że CSC mogą być wykorzystywane jako skuteczniejsze źródło antygenów do ładowania komórek dendrytycznych niż tradycyjne, nieposortowane komórki nowotworowe w celu indukowania odporności ochronnej przeciwko wyzwaniu komórkami nowotworowymi.

Aby lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw zaobserwowanej, indukowanej przez CSC ochronnej odporności przeciwnowotworowej, aktywowano cyty z organizmów zwierząt szczepionych DC i zmierzono ich produkcję cytokin za pomocą EISA; jak właśnie wykazano, produkcja cytokin była znacząco wyższa w przypadku cytów pobranych od zwierząt szczepionych D five CSC TPCs lub S CCC seven CSC PCs, niż od zwierząt szczepionych D five H TPCs lub SCC seven HTCs. W dzisiejszym materiale zaprezentowano, jak wykorzystać test Alor do izolacji komórek macierzystych nowotworu.

Te nowotworowe komórki macierzyste mogą następnie zostać wykorzystane do opracowania immunoterapii z wykorzystaniem komórek dendrytycznych. Mamy nadzieję, że immunoterapie te, stosowane samodzielnie lub w połączeniu z istniejącymi terapiami, poprawią rokowania pacjentów z wieloma typami nowotworów.