Name: Pomiar kinetyczny w stanie ustalonym, przed stanem ustalonym i pojedynczym obrotem dla aktywności glikozylazy DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 27 s
Description: Poznaj kinetykę glikozylazy DNA 8-okzoguaninowej, mierząc fazy ustalone i przedustalone oraz pojedynczy obrót enzymu. Ta metoda pozwala określić szybkość wycięcia uszkodzonej zasady i wypuszczenia produktu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Julie K. Horton za krytyczne przeczytanie manuskryptu oraz dr Rajendrze Prasadowi za pomocne sugestie i dyskusje. Fragmenty tych badań zostały pierwotnie opublikowane w The Journal of Biological Chemistry, Sassa A i wsp., "Wpływ kontekstu sekwencji DNA na aktywność glikozylazy ludzkiej glikozylazy DNA 8-oksoguaniny". J Biol Chem. 287, 36702-36710 (2012) 2. Prace te były wspierane, w całości lub w części, przez National Institutes of Health Research Project Grant Z01-ES050158 w ramach Intramural Research Program, NIEHS.

1. Przygotowanie enzymu i substratu DNA
<ol>
 <li>Nadeksperymować OGG1 jako białko fuzyjne z GST w E. coli, wykorzystać znacznik GST do oczyszczania, a następnie usunąć znacznik GST poprzez cięcie proteazą HRV-3C (Rysunek 1)6.</li>
 <li>Zakupić chemicznie syntetyzowany oligonukleotyd znakowany 5'-6-karboksyfluoresceiną (6-FAM) zawierający pojedynczy resztę 8-oxoG oraz komplementarną, nieznakowaną nić oligonukleotydową. Oligonukleotydy o długości 34 merów zawierają 8-oxoG w pozycji 17 od końca 5'. Oczyścić te oligonukleotydy za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym.</li>
 <li>Przygotować dwuniciowy substrat DNA zawierający 8-oxoG poprzez zmieszanie oligonukleotydu znakowanego 5'-6-FAM z nicią komplementarną w stosunku molowym 1:1,2 w buforze do hybrydyzacji (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) w probówce mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Umieścić probówkę w pływaku w wrzącej wodzie na 5 min. Pozostawić probówkę w tym miejscu, a następnie pozwolić wodzie powoli ostygnąć do temperatury pokojowej (trwa to około 2 h).</li>
 <li>Przeprowadzić przygotowanie próbek i eksperyment w warunkach niskiego lub minimalnego oświetlenia, aby zminimalizować fotobleaching znacznika fluorescencyjnego.</li>
</ol>
2. Pomiar stanu stacjonarnego w czasie oraz miareczkowanie miejsca aktywnego OGG1
2.1. Przygotowanie próbek i kinetyka stanu stacjonarnego
<ol>
 <li>Przygotuj oddzielnie substrat DNA oraz roztwory OGG1 w buforze reakcyjnym (50 mM HEPES, pH 7.5, 20 mM KCl, 0.5 mM EDTA oraz 0,1% albuminy surowicy bydlęcej) w probówkach do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml na lodzie. Stężenie DNA wynosi 400 nM, a pozorne stężenie OGG1 wynosi 30, 60, 90 lub 120 nM, określone za pomocą testu białkowego Bradforda. Umieść probówki reakcyjne w bloku grzejnym ustawionym na 37 °C. Preinkubuj oddzielnie roztwory enzymu i substratu DNA w temperaturze 37 °C przez 1 min.</li>
 <li>Rozpocznij reakcję, mieszając za pomocą pipety równe objętości roztworów OGG1 i substratu DNA. Po zmieszaniu tych roztworów w stosunku 1:1 (v/v), stężenia końcowe wynoszą odpowiednio 200 nM DNA oraz 15, 30, 45 lub 60 nM OGG1. Pobieraj alikwoty (10 μl) w określonych odstępach czasu i zatrzymaj reakcję, mieszając je z 1 μl 1 M NaOH. Jako kontrolę dla przebiegu czasowego 10 μl mieszaniny reakcyjnej bez enzymu miesza się z 1 μl 1 M NaOH.</li>
 <li>Umieść próbki reakcyjne w bloku grzejnym o temperaturze 90 °C przez 5 min, aby rozciąć powstałe miejsce AP produktu. Po ogrzaniu dodaj 1 μl 1 M HCl, aby zneutralizować każdą próbkę.</li>
 <li>Dodaj równą objętość (12 μl) buforu do ładowania żelu (95 % formamidu, 20 mM EDTA, 0,02% bromofenolu i 0,02% ksylenolcyjanolu) do każdej próbki reakcyjnej, a następnie umieść mieszaninę w bloku grzejnym ustawionym na 95 °C przez 2 min, po czym natychmiast przenieś probówkę na lód.</li>
 <li>Nałóż próbki (5 μl) na 15% denaturujący żel poliakrylamidowy zawierający 8 M mocznika w 89 mM Tris-HCl, pH 8.8, 89 mM kwasu borowego oraz 2 mM EDTA. Substrat i produkty cięcia są dobrze rozdzielone po przeprowadzeniu elektroforezy.</li>
</ol>
2.2. Obrazowanie żelu
<ol>
 <li>Zeskanuj żel za pomocą obrazownika zdolnego do wykrycia znakowanego fluorescencyjnie DNA i zwizualizuj prążki substratu oraz produktu.</li>
 <li>Ilościowo określ prążki po obrazowaniu żelu. Należy zauważyć, że po potraktowaniu samego substratu NaOH może wystąpić pewien rozkład tła (Rysunek 2A). Odejmij to tło od zmierzonej ilości każdego produktu reakcji.</li>
</ol>
2.3. Analiza danych
<ol>
 <li>Nanieś na wykres ilość produktu powstałego w każdym czasie reakcji (t) (Rysunek 2B). Przeanalizuj surowe dane za pomocą równania 1, aby wyznaczyć amplitudę skoku (A0, punkt przecięcia z osią y) oraz nachylenie liniowej fazy stanu stacjonarnego (vss).</li>
</ol>
 <img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq1.jpg" alt="Równanie stanu równowagi statycznej, Produkt=A0+vsst (eq.1), formuła matematyczna." data-altupdatedat="1787630408000"> 
<ol start="2">
 <li>Nanieś punkt przecięcia z osią y w funkcji całkowitego stężenia białka (t.j. pozornego stężenia enzymu; Rysunek 2C), co pozwoli określić frakcję aktywnego enzymu. Zastosuj dopasowanie liniowe z przecięciem w punkcie zero, aby wyznaczyć współczynnik korekcyjny służący do określenia frakcji aktywnego enzymu.</li>
 <li>Nanieś szybkość stanu stacjonarnego w funkcji stężenia aktywnego enzymu (Rysunek 2D), co pozwoli wyznaczyć stałą szybkości dysocjacji produktu (t.j. nachylenie dopasowanej linii).</li>
</ol>
3. Pomiar przebiegu czasowego stanu przedustalonego
Jak pokazano na Rysunku 2, tworzenie produktu podczas fazy gwałtownej (burst phase) zachodzi zbyt szybko, aby można go było zmierzyć poprzez ręczne mieszanie i gasić reakcję. Dlatego urządzenie do szybkiego gaszenia przepływu (rapid quench-flow) może stanowić skuteczną metodę pomiaru szybkich reakcji zachodzących w skali milisekundowej (Rysunek 3)5. Urządzenie wykorzystuje sterowany komputerowo silnik napędowy do szybkiego mieszania i wygaszania reakcji po określonym czasie. Przykładowo, można użyć urządzenia Kintek RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument do pomiaru początkowej fazy gwałtownej oraz następującej po niej fazy stanu stacjonarnego tworzenia produktu katalizowanego przez OGG1. Urządzenia typu Rapid Quench-Flow są dostępne u kilku producentów.
3.1. Przygotowanie próbki
Przygotuj oddzielnie roztwory podłoża DNA oraz OGG1 w probówkach 1,5 ml, zgodnie z opisem w punkcie 2-1. Stężenia DNA i aktywnego OGG1 wynoszą odpowiednio 400 nM i 80 nM. Po zmieszaniu w stosunku 1:1 (v/v) końcowe stężenia wyniosą 200 nM DNA i 40 nM aktywnego OGG1.
3.2. Przygotowanie urządzenia do szybkiego przepływu z gwałtownym schłodzeniem
<ol>
 <li>Podłącz cyrkulacyjną kąpiel wodną do urządzenia do szybkiego przerywania przepływu (rapid quench-flow) w celu kontroli temperatury (37 °C).</li>
 <li>Dostosuj parametry urządzenia i wybierz odpowiednią pętlę reakcyjną dla pożądanych punktów czasowych zgodnie z instrukcjami producenta. Pętle reakcyjne mają różną długość, aby zapewnić alternatywne czasy reakcji.</li>
 <li>Przygotuj bufor reakcyjny i roztwory przerywające NaOH w jednorazowych strzykawkach 10 ml z złączem Luer Lock, podłącz strzykawki do portów napędowych (Drive Ports) i napełnij zbiorniki napędowe buforem reakcyjnym (strzykawki B) oraz 142 mM NaOH (strzykawka Q) (zawory załadunku strzykawek w pozycji LOAD). Aby usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawki, kilkukrotnie przesuń roztwór w przód i w tył.</li>
 <li>Obniż silnik krokowy, aż zetknie się z górną częścią strzykawek (zawory załadunku strzykawek i zawory załadunku próbek w pozycji FIRE).</li>
 <li>Przepłucz pętle z próbkami (Sample Loops), pętlę reakcyjną (Reaction Loop) oraz linię wyjściową (Exit Line) wodą i metanolem. Całkowicie osusz przepłukane obszary (zawory w pozycji FLUSH).</li>
</ol>
3.3. Kinetyka stanu przedstacjonarnego
<ol>
 <li>W górnej części zamkniętej probówki o pojemności 1,5 ml wykonać otwór za pomocą igły o rozmiarze 16 G. Do linii wyjścia (Exit Line) podłączyć probówkę w celu zebrania zatrzymanej reakcji.</li>
 <li>Za pomocą klawiatury ustaw pożądany czas reakcji (w sekundach). Silnik krokowy cofnie się, aby skorygować objętość pętli w celu zachowania stałej objętości gaszenia. Ustaw tłoki strzykawki B przy platformie silnika krokowego, dodając bufor za pomocą jednorazowych strzykawek podłączonych do portów napędowych (Drive Ports).</li>
 <li>Napełnić jednorazowe strzykawki Luer Lock o objętości 1 ml odpowiednio roztworami substratu DNA oraz OGG1 (zawory próbkowania w pozycji LOAD). Przymocować strzykawki z roztworami substratu DNA oraz OGG1 do odpowiednich portów załadunku próbek, a następnie napełnić pętle załadunku próbek odpowiednio roztworami substratu DNA oraz OGG1 (zawory załadunku próbek w pozycji LOAD).</li>
 <li>Ustaw wszystkie zawory załadowcze strzykawki (Syringe Load Valves) oraz zawory załadowcze próbek (Sample Load Valves) w pozycji FIRE. Rozpocznij reakcję, naciskając odpowiedni klawisz na klawiaturze (np. naciśnięcie klawisza „G” lub „START”). Roztwory substratu DNA oraz OGG1 (18 μl (po jednej) są natychmiast mieszane w pętli reakcyjnej (Reaction Loop).</li>
 <li>Należy poczekać, aż reakcja zostanie automatycznie zatrzymana w pożądanym czasie reakcji poprzez zmieszanie 36 μl mieszaniny reakcyjnej z 86 μl 142 mM NaOH. Po wygaszeniu reakcji próbka jest wyprowadzana z linii wyjściowej (Exit Line).</li>
 <li>Ustaw zawory załadowcze strzykawek w pozycji LOAD, a zawory załadowcze próbek w pozycji FLUSH. Przepłucz pętle załadowcze próbek, pętlę reakcyjną oraz linię wyjściową wodą i metanolem, a następnie wysusz zgodnie z opisem w punkcie 3.2. Powtórz powyższą procedurę dla każdego punktu czasowego.</li>
 <li>Przeprowadź eksperyment kontrolny bez udziału enzymu w celu wyznaczenia korekty tła; można to zrobić ręcznie lub za pomocą urządzenia do szybkiego gaszenia reakcji (rapid-quench). Aby przeprowadzić kontrolę przy użyciu urządzenia do szybkiego gaszenia reakcji, napełnij pętlę próbowczą (Sample Loop) przeznaczoną dla DNA substratem DNA, pozostawiając pętlę próbowczą dla OGG1 pustą. Ustaw czas reakcji, a następnie przeprowadź mieszanie i gaszenie zgodnie z opisem w punktach 3.3.4–3.3.6.</li>
 <li>Przemyj pętle próbkowe (Sample Loops) oraz pętlę reakcyjną (Reaction Loop) 2 M NaOH, 2 M HCl, wodą i metanolem, a następnie wysusz przemyte linie. Po ustawieniu silnika krokowego (Stepper Motor) w pozycji początkowej, przełącz zawory załadunkowe strzykawek (Syringe Load Valves) do pozycji LOAD i przemyj zbiorniki napędowe (Drive Reservoirs) wodą.</li>
 <li>Próbki z reakcji po zatrzymaniu poddać działaniu ciepła, a następnie rozdzielić DNA substratu i produktu za pomocą denaturującej elektroforezy w 15% żelu poliakrylamidowym, zgodnie z opisem w sekcji 2.1.</li>
 <li>Zwizualizuj i zmierz intensywność prążków na żelu zgodnie z opisem w punkcie 2.2.</li>
</ol>
3.4. Analiza danych
Dopasuj przebiegi czasowe powstawania produktu za pomocą analizy regresji nieliniowej do równania z członem wykładniczo rosnącym i członem liniowym (Równanie 2), aby wyznaczyć stałą szybkości reakcji pierwszego rzędu (kobs), amplitudę skoku (A0) oraz szybkość liniową (vss).
<img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq2.jpg" alt="Równanie kinetyki powstawania produktu; wzór na wzrost wykładniczy; narzędzie analizy matematycznej." data-altupdatedat="1787630408000"> 
4. Kinetyka pojedynczego obrotu
<ol>
 <li>Przygotować substrat DNA oraz OGG1 w oddzielnych probówkach 1,5 ml zgodnie z opisem w punkcie 2-1. Stężenia DNA i aktywnego OGG1 wynoszą odpowiednio 100 nM i 500 nM; pozwala to uzyskać stężenia końcowe 50 nM DNA i 250 nM OGG1 po zmieszaniu w stosunku 1:1 (v/v).</li>
 <li>Przygotować urządzenie do szybkiego przepływu z gwałtownym zatrzymaniem reakcji (rapid quench-flow) oraz przygotować próbki reakcyjne zgodnie z opisem w punktach 3.2 i 3.3.</li>
 <li>Próbki z zatrzymaną reakcją poddać obróbce termicznej, a następnie poddać denaturującej elektroforezie w 15% żelu poliakrylamidowym w celu rozdzielenia substratu i produktów, zgodnie z opisem w punkcie 2.1.</li>
 <li>Wizualizować i ilościowo określić pasma na żelu zgodnie z opisem w punkcie 2.2.</li>
 <li>Dopasować przebiegi czasowe powstawania produktu do pojedynczej funkcji wykładniczej, aby wyznaczyć stałą szybkości reakcji pierwszego rzędu (kobs) zgodnie z równaniem 3.</li>
</ol>
<img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq3.jpg" alt="Równanie kinetyczne powstawania produktów w reakcjach chemicznych, ilustrujące proces dynamiczny." data-altupdatedat="1787630408000">

<ol><li>Porello, S. L., Leyes, A. E., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-turnover+and+pre-steady-state+kinetics+of+the+reaction+of+the+adenine+glycosylase+MutY+with+mismatch-containing+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates.</a> Biochemistry. 37, 14756-14764 (1998).</li>
<li>Sassa, A., Beard, W. A., Prasad, R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequence+context+effects+on+the+glycosylase+activity+of+human+8-oxoguanine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">DNA sequence context effects on the glycosylase activity of human 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287, 36702-36710 (2012).</li>
<li>Wong, I., Lundquist, A. J., Bernards, A. S., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presteady-state+analysis+of+a+single+catalytic+turnover+by+Escherichia+coli+uracil-DNA+glycosylase+reveals+a+%22pinch-pull-push%22+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Presteady-state analysis of a single catalytic turnover by Escherichia coli uracil-DNA glycosylase reveals a "pinch-pull-push" mechanism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277, 19424-19432 (1074).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+transient-state+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in transient-state kinetics.</a> Current Opinion in Biotechnology. 9, 87-89 (1998).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+kinetic+analysis+of+mechanochemical+adenosinetriphosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Rapid kinetic analysis of mechanochemical adenosinetriphosphatases.</a> Methods in Enzymology. 134, 677-705 (1986).</li>
<li>Kovtun, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OGG1+initiates+age-dependent+CAG+trinucleotide+expansion+in+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">OGG1 initiates age-dependent CAG trinucleotide expansion in somatic cells.</a> Nature. 447, 447-452 (2007).</li>
<li>Hill, J. W., Hazra, T. K., Izumi, T., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+human+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+by+AP-endonuclease%3A+potential+coordination+of+the+initial+steps+in+base+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP-endonuclease: potential coordination of the initial steps in base excision repair.</a> Nucleic Acids Research. 29, 430-438 (2001).</li>
<li>Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A., Gerchman, S. E., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+and+reaction+mechanism+of+murine+8-oxoguanine-DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity and reaction mechanism of murine 8-oxoguanine-DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 28607-28617 (2000).</li>
<li>Waters, T. R., Swann, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+the+action+of+thymine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics of the action of thymine DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 20007-20014 (1998).</li>
<li>Nilsen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excision+of+deaminated+cytosine+from+the+vertebrate+genome%3A+role+of+the+SMUG1+uracil-DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Excision of deaminated cytosine from the vertebrate genome: role of the SMUG1 uracil-DNA glycosylase.</a> The EMBO Journal. 20, 4278-4286 (2001).</li>
<li>Gill, S. C., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+protein+extinction+coefficients+from+amino+acid+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data.</a> Analytical Biochemistry. 182, 319-326 (1989).</li>
<li>Van de Berg,, Beard, B. J., A, W., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+structure+and+aspartate+276+influence+nucleotide+binding+to+human+DNA+polymerase+beta.+Implication+for+the+identity+of+the+rate-limiting+conformational+change%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">DNA structure and aspartate 276 influence nucleotide binding to human DNA polymerase beta. Implication for the identity of the rate-limiting conformational change.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276, 3408-3416 (2001).</li>
<li>Krishnamurthy, N., Haraguchi, K., Greenberg, M. M., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+removal+of+formamidopyrimidines+by+8-oxoguanine+glycosylases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Efficient removal of formamidopyrimidines by 8-oxoguanine glycosylases.</a> Biochemistry. 47, 1043-1050 (2008).</li>
<li>Leipold, M. D., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+hydantoin+products+of+8-oxoguanine+oxidation+by+the+Escherichia+coli+DNA+repair+enzyme%2C+FPG%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Removal of hydantoin products of 8-oxoguanine oxidation by the Escherichia coli DNA repair enzyme, FPG.</a> Biochemistry. 39, 14984-14992 (2000).</li>
<li>Zhao, X., Krishnamurthy, N., Burrows, C. J., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+versus+repair%3A+NEIL1+removal+of+hydantoin+lesions+in+single-stranded%2C+bulge%2C+bubble%2C+and+duplex+DNA+contexts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mutation versus repair: NEIL1 removal of hydantoin lesions in single-stranded, bulge, bubble, and duplex DNA contexts.</a> Biochemistry. 49, 1658-1666 (2010).</li>
<li>Leipold, M. D., Workman, H., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+and+removal+of+oxidized+guanines+in+duplex+DNA+by+the+base+excision+repair+enzymes+hOGG1%2C+yOGG1%2C+and+yOGG2%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Recognition and removal of oxidized guanines in duplex DNA by the base excision repair enzymes hOGG1, yOGG1, and yOGG2.</a> Biochemistry. 42, 11373-11381 (2003).</li>
<li>Robey-Bond, S. M., Barrantes-Reynolds, R., Bond, J. P., Wallace, S. S., Bandaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+acetobutylicum+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+%28Ogg%29+differs+from+eukaryotic+Oggs+with+respect+to+opposite+base+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Clostridium acetobutylicum 8-oxoguanine DNA glycosylase (Ogg) differs from eukaryotic Oggs with respect to opposite base discrimination.</a> Biochemistry. 47, 7626-7636 (2008).</li>
<li>Jarem, D. A., Wilson, N. R., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-dependent+DNA+damage+and+repair+in+a+trinucleotide+repeat+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure-dependent DNA damage and repair in a trinucleotide repeat sequence.</a> Biochemistry. 48, 6655-6663 (2009).</li>
<li>Livingston, A. L., Kundu, S., Henderson Pozzi, M., Anderson, W. D., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+roles+of+tyrosine+82+and+glycine+253+in+the+Escherichia+coli+adenine+glycosylase+MutY%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Insight into the roles of tyrosine 82 and glycine 253 in the Escherichia coli adenine glycosylase MutY.</a> Biochemistry. 44, 14179-14190 (2005).</li>
<li>Kundu, S., Brinkmeyer, M. K., Livingston, A. L., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenine+removal+activity+and+bacterial+complementation+with+the+human+MutY+homologue+%28MUTYH%29+and+Y165C%2C+G382D%2C+P391L+and+Q324R+variants+associated+with+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Adenine removal activity and bacterial complementation with the human MutY homologue (MUTYH) and Y165C, G382D, P391L and Q324R variants associated with colorectal cancer.</a> DNA Repair. 8, 1400-1410 (2009).</li>
<li>Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+mammalian+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+by+cadmium%28II%29%3A+implications+for+cadmium+genotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Inactivation of mammalian 8-oxoguanine-DNA glycosylase by cadmium(II): implications for cadmium genotoxicity.</a> DNA Repair. 1, 661-670 (2002).</li>
<li>Jarem, D. A., Wilson, N. R., Schermerhorn, K. M., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+and+persistence+of+8-oxo-7%2C8-dihydroguanine+within+a+hairpin+intermediate+exacerbates+a+toxic+oxidation+cycle+associated+with+trinucleotide+repeat+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Incidence and persistence of 8-oxo-7,8-dihydroguanine within a hairpin intermediate exacerbates a toxic oxidation cycle associated with trinucleotide repeat expansion.</a> DNA Repair. 10, 887-896 (2011).</li>
<li>Mokkapati, S. K., Wiederhold, L., Hazra, T. K., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+DNA+glycosylase+activity+of+OGG1+by+NEIL1%3A+functional+collaboration+between+two+human+DNA+glycosylases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stimulation of DNA glycosylase activity of OGG1 by NEIL1: functional collaboration between two human DNA glycosylases.</a> Biochemistry. 43, 11596-11604 (2004).</li>
<li>Sidorenko, V. S., Nevinsky, G. A., Zharkov, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+interaction+between+human+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+and+AP+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease.</a> DNA Repair. 6, 317-328 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisane tutaj podejścia kinetyczne nakreślają metody definiowania elementarnych stałych kinetycznych. Jeśli przebieg tworzenia produktu w czasie jest dwufazowy, a pierwsza przemiana enzymatyczna zachodzi szybko, to krok po chemii ogranicza szybkość podczas kolejnych przemian katalitycznych. W przypadku OGG1 pierwszy obrót można zmierzyć przy użyciu wysokich stężeń enzymów z ograniczającymi (S<E) lub wysokimi (S>E) stężeniami DNA. W pierwszym przypadku reakcja ogranicza się do "pojedynczego obrotu" i dostarcza miary szybk...

Środowisko tlenowe przyspiesza niestabilność genomu. Główną promutagenną zmianą DNA wynikającą ze stresu oksydacyjnego jest 7,8-dihydro-8-oksoguanina (8-oxoG). Wynika to z niejednoznacznego potencjału kodowania 8-oxoG. Ludzka glikozylaza DNA 8-oksoguaniny (OGG1) jest odpowiedzialna za inicjację naprawy przez wycinanie zasady 8-oksoG. Aktywność glikozylazy OGG1 wycina zasadę 8-oksoG, w wyniku czego powstaje DNA produktu z miejscem apurinowym (miejsce AP). Słaba aktywność liazy OGG1 może w niektórych przypadkach naciąć miejsce AP.
Charakterystyka kinetyczna glikozylaz DNA zazwyczaj stwierdza, że wykazują one dwufazowe przebiegi czasowe. Po początkowej szybkiej fazie tworzenia produktu (tj. pęknięciu) obserwuje się liniową fazę stanu ustalonego1-3. To zachowanie wskazuje na to, że krok następujący po chemii (tj. zmiana konformacyjna lub uwolnienie produktu) jest ograniczony w liniowej części przebiegu czasu, podczas gdy faza burst, często określana jako faza przejściowa, odpowiada tworzeniu się produktu w miejscu aktywnym enzymu podczas pierwszego cyklu reakcji. Gdy uwalnianie produktu jest ograniczone w fazie stanu ustalonego, pomiary aktywności zapewniają jakościową miarę powinowactwa wiązania DNA produktu, ale nie dostarczają informacji kinetycznych dotyczących zdarzeń w miejscu aktywnym enzymu (tj. chemii). W związku z tym potrzebne są metody izolacji i pomiaru wykładniczej fazy rozbłysku w stanie poprzedzającym stan ustalony, aby zbadać zdarzenia podczas pierwszego obrotu enzymatycznego w miejscu aktywnym enzymu4.
Istnieją trzy standardowe podejścia kinetyczne do charakteryzowania katalitycznego zachowania OGG1: (1) stan ustalony, (2) stan przed ustalonym i (3) pojedynczy obrót. Podejścia te różnią się od siebie stężeniem enzymu w mieszaninie reakcyjnej oraz stosunkiem enzymu do substratu zastosowanym w każdym podejściu. W typowym podejściu w stanie ustalonym, czasami nazywanym kinetyką wielokrotnego obrotu, niskie stężenia enzymu są wykorzystywane do śledzenia tworzenia się produktu. Stężenie substratu znacznie przekracza stężenie enzymu, dzięki czemu wielokrotne obroty enzymatyczne nie wpływają znacząco na stężenie substratu. W tej sytuacji przebiegi czasowe powinny być liniowe i często trudno jest stwierdzić, czy wybuch nastąpił podczas pierwszego obrotu ze względu na niskie stężenie enzymu zastosowane w tym podejściu; Należy zauważyć, że amplituda impulsu jest równoważna stężeniu enzymu. Można temu zaradzić, stosując wyższe stężenie enzymu i ekstrapolując liniowy przebieg czasu na czas zerowy, aby wykryć, czy pierwsza przemiana enzymatyczna nastąpiła szybko. Przecięcie na rzędnej (osi y) powinno być proporcjonalne do stężenia enzymu i zapewnia miarę enzymu aktywnie zaangażowanego w substrat. Chociaż podejście to może w zasadzie dostarczyć dowodów na istnienie fazy rozbłysku, do pomiaru kinetyki fazy rozbłysku wymagane jest inne podejście. W wielu przypadkach faza rozerwania jest zbyt szybka, aby można ją było zmierzyć za pomocą ręcznych technik mieszania i hartowania. W tej sytuacji podejścia kinetyczne w stanie ustalonym i jednoobrotowym (tj. kinetyczne przejściowe) często wymagają instrumentu do szybkiego mieszania i wygaszania, aby śledzić wczesne punkty czasowe reakcji5. W podejściu pre-steady-state stosuje się wysokie stężenia enzymu, tak aby podczas pierwszego obrotu tworzyła się znaczna ilość produktu. Ponieważ w celu zaobserwowania cyklu katalitycznego (tj. fazy liniowej, która następuje po rozbłysku), obserwuje się wielokrotne obroty, stężenie substratu jest większe niż stężenie enzymu ([enzym] < [substrat]). Aby wyizolować zdarzenia w miejscu aktywnym enzymu bez cyklu katalitycznego, stosuje się warunki pojedynczego obrotu. W tym przypadku substrat jest nasycony enzymem (E>>S), tak że cały substrat będzie uczestniczył w "pojedynczym obrocie" i zazwyczaj będzie wykazywał jednowykładniczy przebieg w czasie.
Jak wspomniano powyżej, dla enzymów, które wykazują fazę burst, uwalnianie produktu (koff) często ogranicza tempo fazy stanu ustalonego w przebiegu czasu. Szybkość uwalniania produktu (vss, sc./czas) można określić na podstawie nachylenia liniowej fazy w stanie ustalonym. Stężenie aktywnego enzymu (E) jest potrzebne do przekształcenia szybkości uwalniania produktu na wewnętrzną stałą szybkości, gdzie koff = vss/[E]. Co ważne, stężenie aktywnego enzymu jest zwykle niższe niż zmierzone stężenie białka ze względu na zanieczyszczenia, nieaktywny enzym, enzym nieproduktywnie związany z substratem oraz metodę zastosowaną do określenia stężenia białka. Stężenie aktywnego enzymu można określić na podstawie amplitudy impulsu, gdy uwalnianie produktu jest powolne. W związku z tym ekstrapolacja przebiegu w czasie w stanie ustalonym na czas zerowy zapewnia oszacowanie aktywnego enzymu potrzebnego do obliczenia koff (uwalniania produktu) od obserwowanego tempa w stanie ustalonym.
Aby zmierzyć kinetykę rozbłysku, konieczne jest podejście pre-steady-state, aby śledzić powstawanie produktu podczas pierwszego obrotu, który następuje przed liniową fazą stanu ustalonego. Kinetyka rozerwania następuje po powstaniu półproduktu enzymatycznego. Gdy reakcja zostanie zainicjowana przez zmieszanie enzymu z substratem, ilość produktu enzymatycznego gwałtownie wzrasta, aż reakcja osiągnie fazę stanu ustalonego. Jeśli kataliza jest znacznie szybsza niż uwalnianie produktu, amplituda rozbłysku jest równa aktywnie zaangażowanemu enzymowi, a obserwowane wykładnicze podejście do równowagi (kobs) odpowiada szybkości chemicznej konwersji substratu w produkt, przy założeniu, że odwrotna szybkość chemii jest znikoma.
W niektórych przypadkach cykl katalityczny zakłóca analizę stanu przed stanem ustalonym, na przykład gdy wielkości szybkości dla chemii i uwalniania produktu nie różnią się znacząco. W tym przypadku zastosowanie nadmiaru enzymu w stosunku do substratu zapobiega cyklom katalitycznym i ogranicza substrat związany z enzymem do pojedynczego obrotu. W związku z tym pierwszy chemiczny etap reakcji można wyizolować i dokładnie określić jako stałą szybkości pierwszego rzędu (kobs). Ta stała szybkości powinna być podobna do kobs wyznaczonej za pomocą opisanego powyżej podejścia opartego na stanie wstępnym.
Tutaj opisujemy, jak te podejścia kinetyczne mogą być wykorzystane do analizy aktywności glikozylazy OGG1.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Odczynnik/Materiał</td></tr><tr><td>5'-6-FAM znakowane oligonukleotydami zawierającymi pojedyncze 8-oksoG</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>5'-P32 znakowane radioaktywnie oligonukleotydy mogą być również używane. Zalecany jest stopień oczyszczenia żelu poliakrylamidowego. </td></tr><tr><td>Nieznakowane oligonukleotydy (nić komplementarna)</td><td>Zalecany jest stopień oczyszczania żelu poliakrylamidowego </td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td>.</tr><tr>Można również użyć <td>jednorazowej strzykawki 1 ml BD Luer Lock</td><td>Jednorazowa strzykawka BD Medical 309628 Lue Lock od innych dostawców.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa strzykawka 10 ml BD Luer Lock</td><td>BE Medical</td><td>309604</td><td>Można również użyć jednorazowej strzykawki Luer Lock od innych dostawców.</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td> Może być również używana <td>dowolna przyrząd do</td><td></td><td></td></tr><tr><td>szybkiego tłumienia RQF-3</td><td>KinTek Corporation</td><td></td><td>Rapid Quench-Flow od innych dostawców.</td></tr><tr>Można również używać <td>Typhoon Phosphorimager 8600</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td>Imager innych producentów.</td></tr><tr>Oprogramowanie <td></td><td></td><td>KaleidaGraph</td><td>Synergy</td></tr></tbody></table>

pomiar kinetyczny w stanie ustalonym, przed stanem ustalonym i pojedynczym obrotem dla aktywności glikozylazy dna

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Ludzka glikozylaza DNA 8-oksoguaniny (OGG1) wycina z DNA mutagenną zmianę oksydacyjną DNA 8-okso-7,8-dihydroguaninę (8-oxoG). Charakterystyka kinetyczna OGG1 jest podejmowana w celu zmierzenia szybkości wycinania 8-oxoG i uwalniania produktu. Gdy stężenie OGG1 jest niższe niż DNA substratu, przebiegi czasowe tworzenia produktu są dwufazowe; Po szybkiej fazie wykładniczej (tj. rozbłysku) powstawania produktu następuje liniowa faza stanu ustalonego. Początkowy impuls tworzenia produktu odpowiada stężeniu enzymu odpowiednio zaangażowanego na podłożu, a amplituda impulsu zależy od stężenia enzymu. Stała szybkości rozbłysku pierwszego rzędu odpowiada wewnętrznej szybkości wycinania 8-oksoG, a wolniejsza szybkość w stanie ustalonym mierzy szybkość uwalniania produktu (stała szybkości dysocjacji DNA produktu, koff). W tym miejscu opisujemy podejścia w stanie ustalonym, przed stanem ustalonym i pojedynczym obrotem w celu wyizolowania i zmierzenia określonych kroków podczas cyklu katalitycznego OGG1. Znakowany fluorescencyjnie oligonukleotyd zawierający zmiany chorobowe i oczyszczony OGG1 są używane w celu ułatwienia precyzyjnych pomiarów kinetycznych. Ponieważ do pomiarów w stanie ustalonym stosuje się niskie stężenia enzymów, można przeprowadzić ręczne mieszanie odczynników i hartowanie reakcji w celu ustalenia szybkości w stanie ustalonym (koff). Dodatkowo, ekstrapolacja szybkości w stanie ustalonym do punktu na rzędnej w czasie zerowym wskazuje, że podczas pierwszego obrotu nastąpił impuls tworzenia się produktu (tj. przecięcie z osią y jest dodatnie). Stała szybkości pierwszego rzędu fazy wybuchu wykładniczego może być mierzona za pomocą techniki szybkiego mieszania i hartowania, która bada ilość produktu powstałego w krótkich odstępach czasu (<1 s) przed fazą w stanie ustalonym i odpowiada szybkości wycinania 8-oxoG (tj. chemii). Etap chemiczny można również zmierzyć przy użyciu podejścia jednoobrotowego, w którym cyklowi katalitycznemu zapobiega się poprzez nasycenie substratu DNA enzymem (E>S). Podejścia te mogą mierzyć podstawowe stałe szybkości, które wpływają na skuteczność usuwania zmiany DNA.

Analizę kinetyki stanu stacjonarnego przeprowadzono z użyciem 200 nM substratu DNA oraz czterech różnych pozornych stężeń OGG1 (15, 30, 45 i 60 nM), wyznaczonych za pomocą metody Bradforda2. Przebiegi czasowe powstawania produktu dopasowano do równania liniowego w celu wyznaczenia punktów przecięcia z osią y, które wynosiły odpowiednio 2,2, 11, 15 i 26 nM w stosunku do każdego stężenia białka (Rycyna 2B). Punkty przecięcia z osią y naniesiono następnie na wykres w zależności od rzeczywistego s...

Kursy czasowe aktywności glikozylazy DNA 8-oksoguaniny są dwufazowe, wykazując gwałtowne tworzenie produktu i liniową fazę stanu ustalonego. Wykorzystując techniki przepływu gaszącego, można zmierzyć szybkość rozerwania i stanu ustalonego, które odpowiadają odpowiednio wycięciu 8-oksoguaniny i uwolnieniu glikozylazy z DNA produktu.

Pomiar kinetyczny w stanie ustalonym, przed stanem ustalonym i pojedynczym obrotem dla aktywności glikozylazy DNA

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wyznaczenie szybkości wycinania 8-oxoG oraz uwalniania produktu przez ludzką glikozylazę DNA 8-oxoG z wykorzystaniem szybkich technik kinetycznych. Osiąga się to poprzez wstępny pomiar przebiegu kinetycznego w stanie stacjonarnym przy niskim stężeniu enzymu, aby ustalić, czy podczas pierwszego obrotu katalitycznego występuje faza szybka. Jeśli pierwszy obrot jest szybki, przebieg w stanie stacjonarnym nie ekstrapoluje do zera, lecz w drugim kroku odzwierciedla stężenie aktywnego enzymu.Szybkość powstawania produktu w stanie przedstacjonarnym można zmierzyć za pomocą technik szybkiego mieszania i gwałtownego zatrzymania reakcji (quenching) przy zastosowaniu wyższego stężenia enzymu, aby zaobserwować znaczną ilość produktu podczas pierwszego obrotu katalitycznego. Następnie etap chemiczny można monitorować w warunkach pojedynczego obrotu, w których substrat jest nasycony enzymem. W celu wyizolowania zdarzeń w centrum aktywnym enzymu bez cyklu katalitycznego, wyniki pokazują, że uwalnianie produktu z enzymu jest etapem limitującym w stanie stacjonarnym, co opiera się na obserwacji, że przebieg czasowy nie ekstrapoluje do zerowej ilości produktu w czasie zero.Niniejsza metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu naprawy końców DNA. Obejmuje to wpływ struktury DNA, rolę reszt aminokwasowych w centrum aktywnym, efekt jonów metali oraz białek akcesoryjnych komórki na przebieg reakcji chemicznych i uwalnianie produktów. W pierwszej kolejności należy przygotować dwuniciowy substrat DNA zawierający osiem OXO G poprzez zmieszanie oligonukleotydu z etykietą 5'-FAM z nicią komplementarną w stosunku molowym od 1 do 1,2 w buforze annealingowym w probówce mikrocentryfużowej o pojemności 1,5 ml.Umieść probówkę w pływaku w wrzącej wodzie na pięć minut. Pozostaw wodę do powolnego ochłodzenia do temperatury pokojowej przed wyjęciem probówki z pływaka. Przygotuj oddzielnie roztwory podłoża DNA oraz OG G1 w buforze reakcyjnym w probówkach mikrocentryfugowych o pojemności 1,5 ml na lodzie.Należy zauważyć, że stężenie DNA wynosi 400 nM, a pozorne stężenie Ogg1 wynosi 30, 60, 90 lub 120 nM, co zostało określone za pomocą testu białek Bradforda. Po wyjęciu probórek z reakcją z lodu, należy przeprowadzić preinkubację każdego roztworu, umieszczając probówkę w bloku grzejnym ustawionym na 37 °C przez jedną minutę. Następnie należy rozpocząć reakcję, mieszając równe objętości substratu DNA oraz roztworów Ogg1, aby uzyskać końcowe stężenia 200 nM DNA oraz 15, 30, 45 lub 60 nM Ogg1. Należy pobrać aliquoty o objętości 10 µL w wymienionych odstępach czasu i zatrzymać reakcję poprzez zmieszanie z 1 µL 1 M wodorotlenku sodu jako kontrolę dla przebiegów czasowych.Wymieszać 10 µL mieszaniny reakcyjnej bez enzymu z 1 µL 1 M wodorotlenku sodu. Umieścić próbki reakcyjne w bloku grzewczym w temperaturze 90 °C przez pięć minut, aby dokonać rozcięcia w miejscu AP powstałego produktu. Po podgrzaniu dodać 1 µL 1 M kwasu solnego, aby zneutralizować każdą próbkę.Następnie do każdej próbki z reakcji należy dodać 12 µL buforu do ładowania żelu, a następnie umieścić mieszaninę w bloku grzewczym ustawionym na 95 °C. Po dwóch minutach probówkę należy wyjąć z bloku grzewczego i umieścić na lodzie. Następnie 5 µL każdej próbki nanosi się na 15% denaturujący żel poliakrylamidowy.Po przeprowadzeniu elektroforezy żelu należy go zeskanować za pomocą obrazowca zdolnego do detekcji znakowanego fluorescencyjnie DNA, aby zwizualizować prążki substratu i produktu. Po obrazowaniu żelu należy przeprowadzić kwantyfikację prążków; jeśli po potraktowaniu substratu wodorotlenkiem sodu zaobserwowano cięcie tła, należy odjąć tę wartość tła od zmierzonej ilości każdego produktu reakcji. Następnie należy wykreślić ilość powstałego produktu w zależności od czasu trwania reakcji.Przeanalizuj surowe dane, korzystając z następującego równania, aby wyznaczyć punkt załamania (knot), amplitudę impulsu oraz VSS, czyli nachylenie liniowej fazy stanu stacjonarnego. Wykreśl punkt przecięcia z osią Y w odniesieniu do całkowitego stężenia białka, co pozwoli określić frakcję aktywnego enzymu. Zastosuj dopasowanie liniowe z przecięciem w punkcie zero, aby wyznaczyć współczynnik korekcyjny niezbędny do określenia frakcji aktywnego enzymu.Następnie wykreśl stan stacjonarny w zależności od stężenia aktywnego enzymu, podając stałą szybkości asocjacji produktu w dwóch oddzielnych probówkach mikrocentryfużkowych o pojemności 1,5 ml. Przygotuj 400 nM substratu DNA oraz 80 nM roztwory aktywnego ogg1 w buforze reakcyjnym zgodnie z wcześniejszym opisem. Podłącz cyrkulacyjną łaźnię wodną do urządzenia do szybkiego gaszenia przepływu (rapid quench flow) i ustaw temperaturę na 37 °C.Następnie należy dostosować parametry instrumentu i wybrać odpowiednią pętlę reakcyjną dla pożądanych punktów czasowych. Zgodnie z instrukcjami producenta należy przygotować bufor reakcyjny oraz 142 roztwory wstrzymujące reakcję na bazie wodorotlenku sodu w jednorazowych strzykawkach typu lure lock o pojemności 10 ml.Podłącz strzykawkę z wodorotlenkiem sodu do portów napędowych i ustaw zawory w pozycji ładowania. Napełnij zbiorniki napędowe wodorotlenkiem sodu ze strzykawki Q, aby usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawki. Przesuwaj roztwór kilkakrotnie w obie strony.Następnie podłącz strzykawki z buforem reakcyjnym do portów napędowych i napełnij strzykawki buforem. B, w ten sam sposób, przy wszystkich zaworach w pozycji „fire”, obniżaj silnik krokowy, aż zetknie się on z górną częścią strzykawek. Przy zaworach załadunku próbek w pozycji płukania, przepłucz pętle załadunkowe próbek, pętlę reakcyjną oraz linię wyjściową wodą i metanolem.Następnie całkowicie osusz pętle i linię wyjściową, przepłukując je powietrzem. Wykonaj otwór w górnej części zakręconej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Używając igły o rozmiarze 16 G, podłącz probówkę do linii wyjściowej za pomocą rurki, aby zebrać zatrzymaną reakcję.Następnie za pomocą klawiatury ustaw pożądany czas reakcji w sekundach. Po cofnięciu się silnika krokowego, ustaw tłoki strzykawki B naprzeciwko platformy silnika krokowego, dodając bufor za pomocą strzykawek jednorazowych podłączonych do portów napędowych.Napełnić jednorazowe strzykawki 1 mL z końcówką luer lock odpowiednio substratem DNA oraz roztworem ogg one. Przy zaworach próbkowych ustawionych w pozycji załadunku (load), przymocować strzykawki z substratem DNA i roztworami ogg one do każdego z portów załadunku próbek, a następnie napełnić pętle próbkowe przygotowanymi roztworami. Ustawić wszystkie zawory załadunku strzykawek oraz zawory załadunku próbek w pozycji startowej (fire) i rozpocząć reakcję, naciskając klawisz G.Po naciśnięciu klawisza G silnik krokowy przesuwa tłoki strzykawek, aby rozpocząć i przerwać reakcję. Po automatycznym przerwaniu reakcji 36 µL mieszaniny reakcyjnej za pomocą 86 µL 142 mM wodorotlenku sodu należy pobrać próbkę z linii wyjściowej.Po zakończeniu reakcji ustaw zawory załadunkowe strzykawki w pozycji załadunku, a zawory załadunkowe próbek w pozycji płukania. Przepłucz pętle próbek, pętlę reakcyjną oraz linię wyjściową wodą i metanolem, a następnie całkowicie osusz wypłukane obszary. Powtórz poprzednie kroki dla każdego punktu czasowego.W celu wyznaczenia korekcji tła należy przeprowadzić eksperyment kontrolny bez użycia enzymu, korzystając z urządzenia do szybkiego quenchowania. Napełnij pętlę z próbką DNA substratem DNA, pozostawiając jednak pętlę z próbką ogg pustą.Ustaw czas reakcji. Przeprowadź mieszanie i zatrzymanie reakcji w tych samych warunkach co poprzednio. Przepłucz pętle próbkowe 2 M wodorotlenkiem sodu, 2 M kwasem solnym, wodą i metanolem, a następnie wysusz przepłukane linie.Po ustawieniu silnika krokowego w pozycji początkowej, przełącz zawory załadunkowe strzykawki do pozycji załadunku i przemyj zbiorniki napędowe wodą. Po podgrzaniu próbek z przerwanej reakcji, oddziel DNA substratu i produktu za pomocą 15% denaturującej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Następnie zwizualizuj i przeprowadź ilościową ocenę prążków na żelu zgodnie z opisem.Wcześniej dopasowano przebiegi czasowe powstawania produktu za pomocą analizy regresji nieliniowej do następującego równania z członem wykładniczo rosnącym i liniowym, co pozwoliło wyznaczyć stałą szybkości pierwszego rzędu K, amplitudę gwałtownego wzrostu (burst), punkt węzłowy oraz liniową szybkość VSS. Dla eksperymentu z pojedynczym obrotem enzymatycznym przygotowano roztwory 100 nM substratu DNA oraz 500 nM aktywnego ogg1 w oddzielnych probówkach o pojemności 1,5 ml.Stosując opisane wcześniej warunki, przygotuj instrument do szybkiego przepływu z gaszeniem (rapid quench flow) i przeprowadź reakcję w ten sam sposób, co w eksperymencie określającym przebieg czasowy stanu przedstacjonarnego. Po podgrzaniu zgaszonych próbek i rozdzieleniu ich za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym, zwizualizuj i skwantyfikuj prążki na żelu zgodnie z wcześniejszym opisem. Na koniec dopasuj przebiegi czasowe powstawania produktu do funkcji pojedynczej wykładniczej, aby wyznaczyć stałą szybkości reakcji pierwszego rzędu zgodnie z poniższym równaniem.Analizę kinetyki stanu stacjonarnego przeprowadzono, wykorzystując 200 nM substratu DNA oraz cztery różne stężenia ogg. Stężenie określono za pomocą testu białkowego metodą Bradforda. Produkty cięcia oraz nieprzereagowany substrat rozdzielono metodą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym.Krzywe czasowe powstawania produktu dopasowano do równania liniowego w celu wyznaczenia punktów przecięcia z osią Y, które wynosiły odpowiednio 2,2 1115 oraz 26 nanomolar w stosunku do każdego stężenia białka; następnie punkty przecięcia z osią Y naniesiono na wykres w zależności od rzeczywistego stężenia białka. Udział aktywnego enzymu wyznaczono na podstawie nachylenia linii służącej do określenia szybkości stanu stacjonarnego i wyniósł on 38%. Wcześniej wyznaczone wartości VSS naniesiono na wykres w odniesieniu do punktów przecięcia z osią Y.Nachylenie linii wyniosło 0,0028 na sekundę, co odpowiada stałej szybkości dysocjacji dla produktu powstałego w wyniku aktywności DNA glikozylo-liazy. Przebieg czasowy stanu przedstacjonarnego śledzono przy użyciu 200 nM substratu DNA oraz 40 nM aktywnego OG1. Przebiegi czasowe powstawania produktu można dopasować do równania z członami wykładniczo rosnącymi i liniowymi.Wyznaczono, że wartości k_obs oraz k_off wynosiły odpowiednio 0,75 i 0,0055 s⁻¹. W warunkach pojedynczego obrotu reakcja wycinania 8-oxo-g została zakończona w ciągu sześciu sekund. Kinetyka powstawania produktu mogła zostać dopasowana do pojedynczego równania wykładniczego, co pozwoliło uzyskać wartość k_obs wynoszącą 0,74 s⁻¹.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak izolować kluczowe etapy cyklu katalitycznego oraz mierzyć szybkość reakcji chemicznych i obrót enzymatyczny.

steady-state-pre-steady-state-single-turnover-kinetic-measurement-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Kinetyka stanu stacjonarnego, przedstacjonarnego i jednoturowego pomiaru aktywności glikozylazy DNA

Opisujemy metodę obserwacji replikacji pojedynczych cząsteczek DNA w czasie rzeczywistym, pośredniczonej przez białka systemu replikacyjnego bakteriofaga.

Bezpośrednia obserwacja enzymów replikujących DNA z wykorzystaniem testu rozciągania pojedynczej cząsteczki DNA

Msh2-Msh6 odpowiada za inicjację naprawy błędów replikacyjnych w DNA. Przedstawiamy tutaj podejście oparte na kinetyce przejściowej, mające na celu zrozumienie mechanizmu działania tego kluczowego białka. Raport ilustruje eksperymenty z zastosowaniem techniki przepływu zatrzymanego (stopped-flow) w celu pomiaru sprzężonej kinetyki wiązania DNA oraz aktywności ATPase, które leżą u podstaw mechanizmu działania Msh2-Msh6 w procesie naprawy DNA.

Zastosowanie metod kinetyki stop-flow w celu zbadania mechanizmu działania białka naprawczego DNA

Kinezyny charakteryzują się zależnym od nukleotydów oddziaływaniem z mikrotubulami: cyklem obrotu ATP sprzężonym z cyklem interakcji mikrotubul. W tym miejscu opisujemy protokoły analizy kinetyki poszczególnych przejść nukleotydowych w cyklu obrotu ATP kinezyny przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie nukleotydów i fluorescencji zatrzymanego przepływu.

Zastosowanie fluorescencji o zatrzymanym przepływie i znakowanych nukleotydów do analizy cyklu obrotu ATP kinezyn

Opisujemy czułe, żelowe testy nieciągłe, aby zbadać kinetykę inicjacji opóźnionej nici przy użyciu białek replikacyjnych bakteriofaga T7.

Kinetyka syntezy opóźnionej nici DNA in vitro przez białka replikacji bakteriofagów T7

Ten protokół opisuje charakterystykę syntezy modyfikowanego DNA przez polimerazę DNA poprzez obserwację zmian w DNA znakowanym fluorescencyjnie w bliskiej podczerwieni za pomocą elektroforezy żelowej i obrazowania żelowego. Żele akrylamidowe są używane do obrazowania w wysokiej rozdzielczości separacji krótkich kwasów nukleinowych, które migrują z różną szybkością w zależności od wielkości.

Test aktywności polimerazy DNA przy użyciu znakowanego fluorescencyjnie DNA w bliskiej podczerwieni wizualizowanego za pomocą elektroforezy w żelu akrylowym

Opisano wysoce równoległą metodę pomiaru specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki. Protokół ten demonstruje technikę przy użyciu endonukleazy restrykcyjnej NdeI. Metodę można łatwo zmodyfikować w celu zbadania dowolnego procesu, który prowadzi do specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA.

Równoległy, wysokoprzepustowy test kinetyczny pojedynczej cząsteczki do specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA

Korzystając z DNA znakowanego kwantowo kropkami i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem, możemy badać mechanizm reakcji endonukleaz restrykcyjnych, używając nieznakowanego białka. Ta technika jednocząsteczkowa pozwala na masowo multipleksowaną obserwację poszczególnych interakcji białko-DNA, a dane mogą być łączone w celu wygenerowania dobrze wypełnionych rozkładów czasu przebywania.

Analiza w czasie przebywania pojedynczej cząsteczki rozszczepienia DNA za pośrednictwem endonukleazy restrykcyjnej

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

Tutaj przedstawiono protokół oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe, na przykładzie enzymów ligazy, nukleazy i polimerazy. Test wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie i nieznakowane oligonukleotydy, które można łączyć w dupleksy naśladujące uszkodzenia RNA i / lub DNA lub pośrednie szlaki, co pozwala na scharakteryzowanie zachowania enzymu.

Wykorzystanie zmodyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów do oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe

Protokół ten demonstruje wykonanie testu pojedyncząłego w celu wizualizacji na żywo rozwijania DNA za pomocą helikazy CMG. Opisuje (1) przygotowanie substratu DNA, (2) oczyszczanie fluorescencyjnie znakowanej helikazy Drosophila melanogaster CMG, (3) przygotowanie komórki przepływowej mikrofluidycznej do mikroskopii całkowitej fluorescencji odbicia wewnętrznego (TIRF) oraz (4) test odwijania DNA pojedyncząłą.

Wizualizacja rozwijania DNA w czasie rzeczywistym pojedyncząłą cząsteczką przez helikazę CMG

Ten protokół opisuje test replikacji pojedynczej cząsteczki DNA oparty na mikroskopii fluorescencyjnej, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym interakcji między polimerazami DNA a przeszkodami, takimi jak struktury G-quadruplex.

Wizualizacja fluorescencji pojedynczej cząsteczki dynamiki polimerazy DNA w G-kwadrupleksach

Poznaj kinetykę glikozylazy DNA 8-okzoguaninowej, mierząc fazy ustalone i przedustalone oraz pojedynczy obrót enzymu. Ta metoda pozwala określić szybkość wycięcia uszkodzonej zasady i wypuszczenia produktu.

Pomiar kinetyczny w stanie ustalonym, przed stanem ustalonym i pojedynczym obrotem dla aktywności glikozylazy DNA

Przeglądaj więcej filmów