Wywoływanie przerostu mięśniowo-wewnętrznego, a miażdżyca u myszy: wprowadzenie dwóch prawidłowych modeli

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przedstawienie dwóch uznanych modeli zwierzęcych prowadzących do zwężenia aorty poprzez różne mechanizmy. Pierwszym modelem jest cewnikowanie aorty balonem w celu wywołania hiperplazji neointimy. W pierwszej kolejności odsłania się i zaciska brzuszną aortę poniżej poziomu nerek.

Następnie aortę otwiera się za pomocą cięcia poprzecznego i wprowadza cewnik balonowy. Następnie śródbłonek aorty usuwa się za pomocą napompowanego cewnika, po czym zabieg zostaje zakończony. Drugi model polega na manipulacji dietą transgenicznych myszy APOE null w celu wywołania blaszek miażdżycowych.

Myszy te są utrzymywane w standardowych warunkach i karmione dietą typu western z wysoką zawartością lipidów przez okres od czterech do sześciu miesięcy. Ostatecznie analiza histologiczna hiperplazji neointimy indukowanej chirurgicznie oraz modelu z restrykcją dietetyczną wykazuje, że prowadzą one do różnego stopnia zwężenia światła naczynia. Dzisiaj zaprezentujemy dwa różne modele indukcji zwężenia światła: model mysi z wykorzystaniem cewnika balonowego do wywołania uszkodzenia naczynia oraz model arteriosklerozy.

Wykorzystanie myszy transgenicznych w diecie zachodniej (Western diet) oraz modelu cewnika balonowego pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie stenozy. Transgeniczny homozygotyczny model myszy z mutacją upper E jest stosowany do badania patofizjologii miażdżycy. W przypadku modelu hiperplazji intimy należy pozyskać myszy C 57 black six J o masie około 25 g.

Utrzymuj je w normalnych warunkach, podając standardową dietę. Po znieczuleniu myszy 2% isofluranem, usuń owłosienie z brzucha, a następnie podaj karprofen w iniekcji podskórnej w celu zapewnienia analgezji. Następnie, naprzemiennie, zdezynfekuj skórę jodynem Povidone i 80% etanolem w dwóch cyklach.

Następnie sprawdź brak odruchów, uciskając palec u nogi. Rozpocznij operację, rozdzielając skórę i mięśnie wzdłuż białej linii brzucha. Następnie owiń jelita rękawiczką zwilżoną solą fizjologiczną, a potem uważnie usuń tkankę tłuszczową, odsłaniając aortę brzuszną.

Następnie odsłoń aortę podnerkową aż do jej rozwidlenia, uważając, aby nie uszkodzić żadnych naczyń odchodzących. Teraz zaklemuj aortę.

W pierwszej kolejności załóż zacisk mikrosurgicalny na proksymalną część aorty podnerkowej, aby zablokować przepływ krwi. Następnie załóż drugi zacisk dystalny obok rozwidlenia aorty. Po przerwaniu przepływu krwi wykonaj małe nacięcie w aorcie w pobliżu zacisku proksymalnego.

Wprowadź cewnik w stronę dystalnego zacisku aorty, aby wywołać uszkodzenie śródbłonka. Usuń śródbłonek aorty poprzez ostrożne napompowanie balonu cewnika i powolne wycofanie cewnika w kierunku zacisku proksymalnego. Powtórz ten manewr dwukrotnie, tak aby łącznie napompować aortę trzy razy.

Następnie usuń cewnik i zamknij nacięcie aorty, używając szwów ciągłych z proliny 10 au. Po założeniu szwów ostrożnie otwórz zacisk dystalny, jeśli w miejscu autotomii aorty występuje krwawienie. Ponownie zamknij zacisk, zlokalizuj miejsce krwawienia i zatamuj je, stosując dodatkowe szwy przerywane.

W przypadku braku krwawienia powoli otwórz zacisk proksymalny. Dystalnie od nacięcia powinien być widoczny puls aorty. Teraz ułóż jelita w C dwa.

Następnie zamknąć ścianę brzusną, zaczynając od warstwy mięśniowej, stosując sześć ciągłych szwów w technice OTT z użyciem prolinu. Następnie zamknąć skórę za pomocą pięciu szwów OTT i przenieść mysz z powrotem do klatki. Przez pierwsze trzy dni po operacji podawać metrazol w wodzie pitnej w celu kontroli bólu.

Monitoruj zwierzę przez cały okres rekonwalescencji, który trwa około 28 dni. W przypadku modelu miażdżycy należy pozyskać czterotygodniowe myszy z niedoborem POE. Utrzymuj te mysze w standardowych warunkach, podając im dietę western o wysokiej zawartości lipidów przez okres od czterech do sześciu miesięcy.

Należy utrzymać tę dietę przez cały okres trwania eksperymentu. Na sześć godzin przed pobraniem aorty należy odstawić pożywienie. Następnie przygotować mysz do zabiegu chirurgicznego zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji.

Operację rozpoczynaj od otwarcia klatki piersiowej. Następnie odetnij wierzchołek serca i pod delikatnym ciśnieniem przepłucz go 3 mL 4% paraformaldehydu przez pierścień aorty w celu utrwalenia aorty. Następnie uwolnij aortę od pierścienia aż do miejsca jej rozwidlenia.

Należy usunąć jak największą ilość tkanki tłuszczowej. Następnie odciąć łuk aorty i przechowywać go w 4% paraformaldehydzie. Teraz przenieść serce i drzewo aortalne do naczynia wyłożonego silikonem z PBS.

Odetnij jeden koniec drzewa aorty i przymocuj go do warstwy silikonu za pomocą cienkich pinset. Rozetnij aortę wzdłużnie i pozostaw tkankę aorty w PBS w temperaturze pokojowej na kilka minut. Następnie przepłucz tkankę raz 50% etanolem i zanurz ją w kąpieli z Sudanim.

Trzeci krok: inkubacja w roztworze barwiącym przez około 15 minut. Po barwieniu tkankę należy szybko przepłukać 50% etanolem przez kilka sekund, aby usunąć jedynie nadmiar Sudanu. Zbyt długie płukanie spowoduje usunięcie zbyt dużej ilości barwnika; tkankę należy niezwłocznie przepłukać wodą destylowaną i przystąpić do obrazowania. W modelu hiperplazji neointimy pobrano odarte z endotelium aorty mysie, zatopiono je w parafinie i zabarwiono trichromem. Stosunki imi zostały obliczone na podstawie sekcji zabarwionych trichromem poprzez pomiar grubości intimy i media.

Przy użyciu analizy komputerowej, a następnie obliczenia stosunku, maksymalną grubość blaszki zmierzono jako maksymalną grubość intimy w świetle naczynia za pomocą komputerowego drzewa morfologicznego. Procentowe zamknięcie światła naczynia obliczono jako stosunek nowego wewnętrznego światła naczynia do światła pierwotnego. Pole powierzchni blaszki obliczono poprzez odjęcie nowego wewnętrznego światła naczynia od światła pierwotnego.

Analogiczne analizy przeprowadzono na barwionych trichromem przekrojach poprzecznych modelu miażdżycy na poziomie zastawki aortalnej, łuku aorty oraz aorty zstępującej wyłącznie dla modelu miażdżycy. Aortę zstępującą otwarto wzdłużnie i zabarwiono czerwienią Sudan. Powierzchnię blaszki miażdżycowej oraz całkowitą powierzchnię aorty zmierzono przy użyciu komputera w celu analizy obu modeli.

W celu uzyskania odpowiedzi na pytania dotyczące m.in. obliteracji światła, morfologii oraz komórkowości można zastosować inne metody, takie jak histopatologia i konfokalna mikroskopia immunofluorescencyjna. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.