Name: In vivo (in vivo) Obrazowanie integralności włókien nerwu wzrokowego za pomocą rezonansu magnetycznego ze wzmocnieniem kontrastowym u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Poznaj metodę obrazowania MRI ze wzmocnieniem manganowym do badania zwyrodnienia nerwu wzrokowego u myszy in vivo. Technika umożliwia długoterminowe monitorowanie zmian strukturalnych w układzie wzrokowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.K. jest wspierany przez Fundację Oppenheim, a R.H. jest wspierany przez Fundację Velux. Dziękujemy I. Krumbeinowi za pomoc techniczną i K. Buderowi za wsparcie histologiczne oraz J. Goldschmidtowi (Instytut Neurobiologii im. Leibniza, Magdeburg, Niemcy) za porady techniczne dotyczące barwienia TIMM.

Wszystkie interwencje na zwierzętach są wykonywane zgodnie z Europejską Konwencją o Opiece nad Zwierzętami i Wykorzystaniu Zwierząt Laboratoryjnych oraz Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystywania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Wszystkie eksperymenty są zatwierdzane przez lokalną komisję etyczną. Procedura uszkodzenia ON u myszy jest opisana w innym miejscu9.
1. Doszklistkowe wstrzyknięcie manganu
<ol>
	<li>Wykonaj wstrzyknięcie Mn2+ 24 godziny przed badaniem MR z pomocą asystenta. Znieczulić zwierzęta przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 5% roztworu wodzianu chloralu (420-450 mg/kg masy ciała w sterylnym PBS). W celu dodatkowego znieczulenia miejscowego nałóż jedną kroplę płynnej spojówki (0,4% chlorowodorku oksybuprokainy) na rogówkę przed punkcją oka. Aby wstrzyknąć 15 nmol Mn2+ na oko, należy przygotować roztwór MnCl2 o stężeniu 7,5 mM, np. rozcieńczając 1 l 1 M roztworu podstawowego MnCl2 w 132 L H2O. Załadować 5 μl końcowego roztworu do strzykawki Hamilton o pojemności 5 μl połączonej z wyjmowaną igłą o masie 34 g (igła RN).</li>
	<li>Zaczynając od prawego oka, ustaw mysz po lewej stronie pod mikroskopem lornetkowym i delikatnie otwórz i umieść prawe oko między kciukiem a palcem wskazującym lewej ręki. Podnieść strzykawkę prawą ręką i chwycić igłę blisko końcówki. W przypadku atraumatycznego nakłucia bańki oka ostrożnie włóż igłę do ciała szklistego na obwodzie dolno-skroniowym około 1 mm dystalnie do rąbka, oszczędzając w ten sposób naczynia twardówkowe.</li>
	<li>Następnie asystent powoli nakłada całkowitą objętość 2 μl, kontrolując skalę strzykawki Hamiltona. Podczas tej procedury należy monitorować optymalne ułożenie igły pod mikroskopem i unikać przebicia soczewki lub rozlania płynu. Trzymać igłę statycznie włożoną statycznie przez dodatkowe 30 sekund, a następnie powoli ją wyjmować, aby zminimalizować wyciek płynu z miejsca wstrzyknięcia.</li>
	<li>Podczas całego zabiegu należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć ucisku na oko. Podobnie unikaj ostrych lub licznych prób przebicia bańki oka. Ponieważ wychwyt Mn2+ do RGC i transport wzdłuż ON jest już nasycony przy 15 nmol MnCl2, minimalizuje to zmiany sygnału przez nieco nieprecyzyjne objętości wtrysku. W celu obustronnego wzmocnienia sygnału projekcji wzrokowej należy powtórzyć procedurę wstrzykiwania dla lewego oka.</li>
	<li>Krople do oczu zawierające ofloksacynę (3 mg/ml) i maść zawierającą pantenol należy stosować raz po zabiegu, aby zapobiec infekcjom oczu i wysuszeniu oka. Umieść myszy z powrotem w klatkach w normalnych warunkach mieszkaniowych do czasu rozpoczęcia badania MR.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zwierząt do rezonansu magnetycznego
<ol>
	<li>Znieczulij mysz, podając mieszaninę 2%/98% izofluranu i tlenu gazowego. Zamontuj mysz na uchwycie myszy w prawie poziomej, nieskręconej pozycji. Włóż go do cewki MR, która jest następnie regulowana wewnątrz skanera MR. Monitoruj oddech i tętno za pomocą odpowiednich systemów. Szczegółowe informacje techniczne można znaleźć w Herrmann i wsp. 20.</li>
	<li>Podczas rezonansu magnetycznego należy podać znieczulenie poprzez ciągłą inflację początkowo 1,5%/98,5% mieszaniny izofluranu i tlenu przez parownik połączony z uchwytem głowy myszy za pomocą zintegrowanej rurki. Podczas skanowania dostosuj głębokość znieczulenia zgodnie z zarejestrowanymi parametrami życiowymi (tj. staraj się osiągnąć stabilne tempo oddychania wynoszące około 40 oddechów na minutę). Za pomocą urządzenia grzewczego utrzymuj stabilną temperaturę powierzchni ciała w zakresie od 35 do 37 °C, mierzoną przez czujnik termiczny umieszczony w miejscu brzucha myszy. Szczegółowe informacje techniczne można znaleźć w Herrmann i wsp. 17.</li>
	<li>Po skanowaniu uwolnij mysz z uchwytu i zaopatrz ją w czysty tlen, aby przyspieszyć powrót do zdrowia po znieczuleniu. Dodatkowo utrzymuj stabilną temperaturę ciała za pomocą źródła ogrzewania światłem czerwonym.</li>
</ol>
3. Protokół MRI
<ol>
	<li>Protokół został zweryfikowany dla skanera o mocy 3 Tesli wyposażonego w dedykowaną, wydajną pod kątem SNR, cewkę dla małych zwierząt (cewka Litz spolaryzowana liniowo) o efektywnym polu widzenia o średnicy 35 mm × 38 mm. Używaj cewki w trybie nadawczo-odbiorczym.</li>
	<li>Gdy zwierzę znajdzie się w końcowej pozycji, wyreguluj strojenie i dopasowanie cewki za pomocą analizatora częstotliwości. Ręcznie dostosuj napięcie odniesienia przetwornika i prądy podkładki, aby zoptymalizować jednorodność i jakość obrazu.</li>
	<li>Rejestruj ważone obrazy 2D TSE T1 o rozdzielczości 0,5 mm × 0,5 mm × 2 mm w widoku strzałkowym i poprzecznym w celu planowania. Korzystając z planistycznych skanów MR, uzyskaj obrazy MEMR w kierunku pomiaru koronalnego, obrócone tak, aby były równoległe do głowy zwierzęcia z kodowaniem fazowym wzdłuż kierunku lewo-prawo. Aby zminimalizować czas akwizycji, należy użyć prostokątnego pola widzenia dostosowanego do rzeczywistych wymiarów głowicy. Zastosuj zepsutą sekwencję 3D FLASH (VIBE 3D) przy użyciu następujących parametrów: matryca bazowa 256, pole widzenia 54 mm × 50,65 mm × 14,08 mm, wykorzystująca prostokątne pole widzenia 93,8% w kierunku kodowania fazowego oraz 128 warstw o grubości 0,11 mm z rozdzielczością warstwy ustawioną na 61%.</li>
	<li>Aktywuj interpolację w płaszczyźnie, aby utworzyć końcowe obrazy o 512 × 480 × 128, zapewniając efektywną rozdzielczość 0,21 mm × 0,21 mm × 0,18 mm (0,1 mm × 0,1 mm × 0,09 mm interpolowane), czas echa TE = 6,51 ms, czas powtarzania TR = 16 ms, szerokość pasma = 160 Hz/px, kąt odwrócenia = 22°. Zastosuj dwie średnie i trzy powtórzenia, aby osiągnąć całkowity czas przyswajania (TA) około 30 minut.</li>
</ol>
4. Analiza danych MRI
<ol>
	<li>Analizuj dane za pomocą oprogramowania syngo fastView. W celu ilościowego wzmocnienia sygnału wybierz zdefiniowane obszary zainteresowania w płaskich zapisach MRI 2D i określ natężenie sygnału (SI) wzmocnionej struktury (SIMEMRI), tła tkankowego (SI backgr) i odchylenie standardowe szumu (SDN). W razie potrzeby należy użyć atlasu mózgu myszy, aby ułatwić orientację neuroanatomiczną struktur LGN i SC. Oblicz stosunek kontrastu do szumu (CNR) za pomocą wzoru:</li>
	<li>CNR = (SIMEMRI– SIbackgr) / SDN</li>
	<li>Określ ilościowo trzy kolejne obrazy w celu obliczenia średniej CNR dla każdej próbki. U zwierząt, którym wstrzyknięto obustronnie, analizuj każdą półkulę niezależnie.</li>
	<li>Aby zobrazować obrazy poziome, czołowe i strzałkowe, należy obliczyć rekonstrukcje wielopłaszczyznowe z oryginalnego zestawu danych MRI 3D. Te przetworzone obrazy nie są zalecane do analizy ilościowej. Aby stworzyć animowane rekonstrukcje 3D (projekcje o maksymalnej intensywności, MIP) projekcji siatkówkowo-tektalnej, należy użyć modułu oprogramowania do post-processingu angiografii.</li>
</ol>
5. Mn2+ Autometalografia (barwienie TIMM)
<ol>
	<li>W przypadku barwienia TIMM struktur mózgu śledzonych przez Mn2+ po MEMRI, należy wstrzyknąć dawkę 15-150 nmol Mn2+ ivit 24 godziny przed obrazowaniem.</li>
	<li>Po badaniu MR należy przeprowadzić perfuzję u zwierząt za pomocą 30 ml lodowatego roztworu 0,325% Na2S w PBS (pH 7,4). Wypreparuj siatkówki i zamroź próbki w sekcji Zamrożone.</li>
	<li>Na kriotomie należy wyciąć sekwencyjne, równikowe odcinki o grubości 15 μm.</li>
	<li>Wykonaj barwienie TIMM21 przy braku utrwalacza i krioprotekcji zgodnie z Angensteinem i wsp. 22.</li>
</ol>
6. Analiza statystyczna
Wykonuj analizy statystyczne za pomocą testu t-Studenta dla pojedynczych porównań, a następnie ANOVA post hoc. Dane są prezentowane jako błąd średni ± standardowym. Poszczególne liczby N są podawane osobno dla każdego eksperymentu. Wyniki osiągające P ≤ 0,05 uznaje się za istotne statystycznie (P ≤ 0,05, *; P ≤ 0,01, **; P ≤ 0,001, ***).

<ol><li>Kretz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simvastatin+promotes+heat+shock+protein+27+expression+and+Akt+activation+in+the+rat+retina+and+protects+axotomized+retinal+ganglion+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Simvastatin promotes heat shock protein 27 expression and Akt activation in the rat retina and protects axotomized retinal ganglion cells in vivo.</a> Neurobiol Dis. 21, 421-430 (2006).</li>
<li>Lima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+therapy+stimulates+long-distance+regeneration%2C+target+reinnervation%2C+and+partial+recovery+of+vision+after+optic+nerve+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial therapy stimulates long-distance regeneration, target reinnervation, and partial recovery of vision after optic nerve injury in mice.</a> Int Rev Neurobiol. 106, 153-172 (2012).</li>
<li>Lima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+axon+regeneration+in+the+adult+mouse+optic+nerve+and+partial+recovery+of+simple+visual+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Full-length axon regeneration in the adult mouse optic nerve and partial recovery of simple visual behaviors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9149-9154 (2012).</li>
<li>Goetze, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vision+and+visual+cortical+maps+in+mice+with+a+photoreceptor+synaptopathy%3A+reduced+but+robust+visual+capabilities+in+the+absence+of+synaptic+ribbons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Vision and visual cortical maps in mice with a photoreceptor synaptopathy: reduced but robust visual capabilities in the absence of synaptic ribbons.</a> Neuroimage. 49, 1622-1631 (2010).</li>
<li>Luo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+evaluation+of+retinal+ganglion+cell+axon+regeneration+and+pathfinding+in+whole+mouse+tissue+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional evaluation of retinal ganglion cell axon regeneration and pathfinding in whole mouse tissue after injury.</a> Exp Neurol. 247, 653-662 (2013).</li>
<li>Pautler, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+neuronal+tract+tracing+using+manganese-enhanced+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo neuronal tract tracing using manganese-enhanced magnetic resonance imaging.</a> Magn Reson Med. 40, 740-748 (1998).</li>
<li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+retinal+projections+in+the+living+rat+using+high-resolution+3D+gradient-echo+MRI+with+Mn2%2B-induced+contrast%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Mapping of retinal projections in the living rat using high-resolution 3D gradient-echo MRI with Mn2+-induced contrast.</a> Magn Reson Med. 46, 424-429 (2001).</li>
<li>Pautler, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo%2C+trans-synaptic+tract-tracing+utilizing+manganese-enhanced+magnetic+resonance+imaging+%28MEMRI%29%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+biomed%22%5BJournal%5D)">In vivo, trans-synaptic tract-tracing utilizing manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI).</a> NMR biomed. 17, 595-601 (2004).</li>
<li>Haenold, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+of+the+mouse+visual+pathway+for+in+vivo+studies+of+degeneration+and+regeneration+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging of the mouse visual pathway for in vivo studies of degeneration and regeneration in the CNS.</a> Neuroimage. 59, 363-376 (2012).</li>
<li>Lindsey, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+of+the+visual+system+in+vivo%3A+transsynaptic+illumination+of+V1+and+V2+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging of the visual system in vivo: transsynaptic illumination of V1 and V2 visual cortex.</a> Neuroimage. 34, 1619-1626 (2007).</li>
<li>Bearer, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+neuronal+activity+and+kinesin+on+tract+tracing+by+manganese-enhanced+MRI+%28MEMRI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Role of neuronal activity and kinesin on tract tracing by manganese-enhanced MRI (MEMRI).</a> Neuroimage. 37, Suppl 1. S37-S46 (2007).</li>
<li>Mendonca-Dias, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paramagnetic+contrast+agents+in+nuclear+magnetic+resonance+medical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Paramagnetic contrast agents in nuclear magnetic resonance medical imaging.</a> Semin Nucl Med. 13, 364-376 (1983).</li>
<li>Thuen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese-enhanced+MRI+of+the+optic+visual+pathway+and+optic+nerve+injury+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson+Imaging%22%5BJournal%5D)">Manganese-enhanced MRI of the optic visual pathway and optic nerve injury in adult rats.</a> J Magn Reson Imaging. 22, 492-500 (2005).</li>
<li>Sandvig, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+MRI+of+olfactory+ensheathing+cell+grafts+and+regenerating+axons+in+transplant+mediated+repair+of+the+adult+rat+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+biomed%22%5BJournal%5D)">In vivo MRI of olfactory ensheathing cell grafts and regenerating axons in transplant mediated repair of the adult rat optic nerve.</a> NMR biomed. 25, 620-631 (2012).</li>
<li>Chan, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+retinotopic+mapping+of+superior+colliculus+using+manganese-enhanced+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">In vivo retinotopic mapping of superior colliculus using manganese-enhanced magnetic resonance imaging.</a> Neuroimage. 54, 389-395 (2011).</li>
<li>Chan, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+chromium-enhanced+MRI+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo chromium-enhanced MRI of the retina.</a> Magn Reson Med. 68, 1202-1210 (2012).</li>
<li>Herrmann, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possibilities+and+limitations+for+high+resolution+small+animal+MRI+on+a+clinical+whole-body+3T+scanner%5BTitle%5D)+AND+%22Magma%22%5BJournal%5D)">Possibilities and limitations for high resolution small animal MRI on a clinical whole-body 3T scanner.</a> Magma. 25, 233-244 (2012).</li>
<li>Villegas-Perez, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+protracted+phases+of+retinal+ganglion+cell+loss+follow+axotomy+in+the+optic+nerve+of+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and protracted phases of retinal ganglion cell loss follow axotomy in the optic nerve of adult rats.</a> J Neurobiol. 24, 23-36 (1993).</li>
<li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+spontaneous+optic+neuropathy+in+NF-%CE%BA%CE%9250-deficient+mice%3A+requirement+for+NF-%CE%BA%CE%92p50+in+ganglion+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol+Appl+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Development of spontaneous optic neuropathy in NF-κΒ50-deficient mice: requirement for NF-κΒp50 in ganglion cell survival.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 33, 692-705 (2007).</li>
<li>Herrmann, K. H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+compatible+small+animal+monitoring+and+triggering+system+for+whole+body+scanners%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Med+Phys%22%5BJournal%5D)">MRI compatible small animal monitoring and triggering system for whole body scanners.</a> Z Med Phys. 24, 55-64 (2013).</li>
<li>Danscher, G., Zimmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+Timm+sulphide+silver+method+for+light+and+electron+microscopic+localization+of+heavy+metals+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">An improved Timm sulphide silver method for light and electron microscopic localization of heavy metals in biological tissues.</a> Histochemistry. 55, 27-40 (1978).</li>
<li>Angenstein, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese-enhanced+MRI+reveals+structural+and+functional+changes+in+the+cortex+of+Bassoon+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+cortex%22%5BJournal%5D)">Manganese-enhanced MRI reveals structural and functional changes in the cortex of Bassoon mutant mice.</a> Cereb cortex. 17, 28-36 (2007).</li>
<li>Thuen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese-enhanced+MRI+of+the+rat+visual+pathway%3A+acute+neural+toxicity%2C+contrast+enhancement%2C+axon+resolution%2C+axonal+transport%2C+and+clearance+of+Mn%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson+Imaging%22%5BJournal%5D)">Manganese-enhanced MRI of the rat visual pathway: acute neural toxicity, contrast enhancement, axon resolution, axonal transport, and clearance of Mn(2).</a> J Magn Reson Imaging. 28, 855-865 (2008).</li>
<li>Lehmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vision+and+visual+plasticity+in+ageing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Restor+Neurol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vision and visual plasticity in ageing mice.</a> Restor Neurol Neurosci. 30, 161-178 (2012).</li>
<li>Takeda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese+transport+in+the+neural+circuit+of+rat+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Manganese transport in the neural circuit of rat CNS.</a> Brain Res Bull. 45, 149-152 (1998).</li>
<li>Nairismagi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese-enhanced+magnetic+resonance+imaging+of+mossy+fiber+plasticity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Manganese-enhanced magnetic resonance imaging of mossy fiber plasticity in vivo.</a> Neuroimage. 30, 130-135 (2006).</li>
<li>Smith, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+axonal+transport+rates+decrease+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">In vivo axonal transport rates decrease in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neuroimage. 35, 1401-1408 (2007).</li>
<li>Berkowitz, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+and+simultaneous+imaging+of+layer-specific+retinal+functional+adaptation+by+manganese-enhanced+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Noninvasive and simultaneous imaging of layer-specific retinal functional adaptation by manganese-enhanced MRI.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 2668-2674 (2006).</li>
<li>Schnapf, J. L. B. D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+photoreceptor+cells+respond+to+light%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Am%22%5BJournal%5D)">How photoreceptor cells respond to light.</a> Sci. Am. 256 (8), (1987).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+auditory+brain+mapping+in+mice+with+Mn-enhanced+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo auditory brain mapping in mice with Mn-enhanced MRI.</a> Nat Neurosci. 8, 961-968 (2005).</li>
<li>Sun, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+topical+loading+for+manganese-enhanced+MRI+of+the+mouse+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Noninvasive topical loading for manganese-enhanced MRI of the mouse visual system.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 3914-3920 (2011).</li>
<li>Sun, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+repeated+topical-loaded+manganese-enhanced+MRI+on+the+mouse+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Impact of repeated topical-loaded manganese-enhanced MRI on the mouse visual system.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 4699-4709 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

MEMRI układu wzrokowego rozszerza konwencjonalne techniki neurobiologiczne do oceny funkcjonalności w warunkach naiwnych i patologicznych. Oprócz zapewnienia unikalnego wglądu w integralność izolowanego przewodu światłowodowego OUN, MEMRI można łatwo uzupełnić o testy behawioralne, np. optometrię i zadania wodne oparte na wzroku, w celu zbadania bezpośrednich konsekwencji danego paradygmatu dla percepcji wzrokowej. Łączy również badania elektrofizjologiczne i histologiczne z funkcjonalną charakterystyką wzrokową...

Na podstawie korzystnej struktury neuroanatomicznej, system wzrokowy gryzoni oferuje unikalne możliwości oceny związków farmakologicznych i ich zdolności do pośredniczenia w neuroprotekcji1 lub efektach proregeneracyjnych2,3. Co więcej, umożliwia badania nad funkcjonalnymi i neuroanatomicznymi cechami mutantów myszy, czego przykładem jest niedawny przykład dla myszy pozbawionych białka rusztowania presynaptycznego Basgot4. Ponadto szerokie spektrum narzędzi uzupełniających pozwala na dodatkowe poznanie liczby komórek zwojowych siatkówki (RGC) i liczby aksonów RGC, a także aktywności RGC, np. za pomocą elektroretinografii i testów behawioralnych, a także określanie przegrupowań kory mózgowej za pomocą optycznego obrazowania sygnałów wewnętrznych. Najnowsze osiągnięcia techniczne w mikroskopii laserowej umożliwiają wizualizację in situ regeneracji RGC poprzez obrazowanie głębokiej fluorescencji tkanek w całych próbkach nerwu wzrokowego (ON) i mózgu. W tym podejściu histologicznym oczyszczanie tkanek na bazie tetrahydrofuranu w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną arkusza świetlnego pozwala na rozdzielczość pojedynczych włókien, które ponownie wchodzą do pozbawionego kofeiny ON i drogi wzrokowej 5. Chociaż takie techniki mogą być lepsze pod względem rozdzielczości i określania wzorców wzrostu, nie umożliwiają one powtarzalnych i podłużnych analiz poszczególnych zdarzeń wzrostu, które są szczególnie pożądane do oceny procesu długoterminowej regeneracji.
Rezonans magnetyczny ze wzmocnieniem kontrastowym został wykorzystany do minimalnie inwazyjnej wizualizacji projekcji siatkówkowo-tektalnej u myszy i szczurów6,7. Można to osiągnąć poprzez bezpośrednie dostarczanie do gałki ocznej jonów paramagnetycznych (np. Mn2+) do komórek siatkówki. Jako analog wapnia, Mn2+ jest włączany do somatów RGC za pośrednictwem bramkowanych napięciem kanałów wapniowych i aktywnie transportowany wzdłuż aksonalnego cytoszkieletu nienaruszonego ON i drogi wzrokowej. O ile gromadzi się w jądrach mózgowych projekcji wzrokowej, tj. w jądrze kolankowatym bocznym (LGN) i wzgórku górnym (SC), o tyle propagacja transsynaptyczna do pierwszorzędowej kory wzrokowej wydaje się nieistotna8,9, chociaż może wystąpić10,11. W sekwencjonowaniu MR paramagnetyczny Mn2 + zwiększa kontrast MR głównie poprzez skrócenie czasu relaksacji sieci spinowej T1 12. Taki rezonans magnetyczny wzmocniony Mn2 + (MEMRI) został z powodzeniem zastosowany w różnych badaniach neuroanatomicznych i funkcjonalnych szczurów, w tym w ocenie regeneracji i zwyrodnienia aksonów po urazie ON13,14, precyzyjnym mapowaniu anatomicznym projekcji siatkówkowo-tektalnej15, a także w określaniu charakterystyki transportu aksonalnego po leczeniu farmakologicznym16. Niedawne udoskonalenia w dawkowaniu, toksyczności i kinetyce neuronalnego wychwytu i transportu Mn2 +, a także ulepszone protokoły MRI rozszerzyły jego zastosowanie na badania na transgenicznych myszach9 przy użyciu 3 skanerów Tesli powszechnie stosowanych w praktyce klinicznej17.
Tutaj prezentujemy protokół MEMRI odpowiedni do podłużnego obrazowania in vivo projekcji siatkówkowo-tektalnej myszy i pokazujemy jego przydatność poprzez ocenę wzmocnienia sygnału zależnego od Mn2+ w naiwnych i różnych warunkach neurodegeneracji. Nasz protokół kładzie szczególny nacisk na pozyskiwanie danych MR w umiarkowanym polu magnetycznym 3 T, które jest ogólnie bardziej dostępne niż dedykowane skanery zwierząt. U myszy naiwnych pokazujemy, w jaki sposób intensywność sygnału specyficznego dla przewodu pokarmowego może znacznie i powtarzalnie wzrosnąć po zastosowaniu Mn2 + do ciała szklistego (ivit). Ilościowo, propagacja Mn2 + wzdłuż projekcji wzrokowej zachodzi niezależnie od normalnego procesu starzenia się (mierzonego między 3 a 26 miesiącami myszy), a augmentacja jest oporna na stymulację wzrokową i adaptację do ciemności. W przeciwieństwie do tego, wzbogacenie Mn2 + w ośrodkach wzgórza i śródmózgowia jest zmniejszone po ostrym urazie zmiażdżenia ON18, a także u myszy z nokautem nfkb1 (p50KO) cierpiących na spontaniczną apoptozę RGC i zwyrodnienie ON19. W ten sposób, stanowiąc rozszerzenie konwencjonalnej analizy histologicznej, podłużna analiza MEMRI poszczególnych zwierząt umożliwia profilowanie unikalnej kinetyki procesów neurodegeneracyjnych. Powinno to okazać się przydatne w badaniach nad neuroprotekcją i regeneracją aksonów związaną z interwencjami farmakologicznymi lub genetycznymi.

<table><tbody><tr><td>Roztwór chlorku manganu (II) 1 M</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, Niemcy</td><td>M1787</td><td>Odczynnik kontrastowy MEMRI</td></tr><tr><td>Conjuncain</td><td>Dr. Mann Pharma, Berlin, Niemcy</td><td>PZN 7617666</td><td>0,4% chlorowodorek oksybuprokainy</td></tr><tr><td>Krople do oczu Floxal</td><td>Dr. Mann Pharma, Berlin, Niemcy</td><td>PZN 3820927</td><td>3 mg/ml ofloksacyny</td></tr><tr><td>Maść Pantenol</td><td>Jenapharm, Jena, Niemcy</td><td>PZN </td><td></td>3524531</tr><tr><td>Hydrat chloralu&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, Niemcy</td><td>C8383</td><td>420-450 mg/kg masy ciała</td></tr><tr><td>strzykawka Hamiltona&nbsp;</td><td>Hamilton Company, Reno, NV, Stany Zjednoczone</td><td>7634-01</td><td>SYR 5 & mikro; l, 75 RN, bez igły NDL</td></tr><tr><td>34 G (34/35/pst4/tapN)</td><td>Hamilton Company, Reno, NV, USA</td><td>Igła wymienna 207434/00</td><td>RN, 34 G, długość 38,1 mm, typ punktowy 4</td></tr><tr><td>Lornetka Stemi-2000</td><td>Zeiss, Oberkochen, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skaner MRI 3 T Magnetom TIM Trio</td><td>Siemens Medical Solutions, Erlangen, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cewka głowna szczura</td><td>Doty Scientific Inc., Columbia, SC, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt</td><td></td><td></td> myszy <td>wykonany na zamówienie</td></tr><tr><td>Lampa</td><td></td><td></td><td></td>światła czerwonego</tr><tr><td>Sekcja mrożona medium NEG-50</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy</td><td>6502</td><td>zatapianie tkanek do kriosekcji</td></tr><tr><td>Diwodorofosforan sodu jednowodny (NaH2PO4&middot; H2O)</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>106346</td><td>do perfuzji siarczkowej</td></tr><tr><td>Siarczek sodu niewodny (Na2S&middot; 9H2O)</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, Niemcy</td><td>208043</td><td></td></tr><tr><td>Guma arabska</td><td>Roth, Arlesheim, Szwajcaria</td><td>4159</td><td>do barwienia TIMM</td></tr><tr><td>Hydrochinon (C6H6O2)</td><td>Roth, Arlesheim, Szwajcaria</td><td>3586</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy (C6H8O7)</td><td>Roth, Arlesheim, Szwajcaria</td><td>6490</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian trisodu dwuwodny (C6H5Na3O7&middot; 2H2O)</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>106448</td><td></td></tr><tr><td>Azotan srebra (AgNO3)</td><td>Roth, Arlesheim, Szwajcaria</td><td>7908</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) obrazowanie integralności włókien nerwu wzrokowego za pomocą rezonansu magnetycznego ze wzmocnieniem kontrastowym u myszy

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

System wzrokowy gryzoni obejmuje komórki zwojowe siatkówki i ich aksony, które tworzą nerw wzrokowy, aby wejść do ośrodków wzgórza i śródmózgowia, oraz projekcje postsynaptyczne do kory wzrokowej. Ze względu na swoją odrębną strukturę anatomiczną i wygodną dostępność, stał się preferowaną strukturą do badań nad przeżyciem neuronów, regeneracją aksonów i plastycznością synaptyczną. Ostatnie postępy w obrazowaniu MR umożliwiły wizualizację in vivo siatkówkowo-tektalnej części tej projekcji za pomocą wzmocnienia kontrastu za pośrednictwem manganu (MEMRI). W tym miejscu przedstawiamy protokół MEMRI w celu zilustrowania projekcji wizualnej u myszy, dzięki któremu rozdzielczości (200 μm)3 można osiągnąć przy użyciu zwykłych 3 skanerów Tesli. Pokazujemy, w jaki sposób wstrzyknięcie do ciała szklistego pojedynczej dawki 15 nmol MnCl2 prowadzi do nasycenia nienaruszonej projekcji w ciągu 24 godzin. Z wyjątkiem siatkówki, zmiany intensywności sygnału są niezależne od jednoczesnej stymulacji wzrokowej lub fizjologicznego starzenia. Następnie stosujemy tę technikę do wzdłużnego monitorowania zwyrodnienia aksonów w odpowiedzi na ostre uszkodzenie nerwu wzrokowego, paradygmat, w którym transport Mn2 + całkowicie zatrzymuje się w miejscu uszkodzenia. I odwrotnie, aktywny transport Mn2 + jest ilościowo proporcjonalny do żywotności, liczby i aktywności elektrycznej włókien aksonowych. Do takiej analizy przykładamy kinetykę transportu Mn2+ wzdłuż ścieżki wzrokowej w transgenicznym modelu myszy (NF-κB p50KO) wykazującym spontaniczną atrofię projekcji sensorycznych, w tym wzrokowych. U tych myszy MEMRI wskazuje na zmniejszony, ale nie opóźniony transport Mn2 + w porównaniu z myszami typu dzikiego, ujawniając w ten sposób oznaki upośledzenia strukturalnego i / lub funkcjonalnego przez mutacje NF-κB.
Podsumowując, MEMRI wygodnie łączy testy in vivo z histologią post mortem w celu scharakteryzowania integralności i aktywności włókien nerwowych. Jest bardzo przydatny w badaniach podłużnych nad degeneracją i regeneracją aksonów oraz w badaniach zmutowanych myszy pod kątem prawdziwych lub indukowalnych fenotypów.

Zdolność tej techniki obrazowania do dokładnej oceny żywotności i funkcjonalności projekcji wzrokowej opiera się na precyzyjnym podaniu nietoksycznej dawki Mn2+ do ciała szklistego oraz jej pobieraniu przez RGC. To główne założenie zostało przetestowane na Rysunku 1, gdzie warstwowe pobieranie Mn2+ zostało wykazane za pomocą autometalografii (barwienie TIMM)21. Przekroje siatkówki analizowano 24 h po podaniu ivit 15 nmol lub 150 nmol Mn2+, lub PBS jako...

Ten film ilustruje metodę, przy użyciu klinicznego skanera 3 T, do obrazowania MR z kontrastem projekcji wzrokowej naiwnej myszy oraz do powtarzalnych i podłużnych badań in vivo zwyrodnienia nerwu wzrokowego związanego z ostrym uszkodzeniem nerwu wzrokowego i przewlekłym zwyrodnieniem nerwu wzrokowego u myszy z nokautem (p50KO).

In vivo (in vivo) Obrazowanie integralności włókien nerwu wzrokowego za pomocą rezonansu magnetycznego ze wzmocnieniem kontrastowym u myszy

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest monitorowanie zmian strukturalnych i funkcjonalnych wzdłuż drogi wzrokowej u myszy in vivo. Jest to realizowane najpierw poprzez dokonać zastrzyku do ciała szklistego z paramagnetycznymi jonami manganu, które pełnią wewnątrzkomórkową rolę znaczników wrażliwych na MR i są podawane w postaci roztworu chlorku manganu na 24 godziny przed badaniem. Drugim krokiem jest umieszczenie znieczulonej myszy w skanerze MR o natężeniu 3 T przy użyciu odpowiedniego sprzętu do akwizycji obrazów i monitorowania funkcji życiowych.Następnie przeprowadza się dostosowany do myszy i czuły na znaczniki protokół MEMR, a następnie rekonstruuje się wielopłaszczyznowe obrazy 3D wzmocnienia sygnału wewnątrzczaszkowego wzdłuż drogi siatkówkowo-skroniowej. Ostatnim krokiem jest wyjęcie myszy ze skanera MRI i zapewnienie wsparcia funkcji życiowych w celu szybkiego wybudzenia z anestezji, co umożliwia powtarzalne badania EMRI u tego samego zwierzęcia lub późniejsze badania behawioralne bądź histologiczne. Ostatecznie MRI z użyciem manganu do obrazowania projekcji dotykowej jest wykorzystywane do wykazania ostrych lub postępujących neuropatologii u myszy modyfikowanych eksper

in-vivo-imaging-optic-nerve-fiber-integrity-contrast-enhanced-mri

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

In vivo obrazowanie integralności włókien nerwu wzrokowego poprzez MRI z kontrastem u myszy

Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej uwidocznij uszkodzony nerw, który wykazuje postępujący wzrost obrzęków i rozłączeń aksonów.

Mikroskopowa analiza elektronowa uszkodzenia aksonów w nerwie wzrokowym myszy z uszkodzeniem mózgu

Źródło: Wang, Z., et al. Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy.  J. Vis. Exp. (2021). Ten film przedstawia technikę obrazowania siatkówki in vivo przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Znieczulone myszy są przygotowywane do obrazowania poprzez zabezpieczenie głowy, nałożenie lubrykantu do oczu i umieszczenie szkiełka nakrywkowego na oku. Komórki zwojowe siatkówki (RGC) eksprymujące białka fluorescencyjne są najpierw wizualizowane za pomocą epifluorescencji w celu...

Dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Źródło: Bosco, A., et al.  In Vivo Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy. J. Vis. Exp. (2015) Ten film przedstawia obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry. Transgeniczna mysz z mikroglejem siatkówki wykazującym ekspresję białka fluorescencyjnego jest umieszczana pod oftalmoskopem. Oświetlenie w podczerwieni służy do zlokalizowania głowy nerwu wzrokowego (ONH), a...

Obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry

Source: Jagodzińska, J., et. al., optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy . J. Vis. Exp. (2017)  W tym filmie pokazujemy zastosowanie optycznej koherentnej tomografii w domenie spektralnej (SD-OCT) do obrazowania warstw siatkówki i oceny zmian strukturalnych w genetycznie zmodyfikowanym modelu myszy z neuropatią nerwu wzrokowego.

Obrazowanie in vivo siatkówki myszy za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Pokazujemy technikę obrazowania in vivo na żywo bioluminescencji i bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu w eksperymentalnym modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) dla stwardnienia rozsianego u myszy SJL/J.

Bioluminescencja i obrazowanie w bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu w modelu EAE stwardnienia rozsianego u myszy

Ten protokół opisuje, jak techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takie jak optyczna koherentna tomografia w domenie spektralnej i skaningowa oftalmoskopia laserowa, mogą być wykorzystane u małych gryzoni, przy użyciu systemu platformy obrazowania okulistycznego, aby uzyskać informacje odpowiednio o grubości siatkówki i rozmieszczeniu komórek mikrogleju.

In vivo (in vivo) Obrazowanie myszy reporterowych Cx3cr1gfp/gfp z optyczną koherentną tomografią w domenie spektralnej i skaningową oftalmoskopią laserową

Tutaj prezentujemy przydatność podłużnego obrazowania in vivo w obserwacji zmian morfologicznych wywołanej laserem neowaskularyzacji naczyniówkowej u myszy.

In vivo (in vivo) Multimodalne obrazowanie i analiza mysiego modelu neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem

Tutaj prezentujemy protokół wywoływania paraliżu i zapalenia wzrokowo-rdzeniowego poprzez transfer limfocytów T specyficznych dla akwaporyny-4 (AQP4) z myszy AQP4-/- do myszy WT. Ponadto pokazujemy, jak wykorzystać seryjną optyczną tomografię koherentną do monitorowania dysfunkcji układu wzrokowego.

Indukcja paraliżu i uszkodzenia układu wzrokowego u myszy przez limfocyty T specyficzne dla Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Obecny protokół przedstawia kroki do wyrównania in vivo obrazów światłowodowej optycznej koherentnej tomografii koherentnej (vis-OCTF) in vivo z obrazami konfokalnymi ex vivo tej samej siatkówki myszy w celu weryfikacji obserwowanej morfologii pęczka aksonów komórek zwojowych siatkówki na obrazach in vivo.

Wyrównanie światłowodów światłowodowej koherentnej tomografii koherentnej w świetle widzialnym z obrazami konfokalnymi tej samej siatkówki myszy

Poznaj metodę obrazowania MRI ze wzmocnieniem manganowym do badania zwyrodnienia nerwu wzrokowego u myszy in vivo. Technika umożliwia długoterminowe monitorowanie zmian strukturalnych w układzie wzrokowym.

In vivo (in vivo) Obrazowanie integralności włókien nerwu wzrokowego za pomocą rezonansu magnetycznego ze wzmocnieniem kontrastowym u myszy (Wideo) | JoVE Journal

In vivo (in vivo) Obrazowanie integralności włókien nerwu wzrokowego za pomocą rezonansu magnetycznego ze wzmocnieniem kontrastowym u myszy

Przeglądaj więcej filmów