Name: System kokultury z organotypowym wycinkiem mózgu i sferoidą 3D komórek rakowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-09T22:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji interakcji komórek glejowych podczas tworzenia przerzutów mózgowych przy użyciu organotypowych wycinków mózgu myszy współkulturywanych z komórkami raka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Chalidowi Ghadbanowi za doskonałą pomoc techniczną, Andreasowi Wodarzowi i Stephanowi Heermannowi za ich techniczne porady dotyczące mikroskopii konfokalnej i poklatkowej. Dla żadnego z autorów nie ma konfliktu interesów. Prace te są finansowane przez Niemiecką Radę ds. Badań Naukowych (DFG) w ramach projektu 2 Forschergruppe 942 (FOR942 BI 703/3-1) przez Dres. Bayer-Stiftung (Badenia-Wirtembergia, Niemcy) oraz w ramach programu badawczego Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Georga Augusta w Getyndze, Niemcy.

Ten nowy model jest adaptacją wcześniej opublikowanego organotypowego podejścia do wycinków mózgu hipokampa9-12. Modyfikacje i dodatki zostały wprowadzone w celu optymalizacji interakcji komórka rakowa - tkanka mózgowa i zagwarantowania odtwarzalności. Badanie zostało ocenione i zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną. Zwierzęta były traktowane ostrożnie, zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami na Uniwersytecie Medycznym w Getyndze. Organotypową kokulturę wycinków mózgu można podzielić na dwa etapy. Pierwszym krokiem jest przygotowanie organotypowego wycinka mózgu. Etap drugi obejmuje przygotowanie i depozycję komórek nowotworowych w modelu kokultury.
1. Organotypowy wycinek mózgu
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę preparacyjną składającą się z minimalnej ilości pożywki niezbędnej (MEM), uzupełnionej 0,2 mM glutaminy, 100 m/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny i 4,5 mg/ml glukozy.</li>
	<li>Odetnij głowy myszy z dowolnego szczepu myszy między szóstym a ósmym dniem po urodzeniu (P6-8).</li>
	<li>Szybko usuń mózg z czaszki w warunkach aseptycznych i przenieś go do lodowatego podłoża preparacyjnego.</li>
	<li>Usuń biegun czołowy i móżdżek z całej części mózgu.</li>
	<li>Napraw i ustabilizuj mózg na scenie za pomocą kleju kriogenicznego i 5% agarozy.</li>
	<li>Pokrój sekcje mózgu poziomo do grubości 350 μm za pomocą wibratomu.</li>
	<li>Zbierz od czterech do sześciu całych wycinków mózgu z jednego mózgu myszy, w zależności od gatunku i wieku.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę hodowlaną składającą się z 50% MEM, 25% zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS), 25% normalnej surowicy końskiej (NHS), 0,2 mM glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny (Sigma, Monachium, Niemcy) i 4,5 mg/ml glukozy.</li>
	<li>Umieść każdy organotypowy wycinek mózgu na wkładce z membrany transwell z poliwęglanu o grubości 0,4 μm na płytce sześciodołkowej z 1 ml podłoża hodowlanego w dolnej studzience.</li>
	<li>Hoduj organotypowe plastry mózgu przez noc w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
2. Model kokultury Slice
<ol>
	<li>Osadź 105 komórek guza transfekowanego GFP lub innych komórek (np. komórek MCF-7-GFP) w 20 μl matrycy żelowej, składającej się z 15% pożywki RPMI i 85% żelu ECM.</li>
	<li>Umieść mieszaninę matrycy żelowej MCF-7 w sterylnej metalowej przekładce (o średnicy 3,8 mm) bezpośrednio przylegającej do obszaru korowego organotypowego wycinka mózgu i inkubuj przez 2 godziny.</li>
	<li>Usuń przekładkę i pozwól sferoidzie guza 3D na kokulturację z plastrem organotypowym przez 24-96 godzin.</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę co drugi dzień.</li>
</ol>
3. Barwienie immunofluorescencyjne astrocytów i mikrogleju w organotypowej kokulturze wycinków mózgu
<ol>
	<li>Utrwalić organotypową kokulturę plastrów mózgu z 4% paraformaldehydem przez 8 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Płukać plastry plastrem za pomocą PBST (PBS z 0,5% Triton X-100) przez 5 minut.</li>
	<li>Blokować próbki normalną surowicą kozią w PBST (1:20) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Wybarwić astrocyty, inkubując kokulturę wycinków mózgu z przeciwciałem monoklonalnym przeciwko glejowemu fibrylarnemu białku fibrylarnemu (GFAP, 1:200 w PBST) przez 36 godzin w temperaturze 4 °C, a następnie barwienie kozim anty-mysim TRITC (1:100 w PBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć próbki trzykrotnym roztworem PBST przez 5 minut. </li>
	<li>Wybarwić komórki mikrogleju za pomocą ILB4-Alexa Fluor 647 (1:100 w PBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przeciwbarwić kokulturę wycinków mózgu za pomocą DAPI (1:1,000) przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zamontuj i nakryj szkiełko nakrywkowe kokulturę plastrów mózgu za pomocą fluorescencyjnego podłoża montażowego DAKO.</li>
	<li>Oceń stopień inwazji guza w oparciu o następujący system punktacji: 0 = żadna z komórek; + < 1/3; ++ = 1/3 - 2/3; +++ ≥ 2/3 zaatakowanych komórek (najpierw zmierz długość odcinka kontaktowego między czopem nowotworowym a plasterkiem, a następnie zmierz frakcję kontaktu wykrywalną przez atakujące komórki).</li>
</ol>
4. Obrazowanie na żywo interakcji między komórkami glejowymi i nowotworowymi
<ol>
	<li>Wykonaj eksperyment pod odwróconym mikroskopem Leica DMI 6000B z 10-krotnym powiększeniem i kamerą Leica DFC 350 FX CCD.</li>
</ol>

<ol><li>Langley, R. R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+seed+and+soil+hypothesis+revisited--the+role+of+tumor-stroma+interactions+in+metastasis+to+different+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The seed and soil hypothesis revisited--the role of tumor-stroma interactions in metastasis to different organs.</a> Int. J. Cancer. 128, 2527-2535 (2011).</li>
<li>Joyce, J. A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 9, 239-252 (2009).</li>
<li>Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-related+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cancer-related inflammation.</a> Nature. 454, 436-444 (2008).</li>
<li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+organ+microenvironment+in+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of the organ microenvironment in brain metastasis.</a> Semin. Cancer Biol. 21, 107-112 (2011).</li>
<li>Rath, B. H., Fair, J. M., Jamal, M., Camphausen, K., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+enhance+the+invasion+potential+of+glioblastoma+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Astrocytes enhance the invasion potential of glioblastoma stem-like cells.</a> PloS one. 8, e54752(2013).</li>
<li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metastasis%3A+mechanistic+insights+and+clinical+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nat. Med. 12, 895-904 (2006).</li>
<li>Eichler, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+brain+metastases-translation+to+new+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">The biology of brain metastases-translation to new therapies.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 344-356 (2011).</li>
<li>Winkler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+glioma+cell+invasion+in+vivo+reveals+mechanisms+of+dissemination+and+peritumoral+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis.</a> Glia. 57, 1306-1315 (2009).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Kreutz, S., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoids+and+neuronal+damage%3A+differential+effects+of+THC%2C+AEA+and+2-AG+on+activated+microglial+cells+and+degenerating+neurons+in+excitotoxically+lesioned+rat+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cannabinoids and neuronal damage: differential effects of THC, AEA and 2-AG on activated microglial cells and degenerating neurons in excitotoxically lesioned rat organotypic hippocampal slice cultures.</a> Exp. Neurol. 203, 246-257 (2007).</li>
<li>De Simoni, A., Yu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures%3A+interface+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method.</a> Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).</li>
<li>Fuller, L., Dailey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rodent+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of rodent hippocampal slice cultures.</a> CSH Protoc. 2007, pdb prot4848(2007).</li>
<li>Lorger, M., Felding-Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+changes+in+the+brain+microenvironment+during+initial+steps+of+breast+cancer+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Capturing changes in the brain microenvironment during initial steps of breast cancer brain metastasis.</a> Am. J. Pathol. 176, 2958-2971 (2010).</li>
<li>Brana, C., Biggs, T. E., Mann, D. A., Sundstrom, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+macrophage+hippocampal+slice+co-culture+system%3A+application+to+the+study+of+HIV-induced+brain+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A macrophage hippocampal slice co-culture system: application to the study of HIV-induced brain damage.</a> J. Neurosci. Methods. 90, 7-11 (1999).</li>
<li>Kim, J. A., Yamada, M. K., Nishiyama, N., Matsuki, N., Ikegaya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mossy+fiber+pathfinding+in+multilayer+organotypic+cultures+of+rat+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Mossy fiber pathfinding in multilayer organotypic cultures of rat hippocampal slices.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 23, 115-119 (2003).</li>
<li>Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+glioma+cell+invasion+by+confocal+laser+scanning+microscopy+in+a+novel+brain+slice+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 269, 513-520 (2000).</li>
<li>Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The brain tumor microenvironment.</a> Glia. , (2011).</li>
<li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> J. Immunol. 188, 29-36 (2012).</li>
<li>Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Physiology of microglia.</a> Physiol. Rev. 91, 461-553 (2011).</li>
<li>Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+stimulate+the+invasiveness+of+glioma+cells+by+increasing+the+activity+of+metalloprotease-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 754-762 (2005).</li>
<li>Baumert, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathology-based+substrate+for+target+definition+in+radiosurgery+of+brain+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Radiat.+Oncol.+Biol.+Phys%22%5BJournal%5D)">A pathology-based substrate for target definition in radiosurgery of brain metastases.</a> Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 66, 187-194 (2006).</li>
<li>Palmieri, D., Chambers, A. F., Felding-Habermann, B., Huang, S., Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+metastasis+to+a+sanctuary+site%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The biology of metastasis to a sanctuary site.</a> Clin. Cancer Res. 13, 1656-1662 (2007).</li>
<li>Pukrop, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+colonization+of+brain+tissue+by+breast+cancer+cells+in+a+Wnt-dependent+way%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way.</a> Glia. 58, 1477-1489 (2010).</li>
<li>Bos, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain.</a> Nature. 459, 1005-1009 (2009).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Wcześniejsze badania histologiczne przerzutów do mózgu wykazały szybkie i drastyczne zmiany w rezydentnych komórkach glejowych, zwłaszcza astrocytów i mikrogleju13. Do badania tych zmian i interakcji z komórkami rakowymi dobrze nadaje się ten nowatorski system kokultury. Inne dziedziny badań mają już wieloletnie doświadczenie z organotypowymi wycinkami mózgu w hipokampie. Jedną z zalet jest to, że organotypowe kultury wycinków mózgu w hipokampie są żywotne i skutecznie przechowywane przez kilka dni lub tygodni, dzięki czemu nadają się do długoterminowych eksperymentów. Od czasu wprowadzenia przez Stoppiniego w 1991 r. organotypowego systemu plastrów hipokampa, jest on szeroko stosowany, na przykład w badaniach nad chorobami zwyrodnieniowymi. W związku z tym ten innowacyjny system kokultury stanowi modyfikację dobrze ugruntowanego podejścia z szeregiem zastosowań w biologii nowotworów9,11. Modyfikacja dała nam powtarzalny model do oceny stopnia inwazji guza po jej zakończeniu, a kultury wyhodowane metodą interfejsu idealnie nadają się do eksperymentów wymagających trójwymiarowej struktury. Zastosowano kilka technik do kohodowli organotypowych wycinków hipokampa z innymi komórkami. Obejmują one pośredni system między komórkami makrofagów a organotypowym wycinkiem mózgu14 oraz bezpośrednią kokulturę dwóch różnych wycinków z regionu hipokampa15. Agregaty glejaka były również hodowane wspólnie z wycinkami mózgu16. Modele te mogą być używane do analizy zdarzeń komórkowych i molekularnych w wycinkach mózgu, ale nie pozwalają na bezpośredni, fizjologiczny kontakt między komórkami nowotworowymi, mikroglejem i miąższem mózgu. Ponadto metoda ta pozwala na obserwację mikrogleju bez zanieczyszczenia obwodowych monocytów/makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego. Zastosowanie transgenicznego modelu myszy CCR2 i CX3CR1 jest krytycznym ulepszeniem ze względu na fakt, że trudno jest odróżnić rezydujący mikroglej od inwazyjnych monocytów na podstawie ich podobnych właściwości17,18,19. Chociaż domózgowe wstrzyknięcie komórek rakowych pozwala na zbadanie progresji guza, nie może wiele powiedzieć, czy otoczone komórki podobne do makrofagów pochodzą z populacji mikrogleju rezydującego w mózgu, czy z obwodowych monocytów/makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego17. Zespół Kettenmanna wprowadził organotypowy model wycinka mózgu, który polegał na zaszczepieniu komórek glejaka w wycinkach mózgu za pomocą mikromanipulatora 20. Jednak pierwotne glejaki złośliwe różnią się pod wieloma względami od raków przerzutowych. Po pierwsze, glejaki złośliwe są pochodzenia mezenchymalnego, nie dają przerzutów poza układ nerwowy i migrują/atakują jako pojedyncze komórki bez granicy między guzem a tkanką mózgową. Natomiast wzrost naciekowy jest typową cechą patologiczną, a takie raki zwykle migrują/atakują jako kohorty. Po drugie, raki często próbują odbudować struktury nabłonkowe w mózgu, podczas gdy komórki glejowe próbują oddzielić guz od tkanki mózgowej za pomocą (pseudo) kapsułki. Biorąc pod uwagę cechy biologiczne i morfologiczne, glejak złośliwy i przerzuty raka nie są tak naprawdę porównywalne. Z tych powodów zmodyfikowaliśmy i opracowaliśmy system kokultury, w którym nie wstrzykujemy, ale kokulturujemy czop komórkowy raka przylegający do wycinka mózgu. Ponadto zaobserwowaliśmy akumulację mikrogleju i astrocytów na granicy czopa nowotworowego, co oznacza, że mikroglej dostaje się do czopa nowotworowego i może być łatwo wykryty za pomocą mikroskopii jasnego pola, a następnie potwierdzony przez mikroskopię konfokalną. Komórki rakowe wnikają do wycinka mózgu, co jest porównywalne z rzeczywistą sytuacją in vivo i z obserwacją dokonaną przez Baumerta i współpracowników, którzy znaleźli strefę nacieku w 63% przypadków autopsji zprzerzutami do mózgu.
Ze względu na brakującą perfuzję krwi, w tej kulturze występują tylko makrofagi/mikroglej. Co więcej, ze względu na brakujące limfocyty T, a tym samym brak alloreaktywności, ludzkie komórki rakowe mogą być wykorzystywane do kokultury nawet z wycinkami mózgu immunokompetentnych myszy lub szczurów (NMRI, B6 lub Wistar). Może to służyć jako alternatywa dla nagiego modelu myszy. Ponieważ z każdej myszy można uzyskać od czterech do pięciu plastrów, wymagana jest znacznie zmniejszona liczba zwierząt w porównaniu z istniejącymi modelami iniekcji. Ponadto zwierzęta nie cierpią przez długi czas na chorobę przerzutową i nie są poddawane powtarzalnym zabiegom operacyjnym22.
Dzięki temu systemowi kohodowli wykazaliśmy aktywację mikrogleju przez komórki rakowe i zdolność do promowania inwazji komórek rakowych. Dodatkowo, według naszej wiedzy, po raz pierwszy stwierdzono, że mikroglej aktywnie transportuje komórki rakowe23.
Pomimo tych wszystkich zalet, system kokultury ma w istocie również ograniczenia. Nadal jest to model in vitro , w którym brakuje etapów przerzutów przed kolonizacją. Ze względu na brak perfuzji nie jest możliwe badanie wynaczynienia. Tak więc alternatywnym sposobem badania wynaczynienia jest użycie modelu iniekcyjnego in vivo lub zmodyfikowanego systemu komór Boydena z macierzą zewnątrzkomórkową, HUVEC i astrocytami w celu naśladowania bariery krew-mózg22,24. Metoda kokultury wycinków mózgu jest jednak wiarygodnym i powtarzalnym modelem o wielu zaletach i potencjale dla szerokiej gamy zastosowań, takich jak analiza kolonizacji, w szczególności z naciskiem na rolę komórek rezydentnych. Połączenie z innymi uznanymi technikami (takimi jak immunohistochemia, mikroskopia konfokalna i mikroskopia poklatkowa) wspiera badanie bezpośrednich interakcji międzykomórkowych. Jest to łatwa alternatywa i uzupełnienie innych technik oraz oferuje dostęp do badania wskazówek i efektów narzuconych przez mikrośrodowisko przerzutowe.

<table><tbody><tr><td>Hanka&#039; s zrównoważony roztwór soli (HBSS)</td><td>Gibco, Darmstadt,Niemcy</td><td>24020</td><td></td></tr><tr><td>Minimalne niezbędne podłoże (MEM)</td><td>Gibco, Darmstadt, Niemcy</td><td>32360</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>PAA Laboratories Inc., C&ouml; lbe, Niemcy</td><td>E15-840</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039; s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Pan Biotech, Aidenbach, Niemcy</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica konia (NHS)</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy</td><td>10091148</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>B. Braum, Melsungen, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina-penicylina-streptomycyna roztwór</td><td>Sigma, Steinheim, Niemcy</td><td>G1146</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica, Wetzlar, Niemcy</td><td>Leica VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica, Wetzlar, Niemcy</td><td>Leica SM 2000R</td><td></td></tr><tr><td>Membrana poliwęglanowa</td><td>BD Falcon, Heidelberg, Niemcy</td><td>353090</td><td>wkładka membranowa transwell (0,4 &mu; m wielkość porów)</td></tr><tr><td>Żel ECM</td><td>Trevigen, R& D, Wiesbaden-Nordenstadt, Niemcy</td><td>3432-005-01</td><td>Ekstrakt z błony podstawnej</td></tr><tr><td>Metalowa przekładka</td><td>Kig GmbG, Kirkel, Niemcy</td><td>DIN 433</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss, G&ouml; ttingen, Niemcy</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop poklatkowy i kamera</td><td>Leica, Wetzlar, Niemcy</td><td>Mikroskop DMI 6000B i kamera CCD DFC 350 FX</td> Mikroskop anatomiczny Zeiss, G&ouml;<td></td></tr><tr><td></td><td> ttingen, Niemcy</td><td>Stemi SV11</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>1.04005.1000</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko glejowemu fibrylarnemu białku kwasowemu (GFAP)</td><td>Sigma, Steinheim, Niemcy</td><td>G3893</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG, F(ab&#039;)2- TRITC</td><td>Santa Cruz, Heidelberg, Niemcy</td><td>SC3796</td><td></td></tr><tr><td>Izolektyna GS-IB4 z Griffonia simplicifolia, koniugat Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy</td><td>132450</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6&#039;-dihyfrochlorek dimidino-2-fenyloindolu)</td><td>Sigma, Steinheim, Niemcy</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjne medium montażowe</td><td>DAKO, Glostrup, Dania</td><td>Zobacz materiał S3023</td><td></td></tr></tbody></table>

system kokultury z organotypowym wycinkiem mózgu i sferoidą 3d komórek rakowych

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Pacjenci z przerzutami raka do mózgu mają złe rokowania. Jednak proces w miejscu przerzutów nie został prawie zbadany, w szczególności rola komórek rezydentnych (zrębowych). Badania nad rakami pierwotnymi wykazują wpływ mikrośrodowiska na przerzuty, a nawet na rokowanie1,2. Zwłaszcza makrofagi związane z nowotworem (TAM) wspierają migrację, inwazję i proliferację3. Co ciekawe, główne miejsca docelowe przerzutów posiadają makrofagi specyficzne tkankowo, takie jak komórki Kupffera w wątrobie lub mikroglej w OUN. Co więcej, miejsca przerzutów posiadają również inne komórki specyficzne dla tkanki, takie jak astrocyty. Niedawno wykazano, że astrocyty sprzyjają proliferacji i trwałości komórek rakowych4,5. Dlatego funkcje tych specyficznych tkankowo typów komórek wydają się być bardzo ważne w procesie przerzutów do mózgu6,7.
Pomimo tych obserwacji, do tej pory nie ma odpowiedniego modelu in vivo/in vitro, który bezpośrednio obrazowałby reakcje glejowe podczas tworzenia przerzutów do mózgu, w szczególności za pomocą mikroskopii jasnego pola. Niedawne obrazowanie na żywo in vivo komórek rakowych wykazało ich zachowanie kolonizacyjnemózgu 8. Jednak ta metoda jest bardzo pracochłonna, kosztowna i skomplikowana technicznie. Ponadto tego rodzaju eksperymenty na zwierzętach są ograniczone do małych serii i wiążą się ze znacznym stresem dla zwierząt (poprzez wszczepienie szklanej płytki, wstrzyknięcie komórek nowotworowych, powtarzające się znieczulenie i długotrwałą fiksację). Co więcej, obrazowanie in vivo ogranicza się do tej pory do wizualizacji komórek rakowych, podczas gdy interakcje z komórkami rezydentnymi nie zostały jeszcze zilustrowane. Wreszcie, badania ludzkich komórek rakowych u zwierząt immunokompetentnychsą niemożliwe 8.
Z tych powodów stworzyliśmy system kokultury składający się z organotypowego wycinka mózgu myszy i komórek nabłonkowych osadzonych w matrigelu (sferze komórkowej 3D). Kule komórek raka 3D umieszczono bezpośrednio przy krawędzi wycinka mózgu w celu zbadania inwazji sąsiedniej tkanki mózgowej. Dzięki temu możemy wizualizować zmiany morfologiczne i interakcje między komórkami glejowymi a komórkami rakowymi za pomocą fluorescencji, a nawet mikroskopii w jasnym polu. Po eksperymencie kokulturowym tkanka mózgowa lub sferoidy komórek 3D mogą zostać pobrane i wykorzystane do dalszych analiz molekularnych (np. qRT-PCR, IHC lub immunoblot), a także do badań za pomocą mikroskopii konfokalnej. Metoda ta może być stosowana do monitorowania zdarzeń w żywej tkance mózgowej przez wiele dni bez szkodliwego wpływu na wycinki mózgu. Model umożliwia również selektywną supresję i zastępowanie komórek rezydentnych komórkami z tkanki dawcy w celu określenia wyraźnego wpływu danego genotypu. Wreszcie, model kokultury jest praktyczną alternatywą dla podejść in vivo podczas testowania ukierunkowanych manipulacji farmakologicznych.

W pierwszej kolejności wszystkie użyte komórki raka (ludzkie: MCF-7 oraz mysie: 410.4) zinwadowały organotypowy skrawek mózgu myszy. Inwazja ta była zatem niezależna od gatunku (Ryc. 1A), co wskazuje na szeroki zakres zastosowań w sposób niezależny od gatunku. Dodatkowo, w miejscu styku nagromadziły się mikroglej oraz astrocyty, co zostało wcześniej opisane in vivo oraz w próbkach pacjentów13. Obrazowanie poklatkowe w dłuższym okresie czasu nie tylko potwierdziło żywotność skrawka, ale również zapewniło dobrą platformę do obserwacji interakcji komórkowych. W eksperymentach poklatkowych zarejestrowano wniknięcie komórek mikrogleju do trójwymiarowej sfery komórkowej, podczas gdy z kolei komórki nowotworowe również zinwadowały skrawek mózgu (Ryc. 1B1-B2). Ponadto wykazaliśmy wcześniej zdolność mikrogleju do transportowania komórek raka za pomocą wciąż zagadkowego mechanizmu, co wspomaga inwazję raka. Wykorzystując techniki znakowania immunofluorescencyjnego, opisaliśmy ko-lokalizację komórek nowotworowych i komórek zrębu (np. mikrogleju i astrocytów), zarówno w tkance mózgowej, jak i w czopie komórek nowotworowych (Ryc. 1C-D), co sugeruje ścisłą interakcję między tymi komórkami podczas procesu inwazji. Porównywalne wyniki uzyskano, gdy skrawki mózgu myszy współhodowano z ludzkimi (Ryc. 1C1-C3) lub mysimi (Ryc. 1D1-D3) komórkami raka - co wykazuje szeroki zakres zastosowań w badaniu komórek z różnych gatunków, genotypów i szczepów.
<img alt="Analiza inwazji komórek; wykres słupkowy i obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; inwazja komórek nowotworowych w skrawku mózgu." src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1.jpg" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Model kokultury skrawka mózgu z 3D sferoidem mysich i ludzkich komórek raka. A) Ilościowe określenie inwazji komórek rakowych w organotypowych kokulturach całego skrawka mózgu z mysią linią komórkową raka piersi 410.4 lub ludzką linią komórkową raka piersi MCF-7. Dane przedstawiają procentowy stopień inwazji komórek do skrawka mózgu w każdej grupie przy n ≥ 38. Nie stwierdzono istotnej różnicy między tymi dwiema grupami (test Kruskala-Wallisa). B) Przedstawiono obrazy time-lapse z organotypowych kokultur całego skrawka mózgu z komórkami MCF-7-GFP oraz reprezentatywne obrazy z dnia 2 (B1) i dnia 5 (B2). C-D) Obrazy z mikroskopii konfokalnej pokazują grupy raków, astrocytów i mikrogleju. Podwójne barwienie astrocytów (anty-GFAP-TRITC, czerwony) i mikrogleju (ILB4-Alexa Fluor 647, fioletowy) całej kokultury z organotypowym skrawkiem mózgu o grubości 350 μm i wtyczką z komórek nowotworowych przetransfekowanych GFP (zielony): 3D-MCF-7-GFP (C1-C3) oraz 3D-410.4-GFP (D1-D3). Białe kreski wskazują krawędź skrawka mózgu i front inwazji nowotworu. Paski skali reprezentują 50 μm. Kolokalizacje mikrogleju, astrocytów i nowotworów (C1 i D1), kolokalizacje astrocytów i nowotworów (C2 i D2) oraz kolokalizacje mikrogleju i nowotworu (C3 i D3) w kokulturze skrawka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz</a>

Organotypowa kokultura wycinków mózgu z komórkami rakowymi umożliwia wizualizację zmian morfologicznych za pomocą fluorescencji, jak również mikroskopii w jasnym polu (wideo) podczas procesu inwazji komórek rakowych w tkance mózgowej. Ten modelowy system pozwala również na podejście oparte na wymianie i uzupełnianiu komórek oraz oferuje szeroką gamę manipulacji i analiz.

System kokultury z organotypowym wycinkiem mózgu i sferoidą 3D komórek rakowych

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja interakcji glejowych bezpośrednio podczas tworzenia przerzutów do mózgu. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw organotypowych wycinków mózgu od myszy. Następnie organotypowe wycinki mózgu są hodowane wspólnie z komórkami rakowymi.Następnie komórki zrębu są barwione fluorescencyjnie specyficznymi markerami. Na koniec poziom inwazji guza ocenia się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują interakcję i kolokalizację komórek raka glejowego poprzez znakowanie immunofluorescencyjne i mikroskopię poklatkową lub konfokalną.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak domózgowe wstrzykiwanie komórek rakowych, jest to, że metoda ta jest łatwą alternatywą i stanowi dobrą platformę do obserwacji interakcji komórkowych podczas progresji guza. Implikacje tej techniki są 10 w kierunku odkrycia nowej i selektywnych terapii w leczeniu raka. Ponieważ komórki urazowe odgrywają ważną rolę w przerzutach, a także potencjalne cele terapii raka, Demonstrując technikę, Eugenia wręczy doktora mojego laboratorium Przed zabiegiem chirurgicznym przygotuj pożywkę preparacyjną składającą się z minimalnej ilości niezbędnego podłoża, uzupełnionego 0,2 milimolową glutaminą, 100 miligramami na mililitr streptomycyny i 4,5 miligrama na mililitr glukozy po ścięciu głów myszy z dowolnego szczepu myszy między szóstym dniem po urodzeniu a Osiem.Stosując szybko warunki aseptyki, usuń mózg z czaszki i przenieś go do podłoża preparacyjnego. Usuń biegun czołowy i móżdżek z mózgu. Następnie użyj kleju kriogenicznego i 5%agros, aby naprawić i ustabilizować pozostałą tkankę mózgową składającą się z mózgu.Na scenie z użyciem poziomego plastra Vibram, sekcje o grubości 350 mikronów, w zależności od gatunku i wieku myszy, zbierają od czterech do sześciu całych wycinków mózgu z jednego mózgu. Po przygotowaniu pożywki hodowlanej zgodnie z protokołem tekstowym, dodać jeden mililitr do każdego dolnego dołka sześciodołkowej płytki trans-dołkowej. Następnie umieść każdy organotypowy plasterek mózgu na membranie transwell z poliwęglanu o grubości 0,4 mikrona i włóż je do dołków płytki.Inkubuj plastry przez noc w wilgotnej atmosferze z 5% dwutlenkiem węgla i 37 stopniami Celsjusza. Następnego dnia osadź od 10 do piątych komórek guza lub innych komórek transfekowanych przez GFP w 20 mikrolitrach matrycy żelowej składającej się z 15% pożywki RPMI i 85% żelu ECM. Umieść mieszankę matrycy żelowej MCF z siedmioma żelowymi przekładkami w sterylnych metalowych przekładkach bezpośrednio przylegających do obszarów korowych organotypowych wycinków mózgu i inkubuj przez dwie godziny po inkubacji, usuń przekładki i pozwól, aby PHE guza 3D inkubował się z plasterkami mózgu przez 24 do 96 godzin.W razie potrzeby wymieniaj pożywkę hodowlaną co drugi dzień. Przeprowadź obrazowanie na żywo za pomocą mikroskopii poklatkowej z obiektem o 10-krotnym powiększeniu, aby zabarwić kulturę współwarstwy mózgu. Utrwal je 4% aldehydem paraform przez osiem godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie umyj próbki w PBST przez pięć minut.Następnie, aby zablokować próbki, użyj normalnej koziej surowicy w PBST w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Następnie wybarwić astrocyty, inkubując kultury koco z kwaśnym białkiem fibrylarnym antyglejowym lub przeciwciałem monoklonalnym GFAP przez 36 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie barwienie kozy przeciwko myszom przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po trzykrotnym przemyciu próbek PBST przez pięć minut każda, należy zabarwić komórki mikrogleju za pomocą I LB four LOR 647 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie barwieć przeciw DPI przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.Po użyciu fluorescencyjnego podłoża montażowego do zamontowania próbek z kohodowli, należy zobrazować próbki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego o 25-krotnym powiększeniu. Na koniec oceń stopień inwazji guza w oparciu o następujący system punktacji. To najpierw mierzy długość odcinka kontaktowego między czopem nowotworowym a plasterkiem, a następnie frakcję kontaktu wykrywalną przez atakujące komórki.Jak pokazano tutaj, wszystkie testowane linie komórkowe raka zaatakowały organotypowe wycinki mózgu myszy, co sugeruje, że proces inwazji był niezależny od gatunku. Ten film pokazuje nagranie poklatkowe bezpośrednich interakcji komórek nowotworowych gleju. Zaobserwowano, że komórki zrębu atakują guz zawierający czop komórkowy i wchodzą w interakcje z komórkami rakowymi.Obrazowanie poklatkowe przez dłuższy czas potwierdziło żywotność wycinków mózgu i umożliwiło wizualizację komórek mikrogleju wchodzących do sfery trójwymiarowej, a także komórek rakowych atakujących wycinki mózgu. Ponadto, jak wykazaliśmy wcześniej, mikroglej transportuje komórki raka za pomocą wciąż enigmatycznego mechanizmu i pomaga w inwazji raka za pomocą znakowania immunofluorescencyjnego. Wykazaliśmy kolokalizację komórek nowotworowych i zrębowych zarówno w tkance mózgowej, jak i w czopach komórek nowotworowych, co sugeruje ścisłą interakcję między tymi komórkami podczas procesu inwazji.Jak widać tutaj, porównywalne wyniki uzyskano, gdy wycinki mózgu myszy były hodowane jednocześnie z komórkami raka ludzkiego lub moczowego, co wspiera szeroki zakres zastosowań w badaniu komórek różnych gatunków, genotypów i szczepów. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się przerzutami nowotworowymi do zbadania wpływu mikrośrodowiska podczas kolonizacji guza w odległych miejscach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować reakcje komórek rakowych GL podczas tworzenia przerzutów do mózgu w bezpośrednim systemie kontaktu fizjologicznego.

coculture-system-with-an-organotypic-brain-slice-3d-spheroid

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

System kokultury z przekrojem mózgu organotypowego i kulką 3D z komórek karcynoma

Ten film pokazuje rozwój systemu kokultury 3D. Wycinki mózgu myszy umieszcza się na błonie, a znakowane fluorescencyjnie ludzkie komórki guza mózgu mogą na niej rosnąć. Gdy system jest gotowy, jest barwiony do obrazowania.

Ustalenie guza mózgu w organotypowym modelu kokultury warstw

Wideo pokazuje tworzenie i utrzymywanie organtypowych kultur warstwowych z tkanki glejaka. Wyizolowaną tkankę osadza się w matrycy agarozowej, a cienkie skrawki uzyskuje się za pomocą wibratomu. Sekcje te są następnie umieszczane na przepuszczalnych wkładkach membranowych w mikropłytce i hodowane w pożywce do hodowli warstwowej w celu długotrwałej konserwacji.

Generowanie i utrzymywanie kultur plastrów z ludzkiej tkanki glejaka wielopostaciowego

Ten film opisuje przygotowanie i hodowlę organoidów guza mózgu z zawiesiny pojedynczej komórki. Wykorzystując bogatą w lamininę macierz zewnątrzkomórkową jako rusztowanie i pożywkę hodowlaną dla składników odżywczych, komórki mają ułatwione namnażanie się i samoorganizację w organoidzie. W związku z tym generowane są organoidy ex vivo, naśladujące różnorodność komórkową i mikrośrodowisko guzów mózgu.

Generowanie kultury organoidów z zawiesiny komórek guza mózgu

Opisano metody tworzenia ludzkich tkanek nowotworowych 3D jako systemów testowych. Technologie te opierają się na bezkomórkowym biologicznym rusztowaniu unaczynionym (BioVaSc), pierwotnych komórkach ludzkich i linii komórek nowotworowych, które mogą być hodowane zarówno w warunkach statycznych, jak i dynamicznych w bioreaktorze przepływowym.

Inżynieria tkankowa ludzkiego systemu badań 3D nowotworów in vitro

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Wiele typów ludzkich guzów mózgu jest zlokalizowanych w określonych regionach mózgu i są trudne do wyhodowania w kulturze. Protokół ten odnosi się do roli mikrośrodowiska guza i bada nowe terapie lekowe poprzez analizę fluorescencyjnych pierwotnych komórek guza mózgu rosnących w organotypowym wycinku mózgu myszy.

System kohodowli guzów mózgu/organotypowych plastrów do badania mikrośrodowiska guza i celowanych terapii lekowych

Obecne modele ex vivo glejaka (GBM) nie są zoptymalizowane pod kątem fizjologicznie istotnych badań nad inwazją nowotworów u ludzi. W tym miejscu przedstawiamy protokół generowania i utrzymywania organotypowych kultur warstwowych ze świeżej tkanki ludzkiej GBM. Przedstawiono opis technik mikroskopii poklatkowej i ilościowej analizy migracji komórek.

Organotypowy model hodowli warstwowej glejaka ludzkiego do badania migracji komórek nowotworowych i specyficznych dla pacjenta skutków leków przeciwinwazyjnych

Organotypowe kultury plastrów hipokampa (OHSC) reprezentują model in vitro, który bardzo dobrze symuluje sytuację in vivo. W tym miejscu opisujemy ulepszony protokół krojenia oparty na wibratomie w celu uzyskania wysokiej jakości plastrów do wykorzystania w ocenie potencjału neuroprotekcyjnego nowych substancji lub biologicznego zachowania komórek nowotworowych.

Organotypowe kultury warstwowe hipokampa jako model do badania neuroprotekcji i inwazyjności komórek nowotworowych

Tutaj opisujemy łatwy w użyciu test na inwazję glejaka. Ten test jest odpowiedni dla komórek macierzystych podobnych do glejaka. Opisano również makro Fidżi do łatwego ilościowego określania inwazji, migracji i proliferacji.

Model sferoidalny 3D glejaka wielopostaciowego

Brakuje kompleksowych modeli in vitro, które wiernie odwzorowują daną chorobę ludzką. Obecne badanie przedstawia trójwymiarowe (3D) tworzenie i hodowlę sferoidów guza, wiarygodne narzędzie in vitro do badania interakcji guz-zręb w ludzkim raku wątrobowokomórkowym.

Trójwymiarowy model sferoidalny do badania interakcji guz-zręb w raku wątrobowokomórkowym

Istnieje krytyczna potrzeba modeli 3D raka, które rejestrują przesłuchy heterokomórkowe do badania przerzutów nowotworowych. Nasze badanie przedstawia wytwarzanie heterowielokomórkowego nabłonka podścielisko-podścieliskowego w środowisku wolnym od rusztowań i rusztowań, które można wykorzystać do badania inwazji i przestrzennych rozkładów komórkowych.

Heterowielokomórkowe komórki zrębu w wolnych od rusztowań hodowlach 3D nabłonkowych komórek nowotworowych w celu napędzania inwazji

Poznaj metodę wizualizacji interakcji komórek glejowych podczas tworzenia przerzutów mózgowych przy użyciu organotypowych wycinków mózgu myszy współkulturywanych z komórkami raka.

System kokultury z organotypowym wycinkiem mózgu i sferoidą 3D komórek rakowych

Przeglądaj więcej filmów